KR20200017731A - 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생체친화성을 갖는 산화 다당류, 천연 단백질 고분자 및 칼슘 화합물을 포함하는 이중 가교구조의 지혈제 조성물 및 그 제조방법에 대한 것이다.
본 발명에 따라 제조된 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물은 생체 내 분해가 가능하여 생체친화성이 우수할 뿐만 아니라, 세포 혹은 조직에 독성이 없고 높은 체수분 흡수력과 뛰어난 지혈 작용으로 빠르게 출혈을 막을 수 있다.

Description

이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물 및 그 제조방법{Double crosslinked biocompatible hemostatic composition and preparation method thereof}

본 발명은 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생체친화성을 갖는 산화 다당류, 천연 단백질 고분자 및 칼슘 화합물을 포함하는 이중 가교구조의 지혈제 조성물 및 그 제조방법에 대한 것이다.

일반적으로 지혈제는 출혈 증상에 대하여 출혈을 멈추게 할 목적으로 사용되는 약제로 정의할 수 있으며, 찰과상에 의한 약한 출혈에서부터 수술 및 사고 등 여러 가지 이유로 인하여 발생한 큰 출혈에까지 적용할 수 있는 중요한 외과적 의료용품이라 할 수 있다.

그런데 인체 내에서 일어나는 지혈과정은 생리학적으로 매우 복잡하여 완전하게 출혈을 막기에는 한계가 있다. 예를 들면, 예상치 못한 사고에 의한 심각한 조직 손상이나 수술 시 외과적 처치 중 나타날 수 있는 과다출혈의 경우, 인체 내에서 자연히 기능하는 물리ㅇ화학적 지혈작용만으로는 출혈을 온전히 막을 수 없어 지혈제를 반드시 사용하게 되는 것이다.

이러한 지혈제는 절상, 자상, 열상 등 다양한 상처와 인위적 수술시 생기는 상처에 의한 출혈 등에 적용되는 것이므로 적용 부위와 상처 종류에 따라 분말, 젤, 스펀지, 드레싱 등 그 형태가 다양하며, 각각의 형태마다 적용방법과 작용원리 또한 다양하다. 따라서 지혈제로써 완전한 지혈과 상처치유가 가능할 뿐 아니라, 인체에 적용했을 때 발열이나 염증 등의 부작용 및 독성이 없어야 하며, 인체 내부에 적용하는 경우에는 체내에 흡수되는 재료에 대하여 생체 내 분해능이 요구된다. 또한, 흐르는 혈액을 빠르게 흡수함으로써 출혈 부위에 방어막을 형성하여 인체 내 자연히 기능하는 지혈작용과 관련한 혈액응고인자의 농축(recruitment)으로 지혈을 유도하기 위해서는 일정 수준 이상의 수분 흡수력이 요구되기도 한다.

지혈제로 개발된 제품 중 흡수성 직물 혹은 편물인 재생 셀룰로오스(Oxidized Regenerated Cellulose, ORC)를 산화시켜 만든 산화 재생 셀룰로오스계가 있다. 이 지혈제의 지혈작용 원리는 생체 내의 혈액 응고 과정에 참여하지 않고, 출혈 부위의 혈액과 접촉하면 팽윤되어 출혈 부위를 뒤덮음으로써 혈관주위의 조직을 수축시켜 지혈하는 것이다. 하지만 산화 재생 셀룰로오스는 지혈 시 산성을 띠어 혈액 응고 과정에 관여하는 트롬빈과 피브리노겐 등 혈액응고인자들의 활성을 변성시킬 수 있는 문제점이 있다(특허문헌 1).

상기 단점을 개선하고자 트롬빈 및 피브리노겐 등 혈액응고인자들을 함유하고 흡수성 부직포, 직물 혹은 편성물 형태로 제조한 지혈제가 공지된 바 있으나 지혈 효과 및 상처치유 효과가 충분치 않은 것으로 알려져 있다(특허문헌 2).

또한, 알긴산 또는 알긴산 알칼리 금속염을 일정 농도로 용해시켜 형성된 수화겔(hydrogel)을 동결건조하여 알긴산 스폰지를 제조한 후, 이를 그대로 또는 압축하여 시트형으로 제조시킨 창상 피복재 목적의 알긴산 스폰지에 관한 기술도 공지된 바 있으나, 이것도 역시 지혈 효과 및 상처치유 효과가 만족스러운 수준이 아닌 것으로 알려져 있다(특허문헌 3).

게다가 지혈제로 개발된 일부 제품은 지혈작용은 뛰어나나 인체에 적용했을 때 적용 부위 주변부 조직에 화상과 비슷한 발열 작용을 일으키거나 손상된 혈관에서 폐쇄성 혈전 염증 (occlusive thrombus) 혹은 내피 세포독성을 일으키는 등의 부작용을 초래하여 사용이 중단된 사례가 보고되어 있다. 또한, 분말 형태의 지혈제 중 일부는 생체분해능이 없어 출혈 부위 적용 후 제거하기가 쉽지 않으므로 외과적 수술시 부적합한 것으로 보고되기도 하였다.

그러므로 본 발명자는 생체친화성의 지혈제를 개발하기 위하여 연구를 거듭한 결과, 다당류는 산화제 등에 의해 산화가 일어나면 지방족 고리 구조가 열리면서(ring-opening) 다당류의 히드록시기가 알데히드기로 변하는바, 산화 다당류의 알데히드기가 천연단백질 고분자의 아민기와 반응하여 아민 결합을 가지는 가교 구조를 형성하고, 부가적으로 칼슘 화합물을 첨가하여 칼슘 화합물과 산화 다당류 사이의 가교 구조를 형성하면, 산화 다당류 및 천연단백질 고분자 사이의 가교 형성에 더불어 칼슘화합물에 의한 산화 다당류 사이의 가교 형성으로 이중 가교구조의 가교체를 제조할 수 있음을 확인하였다. 이렇게 제조된 지혈제는 친수의 성질을 높게 가지고 있어 체내에 흡수되더라도 가수분해에 의해 생체 내 분해 및 배출이 가능하고, 생체친화성이 우수할 뿐만 아니라, 세포 혹은 조직에 독성이 없고, 산화 다당류 및 천연단백질 사이에 형성되는 가교구조 내로 많은 양의 체수분을 흡수할 수 있다. 따라서 출혈부위에 적용했을 때 혈액을 흡수하여 혈액응고에 관여하는 피브린, 트롬빈 등과 같은 혈액응고인자들의 농축을 유발하고, 혈액응고를 유도하여 출혈을 빠르게 제어할 수 있는 지혈 효과를 나타내는 지혈제를 제공할 수 있음에 착안하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

KR 10-2014-0086072 A KR 10-2009-0028690 A KR 10-2006-0072643 A

본 발명의 목적은 생체 내 분해가 가능하여 생체친화성이 우수할 뿐만 아니라, 세포 혹은 조직에 독성이 없고 높은 체수분 흡수력과 뛰어난 지혈 작용으로 빠르게 출혈을 막을 수 있는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 산화 다당류; 천연 단백질 고분자; 및 칼슘화합물을 포함하는, 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물을 제공한다.

상기 산화 다당류는 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시에틸셀룰로오스, 하이드록시메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 덱스트린, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 알긴산, 히알루론산, 키틴, 키토산, 젤란검, 글루칸, 베타글루칸, 콘드로이틴 설페이트, 글리코겐, 녹말, 셀룰로오스, 재생셀룰로오스, 말토덱스트린, 프럭탄, 갈락탄 및 만난으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 다당류의 산화물인 것을 특징으로 한다.

상기 산화 다당류는 분자량이 1,000 내지 300,000인 것을 특징으로 한다.

상기 산화 다당류는 산화도가 5 내지 70%일 수 있다.

상기 천연 단백질 고분자는 젤라틴, 콜라겐, 엘라스틴, 케라틴, 피브로인, 카세인, 글루테닌, 파세올린 및 알부민으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

상기 칼슘화합물은 질산칼슘, 아세트산칼슘, 수산칼슘, 인산칼슘, 염화칼슘, 탄산칼슘, 산화칼슘, 황화칼슘, 브로민화칼슘, 탄화칼슘, 규산칼슘 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물은 산화 알긴산, 젤라틴 및 염화칼슘을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 조성물은 프로트롬빈(prothrombin), 트롬빈(thrombin), 트랜스글루타미나제(transglutaminase), 세린 프로테아제(serine protease), 비타민 K(vitamin K), 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor), 세로토닌(serotonin), ADP(adenosine diphosphate), 트롬보플라스틴(thromboplastin), 피브리노겐(fibronogen) 및 아스코르브산(ascorbic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 지혈 촉진 성분을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물은 용혈성 출혈의 지혈에 사용될 수 있다.

본 발명은 또한, (1) 산화제 수용액 및 다당류 수용액을 혼합한 후 산화반응을 유도하여 산화반응 혼합액을 얻는 단계; (2) 상기 산화반응 혼합액을 세척, 여과 및 건조하여 분말상의 산화 다당류를 수득하는 단계; (3) 상기 수득한 산화 다당류의 수용액 및 칼슘 화합물을 용해시킨 천연 단백질 고분자 수용액을 혼합하여 가교체를 형성하는 단계; (4) 상기 가교체를 가공하는 단계;를 포함하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물의 제조방법을 제공한다.

상기 (1) 단계에서의 다당류는 분자량이 10,000~600,000인 것을 특징으로 한다.

상기 (1) 단계에서의 산화제는 과산화수소, 질산철, 오존, 과초산, 과망간산칼륨, 과산화모노황산 칼륨, 과산화이황산 칼륨, 과요오드산나트륨, 브롬산나트륨, 과붕산나트륨 및 과탄산나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

상기 (1) 단계에서의 다당류 수용액의 용매는 에탄올, 이소프로필알코올, 메탄올, 아세톤, 프로파놀, 판테놀, 부탄올, 옥탄올, 헥산디올으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

상기 (1) 단계에서의 다당류 수용액의 몰 농도는 0.01 내지 0.1인 것을 특징으로 한다.

상기 (1) 단계에서의 산화제 수용액의 몰 농도는 0.005 내지 0.025인 것을 특징으로 한다.

상기 (1) 단계에서의 산화반응은 빛이 차단된 상태로 25~30℃에서 1~96시간 동안 반응시키는 것을 특징으로 한다.

상기 (2) 단계에서의 세척 및 여과는 각각 2 내지 5회 수행되는 것을 특징으로 한다.

상기 (2) 단계에서의 건조는 상기 산화반응 혼합액을 -4 ~ -55℃에서 동결시킨 후 수행되는 것을 특징으로 한다.

상기 (2) 단계에서 수득한 산화 다당류의 산화도는 5 내지 70%이고, 분자량은 1,000 내지 300,000인 것을 특징으로 한다.

상기 (3) 단계에서의 산화 다당류 수용액의 농도는 1 내지 50 중량%이고, 상기 천연 단백질 고분자 수용액의 농도는 1 내지 30 중량%인 것을 특징으로 한다.

상기 (3) 단계에서의 상기 천연 단백질 고분자 수용액 및 산화 다당류 수용액은 1 : 1 ~ 9의 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 한다.

상기 (3) 단계에서의 칼슘화합물의 함량은 상기 산화 다당류 수용액 고형분 중량의 4 내지 20 중량%인 것을 특징으로 한다.

상기 (4) 단계에서의 가교체는 분말, 졸, 겔, 부직포, 직물 또는 스펀지 형태로 가공되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따라 제조된 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물은 생체 내 분해가 가능하여 생체친화성이 우수할 뿐만 아니라, 세포 혹은 조직에 독성이 없고 높은 체수분 흡수력과 뛰어난 지혈 작용으로 빠르게 출혈을 막을 수 있다.

도 1은 본 발명의 제조예 1 내지 3으로부터 제조된 산화알긴산의 산화도에 따른 점도 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 제조예 4 내지 12로부터 제조된 젤 형태의 지혈제에서, 산화 알긴산의 산화도, 산화 알긴산 수용액과 젤라틴 수용액의 비율에 따른 겔화 시간의 차이를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 제조예 4 내지 12로부터 제조된 겔형태의 지혈제에 있어서, 산화 알긴산의 산화도 및 산화 알긴산과 젤라틴의 비율에 따른 수분흡수율을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 제조예 4 내지 12로부터 제조된 겔 형태의 지혈제에 있어서, 수분에 노출되었을 때 산화 알긴산의 산화도에 따른 분해도를 나타낸 그래프이다. 본 발명의 명세서에서, 이하'OA'는 산화 알긴산을, 'G'는 젤라틴을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 제조예 4 내지 12로부터 제조된 겔 형태의 지혈제에 있어서, 수분에 노출되었을 때 산화 알긴산과 젤라틴의 비율에 따른 분해도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예 1 내지 9로부터 제조된 지혈제에서, 산화 알긴산의 산화도, 산화 알긴산 수용액과 젤라틴 수용액의 비율에 따른 겔화 시간의 차이를 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실시예 1 내지 9로부터 제조된 겔 형태의 지혈제에 있어서 산화 알긴산의 산화도 및 산화 알긴산과 젤라틴의 비율에 따른 수분흡수율을 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 실시예 1 내지 9로부터 제조된 겔 형태의 지혈제에 있어서, 수분에 노출되었을 때 산화 알긴산의 산화도에 따른 분해도를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 실시예 1 내지 9로부터 제조된 겔 형태의 지혈제에 있어서, 수분에 노출되었을 때 산화 알긴산과 젤라틴의 비율에 따른 분해도를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 실시예 4 내지 6으로부터 제조된 겔 형태의 지혈제의 세포독성을 확인한 그래프를 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 비교예와 실시예에 따른 지혈제 조성물의 겔화 시간(A)과 수분흡수율(B)을 비교한 그래프이다.
도 12는 본 발명의 실시예 10 내지 12로부터 제조된 스폰지 제형의 지혈제를 나타낸 사진이다.
도 13은 본 발명의 실시예 13 내지 15로부터 제조된 스폰지 제형의 지혈제를 나타낸 사진이다.
도 14는 본 발명의 실시예 16 내지 18로부터 제조된 스폰지 제형의 지혈제를 나타낸 사진이다.
도 15는 본 발명의 산화 알긴산, 젤라틴, 염화칼슘으로 이루어진 스폰지 제형의 지혈제의 산화 알긴산 및 염화칼슘 함량에 따른 수분 흡수율을 나타내는 그래프이다.
도 16은 랫트 대동맥 손상 출혈 유도 모델에서 봉합한 후, 0, 3, 28일 후에 염증과 관련하여 조직분석을 수행한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 산화 다당류; 천연 단백질 고분자; 및 칼슘화합물을 포함하는, 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물을 제공한다.

상기 산화 다당류는 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시에틸셀룰로오스, 하이드록시메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 덱스트린, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 알긴산, 히알루론산, 키틴, 키토산, 젤란검, 글루칸, 베타글루칸, 콘드로이틴 설페이트, 글리코겐, 녹말, 셀룰로오스, 재생셀룰로오스, 말토덱스트린, 프럭탄, 갈락탄 및 만난으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 다당류가 산화반응에 의하여 산화된 상태인 것을 의미한다.

상기 산화 다당류는 분자량이 1,000 내지 300,000일 수 있고, 10,000 내지 200,000인 것이 바람직하며, 20,000 내지 100,000인 것이 더욱 바람직하다. 상기 분자량이 상기 하한치 미만이면 본 발명의 이중 가교구조를 갖는 지혈제의 매트릭스로 작용함에 있어서 기계적 물성이 저하될 수 있고, 분자량이 상기 상한치를 초과하면 기계적 유연성이 떨어지고 생체 내에서 분해되는 시간이 길어지는 문제점이 발생할 수 있다.

또한, 상기 산화 다당류는 산화 전 다당류의 분자량이 10,000 내지 600,000일 수 있고, 20,000 내지 400,000인 것이 바람직하며, 50,000 내지 200,000인 것이 더욱 바람직한 바, 그 분자량이 상기 하한치 미만이면 본 발명의 이중 가교구조를 갖는 지혈제의 매트릭스로 작용함에 있어서 기계적 물성이 저하될 수 있고, 분자량이 상한치를 초과하면 산화제와의 반응성이 떨어져 산화도의 증가에 한계가 생길 수 있다.

한편, 다당류는 산화제 등에 의해 산화가 일어나면 지방족 고리 구조가 열리면서(ring-opening) 다당류의 히드록시기가 알데히드기로 변한다. 이렇게 산화되어 생겨난 다당류의 알데히드기는 천연단백질 고분자의 아민기와 반응하여 아민 가교 결합을 형성하며, 출혈 부위에 적용했을 때 혈액응괴를 유도하여 출혈을 제어한다.

이렇게 다당류가 산화되는 정도를 나타내는 산화도는 산화제 등과의 산화반응에 의하여 다당류의 히드록시기가 알데히드로 전환된 비율(%)을 나타내는 것으로 정의할 수 있는데, 본 발명의 산화 다당류는 산화도가 5 내지 70%일 수 있고, 바람직하게는 10 내지 50%, 더욱 바람직하게는 30 내지 50%일 수 있다. 산화도가 상기 하한치 미만이면 반응 사이트가 적어져서 천연 단백질 고분자와의 가교구조가 잘 형성되지 않아 수분 흡수력이나 지혈 효과가 떨어질 수 있고, 산화도가 상기 상한치를 초과하면 반응 사이트가 많아져서 가교도가 너무 높아지기 때문에 수분에 의해 생체 내에서 분해되는 시간이 길어질 수 있어 바람직하지 않다.

한편, 천연단백질 고분자는 동물의 섬유성 단백질로 인체를 구성하는 단백질 중 30%를 차지하고 있는 단백질이기 때문에, 생체친화성이고 수분 흡수력이 뛰어나 산화 다당류와 아민 가교 결합을 형성하여 출혈 부위에 적용했을 때 출혈 부위의 수분을 흡수하여 혈소판이 손상 혈관 주변에 농축되도록 유도하거나 지혈과정에 중요하게 관여하고 있는 혈액응고인자의 활성을 촉진시킴으로서 출혈 부위의 지혈을 유도할 수 있다.

게다가 천연단백질 고분자는 수용성이면서 동물에서 유래한 것이므로 세포 혹은 조직에 부작용을 주지 않아 안전하게 사용이 가능하며, 산화 다당류는 생체 적합하고 친수성이기 때문에 인체 내 출혈 부위에 적용했을 때 지혈작용을 완료하고 일정 시간이 흐르면 체수분에 의해 생분해될 수 있다.

아울러, 칼슘화합물의 부가는 산화 다당류의 폴리머 사슬 사이에 가교 결합을 유도하여 그물 구조를 형성함으로써, 다공성의 겔 매트릭스 형태를 갖게 하며, 조직에 출혈이 발생했을 때 자연적으로 일어나는 내인성 혈액응고기작 중 트롬빈과 피브린 생성에 관여하여 지혈을 유도하는 역할을 한다.

이로써 산화 다당류, 천연단백질 및 칼슘 화합물의 혼합은 산화 다당류 사이의 가교와 산화 다당류와 천연단백질 사이의 가교, 궁극적으로는 본 발명에 따른 지혈제가 이중 가교를 가짐으로써, 출혈 부위의 혈액 흡수율과 혈액 응고 인자들의 모집(recruiment)을 촉진하여 빠른 지혈 효과를 기대할 수 있다.

또한, 상기 천연 단백질 고분자는 젤라틴, 콜라겐, 엘라스틴, 케라틴, 피브로인, 카세인, 글루테닌, 파세올린 및 알부민으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것일 수 있고, 특히 젤라틴을 더욱 바람직하게 사용한다.

상기 칼슘 화합물은 질산칼슘, 아세트산칼슘, 수산칼슘, 인산칼슘, 염화칼슘, 탄산칼슘, 산화칼슘, 황화칼슘, 브로민화칼슘, 탄화칼슘, 규산칼슘 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 염화칼슘이 이용될 수 있다.

아울러, 본 발명에 따른 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물은 프로트롬빈(prothrombin), 트롬빈(thrombin), 트랜스글루타미나제(transglutaminase), 세린 프로테아제(serine protease), 비타민 K(vitamin K), 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor), 세로토닌(serotonin), ADP(adenosine diphosphate), 트롬보플라스틴(thromboplastin), 피브리노겐(fibronogen) 및 아스코르브산(ascorbic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 지혈 촉진 성분을 추가로 포함함으로써 지혈 효과를 더욱 강화할 수 있다. 본 발명의 조성물에 지혈 촉진 성분을 추가로 포함하는 경우, 그 양에는 특별한 제한이 없으며, 지혈 촉진 성분의 종류 및 원하는 지혈효과에 따라 적절히 선택할 수 있다.

본 발명은 또한, (1) 산화제 수용액 및 다당류 수용액을 혼합한 후 산화반응을 유도하여 산화반응 혼합액을 얻는 단계; (2) 상기 산화반응 혼합액을 세척, 여과 및 건조하여 분말상의 산화 다당류를 수득하는 단계; (3) 상기 수득한 산화 다당류의 수용액 및 칼슘 화합물을 용해시킨 천연 단백질 고분자 수용액을 혼합하여 가교체를 형성하는 단계; 및 (4) 상기 가교체를 가공하는 단계;를 포함하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물의 제조방법을 제공한다.

먼저, (1) 단계에서는 산화제 수용액 및 다당류 수용액을 혼합한 후 산화반응을 유도하여 산화반응 혼합액을 얻는다.

상기 산화제는 과산화수소, 질산철, 오존, 과초산, 과망간산칼륨, 과산화모노황산 칼륨, 과산화이황산 칼륨, 과요오드산나트륨, 브롬산나트륨, 과붕산나트륨 및 과탄산나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 다당류로서는 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시에틸셀룰로오스, 하이드록시메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 덱스트린, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 알긴산, 히알루론산, 키틴, 키토산, 젤란검, 글루칸, 베타글루칸, 콘드로이틴 설페이트, 글리코겐, 녹말, 셀룰로오스, 재생셀룰로오스, 말토덱스트린, 프럭탄, 갈락탄 및 만난으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 다당류는 분자량이 10,000 내지 600,000일 수 있고, 20,000 내지 400,000인 것이 바람직하며, 50,000 내지 200,000인 것을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 분자량이 상기 하한치 미만이면 본 발명의 이중 가교구조를 갖는 지혈제의 매트릭스로 작용함에 있어서 기계적 물성이 저하될 수 있고, 분자량이 상한치를 초과하면 산화제와의 반응성이 떨어져 산화도의 증가에 한계가 생길 수 있다.

상기 (1) 단계에서는 산화제와 다당류를 각각 수용액 상태로 혼합한 후 산화반응을 수행하는바, 산화제 수용액의 몰 농도는 0.001 내지 0.05일 수 있고, 더욱 바람직하게는 0.005 내지 0.025일 수 있다. 또한, 다당류 수용액의 몰 농도는 0.005 내지 0.2일 수 있고, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 0.1일 수 있다. 상기 산화제 수용액 및 다당류 수용액의 몰 농도가 상기 범위일 때, 상기 두 수용액을 혼합하였을 때 최적의 산화반응이 일어나도록 유도할 수 있다.

이때, 상기 혼합액으로부터 산화반응을 유도하는 과정에서 빛 또는 온도에 의한 과민성 산화를 억제하기 위하여 빛이 차단된 상태로 25~30℃에서 1~96시간 동안 산화반응을 수행하는 것이 좋다.

또한, 상기 다당류 수용액의 용매는 에탄올, 이소프로필알코올, 메탄올, 아세톤, 프로파놀, 판테놀, 부탄올, 옥탄올, 헥산디올으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, (2) 단계에서는 상기 산화반응 혼합액을 세척, 여과 및 건조하여 분말상의 산화 다당류를 수득한다.

이때, 상기 세척 및 여과는 각각 2 내지 5회 수행되는 것이 바람직하다. 세척 및 여과 횟수가 2회 미만일 경우 세척되지 않은 산화제의 잔여물로 인하여 분말상 산화 다당류의 색상 변화, 점도 저하 등 변성이 일어날 수 있고, 5회 초과일 경우 산화 다당류가 수분에 노출되는 횟수가 증가하여 세척 및 여과하는 과정에서 분해될 가능성이 있다. 또한, 건조과정은 상기 세척 및 여과한 산화반응 혼합액을 -4 ~ -55℃에서 동결시킨 다음 수행하는 것이 바람직하다.

이때, 수득한 산화다당류는 산화도가 5 내지 70%일 수 있고, 10 내지 50%인 것이 바람직하며, 30 내지 50%인 것이 더욱 바람직하다. 산화도가 상기 하한치 미만이면 반응 사이트가 적어져, 천연 단백질 고분자와의 가교구조가 잘 형성되지 않아 수분 흡수력이나 지혈 효과가 떨어질 수 있고, 산화도가 상기 상한치를 초과하면 반응 사이트가 많아져서 가교도가 너무 높아지기 때문에 수분에 의해 생체 내에서 분해되는 시간이 길어질 수 있어 바람직하지 않다.

또한, 상기 수득한 산화다당류는 분자량이 1,000 내지 300,000일 수 있고, 10,000 내지 200,000인 것이 바람직하며, 20,000 내지 100,000인 것이 더욱 바람직하다. 상기 분자량이 상기 하한치 미만이면 본 발명의 이중 가교구조를 갖는 지혈제의 매트릭스로 작용함에 있어서 기계적 물성이 저하될 수 있고, 분자량이 상기 상한치를 초과하면 기계적 유연성이 떨어지고 생체 내에서 분해되는 시간이 길어지는 문제점이 발생할 수 있다.

그리고, (3) 단계에서는 상기 수득한 산화 다당류의 수용액 및 칼슘 화합물을 용해시킨 천연 단백질 고분자 수용액을 혼합하여 가교체를 형성한다.

상기 천연 단백질 고분자는 젤라틴, 콜라겐, 엘라스틴, 케라틴, 피브로인, 카세인, 글루테닌, 파세올린 및 알부민으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것일 수 있고, 특히 젤라틴을 더욱 바람직하게 사용한다.

또한, 상기 산화 다당류 수용액과 천연 단백질 고분자 수용액은 30~37℃에서 제조 및 보관하는 것이 좋다. 이때, 상기 산화 다당류 수용액의 농도는 1 내지 50 중량%인 것이, 천연 단백질 고분자 수용액의 농도는 1 내지 30 중량%인 것이 바람직하다.

또한, 상기 천연 단백질 고분자 수용액 및 산화 다당류 수용액은 1 : 1 ~ 9의 중량비로 혼합되는 것이 바람직하다.

상기 칼슘화합물은 천연단백질 고분자 수용액에 용해시킨 상태로 사용하며, 이때 칼슘화합물의 함량은 상기 산화다당류 수용액 고형분의 4 내지 20중량%인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 5 내지 15중량%, 가장 바람직하게는 5 내지 10 중량%이다.

다음으로, (4) 단계에서는 상기 (3) 단계에서 얻은 가교체를 가공한다. 구체적으로는 상기 가교체를 지혈부위와 적용 양태에 따라 여러 가지 형태로 가공함으로써, 본 발명에 따른 흡수성 체내 분해 가능 지혈제를 제조할 수 있는바, 공지의 가공방법에 따라 분말, 졸, 겔, 부직포, 직물 또는 스펀지 형태로 다양하게 제조할 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물에 대해 실시예를 들어 상세히 설명하기로 한다.

제조예

제조예 1 내지 3: 산화 다당류 분말의 제조

하기 표 1에 나타낸 바와 같은 산화제 수용액과 다당류(분자량 100,000) 수용액을 빛이 차단된 진탕 배양기를 사용하여 25℃에서 4시간 혼합함으로써 산화반응 혼합액을 얻었다. 상기 산화반응 혼합액을 에탄올로 2회 세척, 여과 및 건조하는 일련의 과정을 거쳐 산화 다당류 분말을 제조하였다.

제조예	산화제 수용액	다당류 수용액
제조예 1	0.005 mol 과요오드산나트륨	0.05 mol 알긴산
제조예 2	0.015 mol 과요오드산나트륨	0.05 mol 알긴산
제조예 3	0.025 mol 과요오드산나트륨	0.05 mol 알긴산

상기 표 1에 따라 제조한 산화 다당류를 요오드 적정법을 이용하여 산화도를 측정한 결과, 하기 표 2에 나타난 것과 같이 각각 서로 다른 산화도를 나타내었다.

제조예	제조예 1		제조예 2		제조예 3
시간 (hour)	적정액 소요량 (ml)	산화도(%)	적정액 소요량 (ml)	산화도(%)	적정액 소요량 (ml)	산화도(%)
Empty	0.5		1.4		2.2
0	0.5	0.00	1.3	5.48	2	10.96
4	0.3	10.96	0.9	27.41	1.3	49.34

도 1은 상기 제조예 1 내지 3으로부터 제조된 산화알긴산의 산화도에 따른 점도 변화를 나타낸 그래프이다. 산화제에 의해 다당류가 산화되면 지방족 고리 구조가 열리면서(ring-opening) 다당류의 히드록시기가 알데히드기로 변하는데, 산화도가 높을수록 다당류의 알데히드기 형성이 많이 일어남으로 인해 분자량이 감소하면서 도 1에서 보는 바와 같이 점도가 감소하는 것을 확인할 수 있다.

또한, 상기 제조예 1의 산화 알긴산은 분자량이 89,000이었고, 제조예 2의 산화 알긴산은 분자량이 72,300이었으며, 제조예 3의 산화 알긴산은 분자량이 50,400인 것을 확인하였다.

제조예 4 내지 12: 산화 다당류와 천연 단백질 고분자로 이루어진 지혈제 조성물의 제조

상기 제조예 1 내지 3으로부터 제조된 산화도가 상이한 산화 알긴산 분말을 생리식염수에 용해시켜 10 중량% 산화 알긴산 수용액을 얻었다. 또, 생리식염수에 용해시킨 10 중량% 젤라틴 수용액을 얻었다.

상기 산화 알긴산 수용액과 젤라틴 수용액을 37 ℃에서 1:1, 3:1, 9:1의 중량 비율로 혼합 및 교반하여 가교체를 형성하였고, 이 가교체는 자체로써 겔을 형성하므로 추가적인 형태 가공을 하지 않았다.

제조예	혼합비	산화 다당류 수용액(산화도)	천연 단백질 고분자 수용액
제조예 4	1:1	10 중량% 산화 알긴산(10.96%)	10 중량% 젤라틴
제조예 5	3:1
제조예 6	9:1
제조예 7	1:1	10 중량% 산화 알긴산(27.41%)	10 중량% 젤라틴
제조예 8	3:1
제조예 9	9:1
제조예 10	1:1	10 중량% 산화 알긴산(49.34%)	10 중량% 젤라틴
제조예 11	3:1
제조예 12	9:1

도 2는 본 발명의 제조예 4 내지 12로부터 제조된 지혈제에서, 산화 알긴산의 산화도, 산화 알긴산 수용액과 젤라틴 수용액의 비율에 따른 겔화 시간(gelling time)의 차이를 나타내는 그래프이다. 가교 반응 초기에는 졸 상태였다가 가교 구조가 본격적으로 형성되면서 점도가 올라가 겔을 형성하는 겔화(gelation) 현상이 일어난다. 도 2에서 보는 바와 같이, 산화 알긴산의 산화도가 높을수록, 산화 알긴산의 비율이 높을수록 천연단백질인 젤라틴의 아민기와 결합할 수 있는 결합기인 알데히드기가 증가하기 때문에 가교되어 겔화되는데 걸리는 시간이 짧아지는 것을 알 수 있다.

도 3은 본 발명의 제조예 4 내지 12로부터 제조된 겔형태의 지혈제에 있어서 산화 알긴산의 산화도 및 산화 알긴산과 젤라틴의 비율에 따른 수분흡수율을 나타낸 그래프이다. 산화제에 의해 다당류가 산화되면 지방족 고리 구조가 열리면서(ring-opening) 다당류의 히드록시기가 알데히드기로 변하는데, 산화 알긴산의 양이 많아질수록 젤라틴의 아민기와 결합할 수 있는 결합기인 알데히드기가 많아져, 산화 알긴산이 젤라틴의 아민기와 결합력이 증가하여 가교 결합을 많이 형성한다. 이에, 산화 알긴산의 비율이 높을수록 수분을 흡수할 수 있는 능력이 증가하여 수분흡수율이 증가한다. 한편, 산화도가 높을수록 수분흡수율은 감소하는데 이는 산화도가 높을수록 분자량과 물리적 강도는 감소하기 때문에 젤라틴과 가교결합을 많이 형성하더라도 수분을 많이 흡수하지 못하고, 빠르게 분해된다.

도 4는 본 발명의 제조예 4 내지 12로부터 제조된 겔 형태의 지혈제에 있어서 수분에 노출되었을 때 산화 알긴산의 산화도에 따른 분해도를 나타낸 그래프이다. 산화 알긴산의 산화도가 높을수록 산화 알긴산의 분자량 감소로 물리적 강도가 저하되어 수분에 의한 가수분해 속도가 빠르게 나타나는 것을 확인되었다. 산화도가 10 내지 30%인 경우, 7일 이내에 분해되고 40% 이상이면 3일 이내에 분해된다.

도 5는 본 발명의 제조예 4 내지 12로부터 제조된 겔 형태의 지혈제에 있어서 수분에 노출되었을 때 산화 알긴산과 젤라틴의 비율에 따른 분해도를 나타낸 그래프이다. 산화 알긴산의 비율이 증가할수록 수분에 의한 가수분해 속도가 느리게 나타나는 것을 확인하였다. 이는 산화 알긴산의 비율이 증가할수록 젤라틴의 아민기와 가교결합할 수 있는 결합기인 알데히드기의 양이 증가로 산화 알긴산과 젤라틴 사이에 가교 결합이 많이 형성되어 산화 알긴산의 비율이 낮은 것에 상대적으로 느리게 분해된다. 산화 알긴산의 비율이 낮은 경우(1:1) 3일 이내 분해되고, 산화 알긴산 비율이 높은 경우 (9:1) 7일 이내 분해되었다.

실시예

실시예 1 내지 9: 산화다당류, 천연단백질고분자 및 칼슘화합물로 이루어진 지혈제 조성물의 제조

상기 제조예 4 내지 12로부터 제조된 지혈제에 칼슘화합물인 염화칼슘을 부가하여 산화 알긴산, 젤라틴 및 염화칼슘으로 이루어진 지혈제를 제조하고자 하였다. 이때, 염화칼슘은 산화 알긴산 고형분의 4 중량%가 되도록 젤라틴 수용액에 부가하였고, 산화 알긴산 수용액, 및 염화칼슘이 부가된 젤라틴 수용액을 1:1, 3:1, 9:1의 중량 비율로 혼합 및 교반하여 가교체를 형성하였고, 가교체 자체로써 겔을 형성하므로 추가적인 형태 가공을 하지 않았다.

도 6은 본 발명의 실시예 1 내지 9로부터 제조된 겔 형태의 지혈제에 산화 알긴산 수용액과 젤라틴 수용액을 혼합 및 교반하는 과정에서 산화 알긴산의 산화도, 산화 알긴산과 젤라틴 수용액의 비율에 따라 겔을 형성하는 시간인 겔화 시간(gelling time)을 나타낸 그래프이다. 도 6에서 보는 바와 같이, 산화 알긴산의 산화도가 높을수록, 산화 알긴산의 비율이 높을수록 겔화되는데 걸리는 시간이 짧아지는 것을 알 수 있다. 또한, 도 2의 본 발명의 제조예 4 내지 12로부터 제조된 겔 형태의 지혈제보다 염화칼슘이 부가된 실시예 1 내지 9로부터 제조된 겔 형태의 지혈제가 겔화 시간이 30초 이내로 단축된 것을 확인하였다. 이는 염화칼슘의 부가로 산화 알긴산과 젤라틴 사이의 가교 결합에 추가적으로 산화 알긴산 사이에 가교결합이 형성된 결과로 겔화 시간이 단축된 것이다.

도 7에는 본 발명의 실시예 1 내지 9로부터 제조된 겔 형태의 지혈제에 있어서 산화 알긴산의 산화도에 따른 수분흡수율과 산화 알긴산과 젤라틴의 비율에 따른 수분흡수율을 나타낸 그래프이다. 도 7에서 보는 바와 같이, 산화 알긴산의 비율이 높을수록 수분을 흡수할 수 있는 능력이 증가하여 수분흡수율이 증가한다. 한편, 산화도가 높을수록 수분흡수율은 감소하는데 젤라틴과 가교 결합을 많이 형성하더라도 수분을 많이 흡수하지 못하고, 빠르게 분해되기 때문이다. 또한, 도 3의 본 발명의 제조예 4 내지 12로부터 제조된 겔 형태의 지혈제보다 염화칼슘이 부가된 실시예 1 내지 9로부터 제조된 겔 형태의 지혈제가 수분흡수율이 2배 이상 증가한 것을 확인할 수 있는데, 이는 염화칼슘의 부가로 산화 알긴산과 젤라틴 사이의 가교 결합에 산화 알긴산 사이에 추가적인 가교 결합이 형성된 결과로 가교 구조 사이로 더 많은 수분을 흡수할 수 있는 것으로 나타난다.

도 8은 본 발명의 실시예 1 내지 9로부터 제조된 겔 형태의 지혈제에 있어서 수분에 노출되었을 때 산화도에 따른 분해도를 나타낸 그래프이다. 산화 알긴산(다당류)의 산화도가 높을수록 산화 알긴산(다당류)의 분자량 감소로 물리적 강도가 저하되어 수분에 의한 가수분해 속도가 빠르게 나타나는 것이 확인되었다. 산화도가 10 내지 30%인 경우 14일 내지 21일 사이에 분해되고, 40% 이상이면 7일 이내에 분해된다. 또한, 도 4의 본 발명의 제조예 4 내지 12로부터 제조된 겔 형태의 지혈제는 산화도가 10 내지 30%인 경우 7일 이내에 분해되고 40% 이상이면 3일 이내에 분해되는데 비해 염화칼슘이 부가된 실시예 1 내지 9로부터 제조된 겔 형태의 지혈제는 분해속도가 제조예 4 내지 12로부터 제조된 겔 형태의 지혈제보다 4일 내지 14일 정도 느리게 나타나는 것을 확인할 수 있는데, 이는 염화칼슘의 부가로 산화 알긴산과 젤라틴 사이의 가교결합에 산화 알긴산 사이에 추가적인 가교결합이 형성된 결과이다.

도 9에는 본 발명의 실시예 1 내지 9로부터 제조된 겔 형태의 지혈제에 있어서 수분에 노출되었을 때 산화 알긴산과 젤라틴의 비율에 따른 분해도를 나타낸 그래프이다. 산화 알긴산의 비율이 증가할수록 수분에 의한 가수분해 속도가 느리게 나타나는 것을 확인하였다. 이는 산화 알긴산의 비율이 증가할수록 젤라틴의 아민기와 가교결합할 수 있는 결합기인 알데히드기의 양이 증가로 산화 알긴산과 젤라틴 사이에 가교 결합이 많이 형성되어 산화 알긴산의 비율이 낮은 것에 상대적으로 느리게 분해된다. 산화 알긴산의 비율이 낮은 경우(1:1) 3일 내지 7일 이내 분해되고, 산화 알긴산 비율이 높은 경우 (9:1) 14일 내지 21 이내 분해되었다. 또한, 도 5의 본 발명의 제조예 4 내지 12로부터 제조된 겔 형태의 지혈제는 산화 알긴산의 비율이 낮은 경우(1:1) 3일 이내 분해되고, 산화 알긴산 비율이 높은 경우 (9:1) 7일 이내 분해되는 반면, 염화칼슘이 부가된 실시예 1 내지 9로부터 제조된 겔 형태의 지혈제는 제조예 4 내지 12로부터 제조된 겔 형태의 지혈제보다 4일 내지 14일 정도 분해속도가 느린 것을 확인할 수 있는데, 이는 염화칼슘의 부가로 산화 알긴산과 젤라틴 사이의 가교결합에 산화 알긴산 사이에 추가적인 가교결합이 형성된 결과이다.

도 10에는 본 발명의 실시예 1 내지 9로부터 제조된 겔 형태의 지혈제 중 7일 이상 14일 이내로 분해되는 산화도 27.41%를 가지는 산화 알긴산을 함유하는 실시예 4 내지 6으로부터 제조된 겔 형태의 지혈제의 세포독성을 확인한 그래프를 나타내었다. 도 10에서 보는 바와 같이 음성대조군 PE를 비롯하여 실시예 4 내지 6에 해당하는 OA(산화 알긴산) : G(젤라틴) = 1 : 1, 3 : 1, 9 : 1 모두 세포생존율이 80% 이상인 것으로 나타났으며, 잠재적으로 세포독성이 없음을 확인하였다.

비교예 1 및 2 : 산화 다당류와 천연 단백질 고분자 및 천연 효소 가교제로 이루어진 지혈제 조성물의 제조

산화제 수용액(5 중량%, 10 중량% 과요오드산나트륨)과 다당류 수용액(10 중량%, 15중량% 키토산)을 빛이 차단된 진탕 배양기를 사용하여 25℃에서 24시간 혼합함으로써(중량비 2:8), 산화반응 혼합액을 얻었다. 상기 산화반응 혼합액을 에탄올로 3회 세척, 여과 및 건조하는 일련의 과정을 거쳐 산화도가 각각 약 10%, 35%에 해당하는 산화 다당류 분말을 제조하였다. 상기 산화도가 상이한 산화 다당류 분말을 생리식염수에 용해시켜 20 중량% 산화 키토산 수용액을 얻었다. 또한, 젤라틴 및 트랜스글루타미나아제를 각각 생리식염수에 용해시켜 각각의 수용액을 얻었다(30 중량% 젤라틴 수용액, 50 중량% 트랜스글루타미나아제 수용액). 이어서 상기 각 수용액을 37℃에서 1: 1: 1의 용량비로 혼합 및 교반하여 가교체를 형성하였고, 겔 형태의 지혈제로 가공하였다(대한민국 공개특허 공보 제10-2017-0007024호 참고).

도 11은 본 발명의 비교예와 실시예에 따른 지혈제 조성물의 겔화 시간(A)과 수분흡수율(B)을 비교한 그래프이다. 도 11에서 보는 바와 같이 산화키토산(각각의 산화도 약 10%, 30%(35%))과 젤라틴, 트랜스글루타미나아제를 1:1:1의 비율로 혼합한 비교예 1 및 비교예 2에 비해 산화 알긴산(각각의 산화도 약 10%(10.96%), 30%(27.41%))과 젤라틴(+염화칼슘)을 1:1(+염화칼슘 4%)의 비율로 혼합한 실시예 4 및 실시예 7이 겔화시간이 현저히 빠르게 나타났고, 수분흡수율은 더욱 높게 나타났다. 비슷한 산화도를 가지는 산화 다당류와 젤라틴을 제외한 차이는 천연 효소 가교제인 트랜스글루타미나아제와 칼슘화합물인 염화칼슘의 부가 여부의 결과로, 트랜스글루다미나아제보다 염화칼슘을 부가하였을 때 산화 다당류와 젤라틴 사이의 이중가교형성을 빠르게 형성함으로써 수분을 더 많이 흡수할 수 있음을 확인하였다. 또한, 이는 염화칼슘을 부가한 제품을 출혈 부위에 적용하였을 때 흐르는 혈액을 빠르게 흡수하여 지혈을 유도할 수 있음으로 해석할 수 있다.

실시예 10 내지 18: 산화다당류와 천연단백질고분자 및 칼슘화합물로 이루어진 스폰지 제형의 지혈제 제조

하기 표 4에 나타낸 바와 같이 산화도 27.41%를 나타내는 산화 알긴산을 생리식염수에 용해시켜 10중량%, 5중량%, 2중량% 산화 알긴산 수용액을 얻고, 젤라틴 분말을 생리식염수에 용해시킨 10중량%, 5중량%, 2중량% 젤라틴 수용액을 얻어 1:1, 3:1, 9:1의 중량 비율로 혼합 및 교반하여 가교체를 형성였다. 이때, 젤라틴 수용액에는 산화 알긴산 고형분의 4%에 해당되는 양의 염화칼슘을 첨가하였다. 또한, 이 가교체를 -4℃에서 동결한 후 -55℃에서 진공으로 동결건조하여 스폰지 제형의 지혈제로 가공하였다.

실시예	혼합비	산화 다당류 수용액(산화도)	천연 단백질 고분자 수용액
실시예 10	1:1	10 중량% 산화 알긴산(27.41%)	10 중량% 젤라틴
실시예 11	3:1
실시예 12	9:1
실시예 13	1:1	5 중량% 산화 알긴산(27.41%)	5 중량% 젤라틴
실시예 14	3:1
실시예 15	9:1
실시예 16	1:1	2 중량% 산화 알긴산(27.41%)	2 중량% 젤라틴
실시예 17	3:1
실시예 18	9:1

도 12는 실시예 10 내지 12로부터 제조된 스폰지 제형의 지혈제로, 스폰지를 함유된 고형분 양이 높아 표면이 부드럽지 않고 딱딱하며, 유연성이 나타나지 않으며, 스폰지 중량의 30배에 달하는 수분에 노출되었을 때 부피가 증가하는 현상을 보였다.

도 13은 실시예 13 내지 15로부터 제조된 스폰지 제형의 지혈제로, 실시예 10 내지 12로부터 제조된 스폰지 제형의 지혈제보다 유연성은 있지만 표면이 부드럽지 않고 거칠며, 스폰지 중량의 30배에 달하는 수분에 노출되었을 때 물리적 형태를 유지하지 못하고 풀어지는 현상을 보였다.

도 14는 실시예 16 내지 18로부터 제조된 스폰지 제형의 지혈제로 실시예 10 내지 15로부터 제조된 스폰지 제형의 지혈제보다 훨씬 유연성이 있고, 표면이 부드럽지만, 스폰지 중량의 30배에 달하는 수분에 노출되었을 때 구조적 형태를 유지하지 못하고 풀어져 분해되는 현상을 보였다.

이에 따라, 상기 실시예 16 내지 18로부터 제조된 지혈제의 경우 부드러움과 유연성을 살리면서 구조적 형태를 유지시키기 위해 각각 4%, 5%, 10% 염화칼슘을 부가하였다. 그 결과, 염화칼슘의 양이 증가할수록 스폰지 중량의 30배에 달하는 수분에 노출되었을 때에도 높은 수분 흡수율을 유지하면서 구조적 형태의 유지가 잘 되는 것을 확인하였다.

도 15는 본 발명의 산화 알긴산, 젤라틴, 염화칼슘으로 이루어진 스폰지 제형의 지혈제의 산화 알긴산 및 염화칼슘 함량에 따른 수분 흡수율을 나타내는 그래프이다.

도 15에 보는 바와 같이 산화 알긴산, 젤라틴, 염화칼슘으로 이루어진 스폰지 제형의 지혈제가 임상에서 널리 사용하고 있는 C사의 스폰지 제형의 지혈제(주로 콜라겐으로 구성됨)보다 수분흡수율이 높게 나타났고, 산화 알긴산의 양이 증가할수록, 염화칼슘의 양이 증가할수록 수분흡수율도 증가하는 것을 확인하였다.

하기 표 5에는 산화 알긴산과 젤라틴 비율이 3 : 1이며 10% 염화칼슘을 부가하여 제조한 겔형태 및 스폰지 형태의 지혈제를, 랫트 대동맥 손상 출혈 유도 모델에 적용했을 때의 평균 지혈 시간을 측정한 결과를 나타내었다. 하기 표 5 및 도 15에서 'OA'는 산화 알긴산을, 'G'는 젤라틴을, 'C'는 염화칼슘을 나타낸다.

구분	평균 지혈시간
멸균 거즈 압박지혈	67.8 sec
제품 비교 대조군 (A사 제품) - 겔형태	50.1 sec
제품 비교 대조군 (B사 제품) - 스폰지 형태	51 sec
OA : G (+C) = 3 : 1 (10%) - 겔형태	33.6 sec
OA : G (+C) = 3 : 1 (10%) - 스폰지 형태	39.5 sec

상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 전통적으로 널리 사용되어왔던 지혈 방법인 멸균 거즈를 이용한 압박지혈을 하였을 때 67.8초라는 평균 지혈 시간이 소요됨을 확인하였다. 또한, 본 발명에서 지혈제 제조에 사용한 알긴산 외 다른 종류의 다당류인 콜라겐 또는 산화재생셀룰로오즈를 원재료로 사용하여 임상에서 널리 사용되는 지혈용품인 A사 및 B사 제품은 각각 50초, 51초의 시간이 소요되는 반면, 본 발명을 통해 산화 알긴산, 젤라틴 및 염화칼슘으로 제조된 지혈제의 경우 겔 형태는 33.6초, 스폰지 형태는 39.5초로, 지혈 시간이 멸균거즈, A사, B사 제품보다 빠른 것을 확인하였다.

한편, 랫트 대동맥 손상 출혈 유도 모델에서 지혈시간을 확인한 다음, 봉합실을 이용하여 일반적인 방법으로 봉합한 후, 0, 3, 28일 후에 염증과 관련하여 조직분석을 수행하였다. 염증정도에 따라 염증없음-0, 경도-1, 중증도-2, 심각-3으로 점수화하였을 때, 멸균거즈를 이용하여 압박지혈을 수행한 실험군에서는 평균 염증정도가 다른 실험군에 비해 28일까지 높게 나타났고, 다른 실험군에서는 수술 당일 높게 나타났으나, 염증도가 1 내지 2 사이로 심각한 염증정도가 아닌 상처 치유동안 자연스럽게 나타날 수 있는 염증 정도로, 시간이 지날수록 감소하는 것을 확인하였다. 그 와중에도, 본 발명을 통해 산화 알긴산, 젤라틴, 염화칼슘으로 제조된 지혈제는 멸균거즈, 임상적으로 널리 이용되고 있는 A사 지혈제(산화 재생 셀룰로스로 구성됨) 및 B사 지혈제(콜라겐 및 트롬빈으로 구성됨) 보다 염증정도가 낮은 것을 확인하였다(도 16 참조).

그러므로, 본 발명에 따라 제조된 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제는 생체 내 분해가 가능하여 생체친화성이 우수할 뿐만 아니라, 세포 혹은 조직에 독성이 없고 높은 체수분 흡수력과 뛰어난 지혈 작용으로 빠르게 출혈을 막을 수 있어, 의료용 지혈제로서 응용이 기대된다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (22)

1. 산화 다당류; 천연 단백질 고분자; 및 칼슘화합물을 포함하는, 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 산화 다당류는 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시에틸셀룰로오스, 하이드록시메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 덱스트린, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 알긴산, 히알루론산, 키틴, 키토산, 젤란검, 글루칸, 베타글루칸, 콘드로이틴 설페이트, 글리코겐, 녹말, 셀룰로오스, 재생셀룰로오스, 말토덱스트린, 프럭탄, 갈락탄 및 만난으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 다당류의 산화물인 것을 특징으로 하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 산화 다당류는 분자량이 1,000 내지 300,000인 것을 특징으로 하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 산화 다당류는 산화도가 5 내지 70%인 것을 특징으로 하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   상기 천연 단백질 고분자는 젤라틴, 콜라겐, 엘라스틴, 케라틴, 피브로인, 카세인, 글루테닌, 파세올린 및 알부민으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물.
6. 제1항에 있어서,
   상기 칼슘화합물은 질산칼슘, 아세트산칼슘, 수산칼슘, 인산칼슘, 염화칼슘, 탄산칼슘, 산화칼슘, 황화칼슘, 브로민화칼슘, 탄화칼슘, 규산칼슘 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물.
7. 제1항에 있어서,
   상기 산화 다당류는 산화 알긴산이고, 상기 천연 단백질 고분자는 젤라틴이며, 상기 칼슘화합물은 염화칼슘인 것을 특징으로 하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물.
8. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 프로트롬빈(prothrombin), 트롬빈(thrombin), 트랜스글루타미나제(transglutaminase), 세린 프로테아제(serine protease), 비타민 K(vitamin K), 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor), 세로토닌(serotonin), ADP(adenosine diphosphate), 트롬보플라스틴(thromboplastin), 피브리노겐(fibronogen) 및 아스코르브산(ascorbic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 지혈 촉진 성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물.
9. (1) 산화제 수용액 및 다당류 수용액을 혼합한 후 산화반응을 유도하여 산화반응 혼합액을 얻는 단계;
   (2) 상기 산화반응 혼합액을 세척, 여과 및 건조하여 분말상의 산화 다당류를 수득하는 단계;
   (3) 상기 수득한 산화 다당류의 수용액, 및 칼슘 화합물을 용해시킨 천연 단백질 고분자 수용액을 혼합하여 가교체를 형성하는 단계; 및
   (4) 상기 가교체를 가공하는 단계;를 포함하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물의 제조방법.
10. 제9항에 있어서,
    (1) 단계에서의 다당류는 분자량이 10,000 내지 600,000인 것을 특징으로 하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물의 제조방법.
11. 제9항에 있어서,
    (1) 단계에서의 산화제는 과산화수소, 질산철, 오존, 과초산, 과망간산칼륨, 과산화모노황산 칼륨, 과산화이황산 칼륨, 과요오드산나트륨, 브롬산나트륨, 과붕산나트륨 및 과탄산나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물의 제조방법.
12. 제9항에 있어서,
    (1) 단계에서의 다당류 수용액의 용매는 에탄올, 이소프로필알코올, 메탄올, 아세톤, 프로파놀, 판테놀, 부탄올, 옥탄올, 헥산디올으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물의 제조방법.
13. 제9항에 있어서,
    (1) 단계에서의 다당류 수용액의 몰 농도는 0.005 내지 0.2인 것을 특징으로 하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물의 제조방법.
14. 제9항에 있어서,
    (1) 단계에서의 산화제 수용액의 몰 농도는 0.001 내지 0.05인 것을 특징으로 하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물의 제조방법.
15. 제9항에 있어서,
    (1) 단계에서의 산화반응은 빛이 차단된 상태로 25~30℃에서 1~96시간 동안 반응시키는 것을 특징으로 하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물의 제조방법.
16. 제9항에 있어서,
    (2) 단계에서의 세척 및 여과는 각각 2 내지 5회 수행되는 것을 특징으로 하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물의 제조방법.
17. 제9항에 있어서,
    (2) 단계에서의 건조는 상기 세척 및 여과한 산화반응 혼합액을 -4 ~ -55℃에서 동결시킨 후 수행되는 것을 특징으로 하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물의 제조방법.
18. 제9항에 있어서,
    (2) 단계에서 수득한 산화 다당류의 산화도는 5 내지 70%이고, 분자량은 1,000 내지 300,000인 것을 특징으로 하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물의 제조방법.
19. 제9항에 있어서,
    (3) 단계에서의 산화 다당류 수용액의 농도는 1 내지 50 중량%이고, 상기 천연 단백질 고분자 수용액의 농도는 1 내지 30 중량%인 것을 특징으로 하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물의 제조방법.
20. 제9항에 있어서,
    (3) 단계에서의 상기 천연 단백질 고분자 수용액 및 산화 다당류 수용액은 1 : 1 ~ 9의 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물의 제조방법.
21. 제9항에 있어서,
    (3) 단계에서의 천연 단백질 고분자 수용액에 포함된 칼슘화합물의 함량은 상기 산화 다당류 수용액 고형분 중량의 4 내지 20 중량%인 것을 특징으로 하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물의 제조방법.
22. 제9항에 있어서,
    (4) 단계에서의 가교체는 분말, 졸, 겔, 부직포, 직물 또는 스펀지 형태로 가공되는 것을 특징으로 하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 조성물의 제조방법.

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