WO2017014450A1 - 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 및 그 제조방법 - Google Patents

이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 및 그 제조방법 Download PDF

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WO2017014450A1
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biocompatible
cellulose
double
polysaccharide
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PCT/KR2016/007226
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이영우
임소연
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(주)헵틸와이
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Definitions

  • the present invention relates to a biocompatible hemostatic agent having a double crosslinked structure and a method for producing the same, and more particularly, to a hemostatic agent having a double crosslinked structure including an oxidized polysaccharide having a biocompatibility, a natural protein polymer, and a natural enzyme crosslinking agent and a method for producing the same. It is about.
  • hemostatic agents can be defined as drugs used for the purpose of stopping bleeding against bleeding symptoms, and are important surgical medical supplies that can be applied to light bleeding from abrasions and large bleeding caused by various reasons such as surgery and accidents. This can be called.
  • hemostatic process occurring in the human body is very physiologically complex and there is a limit to stop bleeding completely.
  • physiological and chemical hemostatic function that functions naturally in the human body cannot prevent bleeding completely, so make sure to use hemostatic agent. Will be.
  • hemostatic agents are applied to various wounds such as cuts, cuts, lacerations, and bleeding caused by artificial surgery, and thus the shapes of powders, gels, sponges, dressings, etc. vary depending on the applied site and type of wound. Methods and principles of action also vary. Therefore, as a hemostatic agent, not only complete hemostasis and wound healing should be possible, but when applied to the human body, there should be no side effects such as fever or inflammation, and toxicity when applied to the human body.
  • oxidized regenerated cellulose made by oxidizing absorbed cellulose (Oxidized Regenerated Cellulose, ORC).
  • ORC oxidizing absorbed cellulose
  • the hemostatic principle of this hemostatic agent is to participate in the blood coagulation process in vivo, and to swell when the blood comes into contact with the bleeding site, covering the bleeding site, thereby constricting the tissue around the blood vessel and bleeding.
  • oxidized regenerated cellulose has a problem in that it can denature the activity of blood coagulation factors such as thrombin and fibrinogen that are acidic during hemostasis and are involved in the blood coagulation process (Patent Document 1).
  • hemostatic agents have excellent hemostatic effects, but when applied to the human body, they cause side effects such as burn-like fever on the surrounding tissues of the application area or occlusive thrombus or endothelial cytotoxicity in damaged blood vessels. There have been reports of cases of discontinuation of use.
  • some of the hemostatic agents in powder form is not suitable for surgical operation because it is not easy to remove after application of the bleeding site because there is no biodegradation.
  • the cross-linked structure of the double cross-linked structure can be produced, it is possible to disintegrate in vivo and provide excellent biocompatibility, and it is not toxic to cells or tissues and provides a hemostatic agent that can prevent bleeding quickly due to high body water absorption and hemostatic effect. Focusing on the completion of the present invention Reached.
  • Patent Document 1 Korean Patent Publication No. 10-2014-0086072
  • Patent Document 2 Korean Patent Publication No. 10-2009-0028690
  • Patent Document 3 Korean Laid-Open Patent Publication No. 10-2006-0072643
  • the present invention has been devised in view of the above problems, and the object of the present invention is not only to be excellent in biocompatibility because it can be degraded in vivo, but also to be toxic to cells or tissues, and to have high body moisture absorption and excellent hemostatic action. It is to provide a biocompatible haemostatic agent having a double crosslinked structure capable of preventing bleeding and a method of manufacturing the same.
  • the present invention for achieving the above object is an oxidized polysaccharide; Natural protein polymers; And it provides a bio-compatible hemostatic agent of a double cross-linked structure comprising a natural enzyme cross-linking agent.
  • the oxidized polysaccharides include oxidized carboxymethyl cellulose, carboxyethyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, dextrin, dextran, dextran sulfate, alginic acid, hyaluronic acid, chitin, chitosan, gellan gum, glucan, betaglucan, At least one member selected from the group consisting of chondroitin sulfate, glycogen, starch, cellulose, regenerated cellulose, maltodextrin, fructan, galactan and mannan.
  • the oxidized polysaccharide is characterized in that the molecular weight of the polysaccharide before oxidation is 1,000 to 100,000.
  • the oxidized polysaccharide is characterized in that the oxidation degree of 5 to 70%.
  • the natural protein polymer is characterized in that at least one selected from the group consisting of gelatin, collagen, elastin, keratin, fibroin, casein, glutenin, paceolin and albumin.
  • the natural enzyme crosslinkers include transglutaminase, sortase A, subtilisin, tyrosinase, laccase, horse raddish peroxidase, amine oxidase and lysyloxidase. It is characterized by one or more selected from the group consisting of.
  • the biocompatible hemostatic agent of the double cross-linked structure is characterized in that it further comprises thrombin, fibrinogen or a mixture thereof.
  • the present invention comprises the steps of I) mixing an oxidizing agent solution and a polysaccharide solution to obtain an oxidation reaction mixture; II) washing the oxidation reaction mixture several times with ethanol, filtration and drying to obtain a powdered oxidized polysaccharide; III) mixing a powdered aqueous polysaccharide solution, a natural protein polymer solution and a natural enzyme crosslinker solution to form a crosslinked product; And IV) processing the crosslinked body into various forms. It provides a biocompatible haemostatic agent having a double crosslinked structure comprising a.
  • the oxidizing agent is at least one selected from the group consisting of hydrogen peroxide, iron nitrate, ozone, peracetic acid, potassium permanganate, potassium persulfate, potassium persulfate, sodium periodate, sodium bromide, sodium perborate and sodium percarbonate It is done.
  • the polysaccharides are carboxymethyl cellulose, carboxyethyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, dextrin, dextran, dextran sulfate, alginic acid, hyaluronic acid, chitin, chitosan, gellan gum, glucan, betaglucan, chondroitin sulfate, At least one member selected from the group consisting of glycogen, starch, cellulose, regenerated cellulose, maltodextrin, fructan, galactan and mannan.
  • the oxidation reaction is characterized in that it is carried out for 1 to 96 hours at 25 ⁇ 30 °C in the light blocked state.
  • the crosslinked product is characterized in that it is processed in the form of a powder, sol, gel, nonwoven, woven or sponge.
  • the biocompatible hemostatic agent of the double-crosslinked structure prepared according to the present invention can be decomposed in vivo and not only excellent in biocompatibility, but also nontoxic to cells or tissues, and can quickly prevent bleeding due to high body water absorption and excellent hemostatic action. have.
  • FIG. 1 is a graph showing the gel formation time according to the degree of oxidation of the polysaccharide in the double-crosslinked biocompatible haemostatic agent prepared from Examples 1 to 3 of the present invention.
  • Figure 2 is a graph showing the water absorption and decomposition degree according to the oxidation degree of the polysaccharide in the double-crosslinked biocompatible hemostatic agent prepared from Examples 1 to 3 of the present invention.
  • Figure 3 is a graph showing the gel formation time according to the content of the natural enzyme crosslinking agent in the biocompatible hemostatic agent of the double cross-linked structure prepared from Examples 1, 4 and 5 of the present invention.
  • Figure 4 is a graph showing the water absorption and decomposition degree according to the content of the natural enzyme crosslinking agent in the biocompatible hemostatic agent of the double cross-linked structure prepared from Examples 1, 4 and 5 of the present invention.
  • the present invention is an oxidized polysaccharide; Natural protein polymers; And it provides a bio-compatible hemostatic agent of a double cross-linked structure comprising a natural enzyme cross-linking agent.
  • the oxidized polysaccharides include carboxymethyl cellulose, carboxyethyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, dextrin, dextran, dextran sulfate, alginic acid, hyaluronic acid, chitin, chitosan, gellan gum, glucan, betaglucan, It means that one or more polysaccharides selected from the group consisting of chondroitin sulfate, glycogen, starch, cellulose, regenerated cellulose, maltodextrin, fructan, galactan and mannan are oxidized by oxidation.
  • the hydroxyl group of the polysaccharide is changed to an aldehyde group by ring-opening the aliphatic ring structure.
  • the aldehyde groups of the oxidized polysaccharides react with the amine groups of the natural protein polymer to form a primary crosslinked structure having imine bonds.
  • natural protein polymer is a fibrous protein of animal and takes up 30% of the protein constituting the human body, so it is biocompatible and has excellent water absorption ability, so when combined with oxidized polysaccharide and applied to the bleeding site It can induce the hemostasis of the bleeding site by absorbing the water to induce platelets to concentrate around the damaged blood vessels or promote the activity of the coagulation factor, which is important in the hemostasis process.
  • oxidized polysaccharides are hydrophilic, when applied to bleeding sites in the human body, hemostasis is completed and after a certain time, they can be degraded by water in the body, and since natural protein polymers are water-soluble and derived from animals, they have no side effects on cells or tissues.
  • the hemostatic agent according to the present invention has a double cross-linking structure, thereby absorbing water at the bleeding site and Double hemostatic effect can be expected by promoting recruitment of blood coagulation factors.
  • the oxidized polysaccharide has a molecular weight of 1,000 to 100,000 before the polysaccharide is oxidized. If the molecular weight is less than 1,000, the mechanical properties may decrease in functioning as a matrix of the hemostatic agent having a double crosslinked structure of the present invention. If this amount exceeds 100,000, the reactivity with the oxidizing agent is lowered, and there is a limit to the increase in the oxidation degree.
  • the degree of oxidation that indicates the degree to which the polysaccharide is oxidized may be defined as representing a percentage (%) in which the hydroxy group of the polysaccharide is converted to an aldehyde by an oxidation reaction with an oxidizing agent.
  • the oxidized polysaccharide has an oxidation degree of 5 to 70%. It is preferable. If the degree of oxidation is less than 5%, the reaction site is small, so that the crosslinked structure with the natural protein polymer is not well formed, and thus the water absorption ability or hemostatic effect may be reduced. If the degree of oxidation exceeds 70%, the crosslinking degree is too high. It may take longer to decompose within.
  • the natural protein polymer may be one or more selected from the group consisting of gelatin, collagen, elastin, keratin, fibroin, casein, glutenine, paceolin, and albumin, and particularly preferably gelatin.
  • the natural enzyme cross-linking agent is transglutaminase, Sortase A, subtilisin, tyrosinase, laccase, horse raddish peroxidase, amine oxidase and lysyloxy
  • transglutaminase is more preferably used.
  • biocompatible hemostatic agent of the double-crosslinked structure according to the present invention may further enhance the hemostatic effect by further including thrombin, fibrinogen or a mixture thereof.
  • the present invention comprises the steps of I) mixing an oxidizing agent solution and a polysaccharide solution to obtain an oxidation reaction mixture; II) washing the oxidation reaction mixture several times with ethanol, filtration and drying to obtain a powdered oxidized polysaccharide; III) mixing a powdered aqueous polysaccharide solution, a natural protein polymer solution and a natural enzyme crosslinker solution to form a crosslinked product; And IV) processing the crosslinked body into various forms. It provides a biocompatible haemostatic agent having a double crosslinked structure comprising a.
  • the oxidant of step I) is selected from the group consisting of hydrogen peroxide, iron nitrate, ozone, peracetic acid, potassium permanganate, potassium monosulfate, potassium persulfate, sodium periodate, sodium bromide, sodium perborate and sodium percarbonate More than one species may be used, but is not limited thereto.
  • One or more selected from the group consisting of beta glucan, chondroitin sulfate, glycogen, starch, cellulose, regenerated cellulose, maltodextrin, fructan, galactan and mannan may be used, but is not limited thereto.
  • step I) the oxidizing agent and the polysaccharide are mixed in an aqueous solution to perform an oxidation reaction.
  • the oxidizing agent aqueous solution has a concentration of 0.5 to 40 wt%, and the polysaccharide aqueous solution has a concentration of 1 to 30 wt%.
  • the oxidation reaction mixture is washed several times with ethanol, filtered and dried through step II) to obtain a powdered oxidized polysaccharide.
  • step III the powdered oxidized polysaccharide, the natural protein polymer and the natural enzyme crosslinking agent are dissolved in purified water or saline solution, respectively, to obtain an aqueous solution, and the respective aqueous solutions are mixed and stirred to form a crosslinked product.
  • the natural protein polymer of step III) may be one or more selected from the group consisting of gelatin, collagen, elastin, keratin, fibroin, casein, glutenine, paceolin and albumin, and particularly preferably gelatin.
  • the natural enzyme cross-linking agent of step III) is transglutaminase, sortase A (Sortase A), subtylsin, tyrosinase, laccase, horse raddish peroxidase, amineoxy At least one selected from the group consisting of polysaccharide and lysyl oxidase is used, and transglutaminase is more preferably used.
  • sortase A Sortase A
  • subtylsin subtylsin
  • tyrosinase laccase
  • horse raddish peroxidase amineoxy
  • amineoxy At least one selected from the group consisting of polysaccharide and lysyl oxidase is used, and transglutaminase is more preferably used.
  • transglutaminase is more preferably used.
  • the remaining oxidized polysaccharide solution and natural protein polymer solution are preferably prepared and stored at 35 to 37 ° C.
  • the concentration of the oxidized polysaccharide aqueous solution is 2 to 30% by weight
  • the concentration of the natural protein polymer aqueous solution is 5 to 50% by weight
  • the concentration of the natural enzyme cross-linking agent aqueous solution is more preferably 10 to 80% by weight.
  • the biocompatible hemostatic agent having a double crosslinked structure according to the present invention can be prepared by processing the crosslinked product formed through step III) in various forms according to the hemostatic region and the application mode. According to the known processing method, it can be produced in various forms in the form of powder, sol, gel, non-woven fabric, fabric or sponge.
  • the oxidizing reaction mixture was obtained by mixing the oxidizing agent solution and the polysaccharide (molecular weight 100,000) aqueous solution as shown in Table 1 at 25 ° C. for 24 hours using a light incubation shaker (weight ratio 2: 8). Oxidized polysaccharide powder was prepared through a series of processes of washing, filtering and drying the oxidation reaction mixture three times with ethanol.
  • Oxidized polysaccharide powders having different oxidation degrees prepared in Preparation Examples 1 to 3 were dissolved in physiological saline to obtain a 20 wt% aqueous solution of chitosan oxide.
  • gelatin and transglutaminase were respectively dissolved in physiological saline to obtain respective aqueous solutions (30 wt% gelatin aqueous solution and 50 wt% transglutaminase aqueous solution). Each aqueous solution was then mixed and stirred at 37: 1 in a volume ratio of 1: 1 to form a crosslinked product, which was processed into a hemostatic agent in gel form.
  • 20 wt% chitosan oxide (10%) 30 wt% gelatin 50 wt% transglutaminase
  • Example 2 20 wt% chitosan oxide (35%)
  • Example 3 20 wt% chitosan oxide (60%)
  • the biocompatible hemostatic agent of the double crosslinked structure was prepared in the same manner as in Examples 2 to 3.
  • FIG. 1 shows a graph of the gel formation time according to the oxidation degree of the polysaccharide in the double-crosslinked biocompatible hemostatic agent prepared from Examples 1 to 3 of the present invention.
  • gelation occurs while the crosslinked structure is formed in earnest.
  • FIG. 1 it can be seen that the higher the oxidation degree of the polysaccharide, the shorter the time required for gelation as the crosslink is formed. This means that the higher the degree of oxidation, the shorter the crosslinking time, that is, the time required for gelation, so that a quick hemostatic effect can be expected.
  • FIG. 2 is a graph showing the water absorption ability and the decomposition degree according to the oxidation degree of the polysaccharide in the double-crosslinked biocompatible hemostatic agent prepared from Examples 1 to 3 of the present invention.
  • W d After weighing (W d ) and soaking in saline solution, the saline solution which was not absorbed by hemostatic agent was discarded every 24 hours and weighed (W s ) to determine the water absorption capacity and the degree of decomposition by water. .
  • W s the higher the oxidation degree of the polysaccharide, the higher the water absorption rate, and the rate of decomposition by water is slower than that of the low oxidation degree.
  • FIG. 3 shows a graph of the gel formation time according to the content of the natural enzyme crosslinking agent in the biocompatible hemostatic agent of the double crosslinked structure prepared from Examples 1, 4 and 5 of the present invention.
  • the time taken for gelation is shortened. This means that the higher the content of the natural enzyme crosslinking agent is, the better the crosslinking of the oxidized polysaccharide and the natural protein polymer is able to exhibit a fast and excellent hemostatic effect.
  • the biocompatible hemostatic agent of the double-crosslinked structure prepared according to the present invention is capable of biodegradation and is not only toxic to cells or tissues, but also prevents bleeding quickly due to high body water absorption and excellent hemostatic action. It can be expected to be used as a medical hemostatic agent.

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Abstract

본 발명은 생체친화성을 갖는 산화 다당류, 천연 단백질 고분자 및 천연 효소 가교제를 포함하는 이중 가교구조의 지혈제 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 제조된 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제는 생체 내 분해가 가능하여 생체친화성이 우수할 뿐만 아니라, 세포 혹은 조직에 독성이 없고 높은 체수분 흡수력과 뛰어난 지혈 작용으로 빠르게 출혈을 막을 수 있어, 의료용 지혈제로서 응용이 기대된다.

Description

이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 및 그 제조방법
본 발명은 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생체친화성을 갖는 산화 다당류, 천연 단백질 고분자 및 천연 효소 가교제를 포함하는 이중 가교구조의 지혈제 및 그 제조방법에 관한 것이다.
일반적으로 지혈제는 출혈증상에 대하여 출혈을 멈추게 할 목적으로 사용되는 약제로 정의할 수 있으며, 찰과상에 의한 약한 출혈에서부터 수술 및 사고 등 여러 가지 이유로 인하여 발생한 큰 출혈에까지 적용할 수 있는 중요한 외과적 의료용품이라 할 수 있다.
그런데 인체 내에서 일어나는 지혈과정은 생리학적으로 매우 복잡하여 완전하게 출혈을 막기에는 한계가 있다. 예를 들면, 예상치 못한 사고에 의한 심각한 조직 손상이나 수술 시 외과적 처치 중 나타날 수 있는 과다출혈의 경우, 인체 내에서 자연히 기능하는 물리·화학적 지혈작용만으로는 출혈을 온전히 막을 수 없어 지혈제를 반드시 사용하게 되는 것이다.
이러한 지혈제는 절상, 자상, 열상 등 다양한 상처와 인위적 수술시 생기는 상처에 의한 출혈 등에 적용되는 것이므로 적용부위와 상처종류에 따라 분말, 젤, 스펀지, 드레싱 등 그 형태가 다양하며, 각각의 형태마다 적용방법과 작용원리 또한 다양하다. 따라서 지혈제로써 완전한 지혈과 상처치유가 가능해야할 뿐만 아니라, 인체에 적용했을 때 발열이나 염증 등의 부작용 및 독성이 없어야 하며 인체 내부에 적용하는 경우에는 생체 내 분해능도 있어야한다.
지혈제로 개발된 제품 중 흡수성 직물 혹은 편물인 재생 셀룰로오스(Oxidized Regenerated Cellulose, ORC)를 산화시켜 만든 산화 재생 셀룰로오스계가 있다. 이 지혈제의 지혈작용 원리는 생체 내의 혈액 응고 과정에 참여하지 않고, 출혈부위의 혈액과 접촉하면 팽윤되어 출혈부위를 뒤덮음으로써 혈관주위의 조직을 수축시켜 지혈하는 것이다. 하지만 산화 재생 셀룰로오스는 지혈 시 산성을 띠어 혈액 응고 과정에 관여하는 트롬빈과 피브리노겐 등 혈액응고인자들의 활성을 변성시킬 수 있는 문제점이 있다(특허문헌 1).
따라서 상기 단점을 개선하고자 트롬빈 및 피브리노겐 등 혈액응고인자들을 함유하고 흡수성 부직포, 직물 혹은 편성물 형태로 제조한 지혈제가 공지된 바 있으나 지혈 효과 및 상처치유 효과가 충분치 않은 것으로 알려져 있다(특허문헌 2).
또한, 알긴산 또는 알긴산 알칼리 금속염을 일정 농도로 용해시켜 형성된 수화겔(hydrogel)을 동결건조하여 알긴산 스폰지를 제조한 후, 이를 그대로 또는 압축하여 시트형으로 제조시킨 창상 피복재 목적의 알긴산 스폰지에 관한 기술도 공지된 바 있으나, 이것도 역시 지혈 효과 및 상처치유 효과가 만족스러운 수준이 아닌 것으로 알려져 있다(특허문헌 3).
게다가 지혈제로 개발된 일부 제품은 지혈 작용은 뛰어나나 인체에 적용했을 때 적용 부위 주변부 조직에 화상과 비슷한 발열작용을 일으키거나 손상된 혈관에서 폐쇄성 혈전염증 (occlusive thrombus) 혹은 내피 세포독성을 일으키는 등의 부작용을 초래하여 사용이 중단된 사례가 보고되어 있다. 또한, 분말형태의 지혈제 중 일부는 생체분해능이 없어 출혈 부위 적용 후 제거하기가 쉽지 않으므로 외과적 수술시 부적합한 것으로 보고되기도 하였다.
그러므로 본 발명자는 생체친화성의 지혈제를 개발하기 위하여 연구를 거듭한 결과, 다당류는 산화제 등에 의해 산화가 일어나면 지방족 고리 구조가 열리면서(ring-opening) 다당류의 히드록시기가 알데히드기로 변하는 바, 산화 다당류의 알데히드기가 천연 단백질 고분자의 아민기와 반응하여 아민 결합을 갖는 가교구조를 형성하고, 아울러 천연 효소 가교제를 부가하여 천연 단백질 고분자의 가교구조를 형성함으로써, 산화 다당류 및 천연 단백질 고분자가 각각 독립적으로 가교구조를 형성한 이중 가교구조의 가교체를 제조할 수 있으면, 생체 내 분해가 가능하여 생체친화성이 우수할 뿐만 아니라, 세포 혹은 조직에 독성이 없고 높은 체수분 흡수력과 지혈효과로 빠르게 출혈을 막을 수 있는 지혈제를 제공할 수 있음에 착안하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
특허문헌 1 한국공개특허공보 제10-2014-0086072호
특허문헌 2 한국공개특허공보 제10-2009-0028690호
특허문헌 3 한국공개특허공보 제10-2006-0072643호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 생체 내 분해가 가능하여 생체친화성이 우수할 뿐만 아니라, 세포 혹은 조직에 독성이 없고 높은 체수분 흡수력과 뛰어난 지혈 작용으로 빠르게 출혈을 막을 수 있는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 및 그 제조방법을 제공하고자 하는 것이다.
상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 산화 다당류; 천연 단백질 고분자; 및 천연 효소 가교제;를 포함하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제를 제공한다.
상기 산화 다당류는 산화된 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시에틸셀룰로오스, 하이드록시메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 덱스트린, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 알긴산, 히알루론산, 키틴, 키토산, 젤란검, 글루칸, 베타글루칸, 콘드로이틴 설페이트, 글리코겐, 녹말, 셀룰로오스, 재생셀룰로오스, 말토덱스트린, 프럭탄, 갈락탄 및 만난으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것을 특징으로 한다.
상기 산화 다당류는 산화 전 다당류의 분자량이 1,000 내지 100,000인 것을 특징으로 한다.
상기 산화 다당류는 산화도가 5 내지 70%인 것을 특징으로 한다.
상기 천연 단백질 고분자는 젤라틴, 콜라겐, 엘라스틴, 케라틴, 피브로인, 카세인, 글루테닌, 파세올린 및 알부민으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것을 특징으로 한다.
상기 천연 효소 가교제는 트랜스글루타미나아제, 소르타제 A(Sortase A), 서브틸신, 타이로시네이즈, 라카아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다제(horse raddish peroxidase), 아민옥시다제 및 리실옥시다제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것을 특징으로 한다.
상기 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제는 트롬빈, 피브리노겐 또는 이들의 혼합물을 더욱 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 I) 산화제 수용액과 다당류 수용액을 혼합하여 산화반응 혼합액을 얻는 단계; II) 상기 산화반응 혼합액을 에탄올로 수회 세척, 여과 및 건조하여 분말상의 산화 다당류를 수득하는 단계; III) 상기 분말상의 산화 다당류 수용액, 천연 단백질 고분자 수용액 및 천연 효소 가교제 수용액을 혼합하여 가교체를 형성하는 단계; 및 IV) 상기 가교체를 다양한 형태로 가공하는 단계;를 포함하는 이중 가교구조를 갖는 생체친화성 지혈제의 제조방법을 제공한다.
상기 산화제는 과산화수소, 질산철, 오존, 과초산, 과망간산칼륨, 과산화모노황산 칼륨, 과산화이황산 칼륨, 과요오드산나트륨, 브롬산나트륨, 과붕산나트륨 및 과탄산나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것을 특징으로 한다.
상기 다당류는 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시에틸셀룰로오스, 하이드록시메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 덱스트린, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 알긴산, 히알루론산, 키틴, 키토산, 젤란검, 글루칸, 베타글루칸, 콘드로이틴 설페이트, 글리코겐, 녹말, 셀룰로오스, 재생셀룰로오스, 말토덱스트린, 프럭탄, 갈락탄 및 만난으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것을 특징으로 한다.
상기 산화반응은 빛이 차단된 상태로 25~30℃에서 1~96시간 수행되는 것을 특징으로 한다.
상기 가교체는 분말, 졸, 겔, 부직포, 직물 또는 스펀지 형태로 가공되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따라 제조된 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제는 생체 내 분해가 가능하여 생체친화성이 우수할 뿐만 아니라, 세포 혹은 조직에 독성이 없고 높은 체수분 흡수력과 뛰어난 지혈 작용으로 빠르게 출혈을 막을 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1 내지 3으로부터 제조된 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제에 있어서, 다당류의 산화도에 따른 겔 형성 시간을 나타낸 그래프.
도 2는 본 발명의 실시예 1 내지 3으로부터 제조된 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제에 있어서, 다당류의 산화도에 따른 수분 흡수력과 분해도를 나타낸 그래프.
도 3은 본 발명의 실시예 1, 4 및 5로부터 제조된 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제에 있어서, 천연 효소 가교제의 함량에 따른 겔 형성 시간을 나타낸 그래프.
도 4는 본 발명의 실시예 1, 4 및 5로부터 제조된 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제에 있어서, 천연 효소 가교제의 함량에 따른 수분 흡수력과 분해도를 나타낸 그래프.
이하에서는 본 발명에 따른 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 및 그 제조방법에 대하여 상세히 설명하기로 한다.
본 발명은 산화 다당류; 천연 단백질 고분자; 및 천연 효소 가교제;를 포함하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제를 제공한다.
먼저, 상기 산화 다당류는 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시에틸셀룰로오스, 하이드록시메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 덱스트린, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 알긴산, 히알루론산, 키틴, 키토산, 젤란검, 글루칸, 베타글루칸, 콘드로이틴 설페이트, 글리코겐, 녹말, 셀룰로오스, 재생셀룰로오스, 말토덱스트린, 프럭탄, 갈락탄 및 만난으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 다당류가 산화반응에 의하여 산화된 상태의 것을 의미한다.
일반적으로 다당류는 산화제 등에 의해 산화가 일어나면 지방족 고리 구조가 열리면서(ring-opening) 다당류의 히드록시기가 알데히드기로 변한다. 이렇게 산화되어 생겨난 다당류의 알데히드기는 천연 단백질 고분자의 아민기와 반응하여 이민 결합을 갖는 일차 가교구조를 형성한다.
한편, 천연 단백질 고분자는 동물의 섬유성 단백질로 인체를 구성하는 단백질 중 30%를 차지하고 있는 단백질이기 때문에, 생체 친화성이고 우수한 수분 흡수력을 가지고 있어 산화 다당류와 결합하여 출혈부위에 적용했을 때 출혈부위의 수분을 흡수하여 혈소판이 손상혈관 주변에 농축되도록 유도하거나 지혈과정에 중요하게 관여하고 있는 혈액응고 인자의 활성을 촉진시켜 출혈부위의 지혈을 유도할 수 있다. 게다가 산화 다당류는 친수성이기 때문에 인체 내 출혈부위에 적용했을 때 지혈작용을 완료하고 일정시간이 흐르면 체내 수분에 의해 분해될 수 있고, 천연 단백질 고분자는 수용성이면서 동물에서 유래한 것이므로 세포 혹은 조직에 부작용을 주지 않아 안전하게 사용이 가능하다. 아울러 천연 효소 가교제가 부가됨으로써 단백질의 라이신 잔기(lysine residues) 등과의 결합을 촉진하여 이차 가교구조를 형성하고, 궁극적으로는 본 발명에 따른 지혈제가 이중 가교구조를 가짐으로써, 출혈부위의 수분흡수와 혈액응고인자들의 모집(recruitment)을 촉진하여 이중 지혈효과를 기대할 수 있다.
또한, 상기 산화 다당류는 산화 전 다당류의 분자량이 1,000 내지 100,000인 것이 바람직한바, 그 분자량이 1,000 미만이면 본 발명의 이중 가교구조를 갖는 지혈제의 매트릭스로 작용함에 있어서 기계적 물성이 저하될 수 있고, 분자량이 100,000을 초과하면 산화제와의 반응성이 떨어져 산화도의 증가에 한계가 있다.
이렇게 다당류가 산화되는 정도를 나타내는 산화도는 산화제 등과의 산화반응에 의하여 다당류의 히드록시기가 알데히드로 전환된 비율(%)을 나타내는 것으로 정의할 수 있는데, 상기 산화 다당류는 산화도가 5 내지 70%인 것이 바람직하다. 산화도가 5% 미만이면 반응 사이트가 적어져서 천연 단백질 고분자와의 가교구조가 잘 형성되지 않아 수분 흡수력이나 지혈효과가 떨어질 수 있고, 산화도가 70%를 초과하면 가교도가 너무 높아 수분에 의해 생체 내에서 분해되는 시간이 길어질 수 있다.
또한, 상기 천연 단백질 고분자는 젤라틴, 콜라겐, 엘라스틴, 케라틴, 피브로인, 카세인, 글루테닌, 파세올린 및 알부민으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것일 수 있고, 특히 젤라틴을 더욱 바람직하게 사용한다.
또한, 상기 천연 효소 가교제는 트랜스글루타미나아제, 소르타제 A(Sortase A), 서브틸신, 타이로시네이즈, 라카아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다제(horse raddish peroxidase), 아민옥시다제 및 리실옥시다제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것을 사용하며, 트랜스글루타미나아제를 더욱 바람직하게 사용한다.
아울러, 본 발명에 따른 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제는 트롬빈, 피브리노겐 또는 이들의 혼합물을 더욱 포함함으로써 지혈효과를 더욱 강화할 수 있다.
또한, 본 발명은 I) 산화제 수용액과 다당류 수용액을 혼합하여 산화반응 혼합액을 얻는 단계; II) 상기 산화반응 혼합액을 에탄올로 수회 세척, 여과 및 건조하여 분말상의 산화 다당류를 수득하는 단계; III) 상기 분말상의 산화 다당류 수용액, 천연 단백질 고분자 수용액 및 천연 효소 가교제 수용액을 혼합하여 가교체를 형성하는 단계; 및 IV) 상기 가교체를 다양한 형태로 가공하는 단계;를 포함하는 이중 가교구조를 갖는 생체친화성 지혈제의 제조방법을 제공한다.
상기 I) 단계의 산화제로서는 과산화수소, 질산철, 오존, 과초산, 과망간산칼륨, 과산화모노황산 칼륨, 과산화이황산 칼륨, 과요오드산나트륨, 브롬산나트륨, 과붕산나트륨 및 과탄산나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 I) 단계의 다당류로서는 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시에틸셀룰로오스, 하이드록시메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 덱스트린, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 알긴산, 히알루론산, 키틴, 키토산, 젤란검, 글루칸, 베타글루칸, 콘드로이틴 설페이트, 글리코겐, 녹말, 셀룰로오스, 재생셀룰로오스, 말토덱스트린, 프럭탄, 갈락탄 및 만난으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 I) 단계에서는 산화제와 다당류를 각각 수용액 상태로 혼합하여 산화반응을 수행하는바, 산화제 수용액은 농도가 0.5 내지 40 중량%인 것이, 다당류 수용액은 농도가 1 내지 30 중량%인 것이 바람직하다. 이때, 산화반응 혼합액으로부터 산화반응을 유도하는 과정에서 빛 또는 온도에 의한 과민성 산화를 억제하기 위하여 빛이 차단된 상태로 25~30℃에서 1~96시간 동안 산화반응을 수행하는 것이 좋다.
이어서, 상기 II) 단계를 통하여 상기 산화반응 혼합액을 에탄올로 수회 세척, 여과 및 건조하여 분말상의 산화 다당류를 수득한다.
다음으로, 상기 III) 단계에서는 상기 분말상의 산화 다당류, 천연 단백질 고분자 및 천연 효소 가교제를 각각 정제수 또는 생리식염수에 용해시켜 수용액을 얻고, 이들 각각의 수용액을 혼합하고 교반함으로써 가교체를 형성한다.
상기 III) 단계의 천연 단백질 고분자는 젤라틴, 콜라겐, 엘라스틴, 케라틴, 피브로인, 카세인, 글루테닌, 파세올린 및 알부민으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것일 수 있고, 특히 젤라틴을 더욱 바람직하게 사용한다.
또한, 상기 III) 단계의 천연 효소 가교제는 트랜스글루타미나아제, 소르타제 A(Sortase A), 서브틸신, 타이로시네이즈, 라카아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다제(horse raddish peroxidase), 아민옥시다제 및 리실옥시다제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것을 사용하며, 트랜스글루타미나아제를 더욱 바람직하게 사용한다. 특히, 천연 효소 가교제 수용액을 얻을 때에는 단백질 효소의 활성을 잃지 않도록 30~37℃에서 짧은 시간 내에 수용액을 만든 후, 4℃ 냉장분위기에 보관했다가 각각의 수용액을 혼합하기 직전에 꺼내어 사용하는 것이 바람직하며, 나머지 산화 다당류 수용액과 천연 단백질 고분자 수용액은 35~37℃에서 제조 및 보관하는 것이 좋다. 이때, 상기 산화 다당류 수용액의 농도는 2 내지 30 중량%인 것이, 천연 단백질 고분자 수용액의 농도는 5 내지 50 중량%인 것이, 천연 효소 가교제 수용액의 농도는 10 내지 80 중량%인 것이 더욱 바람직하다.
마지막으로, 상기 IV) 단계에서는 III) 단계를 통하여 형성된 가교체를 지혈부위와 적용 양태에 따라 여러 가지 형태로 가공함으로써, 본 발명에 따른 이중 가교구조를 갖는 생체친화성 지혈제를 제조할 수 있는바, 공지의 가공방법에 따라 분말, 졸, 겔, 부직포, 직물 또는 스펀지 형태로 다양하게 제조할 수 있다.
이하에서는 본 발명에 따른 실시예를 구체적으로 서술한다.
[ 제조예 1 내지 3] 산화 다당류 분말의 제조
하기 표 1에 나타낸 바와 같은 산화제 수용액과 다당류(분자량 100,000) 수용액을 빛이 차단된 진탕 배양기를 사용하여 25℃에서 24시간 혼합함으로써(중량비 2:8) 산화반응 혼합액을 얻었다. 상기 산화반응 혼합액을 에탄올로 3회 세척, 여과 및 건조하는 일련의 과정을 거쳐 산화 다당류 분말을 제조하였다.
제조예 산화제 수용액 다당류 수용액 산화도
제조예 1 5 중량% 과요오드산 나트륨 10 중량% 키토산 10%
제조예 2 10 중량% 과요오드산 나트륨 15 중량% 키토산 35%
제조예 3 15 중량% 과요오드산 나트륨 20 중량% 키토산 60%
[ 실시예 1 내지 3] 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 제조
상기 제조예 1 내지 3으로부터 제조된 산화도가 상이한 산화 다당류 분말을 생리식염수에 용해시켜 20 중량% 산화 키토산 수용액을 얻었다. 또한, 젤라틴 및 트랜스글루타미나아제를 각각 생리식염수에 용해시켜 각각의 수용액을 얻었다(30 중량% 젤라틴 수용액, 50 중량% 트랜스글루타미나아제 수용액). 이어서 상기 각 수용액을 37℃에서 1: 1: 1의 용량비로 혼합 및 교반하여 가교체를 형성하였고, 겔 형태의 지혈제로 가공하였다.
실시예 산화 다당류 수용액(산화도) 천연 단백질 고분자 수용액 천연 효소 가교제 수용액
실시예 1 20 중량% 산화키토산(10%) 30 중량% 젤라틴 50 중량% 트랜스글루타미나아제
실시예 2 20 중량% 산화키토산(35%) 30 중량% 젤라틴 50 중량% 트랜스글루타미나아제
실시예 3 20 중량% 산화키토산(60%) 30 중량% 젤라틴 50 중량% 트랜스글루타미나아제
[ 실시예 4 내지 5] 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제 제조
트랜스글루타미나아제 수용액의 농도만 각각 60 중량% 및 70 중량%의 것을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2 내지 3과 동일하게 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제를 제조하였다.
도 1에는 본 발명의 실시예 1 내지 3으로부터 제조된 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제에 있어서, 다당류의 산화도에 따른 겔 형성 시간의 추이를 그래프로 나타내었다. 실시예 1 내지 3에 의하면, 가교반응 초기에는 졸 상태였다가 가교구조가 본격적으로 형성되면서 겔화(gelation)가 일어난다. 도 1에서 보는 바와 같이, 다당류의 산화도가 높을수록 가교가 형성되면서 겔화되는데 걸리는 시간이 짧아지는 것을 알 수 있다. 이는 산화도가 높을수록 가교시간 즉, 겔화되는데 걸리는 시간이 단축됨으로써 빠른 지혈효과를 기대할 수 있다는 것을 의미한다.
도 2에는 본 발명의 실시예 1 내지 3으로부터 제조된 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제에 있어서, 다당류의 산화도에 따른 수분 흡수력과 분해도를 그래프로 나타내었는바, 겔 형태로 제조한 지혈제의 최초 무게를 재고(Wd), 생리식염수에 담근 후 24시간마다 지혈제에 흡수되지 않은 생리식염수는 버리고 무게를 재서(Ws) 다당류의 산화도에 따른 수분 흡수력과 수분에 의해 분해되는 정도를 확인하였다. 도 2에서 보는 바와 같이, 다당류의 산화도가 높을수록 수분흡수율이 높고, 수분에 의해 분해되는 속도는 산화도가 낮은 것에 비하여 느린 것을 알 수 있다. 이는 산화도가 높을수록 천연 단백질 고분자와 반응하여 가교도가 높아짐으로써 수분을 많이 흡수할 수 있고 지혈효과가 우수한 반면, 생체 내에서 수분에 의해 분해되는 시간은 오래 걸린다는 것을 의미한다.
도 3에는 본 발명의 실시예 1, 4 및 5로부터 제조된 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제에 있어서, 천연 효소 가교제의 함량에 따른 겔 형성 시간의 추이를 그래프로 나타내었다. 도 3에서 보는 바와 같이, 트랜스글루타미나아제의 함유량이 많을수록 겔화되는데 걸리는 시간이 짧아지는 것을 알 수 있다. 이는 천연 효소 가교제의 함유량이 많을수록 산화 다당류와 천연 단백질 고분자와의 가교가 잘 형성되어 빠르고 우수한 지혈효과를 나타낼 수 있음을 의미한다.
도 4에는 본 발명의 실시예 1, 4 및 5로부터 제조된 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제에 있어서, 천연 효소 가교제의 함량에 따른 수분 흡수력과 분해도를 상기 도 2에서와 같은 방법으로 확인하여 그 결과를 그래프로 나타내었다. 도 4에서 보는 바와 같이, 천연 효소 가교제의 함유량이 많을수록 수분흡수율이 높고 수분에 의해 분해되는 정도가 느리게 나타나지만, 도 2에 도시한 다당류의 산화도에 따른 수분흡수율과 분해정도의 차이에 비하면 그 차이가 미미한 것으로 확인되었다. 이는 천연 효소 가교제에 의한 지혈제의 이중 가교로 지혈효과의 향상을 유도할 수는 있으나, 수분을 흡수하고 생체 내에서 지혈제가 분해되는 속도에 있어서는 천연 효소 가교제의 함유량이 미치는 영향이 중요하지 않다는 것을 의미한다.
그러므로 본 발명에 따라 제조된 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제는 생체 내 분해가 가능하여 생체친화성이 우수할 뿐만 아니라, 세포 혹은 조직에 독성이 없고 높은 체수분 흡수력과 뛰어난 지혈 작용으로 빠르게 출혈을 막을 수 있어, 의료용 지혈제로서 응용이 기대된다.

Claims (14)

  1. 산화 다당류;
    천연 단백질 고분자; 및
    천연 효소 가교제;를 포함하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 산화 다당류는 산화된 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시에틸셀룰로오스, 하이드록시메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 덱스트린, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 알긴산, 히알루론산, 키틴, 키토산, 젤란검, 글루칸, 베타글루칸, 콘드로이틴 설페이트, 글리코겐, 녹말, 셀룰로오스, 재생셀룰로오스, 말토덱스트린, 프럭탄, 갈락탄 및 만난으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것을 특징으로 하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제.
  3. 제2항에 있어서, 상기 산화 다당류는 산화 전 다당류의 분자량이 1,000 내지 100,000인 것을 특징으로 하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 산화 다당류는 산화도가 5 내지 70%인 것을 특징으로 하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제.
  5. 제1항에 있어서, 상기 천연 단백질 고분자는 젤라틴, 콜라겐, 엘라스틴, 케라틴, 피브로인, 카세인, 글루테닌, 파세올린 및 알부민으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것을 특징으로 하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제.
  6. 제1항에 있어서, 상기 천연 효소 가교제는 트랜스글루타미나아제, 소르타제 A(Sortase A), 서브틸신, 타이로시네이즈, 라카아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다제(horse raddish peroxidase), 아민옥시다제 및 리실옥시다제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것을 특징으로 하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제.
  7. 제1항에 있어서, 트롬빈, 피브리노겐 또는 이들의 혼합물을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 이중 가교구조의 생체친화성 지혈제.
  8. I) 산화제 수용액과 다당류 수용액을 혼합하여 산화반응 혼합액을 얻는 단계;
    II) 상기 산화반응 혼합액을 에탄올로 수회 세척, 여과 및 건조하여 분말상의 산화 다당류를 수득하는 단계;
    III) 상기 분말상의 산화 다당류 수용액, 천연 단백질 고분자 수용액 및 천연 효소 가교제 수용액을 혼합하여 가교체를 형성하는 단계; 및
    IV) 상기 가교체를 다양한 형태로 가공하는 단계;를 포함하는 이중 가교구조를 갖는 생체친화성 지혈제의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 산화제는 과산화수소, 질산철, 오존, 과초산, 과망간산칼륨, 과산화모노황산 칼륨, 과산화이황산 칼륨, 과요오드산나트륨, 브롬산나트륨, 과붕산나트륨 및 과탄산나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것을 특징으로 하는 이중 가교구조를 갖는 생체친화성 지혈제의 제조방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 다당류는 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시에틸셀룰로오스, 하이드록시메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 덱스트린, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 알긴산, 히알루론산, 키틴, 키토산, 젤란검, 글루칸, 베타글루칸, 콘드로이틴 설페이트, 글리코겐, 녹말, 셀룰로오스, 재생셀룰로오스, 말토덱스트린, 프럭탄, 갈락탄 및 만난으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것을 특징으로 하는 이중 가교구조를 갖는 생체친화성 지혈제의 제조방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 산화반응은 빛이 차단된 상태로 25~30℃에서 1~96시간 수행되는 것을 특징으로 하는 이중 가교구조를 갖는 생체친화성 지혈제의 제조방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 천연 단백질 고분자는 젤라틴, 콜라겐, 엘라스틴, 케라틴, 피브로인, 카세인, 글루테닌, 파세올린 및 알부민으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것을 특징으로 하는 이중 가교구조를 갖는 생체친화성 지혈제의 제조방법.
  13. 제8항에 있어서, 상기 천연 효소 가교제는 트랜스글루타미나아제, 소르타제 A(Sortase A), 서브틸신, 타이로시네이즈, 라카아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다제(horse raddish peroxidase), 아민옥시다제 및 리실옥시다제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것을 특징으로 하는 이중 가교구조를 갖는 생체친화성 지혈제의 제조방법.
  14. 제8항에 있어서, 상기 IV) 단계에서의 가교체는 분말, 졸, 겔, 부직포, 직물 또는 스펀지 형태로 가공되는 것을 특징으로 하는 이중 가교구조를 갖는 생체친화성 지혈제의 제조방법.
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