CN117244113A - 一种原位成型的可注射水凝胶材料及其在制备组织修复制剂中的应用 - Google Patents
一种原位成型的可注射水凝胶材料及其在制备组织修复制剂中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种原位成型的可注射水凝胶材料及其在制备组织修复制剂中的应用，涉及医用生物材料技术领域。本发明的原位成型可注射水凝胶材料，包括二个流体组分：组分A和组分B，其中组分A为活化的链接剂溶液，组分B为胶原蛋白和/或明胶流体。本发明水凝胶材料在使用时制备，首先用交联活化剂活化链接剂，得到组分A，期间消耗一部分交联活化剂，降低与组织接触的交联活化剂量，然后将组分A和组分B混合，组分中的大分子化学交联形成凝胶，其中组分B中引入中和剂，用于在组分大分子化学交联过程中以及随后的一段时间内消耗材料中的交联活化剂，进一步降低与组织接触的交联活化剂残留量，增进水凝胶材料的生物相容性。
Description
技术领域
本发明涉及医用生物材料技术领域，更具体地，涉及一种原位成型的可注射水凝胶材料及其在制备组织修复制剂中的应用。
背景技术
日常生活中，人体组织会发生多种形式的损伤，造成组织离断或缺损，损伤的组织会通过再生、重建进行修补恢复。组织修复过程包括损伤部位组织中的细胞及身体其他部位的细胞汇集到损伤部位进行分裂、增殖和细胞外基质重建等，生存环境对细胞开展上述工作非常重要，影响细胞生存环境的任何因素都会影响组织愈合。长久以来，人们一直探索各种治疗方法、生物材料产品和药物来缩短组织愈合时间，特别是慢性难愈合组织损伤的修复。
胶原蛋白主要存在于哺乳动物皮肤、肌腱、软骨及骨等组织中，含量丰富，约占人体或其他动物总蛋白的20～30％。作为哺乳动物细胞外基质的主要成分，胶原蛋白参与构成围绕细胞的三维空间网络，在维持细胞外基质的结构完整性和细胞的生物功能发挥着重要作用。胶原蛋白及其部分水解产物—明胶拥有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列，具有良好的促细胞粘附、分化和生长的生物学活性，它们具有优秀的生物相溶性、弱抗原性、可降解性及安全性等优点，经常作为原料制备生物材料医疗产品，用于引导组织再生、促进伤口修复愈合，已开发的以胶原蛋白或明胶为关键材料的医疗产品有双层人工真皮修复材料、医用胶原修复膜、外科生物补片、人工神经导管、软骨修复支架等。单纯的胶原蛋白或明胶构成的材料生物降解速度快、力学强度低，难以很有效地促进受损组织的再生，此外由明胶构成的凝胶具有相对低的熔点，在体温不能成型，因此以胶原蛋白或明胶为关键材料的医疗产品中的胶原蛋白和明胶通常需要经物理、化学或酶类等方式进行交联，形成具有一定力学强度的三维网络稳定结构，其中化学交联使用的京尼平和谷氨酰胺转氨酶生物相容性虽然较好，但是交联时间长，交联产物力学强度较弱，使用生物相容性差的甲醛、戊二醛、碳二亚胺等作为交联剂或交联活化剂，交联时间短，交联产物力学强度较好，但是材料中残留的交联剂/交联活化剂对细胞和组织是有刺激性或毒性，会对组织的修复造成不利影响，因此在制备产品过程中，通常在交联结束后，需要通过洗涤或透析的方法除去材料中残留的交联剂/交联活化剂。
随着科技的发展，微创手术在临床得到了广泛的应用。海绵、薄膜等固态医用材料产品以及成型凝胶类医用材料产品适用于暴露且易于操作的创面，难以在微创和腔镜手术中应用，有待开发新型医用材料产品。新型医用材料产品或原料需要在生理温和条件下，通过注射或喷涂方式置于损伤处，迅速成型，具有一定力学强度，并且在体内存留一定时间。许多以胶原蛋白和明胶为关键材料的医疗产品在体外用物理、酶和/或许多化学交联方法制备，这些传统制备方法不适合在体内使用，尽管一些化学交联方法能够在在生理条件下使用，但是按照传统方法迅速交联胶原蛋白或明胶需要高浓度的交联剂/交联活化剂，残留的交联剂/交联活化剂会损害细胞、刺激组织、限制组织的修复，去除体内材料中残余交联剂/交联活化剂的洗涤或透析方法往往费时、费力、效果不佳，难以在临床微创手术中应用。
现有技术公开了一种透明质酸-明胶_丙烯酰胺双网络水凝胶及其制备方法，具体公开了如下内容：(1)改性透明质酸的制备：a.配制成质量分数为1-4％的透明质酸水溶液，用盐酸调节透明质酸水溶液的pH至4～6，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下搅拌15～25min，然后加入半胱氨酸乙酯盐酸盐反应4～8小时,得到溶液；半胱氨酸乙酯盐酸盐：N-羟基琥珀酰亚胺：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺：透明质酸的摩尔比为1～2:0.5～1:0.25～1:1；b.把步骤a得到的溶液中加入甲基丙烯酸酐，用NaOH溶液调节pH至7.0～9.0，在2～6℃下反应20～48小时，透析5～7天，冷冻干燥，得到改性透明质酸固体；所述的甲基丙烯酸酐与步骤a的透明质酸的摩尔比为1～10：1；(2)第一网络水凝胶的制备：在步骤(1)中得到的改性透明质酸配制成水溶液，再与明胶水溶液、光引发剂混合到一起，室温下避光搅拌20～30min，用紫外光照射20～40min，形成第一网络水凝胶；所述的光引发剂为2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮和α-酮戊二酸中的一种；改性透明质酸水溶液的浓度为1g～4g/100mL；明胶浓度为2g～10g/100mL；改性透明质酸溶液与明胶溶液的体积比为4:1～16；所述的光引发剂用量与改性透明质酸的质量比为40:1～6。但是该透明质酸-明胶_丙烯酰胺双网络水凝胶材料制备步骤复杂，需要透析5～7天，整体反应时间长，且无法原位成型，显然无法解决上述体内组织修复重建的应用需求。
发明内容
本发明目的是克服现有组织修复医用生物材料中交联剂/交联活化剂残留量高、消除方法复杂、耗时长且产品无法原位成型的缺陷和不足，提供一种原位成型的可注射水凝胶材料，包含活化的链接剂溶液的组分A和含胶原蛋白/明胶的流体组分B，在材料接触组织之前，活化链接剂消耗一部分交联活化剂，降低与组织接触的交联活化剂，且组分A和组分B混合过程中及混合后，在组分大分子发生化学交联的同时以及随后的一段时间内，组分B中引入的中和剂可以消耗交联活化剂，进一步降低与组织接触材料中交联活化剂的残留量，提高材料的生物相容性。材料制备操作简单，成胶时间短，水凝胶材料可原位注射成型。
本发明的另一目的在于提供一种原位成型的可注射水凝胶材料在制备组织修复制剂中的应用。
本发明的再一目的在于提供一种组织修复制剂。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种原位成型的可注射水凝胶材料，包括二个流体组分：组分A和组分B，其中组分A为活化的链接剂溶液，pH值为4～8，组分B为胶原蛋白和/或明胶流体，pH值为4～9，
组分A和组分B在使用前独立存在，使用时将组分A和组分B混合，化学交联得到凝胶材料。
本发明的组分A为优先活化链接剂，在与组分B混合挤出形成凝胶材料接触组织之前消耗一部分交联活化剂，降低了与组织接触材料中交联活化剂的含量。
本发明的原位成型的可注射水凝胶材料中组分A和组分B的pH值会影响最终混合后的化学偶联效率，关系其注射成型应用。
组分A和组分B中的原料大分子交联完成后，材料中可能仍有交联活化剂，中和剂能够继续清除交联活化剂，特别是对那些不含羧基的中和剂。
其中，需要说明的是：
本发明引入生物相容性好的链接剂，改善材料大分子之间的交联，即便使用低浓度的交联活化剂，凝胶材料也具有较好的稳定性和强度。
本发明的原位成型可注射水凝胶材料的主要成分为胶原蛋白和/或明胶，胶原蛋白来源于哺乳动物、鱼或基因工程，其中哺乳动物优选牛和猪，基因工程胶原蛋白的生产是在细菌、酵母、细胞、昆虫或转基因作物中表达重组胶原蛋白基因，所述的胶原蛋白包括I型、II型、III型等类型中的一种或几种，优选去除端肽的胶原蛋白。
明胶是胶原蛋白的部分水解产物，可以是动物来源或基因工程来源，动物明胶是通过酸处理(A型明胶)或碱处理(B型明胶)方法提取，明胶冻力在100-400Bloom的范围内，优选冻力不低于200Bloom的明胶。
本发明的原位成型的可注射水凝胶材料的化学交联在使用过程中进行，将A组分和B组分均匀混合，A组分和B组分的挤出体积比为10:1至1:10，优选1:1。挤出开始时间距链接剂与交联活化剂混合时间不少于5min，优选10-100min。
现有绝大部分生物材料产品在使用前已经预制成型，以固体或凝胶形式使用，成型的生物材料难以通过微创和介入方式植入体内，难以方便地安置于组织伤病部位。本发明的原位成型可注射水凝胶材料并非已预制成型，先行将原料混合配制为二种流体：组分A和组分B，然后将配制的组分A和组分B通过注射的方式投放于组织损伤部位，在注射过程中或/和到达组织损伤部位短时间内混合均匀，迅速凝固成型，因此本发明的可注射水凝胶材料能够实现原位成型，不仅适合用于暴露和易于操作的创面，也适合用于微创和介入手术。
本发明原位成型的可注射水凝胶材料到达损伤部位时，没有完全交联，仍处于流动状态，因此能与各种创面契合，包括不平整创面及洞穴伤口。
且本发明的原位成型可注射水凝胶材料分子骨架是由胶原蛋白/明胶和链接剂构成，其中胶原蛋白是由3条左旋螺旋体的多肽链分子相互交联，并沿一个共同轴线盘绕成的一个右旋超螺旋体，明胶是胶原蛋白部分水解/解旋的产物，胶原蛋白每条肽链分子中拥有多个氨基和羧基，链接剂是含有多个羧基的生物大分子。交联活化剂碳二亚胺能够促进羧基与伯氨基反应，形成酰胺键，因此发明的凝胶材料分子骨架有胶原蛋白/明胶自身交联(分子内和分子间)以及胶原蛋白/明胶与链接剂的交联。通常制备胶原蛋白/明胶类生物材料时，采用一步合成法，直接将交联剂/交联活化剂与胶原蛋白/明胶和其它反应原料溶液混合在一起，本发明的凝胶材料采用二步合成法，先将链接剂与交联活化剂反应，活化为A组分，然后再与含中和剂的胶原蛋白/明胶B组分混合，中和剂可以降低材料中交联活化剂的含量。与一步合成法相比，本发明采用的二步合成法能够更有效地活化链接剂，减少胶原蛋白/明胶自身交联，增加链接剂与胶原蛋白/明胶的交联，形成与一步合成方法不同交联方式的分子网络结构。
本发明不仅可以通过氢键、离子键与组织结合，也可以通过胶原蛋白/明胶和链接剂中被活化的羧基，与组织表面的氨基形成共价键，增强凝胶与组织的结合强度。
在具体实施方式中，本发明的组分A中的链接剂包括透明质酸、海藻酸、羧甲基纤维素钠、羧甲淀粉钠及其衍生物中的任意一种或混合，链接剂在可注射水凝胶材料中的质量含量为0.01～5％。
组分A中链接剂的交联活化剂包括1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)或其盐酸盐，交联活化剂在可注射水凝胶材料中的质量含量为0.1～3％。
本发明的原位成型的可注射水凝胶材料以能够引导组织再生、促进伤口愈合的胶原蛋白和/或明胶为主要原料，使用较低毒性/刺激性的EDC或其盐酸盐作为交联剂，从原料方面减低组织可能接触到的刺激性和毒性。
链接剂是将凝胶中的胶原蛋白/明胶的肽链连接起来的大分子，起到增强凝胶材料稳定性的作用，它是含有多个羧基的生物大分子，包括透明质酸、海藻酸、羧甲基纤维素钠、羧甲淀粉钠及其衍生物。
交联活化剂是促进胶原蛋白/明胶及其与链接剂形成化学交联的分子，包括水溶性的碳二亚胺，如1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)或其盐酸盐，其与羧基反应，形成O-酰基脲活性中间体，中间体再与伯氨基反应，形成酰胺键。
在具体实施方式中，本发明的交联活化剂1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐可以单独使用，也可与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和/或N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)等其它交联增强剂联合使用，提升酰胺键形成效率，提高胶原蛋白/胶原肽链及其与链接剂的交联效率，降低交联活化剂的使用浓度。
在具体实施方式中，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐在凝胶材料中的含量为0.1～3％，NHS或Sulfo-NHS是碳二亚胺摩尔量的0～2倍。
在具体实施方式中，本发明的组分A优选通过如下方式配置：
将链接剂和交联活化剂溶解于不含羧基的溶剂中，控制溶解体系pH值为4～8，活化反应时间≥5min，活化得到组分A。
组分A中链接剂的质量浓度为0.01～10％。
链接剂溶液可以预先制备或使用前临时制备。
上述溶解链接剂和交联活化剂可以采用如下方式：
用链接剂溶液直接溶解交联活化剂，
或将交联活化剂先用不含羧基的溶剂(可以与溶解链接剂相同或不同的溶剂)溶解，然后与链接剂溶液混匀。
其中活化时间优选为10～120min。
交联活化剂1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐与链接剂的重量比例为10:1至1:10，优选5:1～1:5。
其中，本发明的不含羧基的溶剂可以包括如下溶剂：
蒸馏水、生理盐水、稀盐酸溶液、磷酸盐缓冲液(PBS)和2-吗啉乙磺酸缓冲液(MES)中的任意一种。
其中磷酸盐缓冲液(PBS)的pH为5.8～8.0，2-吗啉乙磺酸缓冲液(MES)的pH为5.4～6.8。
本发明组分B中的胶原蛋白和/或明胶溶解于或悬浮于水溶液中，形成可以注射的流体，胶原蛋白在可注射水凝胶材料中质量含量为0.1～15％，明胶在可注射水凝胶材料中质量含量为1～30％。
在具体实施方式中，所述水溶液优选地为含羧基缓冲液的水溶液。
在本发明的技术方案中，所述组分B中还包括中和剂，用于降低与凝胶材料中未反应的碳二亚胺含量，减少与组织接触的碳二亚胺量。
所述中和剂为含有羧基的有机分子或能产生含有羧基的有机分子，本发明的实施方式中，所述中和剂可以为甲酸、乙酸、丙酸、乙二酸、丙二酸、乙二胺四乙酸、抗坏血酸、柠檬酸、硫辛酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷胱甘肽、聚谷氨酸、聚天冬氨酸等以及其衍生物中的任意一种或组合。
其中，需要说明的是：
本发明的能产生含有羧基的有机分子是指分子自身不含羧基、但发生反应后产生有含羧基产物，反应可以是水解，也可以是氧化、酶反应等。
中和剂可以通过如下两种方式引入：
方式一：本发明所述溶解或悬浮胶原蛋白/明胶的水溶液中用于调控溶液酸碱度的分子，例如可以为乙酸溶液、乙酸-乙酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中的任意一种。
其中乙酸-乙酸钠缓冲液的pH为3.6～5.8，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的pH为3.0～6.6，柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的pH为2.2～8.0。
方式二：单纯用于降低与凝胶材料中未反应的碳二亚胺含量，包括含有羧基的有机分子或能产生含有羧基的有机分子，其中配制组分A的链接剂也可以用作为中和剂。
在具体实施方式中，优选地，所述组分B中和剂中羧基或其可产生羧基的摩尔量是活化剂碳二亚胺摩尔量的0.1～10倍，优选0.1～5倍。
在具体实施方式中，所述含羧基缓冲剂与中和剂可为同种物质，链接剂与中和剂也可为同种物质。
除胶原蛋白/明胶外，组分B中含羧基的中和分子和/或其产生的含羧基产物在组分A和组分B混合过程中及混合后，消耗与组织接触材料中的交联活化剂，进一步降低凝胶材料中与组织接触的交联活化剂。
胶原蛋白/明胶液可以预先配置，也可以使用前临时制备。
具体配置方法可采用常规配置方法，例如可参考如下：
1)明胶与溶剂混合，加热至40℃～80℃溶解，制成明胶溶液，然后加入中和剂，混合均匀。如果使用的是含羧基溶剂，可不再加入中和剂。此外，链接剂也可以用作中和剂。如果溶液pH<4，用碱例如氢氧化钠溶液等，调节溶液pH值至4～9。明胶质量浓度1～50％，中和剂中羧基或其可产生羧基的摩尔量是碳二亚胺摩尔量的0～10倍。
2)上述明胶溶液中可以加入胶原蛋白溶液，配制成胶原蛋白/明胶溶液。如果溶液pH<4，用碱例如氢氧化钠溶液等，调节溶液pH值至4～9。其中明胶浓度1～50％，胶原蛋白浓度0.1～10％。
3)明胶溶液或胶原蛋白溶液中可以加入胶原蛋白粉，优选去除端肽纤维性胶原蛋白粉，配制成混浊液。调节溶液pH值至4～9，再加入中和剂，混合均匀，在其凝固前使用，胶原蛋白质量浓度1～15％。
在具体实施方式中，进一步优选地，所述链接剂在可注射水凝胶材料中的质量含量为0.1～3％。
在具体实施方式中，本发明的组分B中还含包含显色剂。
显色剂混于凝胶可以方便地判断凝胶是否准确置于目标位置以及凝胶涂覆量，它包括甲苯胺蓝、亚甲基蓝、苯胺蓝、天青石蓝、花青素等，显色剂在凝胶中质量含量为0～1％。
本发明还具体保护一种原位成型的可注射水凝胶材料在组织修复中的应用。
本发明的原位成型的可注射水凝胶材料可用于制备引导组织再生、促进伤口愈合以及防治组织渗漏和粘连等多种治疗功能的医用凝胶材料。
本发明还具体保护一种原位成型的可注射水凝胶材料制备得到的组织修复制剂，通过如下方法制备得到：
将组分A装入注射器1中，将组分B装入注射器2中，将注射器1和注射器2安装于一个三通接头的二个入口，同时挤出二个流体，二个流体通过安装于三通接头出口的混合管均匀混合，或用三通接头出口搅动挤出的溶液，使二个溶液均匀混合，凝固形成组织修复制剂。
本发明的组织修复制剂可用于促进组织愈合和再生以及防治组织渗漏和粘连。
例如可以用于微创手术的医用生物材料，在制备过程中以注射方式植入体内，在目标组织部位迅速凝固成型。
本发明的组织修复制剂可在生理条件下发生化学交联，保证材料具有优秀的生物相容性，避免了使用传统耗时、耗力的洗涤或透析方法，减少了与组织接触的材料中化学交联活化剂的含量。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的原位成型可注射水凝胶材料并非已预制成型，在注射过程中或/和到达组织损伤部位后，短时间混合均匀，迅速凝固成型；到达损伤部位时，没有完全交联，仍处于流动状态，因此能与各种创面契合，包括不平整创面及洞穴伤口，不仅适合用于暴露和易于操作的创面，也非常适合用于微创和介入手术，组织契合性好。
本发明的原位成型可注射水凝胶材料二步合成法能够提升链接剂活化效率，减少胶原蛋白/明胶自身交联，增加链接剂与胶原蛋白/明胶的交联，形成与一步制备方法不同交联方式的分子网络结构，不仅可以通过氢键、离子键与组织结合，也可以通过来胶原蛋白/明胶和链接剂中被活化的羧基，与接触组织表面的氨基形成共价键，增强凝胶与组织的结合强度。
且本发明的原位成型的可注射水凝胶材料选用生物相容性好的胶原蛋白/明胶、链接剂、中和剂和显色剂，交联活化剂选用相对温和的碳二亚胺，并在反应体系中使用链接剂和交联增强剂(NHS/Sulfo-NHS)，以降低碳二亚胺的用量，其次反应采用二步合成法，先将碳二亚胺与链接剂反应，降低接触组织时溶液中碳二亚胺的浓度，此外在组分B中加入中和剂，在原料大分子交联过程中以及随后的一段时间内降低材料中碳二亚胺的含量，进一步降低交联活化剂对细胞和组织的副作用，减轻碳二亚胺对组织的刺激作用。
本发明的凝胶材料以胶原蛋白/明胶作为主要原料，桥接因损伤而分离的组织，引导细胞修复破损组织，从而促进组织愈合，同时凝胶材料组织贴附性好、具有一定力学强度的特点，可以防止组织内容物渗漏，包括止血。此外，其能够隔离损伤组织与周围组织，防止损伤组织与周围组织发生粘连。
附图说明
图1.海藻酸钠作为链接剂提升明胶凝胶材料稳定性。
图2.生长在凝胶材料表面的细胞(A:培养1天，B:培养3天；C:培养5天)。
图3.凝胶材料防治组织粘连(A:对照组，B:凝胶组)。
图4.凝胶材料促进组织愈合(A1/A2：未损伤腹壁肌肉；B1/B2：未用材料组；C1/C2：凝胶组)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。
实施例1
一种原位成型的可注射水凝胶材料，包括组分A和组分B，
其中，组分A和组分B的配制如下：
取300mg海藻酸钠，溶解于10ml 2-吗啉乙磺酸(MES)溶液(50mM，pH 6)，然后加入200mg 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和200mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，待溶解后，等待30分钟，得到组分A：活化的海藻酸钠溶液，pH值为4～8；
取2g明胶，加入到9ml MES溶液(50mM，pH 6)中，加热至60℃，摇动容器，待明胶全部溶解，制成组分B：明胶溶液，pH值为4～9。
混合成胶
将上述明胶溶液和活化的海藻酸钠溶液分别吸入2个注射器中，将注射器安装于出口装有混合管的三通接头，同时挤压二个注射器，二个注射器中的溶液以1：1的体积比通过混合管混合，混合均匀的溶液凝固形成凝胶。
实施例2
一种原位成型的可注射水凝胶材料，包括组分A和组分B，
其中，组分A和组分B的配制如下：
取200mg羧甲基纤维素钠，溶解于10ml MES溶液(50mM，pH 6)，然后加入200mg EDC和200mg NHS，待溶解后，等待30分钟，得到组分A：活化的羧甲基纤维素钠，pH值为4～8；
取2g明胶，加入到9ml MES溶液(50mM，pH 6)中，加热至60℃，摇动容器，待明胶全部溶解，然后加入20mg乙酸钠，摇动容器，待乙酸钠溶解，制成组分B：明胶溶液，pH值为4～9；
混合成胶
将上述明胶溶液和活化的羧甲基纤维素钠溶液分别吸入2个注射器中，将注射器安装于出口装有混合管的三通接头，同时挤压二个注射器，二个注射器中的溶液以1：1的体积比通过混合管混合，混合均匀的溶液凝固形成凝胶。
实施例3
一种原位成型的可注射水凝胶材料，包括组分A和组分B，
其中，组分A和组分B的配制如下：
取200mg透明质酸钠，溶解于10ml MES溶液(50mM，pH 6)，然后加入200mg EDC和200mg NHS，待溶解后，等待30分钟，得到组分A：活化的透明质酸钠，pH值为4～8；
取2g明胶，加入到9ml乙酸-乙酸钠缓冲液(25mM，pH 5.8)中，加热至50℃溶解，制成组分B：明胶溶液，pH值为4～9；
混合成胶
将上述明胶溶液和活化的透明质酸钠溶液分别吸入2个注射器中，将注射器安装于出口装有混合管的三通接头，同时挤压二个注射器，二个注射器中的溶液以1：1的体积比通过混合管混合，混合均匀的溶液凝固形成凝胶。
实施例4
一种原位成型的可注射水凝胶材料，包括组分A和组分B，
其中，组分A和组分B的配制如下：
取200mg海藻酸钠，溶解于10ml生理盐水，然后加入200mg EDC和200mg NHS，待溶解后，等待30分钟，得到组分A：活化的海藻酸钠溶液，pH值为4～8；
取1g明胶，加入到9.5ml溶解100mg海藻酸钠的生理盐水中，加热至60°，摇动容器，待明胶全部溶解，再加入100mg抗坏血酸，混合溶解，制成组分B：明胶/海藻酸钠溶液，pH值为4～9；
混合成胶
将上述活化的海藻酸钠溶液和明胶/海藻酸钠溶液分别吸入2个注射器中，将注射器安装于出口装有混合管的三通接头，同时挤压二个注射器，二个注射器中的溶液以1：1的体积比通过混合管混合，混合均匀的溶液凝固形成凝胶。
实施例5
一种原位成型的可注射水凝胶材料，包括组分A和组分B，
其中，组分A和组分B的配制如下：
取200mg透明质酸钠，溶解于10ml PBS溶液(pH 6)，然后加入200mg EDC和200mgNHS，待溶解后，等待30分钟，得到组分A：活化的透明质酸钠溶液，pH值为4～8；
取2g明胶，加入到4ml PBS溶液(pH 7.4)中，加热至60℃，摇动容器，待明胶全部溶解，再加入5ml去端肽牛胶原蛋白乙酸溶液(4mg/ml)，混匀，配制成组分B：明胶/胶原蛋白溶液，pH值为4～9；
混合成胶
将上述活化的海藻酸钠溶液和明胶/胶原蛋白溶液分别吸入2个注射器中，将注射器安装于出口装有混合管的三通接头，同时挤压二个注射器，二个注射器中的溶液以1：1的体积比通过混合管混合，混合均匀的溶液凝固形成凝胶。
实施例6
一种原位成型的可注射水凝胶材料，包括组分A和组分B，
其中，组分A和组分B的配制如下：
取200mg海藻酸钠，溶解于10ml MES溶液(50mM，pH 6)，然后加入200mg EDC和200mg NHS，待溶解后，等待30分钟，得到组分A：活化的海藻酸钠溶液，pH值为4～8；
取1g明胶，加入到9.5ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(10mM，pH 6)中，加热至60℃，摇动容器，待明胶全部溶解，再加入200mg去端肽牛纤维性胶原蛋白粉，混匀，配制成组分B：明胶/胶原蛋白悬浊液，pH值为4～9；
混合成胶
将上述活化的羧甲基纤维素钠溶液和明胶/胶原蛋白悬浊液分别吸入2个注射器中，将注射器安装于出口装有混合管的三通接头，同时挤压二个注射器，二个注射器中的流体以1：1的体积比通过混合管混合，混合均匀的流体凝固形成凝胶。
实施例7
一种原位成型的可注射水凝胶材料，包括组分A和组分B，
其中，组分A和组分B的配制如下：
取200mg羧甲基纤维素钠，溶解于10ml MES溶液(50mM，pH 6)，然后加入200mg EDC和200mg NHS，待溶解后，等待30分钟，得到组分A：活化的羧甲基纤维素钠溶液，pH值为4～8；
取300mg去端肽牛纤维性胶原蛋白粉，加入到10ml溶解100mg羧甲基纤维素钠(中和剂)的MES缓冲液(pH 6)中，再加入10mg亚甲基蓝，混合均匀，配制为组分B：胶原蛋白/羧甲基纤维素钠悬浊液，pH值为4～9；
混合成胶
将上述胶原蛋白/羧甲基纤维素钠悬浊液和活化的羧甲基纤维素钠溶液分别吸入2个注射器中，将注射器安装于出口装有混合管的三通接头，同时挤压二个注射器，二个注射器中的流体以1：1的体积比通过混合管混合，混合均匀的流体凝固形成凝胶。
实施例8
一种原位成型的可注射水凝胶材料，包括组分A和组分B，
其中，组分A和组分B的配制如下：
取200mg透明质酸钠，溶解于10ml MES溶液(50mM，pH 6)，然后加入200mg EDC和200mg NHS，待溶解后，等待30分钟，得到组分A：活化的透明质酸钠，pH值为4～8；
取300mg纤维性胶原蛋白粉，加入到10ml去端肽牛胶原蛋白乙酸溶液(4mg/ml)中，混合均匀，用氢氧化钠溶液调节溶液pH值至6，配制成组分B：胶原蛋白悬浊液，pH值为4～9；
混合成胶
将上述胶原蛋白悬浊液和活化的透明质酸钠溶液分别吸入2个注射器中，将注射器安装于出口装有混合管的三通接头，同时挤压二个注射器，二个注射器中的流体以1：1的体积比通过混合管混合，混合均匀的流体凝固形成凝胶。
实施例9
本实施例探讨NHS对EDC偶联凝胶原料的影响。
实验先用PBS(pH 6.0)配制10％(w/w)明胶溶液、2％海藻酸钠溶液、10％EDC溶液和10％NHS溶液，然后将明胶溶液、海藻酸钠溶液和一定量的PBS混合。
对应无NHS的配方，再加入EDC溶液，混合物中明胶、海藻酸钠和EDC终浓度依次为5％、0.5％、0.3％；
对应有NHS的配方，加入EDC溶液和NHS溶液，混合物中明胶、海藻酸钠、EDC和NHS终浓度依次为5％、0.5％、0.3％、0.3％。
将上述二种混合溶液均匀混合后，在37℃静置2小时，观察混合溶液流动状态。发现无NHS混合物仍处于流动状态，添加NHS的混合物为凝固状态，当上述混合物中EDC/NHS浓度减少至0.2％，同样发现无NHS混合物为流动状态，添加NHS的混合物完全凝固。说明NHS有助于EDC偶联明胶/海藻酸钠，使用NHS可以降低合成凝胶材料的EDC用量。
实施例10
本实施例探讨链接大分子在水凝胶中的含量对凝胶材料水溶解性和酶解稳定性的作用。
参照本发明材料制备实施例1，实验用50mM MES(pH 6.0)配制20％(w/w)明胶溶液和不同浓度海藻酸钠溶液，然后用EDC活化的海藻酸钠溶液，活化时间为半小时，之后明胶溶液和不同浓度活化的海藻酸钠溶液等体积混合，最终混合液中明胶和EDC浓度分别是10％和1％，海藻酸钠浓度是0、0.5％、1％或1.5％。
将新鲜配制的凝胶混合溶液500ul置于聚四氟乙烯板上，在保湿盒中放置室温过夜，称重。然后各海藻酸钠含量的凝胶样品均随机分为三组：
将海藻酸钠浓度为0的凝胶样品分为三组，
海藻酸钠浓度为0.5％的凝胶样品分为三组，
海藻酸钠浓度为1％的凝胶样品分为三组，
海藻酸钠浓度为1.5％的凝胶样品分为三组。
第一组对照组是将样品在室温晾干，称重；
第二组温水组是将样品放入37℃的去离子水中，在37℃放置3个半小时，取出，室温晾干，称重；
第三组酶解组是将样品置于含0.1％胰蛋白酶的PBS缓冲液(pH7.4)中，在室温放置40分钟，取出，室温凉干，称重。
计算各组凝胶的保留重量百分比(Wt/W0×100％),Wt是样本在37℃的去离子水放置3个半小时或酶解40分钟后的干重，W0是凝胶样本对应相同海藻酸钠含量水凝胶、相同起始重量、直接干燥后样本的重量，不同海藻酸钠含量凝胶对照组的保留重量百分比作为100％。研究发现随着海藻酸钠含量的增加，凝胶材料在温水和胰蛋白酶溶液中的保留重量百分比均呈增加趋势(如图1)，说明海藻酸钠作为链接分子能够增强凝胶材料的稳定性。
实施例11
实验用乙酸钠为例，探讨向反应体系中添加中和分子对明胶交联的影响，同时也研究一步合成法和二步合成法对EDC交联明胶的影响。
用50mM MES溶液(pH 6.0)配制10％(w/w)明胶溶液、5％(w/v)EDC溶液和100mM乙酸钠溶液(pH 6.0)，
一步合成法先将50mM MES溶液(pH 6.0)、10％(w/w)明胶溶液和100mM乙酸钠溶液(pH 6.0)按一定体积比混合后，立即加入5％ EDC溶液，混合液中明胶、EDC的终浓度分别为5％和0.2％，乙酸钠终浓度为0、5、10、20、30、40或48mM，将混合溶液置于37℃放置2小时，观察混合溶液流动状态；
二步合成法是先将50mM MES溶液(pH 6.0)、100mM乙酸钠溶液(pH 6.0)和5％ EDC溶液，按一定体积比混合后，室温静置1小时，然后与相同体积的10％明胶溶液混合，混合液中明胶、EDC的终浓度分别为5％和0.2％，乙酸钠终浓度为0、5、10、20、30、40或48mM，将混合液置于37℃静置2小时，观察混合溶液流动状态。
混合液在37℃静置2小时后，不管是一步合成法还是二步合成法体系，发现随着乙酸钠浓度增加，反应产物都从凝固态递变为流动态(表1)，表明乙酸钠能够消耗EDC，乙酸钠浓度越高，消耗的EDC越多，与明胶反应的EDC越少，从而降低明胶的交联程度。
对比一步合成法和二步合成法，在乙酸钠5～40mM范围，对应相同乙酸钠浓度，二步合成法产物流动性较一步交联法产物流动性强，说明二步合成法中，相同浓度的羧基能够更有效地消耗EDC，从而降低与明胶反应的EDC浓度，进而降低明胶交联程度。
本对比例揭示含羧基的中和剂和二步合成法先将链接剂与交联活化剂反应，活化为A组分，然后再与胶原蛋白/明胶B组分混合，均有助于降低最终反应体系中EDC的量。
表1.乙酸钠和合成流程对明胶偶联的影响
实施例12
本发明的凝胶材料组织贴附及防止组织渗漏测试
优秀的组织愈合促进材料需要具有紧密贴附于各种目标组织表面的能力，本实验检测凝胶材料的贴附性和防止组织渗漏的功能。
实验先在猪小肠壁制造一个直径2mm的孔，然后在小孔处涂覆实施例2制备的含10％明胶/1％羧甲基纤维素凝胶材料，待凝胶完全凝固，小肠一端开口用止血钳夹住，另一端开口连接带压力计的充气球囊，向小肠中充气，当封堵肠壁小孔的水凝胶发生破裂，记录小肠内的最高压力，定义该压力为凝胶的顶破压强。
对比材料是按照实施例2制备不含羧甲基纤维素的凝胶材料，对照凝胶材料的顶破压强为8.1±0.5kPa，实施例2凝胶材料的顶破压强为11.8±1.2kPa，揭示凝胶材料，特别是含链接分子羧甲基纤维素的凝胶材料，有能够紧密贴附于组织表面，而且具有相当的力学强度，具有防治组织渗漏的功能。
其他实施例1-8均具有与实施例2相当的力学强度。
实施例13
本发明凝胶材料止血效果
采用大鼠肝出血模型测试水凝胶止血性能，使用30只无特定病原体的SD大鼠(雄性170～190g)，麻醉大鼠后，将其固定在泡沫板上，剃腹部毛发，然后沿腹中线长为4cm的切口，从腹腔中拉出肝脏，在肝脏下放置预称重的滤纸，用18G针头以30°穿刺大鼠肝脏左外叶，深度10mm，之后立即在伤口涂覆0.2mL实施例2制备的含10％明胶/1％羧甲基纤维素的凝胶材料或不含羧甲基纤维素的对照凝胶材料，3min后，称量滤纸上吸附的血液。
对照组是在肝损伤后，不用任何材料，测量损伤后3分钟的出血量。
不使用任何材料封堵的空白对照组肝脏失血536±172mg，使用不含羧甲基纤维素的凝胶材料或含1％羧甲基纤维素的10％明胶凝胶材料，大鼠肝脏失血量显著降低，分别降至396±154mg和262±115mg，揭示凝胶材料具有止血功能，特别是实施例2制备的含10％明胶/1％羧甲基纤维素凝胶材料止血性能较好。
实施例14
本发明凝胶材料的细胞相容性。
采用实施例3的方法先制备含2％透明质酸钠、2％EDC和2％NHS的组分A和含20％明胶的组分B，组分A和组分B分别通过孔径0.6μm的滤膜除去可能存在的细菌，然后按照实施例3方法混合并注射于24孔细胞培养板孔中，覆盖孔整个低部，室温静置，待材料凝固，将1×104个小鼠成纤维细胞细胞加入孔中，培养1天后，许多细胞贴附于凝胶材料表面，随着培养时间的增加，细胞密度逐渐增加，直至完全铺满凝胶材料表面(图2)。
证明本发明凝胶材料生物相容性好，其他实施例也均具有良好的生物相容性。
实施例15
本发明凝胶材料的防治组织粘连
实施例以大鼠为模型。取20只年龄相同、健康状况良好的大鼠，分成二组，每组10只。对各组的每只大鼠进行以下手术处理：麻醉大鼠，沿腹中线切开腹部皮肤，再沿腹白线肌肉打开腹部，取出盲肠，用牙刷刷盲肠100次，造成面积约1cm×2cm的点状出血损伤，在盲肠所在侧距腹中线1cm处的腹壁内表面剥离一片面积1cm×2cm的浅层肌肉。
对照组直接将损伤的盲肠放回腹腔，其损伤面贴近肌肉损伤面，然后关腹，依次缝合肌肉和皮肤。
凝胶组将实施例5制备的0.5ml组分A和组分B混合物均匀涂抹于腹壁和盲肠损伤处，待材料凝固后，腹壁和盲肠的损伤面贴近，关腹，再依次缝合肌肉和皮肤。饲养2周后，处死大鼠，U型切口打开腹腔，观察大鼠腹壁和盲肠之间的粘连状况。
研究发现对照组所有大鼠的腹壁和盲肠发生粘连(图3A)，而凝胶材料凝胶组大鼠腹壁和盲肠没有发生粘连(图3B)。
实施例16
本发明凝胶材料促进组织愈合
将上述实施例15粘连对比实施例处死大鼠，打开腹腔，小心拉开粘连组大鼠粘连在一起的腹壁和盲肠，观察腹部损伤肌肉以及腹中线对侧非损伤肌肉表面色泽和形态，发现大鼠未损伤腹壁肌肉表面平整，色泽红润(图4A1)，对照组大鼠损伤的腹壁浅层肌肉层缺失明显，缺损面上只有少量新生组织(图4B1)，使用本发明实施例5所制备的凝胶材料处理的大鼠腹部损伤，肌肉缺损面盖有一层厚的新生组织，色泽红润，状况接近正常肌肉层(图4C1)。
取大鼠未损伤以及损伤腹壁肌肉，福尔马林固定，石蜡包埋，用组织切片机切5μm厚的切片，用苏木精-伊红染色，显微镜观察，发现大鼠非损伤腹壁肌肉从外到内有3层肌肉(图4A2)，大鼠腹部内表层肌肉剥离后，对照组大鼠饲养2周后，其表层肌肉仍缺失，只有少许新基质(图4B2)；大鼠腹部肌肉表层剥离后，覆盖凝胶材料，饲养2周后，大鼠腹部肌肉表层填充基本完成(图4C2)。
上述对比可以证明本发明的实施例1-8制备的凝胶材料生物相容性好，能够使损伤肌肉层愈合。
显然，本发明的上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种原位成型的可注射水凝胶材料，其特征在于，包括二个流体组分：组分A和组分B，其中组分A为活化的链接剂溶液，pH值为4～8，组分B为胶原蛋白和/或明胶流体，pH值为4～9，
组分A和组分B在使用前独立存在，使用时将组分A和组分B混合，化学交联得到水凝胶材料。
2.如权利要求1所述原位成型的可注射水凝胶材料，其特征在于，所述组分A中链接剂包括透明质酸、海藻酸、羧甲基纤维素钠、羧甲淀粉钠及其衍生物中的任意一种或混合，链接剂在可注射水凝胶材料中的质量含量为0.01～5％。
3.如权利要求1原位成型的可注射水凝胶材料，其特征在于，所述组分A中的活化的活化剂包括1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺或其盐酸盐，活化剂在可注射水凝胶材料中的质量含量为0.1～3％。
4.如权利要求1原位成型的可注射水凝胶材料，其特征在于，所述组分A的配置方法如下：
将链接剂和活化剂共同溶解于不含羧基的溶剂中，控制溶解体系pH值为4～8，活化反应时间≥5min，活化得到组分A。
5.如权利要求1所述原位成型的可注射水凝胶材料，其特征在于，所述组分B为胶原蛋白和/或明胶溶解于或悬浮于水溶液中，形成可以注射的流体，胶原蛋白在可注射水凝胶材料中质量含量为0.1～15％，明胶在可注射水凝胶材料中质量含量为1～30％。
6.如权利要求1所述原位成型的可注射水凝胶材料，其特征在于，所述组分B中还包括中和剂，所述中和剂为含有羧基的有机分子或能产生含有羧基的有机分子。
7.如权利要求6所述原位成型的可注射水凝胶材料，其特征在于，所述组分B中的中和剂羧基或其产生的羧基摩尔量是交联活化剂摩尔量的0.1～10倍。
8.如权利要求1所述原位成型的可注射水凝胶材料，其特征在于，所述组分B中还包含显色剂。
9.一种权利要求1～8任意一项所述原位成型的可注射水凝胶材料在制备组织修复制剂中的应用。
10.一种由权利要求1～8任意一项所述原位成型的可注射水凝胶材料制备得到的组织修复制剂，其特征在于，由如下方法制备得到：
将组分A装入注射器1中，将组分B装入注射器2中，将注射器1和注射器2安装于一个三通接头的二个入口，同时挤出二个流体，二个流体通过安装于三通接头出口的混合管均匀混合，或用三通接头出口搅动挤出的溶液，使二个溶液均匀混合,凝固形成组织修复制剂。
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