KR20240060716A - 가교된 단백질 폼의 생성을 위한 분말 조성물 및 그 이용 방법 - Google Patents

가교된 단백질 폼의 생성을 위한 분말 조성물 및 그 이용 방법 Download PDF

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KR20240060716A
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Abstract

일 실시형태에서, 본 발명은 a) 콜라겐 및 젤라틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 가교성 단백질; b) 가교성 단백질의 가교를 유도하는 가교제; 및 c) 액체를 포함하는 조성물을 제공하며, 조성물은 다공성 스캐폴드이며, 스캐폴드의 포어는 2 내지 500 미크론이다.

Description

가교된 단백질 폼의 생성을 위한 분말 조성물 및 그 이용 방법{POWDER COMPOSITIONS FOR GENERATING CROSS-LINKED PROTEIN FOAMS AND METHODS OF USING THEREOF}
관련 출원에 관한 상호 참조
본 출원은 전체 내용이 참조로 포함되는 2015년 4월 3일자 출원된 미국 가특허 출원 제62/142,715호, 2015년 4월 3일자 출원된 미국 가특허 출원 제62/142,725호, 2015년 4월 3일자 출원된 미국 가특허 출원 제62/142,732호, 2015년 4월 3일자 출원된 미국 가특허 출원 제62/142,738호, 2015년 4월 3일자 출원된 미국 가특허 출원 제62/142,713호에 대한 우선권을 주장한다.
기술분야
본 발명은 가교성 단백질 및 가교성 단백질의 가교를 유도하는 무독성 물질을 포함하는 개선된 가교된 조성물에 관한 것이다.
동일계 내에서 겔을 형성할 수 있는 생체재료(biomaterial)는 다양한 응용, 예를 들어, 조절된 약물 전달을 위한 주사 가능한 매트릭스, 조직 공학을 위한 주사 가능한 스캐폴드(scaffold), 또는 생리학적 환경에서 조직을 접합시키거나, 기체 또는 유체 누출을 밀봉하기 위한 접착제를 위해 유용하다.
미국 특허출원 공개공보 제2011/0112573호
일 실시형태에서, 본 발명은
a) 콜라겐 및 젤라틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 가교성 단백질;
b) 가교성 단백질의 가교를 유도하는 가교제; 및
c) 액체를 포함하는 조성물을 제공하며,
조성물은 다공성 스캐폴드이며,
스캐폴드의 포어는 2 내지 500 미크론이다.
일 실시형태에서, 액체는 생리학적 완충제이다.
일 실시형태에서, 조성물은 폼(foam)이다.
일 실시형태에서, 가교성 단백질은 5 내지 200 미크론의 평균 입자 크기를 갖는 미분화된 단백질 분말로서 조성물 내로 도입된다.
일 실시형태에서, 가교성 단백질은 200 내지 300 블룸(bloom)의 젤라틴을 포함한다.
일 실시형태에서, 가교성 젤라틴은 0.5 wt% 내지 25 wt%의 범위로 조성물에 존재한다.
일 실시형태에서, 가교제는 트랜스글루타미나제이다.
일 실시형태에서, 트랜스글루타미나제는 0.0001 wt% 내지 2 wt%의 범위로 조성물에 존재한다.
일 실시형태에서, 본 발명은
a) 가교성 젤라틴;
b) 가교성 젤라틴의 가교를 유도하는 트랜스글루타미나제; 및
c) 액체를 포함하는 조성물을 제공하며,
조성물은 2 내지 500 미크론의 포어 크기를 갖는 다공성 스캐폴드이며,
가교성 젤라틴은 5 내지 200 미크론의 입자 크기를 갖는 미분화된 젤라틴 분말로서 조성물 내로 도입되며,
가교성 젤라틴은 200 내지 300 블룸이며,
가교성 젤라틴은 0.5 wt% 내지 25 wt% 범위로 조성물에 존재하며,
트랜스글루타미나제는 0.0001 wt% 내지 2 wt%의 범위로 조성물에 존재한다.
일 실시형태에서, 액체는 생리학적 완충제이다.
일 실시형태에서, 조성물은 환자에서 환자가 조직 결손의 치료를 필요로 하는 부위에 동일계 내에서 형성된다.
일 실시형태에서, 조성물은 조성물을 환자가 조직 결손의 치료를 필요로 하는 부위에서 환자 내로 도입하기 이전에 형성된다.
일 실시형태에서, 본 발명은
a) 조성물을 조직 결손 또는 질환을 치료하기에 충분한 양으로 조직 결손 부위에서 환자 내로 도입하는 단계로서,
조성물이 결손의 부위에서 조직에 결합하는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 조직 결손 또는 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 조직 결손 또는 질환을 치료한다.
일 실시형태에서, 본 발명은
a) 조성물을 조직 결손 또는 질환을 치료하기에 충분한 양으로 환자에서 조직 결손 부위에 형성하는 단계로서,
조성물이 결손의 부위에서 조직에 결합하는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 조직 결손 또는 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 조직 결손 또는 질환을 치료한다.
일 실시형태에서, 조직 결손은 상처이다.
일 실시형태에서, 조직은 손상되며, 재생을 필요로 한다.
일 실시형태에서, 조직 결손은 뼈 결손이다.
일 실시형태에서, 조성물은 환자에서 뼈의 재생을 유도한다.
일 실시형태에서, 질환은 대변 실금이다.
일 실시형태에서, 질환은 요실금이다.
일 실시형태에서, 질환은 폐기종이다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 세포 유형이 조성물 내로 침윤하고, 조성물 내에서 성장한다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 세포 유형은 췌장 줄기세포, 장내분비 세포, 뼈세포, 간세포, 건세포, 근세포, 혈구, 연골세포, 상피 세포, 내피세포, 뉴런, 배아 줄기세포, 중간엽 줄기세포, 자가 골수-유래 중간엽 줄기세포, 전구 세포, 조혈 줄기세포, 중간엽 줄기세포, 신경 줄기세포, 골계(bone system) 줄기 세포, 연골세포주 줄기세포, 상피 줄기세포 및 간 줄기세포로 이루어진 군으로부터의 세포 유형이다.
일 실시형태에서, 본 발명은
a) 환자의 폐 내의 표적 영역을 붕괴시키는 단계;
b) 조성물을 붕괴된 영역의 제1 부분을 붕괴된 영역의 제2 부분에 접착시키기에 충분한 양을 붕괴된 영역의 부위에서 환자 내로 도입하는 단계로서,
붕괴된 영역의 제2 부분으로의 붕괴된 영역의 제1 부분의 접착이 환자의 폐 용적을 감소시키며,
조성물이 섬유아세포 부착 및 콜라겐 합성을 촉진하도록 구성되며,
섬유아세포 부착 및 콜라겐 합성이 염증을 예방하는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 환자에서 폐 용적을 감소시킨다.
일 실시형태에서, 본 발명은
a) 조성물을 폐 용적을 감소시키기에 충분한 양으로 폐 영역의 부위에서 환자 내로 도입하는 단계로서,
조성물이 섬유아세포 부착 및 콜라겐 합성을 촉진하도록 구성되며,
섬유아세포 부착 및 콜라겐 합성이 염증을 예방하는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 환자에서 폐 용적을 감소시킨다.
일 실시형태에서, 본 발명은
a) 환자의 폐 내의 표적 영역을 붕괴시키는 단계;
b) 조성물을 붕괴된 영역의 제1 부분을 붕괴된 영역의 제2 부분에 접착시키기에 충분한 양으로 환자에서 붕괴된 영역의 부위에 형성하는 단계로서,
붕괴된 영역의 제2 부분으로의 붕괴된 영역의 제1 부분의 접착이 환자의 폐 용적을 감소시키며,
조성물이 섬유아세포 부착 및 콜라겐 합성을 촉진시키도록 구성되며,
섬유아세포 부착 및 콜라겐 합성이 염증을 예방하는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 환자에서 폐 용적을 감소시킨다.
일 실시형태에서, 본 발명은
a) 조성물을 폐 용적을 감소시키기에 충분한 양으로 환자에서 폐 영역의 부위에 형성하는 단계로서,
조성물이 섬유아세포 부착 및 콜라겐 합성을 촉진시키도록 구성되며,
섬유아세포 부착 및 콜라겐 합성이 염증을 예방하는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 환자에서 폐 용적을 감소시킨다.
도 1은 본 발명의 일부 실시형태에 따른 미분화된 단백질의 입자 크기 분포를 보여주는 그래프이다.
도 2A는 본 발명의 일부 실시형태에 따른 조성물을 환자의 요도로 전달하기 위한 장치를 보여주는 사진이다. 도 2B는 환자의 요도에서의 동일계 내의 본 발명의 일부 실시형태에 따른 조성물의 형성을 보여주는 사진이다.
도 3은 본 발명의 조성물을 형성하기 위한 본 발명의 일부 실시형태에 따른 장치의 사진이다.
도 4는 장 손상 부위에 접착된 본 발명의 일부 실시형태에 따른 조성물의 사진이다.
도 5는 돼지의 항문 조임근 내로 주사된 본 발명의 일부 실시형태에 따른 조성물의 사진이다.
도 6은 하악골 결손을 채우는 본 발명의 일부 실시형태에 따른 조성물의 사진이다. 도 6b는 개의 좌측 하악골을 보여준다: A - 무손상 소구치 2; B - 시험 화합물을 사용하지 않은 대조군 빈 소켓; C - 단독의 MIS 4 BONE; D - MIS 4 BOND 및 가교된 젤라틴/GAG 폼을 함유하는 혼합된 시험 화합물. 도 6c에서, 개의 우측 하악골을 보여준다: A - 건강한 소구치 2; B - 빈 소켓; C - 단독의 MIS 4 BOND; D - 단독의 가교된 젤라틴 폼.
도 7은 돼지의 요도 내로 주사된 본 발명의 일부 실시형태에 따른 조성물의 사진이다.
도 8은 본 발명의 일부 실시형태에 따른 조성물의 현미경 사진이다.
도 9는 본 발명의 일부 실시형태에 따른 제트 밀링(jet milling) 장치의 사진이다.
도 10은 본 발명의 일부 실시형태에 따른 스캐폴드 조성물 내에 씨딩된 세포의 생존력을 보여준다.
도 11은 본 발명의 일부 실시형태에 따른 스캐폴드 조성물의 사진이다.
개시내용을 명확하게 하기 위하여, 그리고 제한 없이, 본 발명의 상세한 설명은 본 발명의 특정 특징, 실시형태 또는 응용을 설명하거나 예시하는 하기의 하위섹션으로 나뉜다.
본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 하기 용어는, 문맥에서 명백하게 다르게 명시하지 않는 한 본원에서 명백하게 하기의 의미를 갖는다. 본 명세서에 사용되는 어구 "일 실시형태에서" 및 "일부 실시형태에서"는, 반드시 동일한 실시형태(들)를 지칭하는 것은 아니지만, 그럴 수도 있다. 또한, 본 명세서에 사용되는 어구 "다른 실시형태에서" 및 "일부 다른 실시형태에서"는, 반드시 상이한 실시형태를 지칭하는 것은 아니지만, 그럴 수도 있다. 따라서, 후술하는 바와 같이, 본 발명의 다양한 실시형태는 본 발명의 범위 또는 목적에서 벗어남 없이 용이하게 조합될 수 있다.
또한, 본원에 사용되는 용어 "또는"은 포괄적인 "논리합(or)" 연산자이며, 문맥이 명백히 달리 명시하지 않는 한, 용어 "및/또는"과 동등하다. 용어 "~에 기초한"은 한정적인 것이 아니며, 문맥이 명백히 달리 명시하지 않는 한, 기술되지 않은 추가의 인자에 기초하는 것을 허용한다. 또한, 명세서 전반에 걸쳐, 단수("a," "an") 및 상기("the")의 의미는 복수의 지시대상을 포함한다. "~내에"의 의미는 "~내에" 및 "~상에"를 포함한다.
본원에 사용되는 "젤라틴"은 동물 조직 또는 동물 조직으로부터 수득 되는 콜라겐의 부분적인 가수분해에 의해 수득 되며, 동물 조직은 동물 피부, 연결 조직, 가지진 뿔(antler), 뿔(horn), 뼈, 어류 비늘, 및 박테리아, 효모, 동물, 곤충 또는 식물계 또는 임의의 유형의 세포 배양물을 사용하여 생성되는 재조합 젤라틴 또는 그들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 사용되는 "블룸"은 10℃에서 17시간 동안 겔화되는 6% 고형물을 함유하는 젤라틴 용액으로 2분의 1 인치 직경의 플런저를 4 ㎜ 누르는데 필요한 그램 단위의 중량으로 정의된다.
본원에 사용되는 "담체"는 가교 반응 이전에 또는 가교 반응 동안에 가교 효소에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합하는 폴리머, 단백질, 다당류 또는 임의의 다른 구성성분을 지칭한다.
본원에 사용되는 "코-폴리머"는 가교 반응에 참여할 수 있는 매트릭스의 구성성분을 지칭하며, 전형적으로, 매트릭스의 주요 구성성분이 아니다. 코-폴리머는 전형적으로 효소 또는 매트릭스 물질, 예를 들어, 매트릭스의 단백질 베이스에 공유적으로 결합되지 않는다. 코-폴리머의 비제한적인 예에는 다당류, 예를 들어, 덱스트란 및/또는 셀룰로스 폴리머, 예를 들어, 카복시메틸 셀룰로스가 있다.
본원에 사용되는 "가교 효소"는 폴리머 가닥 상의 기질 기를 직접적으로(예를 들어, 이에 국한되지 않지만, 트랜스글루타민화(transglutamination)) 또는 간접적으로(예를 들어, 이에 국한되지 않지만, 퀴논 또는 유리 라디칼 형성) 가교시켜, 매트릭스, 예를 들어, 이에 국한되지 않지만, 하이드로겔을 형성할 수 있는 적어도 하나의 효소(예를 들어, 이에 국한되지 않지만, 1가지 효소, 2가지 효소, 3가지 효소, 4가지 효소, 5가지 효소 등)를 지칭한다.
본원에 사용되는 "확산" 또는 "이동성"은 브라운 운동으로부터 초래될 수 있는 용액 중 존재하는, 예를 들어, 이에 국한되지 않지만, 효소(들) 및/또는 다른 분자, 예를 들어, 이에 국한되지 않지만, 임의의 단백질, 수소 또는 매트릭스의 무작위 분자 운동을 지칭한다.
본원에 정의되는 "확산 계수" 또는 "확산도"는 특정 조건하의 단일 유형의 분자에 대한 확산 정도를 정량화하는 용어를 지칭한다. 구체적으로, 확산 계수 또는 확산도는 분자 확산으로 인한 몰 유량과 화학종의 농도의 기울기(또는 확산을 위한 추진력) 간의 비례, 상수이다. 즉, 하이드로겔에 의해 용리되는 효소의 속도 및/또는 그의 총량의 측정 방법은 하이드로겔로부터의 효소의 용리를 측정함으로써 행해진다.
본원에 정의되는 "유체역학적 부피"는 전형적으로 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 측정될 수 있는 단백질 또는 효소의 분자량을 나타낸다. 구성성분의 유체역학적 부피는 구성성분이 액체 형태에서 운동하는 경우 가정하는 직경 및/또는 부피를 나타낸다.
본원에 정의되는 "매트릭스"는 가교된 물질의 조성물을 지칭한다. 전형적으로, 매트릭스-형성 물질이 가교되는 경우, 이들 물질을 포함하는 조성물은 액체 상태에서 겔 상태로 전이함으로써 "겔", "하이드로겔" 또는 "겔화 조성물"을 형성한다.
본원에 사용되는 "MW"로 약칭되는 "분자량"은 단백질 또는 폴리머의 달톤 또는 킬로달톤 단위의 절대 중량을 지칭한다. 예를 들어, PEG화 단백질(예를 들어, 이에 국한되지 않지만, 하나 이상의 PEG(폴리에틸렌 글리콜) 분자가 결합된 단백질)의 MW는 그의 구성성분 전부의 MW 합이다.
본원에 사용되는 "환자"는 본 발명의 방법에 따른 치료를 필요로 하는 임의의 동물을 지칭한다.
본원에 정의되는 "인지 부피" 또는 "유효 부피"는 가교된 매트릭스 내측의 가교 효소의 유체역학적 유효 부피를 지칭한다. 인지 부피는 가교 반응 이전 또는 가교 반응 동안 다른 분자, 담체, 폴리머, 단백질, 다당류 및 다른 것들로의 효소의 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 증가될 수 있다.
본원에 사용되는 "폴리머"는 반복가능한 단위를 함유하는 천연, 합성 또는 반-합성 분자를 지칭한다.
본원에 정의되는 "감소된 이동성"은 용액 중의 또는 하이드로겔 내측의 단백질 또는 효소의 보다 느린 분자 운동 또는 보다 작은 확산 계수를 지칭하며, 용리 속도에 의해 측정될 수 있다.
본원에 정의되는 "크기"는 분자의 분자량 또는 유체역학적 부피 또는 인지 부피를 지칭한다.
본원에 정의되는 "밀링"은 하기의 방법 중 임의의 것에 의한 물질의 그라인딩(grinding)을 지칭한다: 제트 밀링, 선회/와류 밀링, 볼 밀링, 고압 균질화 및 미세유동화, 분무 건조, 재결정화, 에멀젼-용매 추출 및 초임계유체, 예를 들어, 초임계 유체 급속 팽창(RESS)을 사용하는 방법.
"제트 밀링"은 선회 또는 와류 밀링에 의한 미분화 방법을 지칭한다.
가교성 단백질
방법 및/또는 매트릭스에 대한 적어도 일부의 실시형태에 따르면, 적어도 하나의 기질 폴리머는 천연 가교성 폴리머, 효소에 의해 가교가능한 부분 변성 폴리머, 및 비-변형된 또는 변형된 효소에 의해 가교 가능한 작용기 또는 펩티드를 포함하는 폴리머로 이루어진 군으로부터 선택되는 기질 폴리머를 포함한다. 선택적으로, 적어도 하나의 기질 폴리머는 젤라틴, 콜라겐, 카제인 또는 알부민, 또는 변형된 폴리머를 포함하며, 변형된 효소 분자는 트랜스글루타미나제 및/또는 산화 효소, 변형된 트랜스글루타미나제 및/또는 변형된 산화 효소를 포함한다. 선택적으로, 적어도 하나의 기질 폴리머는 동물 조직 또는 동물 조직으로부터 수득되는 콜라겐의 부분적 가수분해에 의해 수득 되는 젤라틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 젤라틴을 포함하며, 동물 조직은 동물 피부, 연결 조직, 가지진 뿔, 뿔, 뼈, 어류 비늘, 및 박테리아, 효모, 동물, 곤충 또는 식물계 또는 임의의 유형의 세포 배양물을 사용하여 생성되는 재조합 젤라틴 또는 그들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 선택적으로, 젤라틴은 포유동물 또는 어류 기원이다. 선택적으로, 젤라틴은 A형(산 처리) 또는 B형(알칼리 처리)이다. 선택적으로, 젤라틴은 250 내지 300 블룸이다. 일부 실시형태에서, 젤라틴은 75 내지 150 kda의 평균 분자량을 갖는다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 적합한 작용기를 갖는 합성 또는 부분 합성 폴리머는 또한, 본원에 기재된 효소 중 임의의 것에 대한 가교 가능한 기질로서 제공될 수 있다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 효소의 조합이 사용된다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 가교제의 조합이 사용되며, 반드시 효소만 사용되는 것은 아니다.
일부 실시형태에서, 가교성 폴리머는 적어도 하나의 RGD(Arg-Gly-Asp) 모티프를 함유한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 RGD 모티프는 본 발명의 조성물로의 세포 부착을 촉진시킨다.
일부 실시형태에서, 세포-유형 또는 이동성 상태와 무관하게, 세포를 위한 스캐폴드로서 제공될 수 있는 가교성 폴리머는 불균일하게 분포된 RGD 모티프를 함유하여, 가교성 폴리머가 다가 세포 스캐폴드가 된다.
따라서, 본 발명은 RGD 모티프의 다가 디스플레이를 통하여 개선된 세포 부착 및 이동성 양립성을 갖는 가교성 폴리머를 제공한다.
따라서, 본 발명은 RGD 모티프의 다가 디스플레이를 통하여 개선된 세포 부착 및 이동성 양립성을 갖는 비-재조합 가교성 폴리펩티드를 제공한다.
따라서, 본 발명은 RGD 모티프의 다가 디스플레이를 통하여 개선된 세포 부착 및 이동성 양립성을 갖는 젤라틴을 제공한다.
따라서, 본 발명은 RGD 모티프의 다가 디스플레이를 통하여 개선된 세포 부착 및 이동성 양립성을 갖는 비-재조합 젤라틴을 제공한다.
따라서, 본 발명은 RGD 모티프의 다가 디스플레이를 통하여 개선된 세포 부착 및 이동성 양립성을 갖는 미분화된 젤라틴을 제공한다.
따라서, 본 발명은 RGD 모티프의 다가 디스플레이를 통하여 개선된 세포 부착 및 이동성 양립성을 갖는 다공성 스캐폴드, 예를 들어, 젤라틴 폼을 제공한다.
따라서, 본 발명은 RGD 모티프의 다가 디스플레이를 통하여 개선된 세포 부착 및 이동성 양립성을 갖는 가교된 다공성 스캐폴드, 예를 들어, 적어도 5 w/w%의 젤라틴을 갖는 젤라틴 폼을 제공한다.
따라서, 본 발명은 RGD 모티프의 다가 디스플레이를 통하여 개선된 세포 부착 및 이동성 양립성을 갖는 가교된 다공성 스캐폴드, 예를 들어, 10 내지 25 w/w%의 젤라틴을 갖는 젤라틴 폼을 제공한다.
따라서, 본 발명은 피브린이 첨가된 언급된 조성물 중 임의의 것을 제공한다.
본원에 정의되는 "폴리머 가닥" 또는 "폴리머 사슬"은 효소 가교를 위한 기질 폴리머를 지칭하며, 이는 본 발명의 적어도 일부 실시형태에 따르면, 하기의 분류 중 하나에 속한다(오직 비제한적인 예로서):
1) 효소에 의해 천연적으로 가교 가능한 기질 기를 갖는 임의의 폴리머, 및 자체가 효소에 의해 천연적으로 가교 가능한 임의의 폴리머. 예를 들어, 트랜스글루타미나제의 경우에, 이것은 효소에 의해 천연적으로 가교 가능한 단백질 또는 폴리펩티드, 예를 들어, 젤라틴, 콜라겐 및 카제인을 포함할 것이다.
2) 효소에 의해 가교 가능한 기질 기를 함유하지만, 그들의 구조의 결과로서 효소에 의해 천연적으로 가교 가능하지 않은 폴리머. 이러한 경우에, 폴리머 구조는 효소 가교 이전에 변형되어야 한다. 예를 들어, 트랜스글루타미나제의 경우에, 이것은 단백질, 예를 들어, 알부민 또는 락토글로불린을 포함할 것이며, 그들이 효소의 접근을 방해하는 구형 구조를 갖기 때문에 이는 효소에 대한 천연 기질이 아니다. 이들은 환원제, 변성제 또는 열을 사용하여 단백질을 부분적으로 변성시킴으로써 기질로 제조될 수 있다.
3) 효소 가교를 위한 기질이 아니지만, 효소의 기질인 펩티드 또는 작용기로 변형되어, 변형된 폴리머가 효소에 의해 가교 가능하게 되는 천연 또는 합성 폴리머. 이러한 폴리머의 비제한적인 예에는 예를 들어, 상기 언급된 바와 같은 젤라틴을 구성할 수 있는 임의의 적합한 유형의 단백질이 포함된다. 젤라틴은 동물 피부, 연결 조직(인대, 연골 등을 포함하지만 이에 제한되지 않음), 가지진 뿔 또는 뿔 등 및/또는 뼈 및/또는 어류 비늘 및/또는 뼈 또는 다른 성분을 포함하나 이에 제한되지 않는 동물 조직 및/또는 동물 조직으로부터 수득 되는 콜라겐의 부분적인 가수분해에 의해 수득 되는 젤라틴; 및/또는 박테리아, 효모, 동물, 곤충 또는 식물계 또는 임의의 유형의 세포 배양물을 사용하여 생성되는 재조합 젤라틴 또는 그들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 해당 분야에 알려져 있는 단백질을 포함하는 임의의 유형의 젤라틴을 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태에 따르면, 동물 기원으로부터의 젤라틴은 포유동물 기원, 예를 들어, 이에 국한되지 않지만, 돼지 피부, 돼지 및 소 뼈 또는 분리된 소 가죽, 또는 임의의 다른 돼지 또는 소 기원 또는 그들의 임의의 조합 중 하나 이상으로부터의 젤라틴을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 젤라틴은 돼지 젤라틴을 포함할 수 있는데, 이는 그것이 더 낮은 비율의 과민증을 갖기 때문이다. 동물 기원으로부터의 젤라틴은 선택적으로 A형(산 처리) 또는 B형(알칼리 처리)일 수 있지만, 그것은 A형일 수 있다.
일부 실시형태에서, 동물 기원으로부터의 젤라틴은 일반적으로 더 낮은 온도(50 내지 60℃이지만, 이러한 정확한 온도 범위는 반드시 제한이 아님)에서 수행되는 제1 추출 동안 수득 되는 젤라틴을 포함한다. 이러한 방식으로 생성되는 젤라틴은 250 내지 300 블룸의 범위일 것이며, 적어도 약 95 내지 100 kDa의 높은 분자량을 갖는다. 일부 실시형태에서, 275 내지 300 블룸 젤라틴이 사용된다. 이러한 젤라틴의 생산처의 비제한적인 예에는 피비 젤라틴즈(PB Gelatins)(벨기에 소재의 테센데를로 그룹(Tessenderlo Group))가 있다.
본 발명의 일부 실시형태에 따르면, 동물 기원으로부터의 젤라틴은 어류로부터의 젤라틴을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 임의의 유형의 어류, 예를 들어, 한류 종 어류, 예를 들어, 잉어, 대구 또는 강꼬치고기 또는 다랑어가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, (10% 용액에서 측정되는) 어류 젤라틴의 pH는 pH 4 내지 pH 6 범위일 수 있다.
일부 실시형태에서, 한류 어류 젤라틴은 10℃ 물에서 용액을 형성한다. 일부 실시형태에서, 한류 어류 젤라틴은 0 블룸이다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 95 내지 115 kDa의 평균 분자량을 포함하는 고분자량 한류 어류 젤라틴이 사용될 수 있다(한류 어류 젤라틴은 250 내지 300 블룸 동물 젤라틴의 분자량과 유사할 수 있다). 일부 실시형태에서, 한류 어류 젤라틴은 감소된 프롤린 및 하이드록시프롤린의 양으로 인하여 동물 젤라틴보다 더 낮은 온도에서 열가역적인 겔화를 겪는다. 이러한 젤라틴의 생산처의 비제한적인 예에는 노를랜드 프로덕츠(Norland Products)(미국 뉴저지주 크랜베리 소재)가 있다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 저 내독소 젤라틴을 사용하여 젤라틴 매트릭스 조성물의 젤라틴 용액 구성성분을 형성한다. 일부 실시형태에서, 저 내독소 젤라틴은 공급처, 예를 들어, 젤리타(Gelita)™(독일 에버바하 소재)로부터 구매가능하다. 본원에 사용되는 저 내독소 젤라틴은 그램당 1000 내독소 유닛(EU) 미만을 갖는 젤라틴으로 정의된다. 일부 실시형태에서, 500 EU/g 미만의 내독소의 젤라틴이 사용된다.
일부 실시형태에서, 척추 또는 뇌 중 어느 하나와 접촉될 물질을 생성하는 경우, 100 EU/g 미만의 내독소를 갖는 젤라틴이 사용된다(예를 들어, 1 내지 l00 EU/g). 일부 실시형태에서, 50 EU/g 미만을 갖는 젤라틴이 사용된다. 일부 실시형태에서, 10 EU/g 미만의 내독소를 갖는 젤라틴이 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태에 따르면, I형, II형 또는 임의의 다른 유형의 가수분해된 또는 비-가수분해된 콜라겐은 가교 되는 단백질 물질로서 젤라틴을 대체한다. 다양한 유형의 콜라겐의 열적으로 안정한 mTG 가교된 겔을 형성하는 능력이 입증되었다. 예를 들어, 문헌["Characterization of a microbial transglutaminase cross-linked type II collagen scaffold"; PMTD: 16846344]에 보고된 바와 같다.
본 발명의 일부 실시형태에 따르면, 재조합 인간 젤라틴이 사용된다. 일부 실시형태에서, 재조합 인간 젤라틴은 공급처, 예를 들어, 피브로겐(Fibrogen)™(미국 캘리포니아주 샌 프란시스코 소재)으로부터 구매 가능하다. 일부 실시형태에서, 재조합 젤라틴은 적어도 약 90%(예를 들어, 90.01 내지 100%)의 순도일 수 있다. 일부 실시형태에서, 재조합 젤라틴은 적어도 약 95%(예를 들어, 95.01 내지 100%)의 순도일 수 있다. 일부 실시형태에서, 재조합 젤라틴은 10℃에서 비-겔화될 수 있으며, 이에 따라, 0 블룸인 것으로 여겨진다. 본 발명의 일부 실시형태를 위하여, 예를 들어, 적어도 약 95 내지 100 kDa의 분자량을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 고 분자량 재조합 젤라틴이 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 가교성 단백질은 젤라틴을 포함할 뿐 아니라, 추가로 또는 대안적으로 다른 유형의 단백질을 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에 따르면, 단백질은 또한 트랜스글루타미나제에 대한 기질이다. 일부 실시형태에서, 트랜스글루타미나제에 대한 기질은 콜라겐 또는 독립적으로 생체접착제를 형성하는 특성을 갖는 다른 합성된 폴리머 서열 또는 트랜스글루타미나제에 의해 가교되는 물질의 능력을 증가시키는 트랜스글루타미나제-특이적 기질로 변형된 폴리머를 포함할 수 있다. 조성물은 또한 피브린을 포함할 수 있다.
예시적인 실시형태에서, 가교에 적절한 트랜스글루타미나제 표적을 갖는 합성된 폴리펩티드 및 폴리머 서열은 약 20 내지 약 40℃의 전이점을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 물리적 특징은 조직에 결합하는 능력 및 섬유질을 형성하는 능력을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 이러한 펩티드의 비제한적인 예는 본원에 완전히 제시되어 있는 것처럼 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제5,428,014호 및 제5,939,385호에 기재되어 있으며, 이에는 생체적합성, 생체접착성, 트랜스글루타미나제 가교성 폴리펩티드가 기재되어 있으며, 트랜스글루타미나제는 단백질-결합 글루타미닐 잔기의 γ-카복사미드기와 라이신 잔기의 ε-아미노기 간의 아실-전달 반응을 촉매작용시켜, 8-(y-글루타밀) 라이신 이소펩티드 결합의 형성을 초래한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 따뜻한 또는 차가운 액체(예를 들어, 이에 국한되지 않지만, 4℃ 내지 37℃의 액체)로 신속하게 수화되어 다공성 스캐폴드, 겔 또는 폼을 형성하도록 구성된 실질적으로 건성인 젤라틴이며, 다공성 스캐폴드, 겔 또는 폼은 추가로 생체 외 또는 생체 내 임의의 공동, 체강 내로, 상처 상에, 기관 상에, 또는 그들의 임의의 조합에 성형되고 몰딩 되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 비-가교된 젤라틴 및 가교제를 수화/재구성시킨 후에 비-가교된 젤라틴을 가교제와 반응/혼합시키며, 비-가교된 젤라틴과 가교제의 혼합은 안정한, 비-가용성, 비-열 가역성 겔, 폼 또는 다공성 스캐폴드의 형성을 초래한다.
본원에 사용되는 용해도 상수에 대한 입자 크기의 효과는 하기와 같이 정량화될 수 있다:
Figure pat00001
상기 식에서,
*KA는 분자 표면적 A를 갖는 용질 입자에 대한 용해도 상수이며, *KA→0은 0이 되는 경향이 있는 분자 표면적을 갖는 물질에 대한 용해도 상수이며(즉, 입자가 큰 경우), γ는 용매 중 용질 입자의 표면 장력이며, Am은 용질의 분자 표면적(㎡/mol 단위)이며, R은 보편 기체 상수이며, T는 절대 온도이다.
미크론-크기 입자의 약물 및 단백질의 제조를 위한 전형적인 기법은 이전에 형성된 더 큰 입자의 (예를 들어, 파쇄(crushing), 그라인딩 및 밀링에 의한) 기계적 분쇄이다. 본 발명의 방법의 일부 실시형태에서, 밀링은 막자사발에서 달성되며, 다른 바람직한 실시형태에서, 제트 밀링에서 달성된다. 도 1에는 제트 밀링에 의한 미분화 이후의 입자 크기 분포가 예시되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 비-가교된 단백질(예를 들어, 이에 국한되지 않지만, 젤라틴)의 신속하게 용해하는 건조 단백질을 제조하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 젤라틴은 2 내지 250 미크론의 입자 크기를 달성하도록 제트 밀링에 의해 제조된다. 일부 실시형태에서, 입자 크기는 5 내지 130 미크론이다. 일부 실시형태에서, 입자 크기는 10 내지 80 미크론이다. 일부 실시형태에서, 입자 크기는 10 내지 70 미크론이다. 일부 실시형태에서, 입자 크기는 10 내지 60 미크론이다. 일부 실시형태에서, 입자 크기는 10 내지 50 미크론이다. 일부 실시형태에서, 입자 크기는 10 내지 40 미크론이다. 일부 실시형태에서, 입자 크기는 10 내지 30 미크론이다. 일부 실시형태에서, 입자 크기는 10 내지 20 미크론이다. 일부 실시형태에서, 입자 크기는 2 내지 10 미크론이다. 일부 실시형태에서, 입자 크기는 10 내지 100 미크론이다. 일부 실시형태에서, 입자 크기는 20 내지 100 미크론이다. 일부 실시형태에서, 입자 크기는 30 내지 100 미크론이다. 일부 실시형태에서, 입자 크기는 40 내지 100 미크론이다. 일부 실시형태에서, 입자 크기는 50 내지 100 미크론이다. 일부 실시형태에서, 입자 크기는 60 내지 100 미크론이다. 일부 실시형태에서, 입자 크기는 70 내지 100 미크론이다. 일부 실시형태에서, 입자 크기는 80 내지 100 미크론이다. 일부 실시형태에서, 입자 크기는 90 내지 100 미크론이다. 일부 실시형태에서, 입자 크기는 5 내지 50 미크론이다. 일부 실시형태에서, 입자 크기는 10 내지 20 미크론이다. 일부 실시형태에서, 입자 크기는 10 내지 15 미크론이다. 일부 실시형태에서, 입자 크기는 15 내지 20 미크론이다. 일부 실시형태에서, 입자 크기는 12 내지 18 미크론이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 제트 밀링을 포함하며, 제트 밀링은 액체에서의 신속한 용해(예를 들어, 이에 국한되지 않지만, 0.01초 내지 60초 내의 용해)를 위한 각 젤라틴 입자(결정)의 표면의 제조를 초래한다(즉, 초래되는 제트-밀링된 입자는 놀랍게도 제트 밀링되지 않은 출발 물질에 비하여 증가된 흡습(hygroscopic) 특징을 나타낸다). 일부 실시형태에서, 제트-밀링된 입자를 가교제와 혼합하여, 열 안정성 및 조직 접착성 하이드로겔 또는 폼의 형성을 초래할 수 있다. 일부 실시형태에서, 다공성 스캐폴드, 겔/폼은 인간 또는 동물의 체강 내측에 및/또는 조직층 사이에 배치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 다양한 의료 적용을 위해 이용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 인테그린 부착 부위의 증가된 노출 및 접근가능성을 제시하는 세포 스캐폴드로서 사용될 수 있다(예를 들어, RGD 모티프).
일부 실시형태에서, 젤라틴은 작은 입자 크기로의 밀링에 의해 제조되어, 증가된 가교 프로파일을 초래하며, 제조된 젤라틴은 2 내지 200 미크론의 미크론 크기 프로파일을 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 젤라틴은 작은 입자 크기로의 밀링에 의해 제조되어, 증가된 가교 프로파일을 초래하며, 제조된 젤라틴은 2 내지 100 미크론의 미크론 크기 프로파일을 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 젤라틴은 작은 입자 크기로의 밀링에 의해 제조되어, 증가된 가교 프로파일을 초래하며, 제조된 젤라틴은 2 내지 50 미크론의 미크론 크기 프로파일을 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 젤라틴은 작은 입자 크기로의 밀링에 의해 제조되어, 증가된 가교 프로파일을 초래하며, 제조된 젤라틴은 50 내지 150 미크론의 미크론 크기 프로파일을 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 젤라틴은 작은 입자 크기로의 밀링에 의해 제조되어, 증가된 가교 프로파일을 초래하며, 제조된 젤라틴은 100 내지 150 미크론의 미크론 크기 프로파일을 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 젤라틴은 제트 밀링에 의해 제조되어, 증가된 가교 프로파일을 초래하며, 제조된 젤라틴은 미크론 크기 프로파일을 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 사전-가교된 젤라틴을 (1) 동결건조시킨 다음, (2) 제트 밀링시켜, 건조 분말화 젤라틴(즉, "고 블룸 젤라틴")을 생성할 수 있으며, 건조 분말화 젤라틴을 용액 중에 가용화시켜, 예를 들어, 이에 국한되지 않지만, 5℃ 내지 37℃의 온도에서, 120초 이하(즉, 0.01초 내지 120초)의 기간에 용액을 생성할 수 있다.
일 실시형태에서, 밀 장치 및 방법은 본원에 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 제5,855,326호에 개시된 바와 같다. 다른 실시형태에서, 밀 장치는 본원에 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 제6,789,756호에 개시된 바와 같다. 이러한 밀링 장치의 하나의 예에는 이스라엘 요크님 소재의 슈퍼파인 리미티드(SuperFine Ltd.)에 의해 제조되는 슈퍼파인 보텍스 밀(SuperFine Vortex Mill)™이 있다(도 9에 개략적으로 나타냄). 전체 내용이 참조로 포함되는 Beliaysky의 미국 특허 제5,855,326호에는 미립자 고형물의 고운 분쇄를 위한 선회 밀링 챔버가 개시되어 있으며, 챔버는 2개의 단부면 및 챔버 내로의 작동 유체의 주입 및 그 안에서의 와류의 생성을 위한 하나 이상의 접선 노즐과 함께 제공되는 측벽을 갖는 실질적으로 원통 형상을 갖는 하우징 내에 형성되며, 상기 챔버는 분쇄될 미립자 고형물 내로의 도입을 위한 수단, 하나의 또는 둘 모두의 상기 단부면에 제공되는 축 방향으로 배치된 배출 통로, 및 와류가 생성되는 경우 챔버의 내벽에 근접하게 이동하는 그의 층과 상호작용하여, 분쇄의 제어를 가능하게 하도록 구성된 하나 이상의 기계 부재의 형태의 제어 수단을 포함한다. 선회 챔버의 작동은 또한 전체 내용이 참조로 포함되는 상기 Beliaysky의 미국 특허 제6,789,756호를 사용하여 특허에 예시되어 있으며, 하나 이상의 작동 챔버를 포함하는 실질적으로 미립자인 고형물을 밀링하기 위한 개선된 와류 밀이 개시되어 있다. 또한, 밀은 하나 이상의 작동 유체 유입구 및 하나 이상의 배출 포트를 포함한다. 하나 이상의 작동 유체 유입구는 하나 이상의 배출 포트와 함께, 하나 이상의 작동 챔버 내에서 와류 유동을 용이하게 한다. 또한, 하나 이상의 배출 포트로부터 배출되는 고형물의 밀링을 제공하기 위한 하나 이상의 공급 유입구가 존재한다. 또한, 하나 이상의 작동 챔버에 작동 유체의 유동의 제어된 섭동을 유도하여, 그에 의해, 와류 유동에서 고형물의 밀링을 개선시키기 위한 장치가 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 젤라틴 입자의 표면 흡습을 증가시키기 위하여 플라즈마 빔 에너지를 사용하는 단계를 포함할 수 있으며, 초래되는 플라스마 빔 에너지로 처리된 미분화된 젤라틴은 비-플라스마 빔 처리 젤라틴과 실질적으로 동일한 특징/특성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 젤라틴과의 혼합을 위한 추가의 물질/화합물, 예를 들어, 이에 국한되지 않지만,, 최종 제품 내로 혼합될 미생물 트랜스글루타미나제, 골 보강 물질, 단백질 및 코-폴리머 또는 그들의 임의의 조합을 플라즈마 빔 에너지로 처리할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 0.01 내지 120초의 기간 동안 액체와 혼합되는 경우 유동 가능한 겔 또는 폼으로 가용화 되도록 구성된 흡습성 미립자 젤라틴 분말로서 특성화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 액체를 제품 제형(즉, 키트)의 일부로서 제공하고, 의료 전문가(예를 들어, 간호사, 의사, 의사 보조 등)가 혼합 이전에 진료소에서 주사기 내로 로딩할 수 있다. 일부 실시형태에서, 건조 젤라틴을 단독으로 또는 가교제와 함께 혼합하여, 또는 젤라틴 및 가교제 둘 모두를 수술용 메쉬와 함께 신체에 직접 적용하고, 유체(예를 들어, 식염수)를 적용함으로써 또는 촉촉한 조직과 접촉되는 경우 체액(즉, 신체에 내인성인 액체)에 의하여 활성화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 밀링된 젤라틴 분말은 4 내지 40℃의 온도에서 수화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 밀링된 젤라틴 분말은 4 내지 20℃의 온도에서 수화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 밀링된 젤라틴 분말은 4 내지 15℃의 온도에서 수화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 밀링된 젤라틴 분말은 10 내지 25℃의 온도에서 수화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 밀링된 젤라틴 분말은 25 내지 37℃의 온도에서 수화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 밀링된 젤라틴 분말은 15 내지 25℃의 온도에서 수화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 밀링된 젤라틴 분말은 20 내지 25℃의 온도에서 수화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 밀링된 젤라틴 분말은 10 내지 20℃의 온도에서 수화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 밀링된 젤라틴 분말은 12 내지 18℃의 온도에서 수화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 밀링된 젤라틴 분말은 14 내지 19℃의 온도(수술실의 온도 범위임)에서 수화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 밀링된 젤라틴 분말은 약 16℃의 온도에서 수화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 용해된 젤라틴은 심지어 37℃ 미만의 온도에서도 유동가능한 형태를 유지하도록 구성된다(즉, 용해된 젤라틴은 즉시 그의 액체-겔 전이점을 다시 가로질러 비-작동가능한 고체가 되지 않을 것이다).
일부 실시형태에서, 본 발명의 용해된 젤라틴은 긴 주사바늘, 카테터 또는 내시경을 통해 전달될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 용해된 젤라틴은 발포되는 경우 동일한 조성의 융합성(confluent) 젤라틴 하이드로겔보다 더 낮은 점도를 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 방사선 에너지를 사용하여 젤라틴을 제조/멸균하는 단계를 포함하며, 초래되는 방사선 조사된 젤라틴은 비-방사선 조사된 출발 젤라틴과 비교하여 실질적으로 유사한 기능적 특성(예를 들어, 가교 능력)을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 방사선 에너지를 사용하여 젤라틴을 제조/멸균하는 단계를 포함하며, 초래되는 방사선 조사된 젤라틴은 비-방사선 조사된 출발 젤라틴과 비교하여 적어도 25%의 기능적 특성(예를 들어, 가교 능력)을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 방사선 에너지를 사용하여 젤라틴을 제조/멸균하는 단계를 포함하며, 초래되는 방사선 조사된 젤라틴은 비-방사선 조사된 출발 젤라틴과 비교하여 25 내지 100%의 기능적 특성(예를 들어, 가교 능력)을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 젤라틴 분말을 추가의 활성 성분, 예를 들어, 이에 국한되지 않지만, 안정화제(예를 들어, 이에 국한되지 않지만, EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드), NHS(N-하이드록시석신이미드), 카보미드, 글루타르알데히드, 서양고추냉이 퍼옥시다제 및/또는 트랜스글루타미나제)와 혼합하는 단계를 포함하며, 혼합된 젤라틴 및 안정화제는 안정한 다공성 스캐폴드, 겔 또는 폼을 형성하며, 다공성 스캐폴드, 겔 또는 폼의 형상은 (즉, 젤라틴 분자 사이를 가교시키는 공유 결합으로 인하여) 비-가역적이다. 일부 실시형태에서, 젤라틴 다공성 스캐폴드, 겔 또는 폼의 가교(즉, 안정화)는 인간 또는 동물의 체 외에서 또는 체 내에서 발생할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 폴리머, 예를 들어, 단백질 및/또는 폴리펩티드를 건조시키는 단계를 포함하며, 단백질 및/또는 폴리펩티드는 차가운 또는 실온 액체인 환경(예를 들어, 이에 국한되지 않지만, 5℃ 내지 37℃의 액체)을 포함하여, 전형적인 비-미분 젤라틴에 비하여 액체에서 실질적으로 더 신속한(예를 들어, 이에 국한되지 않지만, 0.01초 내지 60초 재구성) 재구성 프로파일을 갖는 건조 폴리머를 초래하도록 콜라겐 및/또는 젤라틴 및/또는 임의의 젤라틴 변이체이다. 일부 비제한적인 예시적인 실시형태에서, 젤라틴 분말은 (1) 실질적으로 더 긴 저장 기간(예를 들어, 1개월 내지 36개월) 및 (2) 실질적으로 더 신속한 재구성/용해도를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 건조 폴리머는 멸균되며, 멸균된 건조 폴리머는 실질적으로 유사한 비-멸균된 건조 폴리머와 비교하여 실질적으로 유사한 생물학적 기능 및 용해/재구성 특징을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 건조 폴리머는 멸균되며, 멸균된 건조 폴리머는 실질적으로 유사한 비-멸균된 건조 폴리머와 비교하여 적어도 25%의 생물학적 기능 및 용해/재구성 특징을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 건조 폴리머는 멸균되며, 멸균된 건조 폴리머는 실질적으로 유사한 비-멸균된 건조 폴리머와 비교하여 50% 내지 100%의 생물학적 기능 및 용해/재구성 특징을 나타낸다.
가교제
예시적인 실시형태에서, 폴리머 가닥 상의 기질 기를 직접 가교시키는 직접 가교 효소의 비제한적인 예에는 트랜스글루타미나제 및 산화 효소가 포함된다. 트랜스글루타미나제의 예에는 미생물 트랜스글루타미나제(mTG), 조직 트랜스글루타미나제(tTG), 케라틴세포 트랜스글루타미나제, 상피 트랜스글루타미나제 전립선 트랜스글루타미나제, 뉴런 트랜스글루타미나제, 인간 트랜스글루타미나제 및 인자 XIII이 포함된다. 일부 실시형태에서, 이들 효소는 천연 또는 재조합 공급원 중 어느 하나로부터의 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리머 가닥 내의 글루타민 및 라이신 아미노산은 트랜스글루타미나제 가교를 위한 기질이다.
예시적인 실시형태에서, 산화 효소의 비제한적인 예에는 티로시나제, 라카아제, 퍼옥시다제 또는 그들의 임의의 조합이 있다. 일부 실시형태에서, 산화 효소는 퀴논 형성(티로시나제) 또는 유리 라디칼 형성(라카제, 퍼옥시다제)에 의해 폴리머를 가교시킨다. 그 다음, 퀴논 및 유리 라디칼은 서로 또는 다른 아미노산 또는 페놀산과 상호작용하여 폴리머를 가교시킨다. 일부 실시형태에서, 산화 효소를 위한 가교성 기질은 티로신 또는 다른 방향족 아미노산을 함유하는 임의의 단백질일 수 있다. 일부 실시형태에서, 기질은 페놀산, 예를 들어, 이에 국한되지 않지만,, 페룰산을 포함하는 탄수화물일 수 있다. 일부 실시형태에서, 탄수화물은 비제한적으로 아라비노자일란 또는 펙틴일 수 있다.
본 발명의 방법의 일부 실시형태에 따르면, 트랜스글루타미나제 용액은 1) 트랜스글루타미나제 혼합물로부터 발효 잔류물의 제거; 2) 트랜스글루타미나제 용액 중 활성 트랜스글루타미나제의 양의 농축; 3) 운반 단백질 및/또는 탄수화물로부터 트랜스글루타미나제 용액의 정제; 4) 트랜스글루타미나제 용액의 내독소 수준의 저하; 5) 트랜스글루타미나제 용액으로부터 모든 미생물을 제거하여, 용액의 효율적인 멸균; 제한적인 목록에 한정되고자 하지 않고, 전부 또는 그들의 임의의 조합 중 하나 이상을 수행하기 위한 1-단계 또는 다-단계 정제를 겪는다.
일부 실시형태에서, 가교 물질의 용액을 가교성 단백질 또는 폴리펩티드와의 혼합 이전에 여과한다. 일부 실시형태에서, 여과 과정은 먼저 때때로 청징으로 알려져 있는 거친 여과를 사용하여, 더 고운 여과 단계를 신속하게 차단할 많은 양의 발효 잔류물을 제거한다. 이러한 거친 여과의 비제한적인 예에는 약 0.45 ㎛ 포어 크기 여과 및 약 0.65 ㎛ 포어 크기 여과가 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 가교 물질의 용액을 0.22 ㎛ 미만의 포어 크기의 필터를 통과시켜, 물질의 미생물 부하를 그램당 10 콜로니 형성 유닛(CFU) 미만으로 감소시키고, 그것을 의학적 이용에 적절하게 만들 수 있다. 일부 실시형태에서, 미생물 부하를 감소시켜, 약 10-2 미만의 무균 보증 수준(SAL)을 달성한다. 일부 실시형태에서, 미생물 부하를 감소시켜, 약 10-3 미만의 무균 보증 수준(SAL)을 달성하며, SAL은 멸균 과정으로 처리한 후에 비-무균인 단일 단위의 확률을 기재하기 위하여 미생물학에서 사용되는 용어이다.
본 발명의 방법의 다른 실시형태에 따르면, 접선 유동 및/또는 중공사 초여과 기법을 사용하여, 운반 탄수화물 및 단백질의 제거에 의해 가교 물질의 용액을 정제하고, 용액을 농축시킨다. 본 발명에 사용하기 위한 포어 크기는 가교 조성물의 성분의 크기보다 더 작은 포어 크기를 갖는 것들이다. 일부 실시형태에서, 가교 물질은 mTG이며, 포어 크기는 10 내지 50 kDa의 범위이다. 일 실시형태에서, 가교 물질은 mTG이며, 포어 크기는 10 내지 30 kDa의 범위이다. 일부 실시형태에서, 이의 비-구속 상업적 예에는 Uniflux(GE), AKTA Pilot(GE) 또는 AKTA Flux 6(GE)이 있다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 크기 배제 크로마토그래피 단계를 사용하여 주변 물질(예를 들어, 이에 국한되지 않지만,, 페닐 세파로스(Phenyl Sepharose) FF 컬럼(2.6*10 ㎝, 파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech)) 또는 예를 들어, 세파크릴(Sephacryl) 컬럼(GE))로부터 가교 물질을 선택적으로 분리한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 소수성 및/또는 친수성 상호작용 크로마토그래피 단계를 사용하여, 주변 물질로부터 가교 물질을 선택적으로 분리한다. 일부 실시형태에서, 가교 물질은 단백질이며, 하나 이상의 이온 교환 크로마토그래피 단계를 사용하여 가교 단백질을 결합시켜, 그것을 주변 물질로부터 정제한다.
일부 실시형태에서, 가교 단백질은 mTG이며, 하나 이상의 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 사용하여 mTG를 정제한다. 일부 실시형태에서, 양이온 교환 수지는 세파로스 수지이다.
일부 실시형태에서, 정제는 가교 물질의 내독소 수준을 그램당 5 내독소 유닛(EU) 미만으로 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 정제는 가교 물질의 내독소 수준을 그램당 0.001 내지 5 내독소 유닛(EU)으로 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 가교제는 mTG이며, 정제에 의해 mTG 조성물이 초래되며, 고유 활성은 밀리그램당 20 효소 유닛 초과이며, 밀리그램당 25 유닛 초과이다. 일부 실시형태에서, 가교 물질은 mTG이며, 정제에 의해 mTG 조성물이 초래되며, 고유 활성은 밀리그램당 10 효소 유닛 내지 밀리그램당 35 유닛이다. 일부 실시형태에서, 가교 물질은 mTG이며, 정제에 의해 95% 내지 99.9%의 전기영동 순도가 초래된다.
일부 실시형태에서, 비제한적인 예로서 식품-등급 mTG 산물을 정제하여, 밀리그램당 24 효소 유닛 초과의 고유 활성, 95% 전기영동 순도 초과, 그램당 5 내독소 유닛 미만 및 10 CFU/g 미만을 갖는 mTG 조성물을 생성하는 mTG 정제 과정이 본원에 기재되어 있다. 비제한적인 예로서, 식품-등급 mTG 산물을 정제하여, 밀리그램당 25 내지 35 효소 유닛의 고유 활성, 95 내지 99.9% 전기영동 순도, 그램당 0.001 내지 5 내독소 유닛, 0.001<10 CFU/g 또는 그들의 임의의 조합을 갖는 mTG 조성물을 생성하는 mTG 정제 과정이 본원에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 상기 명세서의 정제된 효소를 이후에 추가의 탄수화물 또는 안정화제와 함께 또는 이것 없이 동결건조시키고, 이후에 감마 또는 e-빔(e-beam) 방사선에 의해 최종 멸균 처리한다. 일부 실시형태에서, 상기 최종 멸균 후의 고유 활성은 밀리그램당 5 내지 30 효소 유닛이다. 일부 실시형태에서, 상기 최종 멸균 후의 고유 활성은 밀리그램당 20 내지 30 효소 유닛이다. 일부 실시형태에서, 상기 최종 멸균 후의 고유 활성은 밀리그램당 20 내지 25 효소 유닛이다.
일부 실시형태에서, 비제한적인 예로서, mTG 정제 과정은 공개 문헌["Purification and Characterization of Novel Transglutaminase from Bacillus subtilis Spores"; PMID: 11193401]에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, mTG를 정제 후에 건조시키거나 동결 건조시킨 다음, 본원에 기재된 것과 유사한 방법에서 (임의의 유형의) 밀링에 의해 5 내지 50 미크론 흡습성 입자로 미립자화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, mTG를 정제 후에 안정화 하이드로콜로이드로서 셀룰로스 에테르(HPMC)와 또는 트레할로스와 혼합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 트랜스글루타미나제를 말토덱스트린과 혼합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 말토덱스트린은 안정화제이다.
일부 실시형태에서, 농축되고/거나 정제된 효소는, mTG 및 안정화 부형제를 포함하는 미립자를 첨가하고, 첨가제 물질, 예를 들어, 방사선 조사 동안 안정화를 보조할 수 있는 안정화제(예를 들어, 이에 국한되지 않지만,, 셀룰로스, 당, 말토덱스트린, 카로테노이드, 아스코르베이트, L-티로신)를 추가로 포함함으로써 안정화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 안정화 부형제는 폴리올, 만니톨, 수크로스, 글리세롤, 락토스, 글리신 또는 트레할로스이다.
일부 실시형태에서, 변형된 트랜스글루타미나제는 변형된 미생물 트랜스글루타미나제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리머는 변형된 미생물 트랜스글루타미나제에 의한 가교를 가능하게 하도록 변형된다. 일부 실시형태에서, 변형된 산화 효소는 티로시나제, 라카제, 퍼옥시다제 또는 그들의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 매트릭스는 적어도 하나의 기질 폴리머로서 변형된 산화 효소에 의해 가교 되는 페놀산을 포함하는 탄수화물을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 탄수화물은 아라비녹실란 또는 펙틴 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 분자는 PEG화를 통해 변형되며, PEG화는 매트릭스를 받는 숙주 동물의 면역계로부터 효소 분자를 차폐시킴으로써 면역원성 차폐를 제공한다. 일부 실시형태에서, 숙주 동물은 인간이다.
본 발명의 일부 실시형태에 따른 조성물
일부 실시형태에서, 본 발명은
a) 콜라겐 및 젤라틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 가교성 단백질;
b) 가교성 단백질의 가교를 유도하는 가교제; 및
c) 액체를 포함하는 조성물을 제공하며,
조성물은 다공성 스캐폴드이며,
스캐폴드의 포어는 2 내지 500 미크론이다.
본원에 사용되는 용어 "스캐폴드"는 의료 목적을 위하여 새로운 기능성 조직의 형성에 기여하는 바람직한 세포 상호작용을 야기하도록 조작된 물질을 지칭한다. 세포는 3차원 조직 형성을 지지할 수 있는 이들 구조 내로 '씨딩'될 수 있다. 스캐폴드는 고유 조직의 고유 세포외 매트릭스를 모방하여, 생체내 환경을 재현하고, 세포가 그들 자체의 미세환경에 영향을 미치게 할 수 있다. 스캐폴드는 하기의 목적 중 적어도 하나를 위해 제공될 수 있다:
1) 세포 부착 및 이동을 가능하게 할 목적;
2) 세포 및 생화학 인자를 전달하고 유지할 목적;
3) 필수 세포 영양소 및 발현되는 산물의 확산을 가능하게 할 목적; 또는
4) 세포 상의 거동을 변형시키기 위하여 특정 기계적 및 생물학적 영향을 발휘할 목적.
일부 실시형태에서, 액체는 생리학적 완충제이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 폼이다.
일부 실시형태에서, 가교성 단백질은 5 내지 200 미크론의 평균 입자 크기를 갖는 미분화된 단백질 분말로서 조성물 내로 도입된다.
일부 실시형태에서, 가교성 단백질은 200 내지 300 블룸의 젤라틴을 포함한다.
일부 실시형태에서, 가교성 젤라틴은 0.5 wt% 내지 25 wt%의 범위로 조성물에 존재한다.
일부 실시형태에서, 가교제는 트랜스글루타미나제이다.
일부 실시형태에서, 트랜스글루타미나제는 0.0001 wt% 내지 2 wt%의 범위로 조성물에 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은
a) 가교성 젤라틴;
b) 가교성 젤라틴의 가교를 유도하는 트랜스글루타미나제; 및
c) 액체를 포함하는 조성물을 제공하며,
조성물은 2 내지 500 미크론의 포어 크기를 갖는 다공성 스캐폴드이며,
가교성 젤라틴은 5 내지 200 미크론의 입자 크기를 갖는 미분화된 젤라틴 분말로서 조성물 내로 도입되며,
가교성 젤라틴은 200 내지 300 블룸이며,
가교성 젤라틴은 0.5 wt% 내지 25 wt%의 범위로 조성물에 존재하며,
트랜스글루타미나제는 0.0001 wt% 내지 2 wt%의 범위로 조성물에 존재한다.
일부 실시형태에서, 액체는 생리학적 완충제이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 환자에서 환자가 조직 결손의 치료를 필요로 하는 부위에 동일계 내에서 형성된다.
일부 실시형태에서, 조성물은 환자가 조직 결손의 치료를 필요로 하는 부위에서 조성물을 환자 내로 도입하기 이전에 형성된다.
일부 실시형태에서, 건조된 가교제는 트랜스글루타미나제 효소이다. 일부 실시형태에서, 건조된 단백질 조성물은 젤라틴이다. 일부 실시형태에서, 건조 미립자 단백질은 안정화제를 필요로 하지 않는다. 일부 실시형태에서, 분말 조성물은 5분 미만 이내에 유동 가능한 용액 내로 용해된다. 일부 실시형태에서, 분말 조성물은 5분 미만 이내에 유동 가능한 용액 내로 용해된다. 일부 실시형태에서, 분말 조성물은 37℃ 미만의 온도에서 5분 미만 이내에 유동 가능한 용액 내로 용해된다. 일부 실시형태에서, 분말 조성물은 27℃ 미만의 온도에서 1분 미만 이내에 유동 가능한 용액 내로 용해된다. 일부 실시형태에서, 분말 조성물은 수술실의 표준 온도인 20℃ 미만의 온도에서 1분 미만 이내에 유동 가능한 용액 내로 용해된다. 일부 실시형태에서, 젤라틴 조성물은 단일의 구획에서 가교제 분말과 함께 보관된다. 일부 실시형태에서, 젤라틴 분말 및 가교제는 최대 10 ㎖ 대 1 g의 젤라틴의 비로 액체와 혼합된다. 일부 실시형태에서, 젤라틴 분말 및 가교제는 최대 8 ㎖ 대 1 g의 젤라틴의 비로 액체와 혼합된다. 일부 실시형태에서, 젤라틴 분말 및 가교제는 최대 6 ㎖ 대 1 g의 젤라틴의 비로 액체와 혼합된다. 일부 실시형태에서, 젤라틴 분말 및 가교제는 최대 4 ㎖ 대 1 g의 젤라틴의 비로 액체와 혼합된다. 일부 실시형태에서, 젤라틴 분말 및 가교제는 최대 2 ㎖ 대 1 g의 젤라틴의 비로 액체와 혼합된다. 일부 실시형태에서, 분말의 혼합물을 흡수가능한 또는 비-흡수가능한 패드 내로 압축하여, 그에 기계적 지원을 제공한다. 일부 실시형태에서, 패드는 부직 산화 셀룰로스이다. 일부 실시형태에서, 압축은 분해가능하거나 그렇지 않은 수술용 메쉬 내로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 젤라틴 조성물의 농도는 0.5% 내지 25 w/w%의 범위이다. 일부 실시형태에서, 젤라틴 조성물의 농도는 10 내지 20 w/w%의 범위이다. 일부 실시형태에서, 건조 젤라틴 분말은 약 15% 미만의 수분을 함유한다. 일부 실시형태에서, 건조 젤라틴 분말은 약 8% 미만의 수분을 함유한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약 6 내지 약 7의 범위의 pH를 갖는다. 일부 실시형태에서, 건조 가교제 분말은 약 15% 미만의 수분을 함유한다. 일부 실시형태에서, 건조 가교제 분말은 약 8% 미만의 수분을 함유한다. 일부 실시형태에서, 트랜스글루타미나제는 칼슘 독립성이다.
일부 실시형태에서, 트랜스글루타미나제는 미생물 트랜스글루타미나제이다. 일부 실시형태에서, 트랜스글루타미나제의 단백질 농도는 조성물의 약 0.0001% 내지 약 2 w/w%의 양으로 존재한다. 일부 실시형태에서, 트랜스글루타미나제는 조성물의 약 0.01% 내지 약 1.35 w/w%의 양으로 존재한다. 일부 실시형태에서, 트랜글루타미나제의 농도는 총 조성물의 약 1 내지 약 180 효소 유닛(U/㎖)의 범위이다.
일부 실시형태에서, 효소 조성물 대 젤라틴 조성물의 비는 효소 및 젤라틴이 용액 중에 존재한다면, 약 1:1 내지 1:5 v/v이다. 일부 실시형태에서, 정제된 효소 조성물 대 젤라틴 조성물의 비는 효소 및 젤라틴이 고체 건조 형태에 존재한다면, 약 1:100 내지 1:500 w/w이다.
일부 실시형태에서, 젤라틴은 동물 기원, 재조합 기원 또는 그들의 조합으로부터 생성된다. 일부 실시형태에서, 동물 기원은 어류 및 포유동물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 젤라틴은 A형(산 처리) 또는 B형(알칼리 처리)이다. 일부 실시형태에서, 젤라틴은 적어도 약 250 블룸 또는 상응하는 양의 고 분자량 젤라틴을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 계면활성제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20(Tween.TM. 20), 폴리옥시에틸렌글리콜 도데실 에테르(Brij.TM. 35), 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머(플루로닉(Pluronic).TM. F-68), 나트륨 라우릴 설페이트(SLS) 또는 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 나트륨 라우레스 설페이트 또는 나트륨 라우릴 에테르 설페이트(SLES), 폴록사머 또는 폴록사민, 알킬 폴리글루코시드, 지방 알코올, 지방산 염, 코카미드 모노에탄올아민, 코카미드 디에탄올아민 또는 그들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 가소제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 가소제는 소르비톨, 시트르산 알킬 에스테르, 글리세롤, 글리세롤 에스테르, 프탈산 알킬 에스테르, 세바스산 알킬 에스테르, 수크로스 에스테르, 소르비탄 에스테르, 아세틸화 모노글리세리드, 글리세롤, 지방산 에스테르, 글리콜, 프로필렌 글리콜, 라우르산, 수크로스, 글리세릴 트리아세테이트, 폴록사머, 디에틸 프탈레이트, 식용 지방 또는 오일의 모노- 및 디-글리세리드, 디부틸 프탈레이트, 디부틸 세바케이트, 폴리소르베이트, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 200 내지 20,000, 카보왁스(Carbowax) 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 알코올(PVA), 아라비아 고무, 구아 고무, 잔탄 고무, 플라스돈(Plasdone).RTM.(폴리비닐피롤리돈), 만니톨 및 그들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 밀링된 동결건조 젤라틴 조성물 및 건조된 트랜스글루타미나제 조성물을 포함하는 가교성 조성물이며, 건조된 트랜스글루타미나제 조성물은 밀링된 동결건조 젤라틴 조성물의 도처에 완전히 분산된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 젤라틴 및 가교제를 포함하는 가교성 조성물이며, 일단 혼합되면 가교제는 젤라틴과 반응하여, 생분해성 안정화 다공성 스캐폴드를 형성한다. 일부 실시형태에서, 다공성 스캐폴드는 조직상에서 적어도 2주 동안 유연성을 유지한다. 일부 실시형태에서, 트랜스글루타미나제는 변형된 효소 분자이며, 상기 변형된 효소 분자는 매트릭스가 폴리머의 가교를 통해 형성되는 경우 가교된 매트릭스 내의 효소 분자의 인지 부피를 변경시키는 변형을 갖는다. 일부 실시형태에서, 젤라틴은 1200 I.U./g 이하의 내독소 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, 10 bar 미만의 압력 강하를 사용함으로써 젤라틴을 제트 밀링한다. 일부 실시형태에서, 젤라틴 제트 밀링은 5 bar 미만의 압력 강하를 사용함으로써 이루어진다. 일부 실시형태에서, 젤라틴 제트 밀링은 5 m^3/분 미만의 요구되는 공기 유동을 사용함으로써 이루어진다. 일부 실시형태에서, 젤라틴 제트 밀링은 2 m^3/분 미만의 요구되는 공기 유동을 사용함으로써 이루어진다. 일부 실시형태에서, 조성물은 바륨, 요오드, 다른 방사선비투과 물질 또는 그들의 조합을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 방사선 에너지를 사용하여 젤라틴 및 가교제 조성물을 제조/멸균하는 단계를 포함하며, 초래되는 방사선 조사된 조성물은 비-방사선 조사된 출발 조성물과 비교하여 적어도 25%의 기능적 특성(예를 들어, 가교 능력, 효소 고유 활성)을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 방사선 에너지를 사용하여 젤라틴-가교제 조성물을 제조/멸균하는 단계를 포함하며, 초래되는 방사선 조사된 젤라틴은 비-방사선 조사된 출발 조성물과 비교하여 25% 내지 100%의 기능적 특성(예를 들어, 가교 능력)을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 에틸렌 옥사이드를 사용하여 젤라틴 및 가교제 조성물을 제조/멸균하는 단계를 포함하며, 초래되는 처리된 조성물은 비-처리된, 비-멸균된 출발 젤라틴과 비교하여 적어도 25%의 기능적 특성(예를 들어, 가교 능력)을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 에틸렌 옥사이드를 사용하여 조성물을 제조/멸균하는 단계를 포함하며, 초래되는 처리된 조성물은 비-처리된, 비-멸균 출발 조성물과 비교하여 25 내지 100%의 기능적 특성(예를 들어, 가교 능력)을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 세포를 위한 스캐폴드, 조직 재형성제, 벌킹제(bulking agent), 피부 필러, 뼈 접착제, 조직 필러, 폐 용적을 감소시키기 위한 조성물, 수술용 실란트, 생체-접착제, 누공 복구 조성물, 지혈제, 수술용 메쉬, 생물활성제의 지속적인 방출을 위한 조성물로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 목적을 위해 사용된다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 세포 유형은 조성물 내로 침윤하고, 조성물 내에서 성장한다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 세포 유형은 췌장 줄기세포, 장 내분비 세포, 뼈세포, 간세포, 건세포, 근세포, 혈구, 연골세포, 상피 세포, 내피 세포, 뉴런, 배아 줄기세포, 중간엽 줄기세포, 자가 골수-유래 중간엽 줄기세포, 전구 세포, 조혈 줄기세포, 중간엽 줄기세포, 신경 줄기세포, 골계 줄기세포, 연골세포주 줄기세포, 상피 줄기세포 및 간 줄기세포로 이루어진 군으로부터의 세포 유형이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 침윤된 적어도 하나의 세포 유형을 환자의 면역계로부터 분리한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 폼이다. 임의의 특정 이론에 제한하고자 하지 않고, 다공성 스캐폴드는 (예를 들어, mTG에 의해) 일단 가교되면, 생체 내에서 안정하게 유지되고, 조직 내부-성장 및 재생을 유도할 수 있다. 대안적으로, 다공성 스캐폴드는 세포를 위한 3차원 지지체 스캐폴드로서 제공될 수 있다. 가교된 다공성 스캐폴드는 개선된 세포 부착 및 이동성 양립성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 가교성 단백질을 가교제와 혼합한다. 일부 실시형태에서, 가교성 단백질 및 가교제는 건조 분말이며, 건조 물질을 혼합한 다음, 생리학적 액체, 완충제 또는 세포 지지 배지에 의해 용해시킨다. 일부 실시형태에서, 가교성 단백질 및 가교제 둘 모두가 생리학적 완충제에 용해되는 경우에만, 가교제는 단백질을 가교시킨다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 의료 물질은 전형적으로 세포의 배양을 위해 필요한 배지 성분을 포함하는 상기 기재된 성분에 더하여 염(완충제 성분)을 포함할 것이다. 더욱이, 그것은 이식되는 경우 이식 유닛에서 조직의 긴급 재생제(성장 인자)를 추가로 함유할 수 있다. 유용한 성장 인자, 예를 들어, 섬유아세포 성장 인자(FGF: 산성 섬유아세포 성장 인자(aFGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 등, 케라틴 세포 성장 인자(KGF)), 상피 세포 성장 인자(EGF), 신경 성장 인자(NGF), 전환 성장 인자(TGF), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 간세포 성장 인자(HGF), 골 형성 단백질(BMP : BMP-2, BMP-3, BMP-7 등)이 예시될 수 있다. 이들 성장 인자는 재생을 위한 조직의 유형에 따라 적절한 선택에 의해 사용될 수 있다. 구체적으로, 예를 들어, 상피 세포의 재생을 위한 경우에, 상피 성장 인자, 그리고 진피의 재생을 위한 경우에 섬유아세포 성장 인자를 각각 사용할 수 있다. 구체적으로, 예를 들어, 뼈 세포의 재생을 위한 경우에, 골 형성 단백질, 그리고 진피의 재생을 위한 경우에 섬유아세포 성장 인자를 각각 사용할 수 있다. 그것이 고려되는 것이 바람직하다면, 그것은 둘 이상의 종류의 성장 인자와 병용하여 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 건조 분말은 주사기 또는 임의의 용기에 포장될 수 있다. 일부 실시형태에서, 건조 분말은 방사선 또는 에틸렌 옥사이드(ETO)에 의해 멸균될 수 있다.
일부 실시형태에서, 가교성 단백질을 혼합하고, 가교제를 안정화제(예를 들어, 이에 국한되지 않지만,, EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드), NHS(N-하이드록시석신이미드), 카보미드, 글루타르알데히드, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 성장 인자, 치료제 및 호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 다른 작용제와 병용한다.
일부 실시형태에서, 건조 분말은 건조 분말로서 혼합되는 경우 감소된 침출 및/또는 상호작용을 갖는다. 도 3을 참조하여, 일부 실시형태에서, 건조 분말을 개별적으로 생리학적 완충제 중에 용해시키고, 용해된 성분을 하나의 상호연결된 주사기로부터 다른 주사기로 푸싱함으로써 혼합한다. 그러나 임의의 혼합 방법, 예를 들어, 교반이 충분할 수 있다. 대안적으로, 건조 분말을 함께 혼합한 다음, 혼합물을 활성화를 위하여 생리학적 완충제 중에 용해시킨다.
일부 실시형태에서, 단백질의 가교는 다공성 스캐폴드를 초래한다. 일부 실시형태에서, 다공성 스캐폴드는 열안정성이다. 일부 실시형태에서, 다공성 스캐폴드는 접착제이다. 임의의 특정 이론에 의해 제한하려는 의도 없이, 가교는 단백질 분자 간에 가교를 형성하는 공유 결합으로 인하여 비가역적이다. 일부 실시형태에서, 다공성 스캐폴드는 포유동물 조직의 세포외 매트릭스와 구조적으로 유사하며, 종종 온건한 조건하에 가공될 수 있으며, 최소의 침습성 방식으로 전달될 수 있다.
가교는 환자의 체 외에서 또는 체 내에서 발생할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 가교는 환자 내의 부위에 동일계 내에서 발생한다. 대안적으로, 다공성 스캐폴드는 생체 외에서 형성된 다음, 환자 내로 도입된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 하이드로겔은 아직 경화되지 않은 경우 주사바늘을 통과할 수 있으며, 일단 액체 형태로 조직으로 전달되면; 접착제는 안정한 강화된 물리적 형태로 안정화된다(즉, 적어도 0.05 ㎖ 부피의 통합된 단일 입자).
실시예 14의 결과에 의해, 입자 크기를 d(0.5)=15 미크론 미만으로 감소시킴으로써 젤라틴이 잘 용해되지만, 미생물 트랜스글루타미나제 효소와 더 느리게 반응하는 것이 나타난다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 수화 후에 신속하게 안정화되지 않는 신속하게 용해되는 분말을 제공하는 것이 필요하다. 그들은 긴 주사바늘을 통과할 필요가 있으며, 외과의에게 충분히 긴 작업 시간을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 이러한 제형은 젤라틴 입자 크기를 1 내지 15 미크론으로 제어하여 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 제형은 8 내지 14 미크론의 젤라틴 입자 크기로 달성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 (1) 동일계 내에서 또는 생체 외에서 안정화하고 (2) 원하는 형상 또는 체강에 순응하여 세포 및 조직의 내부 성장을 가능하게 하도록 구성된 생체적합성 실란트 또는 스캐폴드의 형성을 초래하도록 구성된 다공성 스캐폴드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 안정화된 다공성 스캐폴드 구조는 통도 조직이며, 하기의 의료 용도를 위해 사용될 수 있다: 조직 재형성제, 벌킹제, 조직 필러 또는 조직 프린팅(예를 들어, 3D 조직 프린팅). 젤라틴의 미분화 및/또는 (구체적으로 트랜스글루타미나제에 의한) 가교된 다공성 스캐폴드로의 재구성은 세포 부착 및 이동성을 크게 개선시킨다. 젤라틴 다공성 스캐폴드 상의 인테그린 인식 모티프(예를 들어, RGD)의 불균일하고 풍부한 디스플레이 및 이러한 모티프로의 세포의 접근가능성은 스캐폴드로서의 기능을 증진시킨다.
조직 프린팅의 실시형태에서, 건조 분말은 분말화된 또는 재구성된 아교(glue)에 의해 서로 접착된 세포의 정밀한 2D 또는 3D 구조를 구성하도록 살아 있는 세포와 함께 프린터를 통해 적용될 수 있다. 예를 들어, 예시에 의해, 이러한 3D 구조는 일단 스캐폴드가 이식되면, 내부 세포에 혈액 공급을 제공할 의도로, 스캐폴드 내에 프린팅될 수 있는 혈관을 형성하기 위한 일부 내피 세포를 함유할 수 있다.
일부 실시형태에서, 다공성 스캐폴드는 소정의 밀도를 가지며, 밀도는 다공성 스캐폴드의 분해 및/또는 세포 내부 성장 역학과 직접적으로 관련이 있다. 일부 실시형태에서, 추가의 생활성 물질은 또한 예를 들어, 이에 국한되지 않지만, 10% 내지 300%의 증가로 세포 내부 성장 역학에 영향을 미칠 수 있다(즉, 세포 내부 성장 역학을 증가시킨다). 일부 실시형태에서, 현탁화된 생활성 물질 및/또는 세포 및/또는 혈소판 풍부 혈장(PRP) 및/또는 성장 인자 및/또는 골 형성 단백질은 (예를 들어, 이에 국한되지 않지만, 환자가 부당하게 긴 기간 동안 치료되는 신체 영역을 고정화시키지 않거나 통상적으로 실시되는 것처럼 인자를 다수 주입하지 않고) 신체의 표적 영역에 실질적으로 남아 있다.
일부 실시형태에서, 폼은 처음에는 0.1 내지 11 KPa의 탄성(영(Young))률을 갖는 폐쇄된 셀 폼이며, 단백질, 가교제 및/또는 생리학적 완충제의 농도를 변경시키고/거나 그 안에 사용되는 젤라틴의 블룸을 변경시킴으로써 탄성률이 달라질 수 있다.
일부 실시형태에서, 단백질 폼은 1 내지 11 KPa의 초기 탄성(영)률을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단백질 폼은 2 내지 10 KPa의 초기 탄성(영)률을 갖는다. 일부 실시형태에서, 안정화된 폼의 초기(즉, 가교 약 30분 후) 신장은 원래의 시작 길이의 1.5 내지 3배이다.
젤라틴을 단백질로서, 그리고 mTG를 가교제로서 포함하는 폼의 기계적 측정을 보여주는 실시형태는 실시예 16의 표에 예시되어 있다.
일부 실시형태에서, 다공성 스캐폴드의 포어 크기는 2 내지 500 미크론 직경이다. 일부 실시형태에서, 다공성 스캐폴드의 포어 크기는 2 내지 400 미크론 직경이다. 일부 실시형태에서, 다공성 스캐폴드의 포어 크기는 2 내지 300 미크론 직경이다. 일부 실시형태에서, 다공성 스캐폴드의 포어 크기는 2 내지 200 미크론 직경이다.
일부 실시형태에서, 다공성 스캐폴드의 포어 크기는 2 내지 50 미크론 직경이다. 일부 실시형태에서, 다공성 스캐폴드의 포어 크기는 2 내지 10 미크론 직경이다.
일부 실시형태에서, 다공성 스캐폴드의 포어 크기는 10 내지 500 미크론 직경이다. 일부 실시형태에서, 다공성 스캐폴드의 포어 크기는 50 내지 400 미크론 직경이다. 일부 실시형태에서, 다공성 스캐폴드의 포어 크기는 100 내지 400 미크론 직경이다. 일부 실시형태에서, 다공성 스캐폴드의 포어 크기는 200 내지 400 미크론 직경이다. 일부 실시형태에서, 다공성 스캐폴드의 포어 크기는 300 내지 400 미크론 직경이다.
도 8을 참조하여, 일부 실시형태에서, 폼의 포어 크기는 2 내지 500 미크론 직경이다. 일부 실시형태에서, 폼의 포어 크기는 2 내지 400 미크론 직경이다. 일부 실시형태에서, 폼의 포어 크기는 2 내지 300 미크론 직경이다. 일부 실시형태에서, 폼의 포어 크기는 2 내지 200 미크론 직경이다.
일부 실시형태에서, 폼의 포어 크기는 2 내지 50 미크론 직경이다. 일부 실시형태에서, 폼의 포어 크기는 2 내지 10 미크론 직경이다.
일부 실시형태에서, 폼의 포어 크기는 10 내지 500 미크론 직경이다. 일부 실시형태에서, 폼의 포어 크기는 50 내지 400 미크론 직경이다. 일부 실시형태에서, 폼의 포어 크기는 100 내지 400 미크론 직경이다. 일부 실시형태에서, 폼의 포어 크기는 200 내지 400 미크론 직경이다. 일부 실시형태에서, 폼의 포어 크기는 300 내지 400 미크론 직경이다.
일부 실시형태에서, 발포 방지제, 예를 들어, 이에 국한되지 않지만,, 폴리디메틸실록산, 폴리소르베이트 등을 첨가하여 더욱 조밀한 폼을 달성할 수 있으며, 더욱 조밀한 폼은 5 KPa 내지 15 KPa의 전단 계수를 가질 수 있다.
임의의 특정 이론에 제한하려는 의도 없이, 일부 실시형태에서, 생체적합성 세제 및/또는 계면활성제의 첨가에 의해 폼의 파괴의 야기가 초래되며, 파괴는 폼이 안정화되기 이전에 도입되며, 유동가능한 겔로서 재구성된 폼이 형성된다. 일부 실시형태에서, 유동가능한 겔을 가교제 용액과 (예를 들어, 수동으로, 기계적으로 또는 정적 혼합기를 통해 동시에 푸싱함으로써) 혼합하여, 균질한 안정화된 겔을 생성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 융합성(즉, 폼과 반대) 안정화된 겔은 생체 내에서 연장된 시간 동안 분해를 견딜 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 적어도 하나의 계면활성제를 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 "계면활성제"는 물의 표면 장력을 낮추는 화합물을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 계면활성제는 이온성 계면활성제, 예를 들어, 나트륨 라우릴 설페이트 및 옥탄산; 또는 중성 계면활성제, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 에테르, 폴리옥시에틸렌 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄일 수 있다.
일부 실시형태에서, 생체 내 분해 속도를 감속시키기 위하여 덱스트린(덱스트란)을 조성물에 첨가할 수 있다.
일부 비제한적인 예시적인 실시형태에서, 세포의 내부-성장은 황산화 글리코사미노글리칸(GAG), 예를 들어, 콘드로이틴 설페이트를 첨가함으로써 훨씬 더 증진될 수 있다. 일부 실시형태에서, GAG를 코폴리머 분말로서 건조 분말 제형에 첨가하거나, 제트-밀링 제조 단계 이전에 단백질/가교제(즉, mTG), 임의의 다른 성분에 화학적으로 결합시키거나, 그들의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시형태에서, GAG의 농도는 조성물의 0.5 wt% 내지 10 wt%일 수 있다.
임의의 특정 이론에 제한하려는 의도 없이, 다공성 스캐폴드 내의 세포는 천연 세포 외 매트릭스의 섬유성 환경 내에서의 그들의 경험과 유사하게, 3차원의 매트릭스 상호작용에 수반될 수 있다. 2D 스캐폴드 또는 덜 적합한 스캐폴드 물질과 비교하여, 3차원에서 발생하는 더욱 천연적인 세포 스프레딩이 달성된다.
임의의 특정 이론에 제한하려는 의도 없이, 3차원 다공성 스캐폴드에서 달성되는 세포 형상은 유전자 발현, 단백질 번역 후 기능을 변경시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 제조시에 다공성 스캐폴드 내로 배합(수화 액체와 혼합)되거나 이후에 다공성 스캐폴드에 유입되며, 그들은 그들의 천연 3D 구조를 유지한다. 따라서, 임의의 특정 이론에 제한하려는 의도 없이, 일부 실시형태에서, 스캐폴드는 개별 세포의 고유 3D 형상을 유지할 뿐 아니라, 그것은 세포를 더욱 천연적인 방식으로 집합하는 작용을 한다. 이는 정상 조직 기능을 더 잘 대표하는 조직-유사 구조 및 세포-대-세포 상호작용의 형성을 초래한다.
젤라틴을 사용하는 일부 실시형태에서, 가교된 젤라틴의 탄성 특성 및 인테그린 부착 부위(폴리머 상의 세포 결합 부위)의 존재비는 세포 내부 성장, 증식을 가능하게 하며, 생리학적 조직 재생을 초래하며, 다양한 조직 공학 적용을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 가교된 젤라틴은 다수의 세포 유형과 함께 시험관 내에서 조직 유사 구조를 생성할 수 있다. 상이한 유형의 세포는 혼합된 집단으로서 또는 상이한 세포 유형의 불연속 층으로서 3D 동시-배양 모델에 집합될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 젤라틴 및 가교제, 예를 들어, mTG를 비제한적으로 하기의 물질을 함유하는 세포 배양 배지와 혼합할 수 있다: 글루코스, 안정성 글루타민(알라닐-글루타민), 페니실린, CaCl2·2H2O, 질산제이철(Fe(NO3)3-9H2O), 염화칼륨(KC1), MgSO4·7H2O, 염화나트륨(NaCl), 중탄산나트륨(NaHCO3), 인산나트륨(NaH2PO4-H2O), D-글루코스, 페놀 레드, L-알라닐-L-글루타민, L-아르기닌-Hcl, L-시스틴, 글리신, L-히스티딘 HC1-H2O, L-이소류신, L-류신, L-라이신-Hcl, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, D-판토텐산칼슘, 염화콜린, 엽산, i-이노시톨, 니아신아미드, 피리독신 Hcl, 리보플라빈, 티아민 HCl 및 우태아혈청.
세포 배양 배지와의 혼합은 다공성 스캐폴드의 가교를 손상시키지 않는다.
일부 실시형태에 따르면, 젤라틴 및 mTG 건조 분말을 혼합하고, 세포 배양 배지(비제한적으로, 하기의 성분 함유: _글루코스, 안정성 글루타민(알라닐-글루타민), 페니실린, CaCl2·2H2O, 질산제이철(Fe(NO3)3-9H2O), 염화칼륨(KC1), MgSO4·7H2O, 염화나트륨(NaCl), 중탄산나트륨(NaHCO3), 인산나트륨(NaH2PO4-H2O), D-글루코스, 페놀 레드, L-알라닐-L-글루타민, L-아르기닌-Hcl, L-시스틴, 글리신, L-히스티딘 HC1-H20, L-이소류신, L-류신, L-라이신-Hcl, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, D-판토텐산칼슘, 염화콜린, 엽산, i-이노시톨, 니아신아미드, 피리독신 Hcl, 리보플라빈, 티아민 HCl 및 우태아혈청)로 수화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 이것은 초기 젤라틴-세포 매트릭스에서 더 나은 세포의 생존을 가능하게 한다. 세포를 배지와 혼합하고, 하나의 주사기에 보유하는 한편, mTG 및 젤라틴 분말은 다른 주사기에 존재할 수 있다. 그 다음, 주사기를 잠금 메커니즘을 사용하여 서로 연결하여, 성분을 함께 혼합하기 위한 수동의 푸시를 가능하게 한다. 그들을 하나의 주사기에서 다른 주사기로 수회 푸싱함으로써, 세포, 배지, 젤라틴, mTG 및 기체는 함께 혼합하여, 세포가 씨딩되는 최적의 스캐폴드를 형성한다. 본 발명의 가교된 젤라틴 다공성 스캐폴드 내의 세포의 생존력을 보여주는 예시적인 실시형태는 실시예 19에 상세히 설명되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 형성되는 가교된 매트릭스 내의 효소 분자의 인지 부피를 변경시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변경되는 인지 부피는 매트릭스를 형성하기 위한 폴리머의 가교 정도에 따라 결정되어, 변형되지 않은 효소 분자와의 가교의 정도와 비교하여 감소된 가교의 정도가 증가된 인지 부피를 나타내게 한다. 일부 실시형태에서, 효소 분자의 인지 부피를 증가시키는 하나의 방법은 효소 분자로의 적어도 하나의 분자 또는 모이어티의 공유적 또는 비-공유적 부착에 의하여 분자의 크기 및/또는 유체역학적 부피를 증가시킴으로써 이루어진다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 변형된 효소의 이용을 포함한다.
일부 실시형태에서, 인지 부피의 증가 방법은 순전하가 폴리머 또는 코-폴리머 사슬 상의 순전하와 반대 극성을 이루는 효소 분자의 정전하 변경을 통해 이루어진다. 일 실시형태에서, 인지 부피의 증가는 효소의 등전점(pi)의 변경에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 조성물의 일부 실시형태에 따르면, 변형된 효소 분자에 의해 가교되는 기질 폴리머를 포함하는 가교된 다공성 스캐폴드가 제공되며, 변형된 효소 분자는 매트릭스가 폴리머의 가교를 통해 형성되는 경우 가교된 매트릭스 내의 효소 분자의 인지 부피를 변경시키는 변형을 갖는다. 일부 실시형태에서, 변형된 효소 분자는 변형된 효소 분자의 실제 크기를 증가시키는 변형을 갖는다. 일부 실시형태에서, 변형된 효소 분자는 변형된 효소 분자의 유체역학적 부피를 증가시키는 변형을 갖는다. 일부 실시형태에서, 변형된 효소 분자는 비변형된 효소와 비교하여 변형된 효소의 등전점(pi)을 변경시킴으로써 변형된 효소의 정전하가 기질 폴리머의 순전하와 반대 부호가 되게 변경시키는 변형을 갖는다. 일부 실시형태에서, 변형은 숙시닐화(숙신산 무수물 이용), 아세틸화(아세트산 무수물 이용), 카바밀화(시아네이트 이용), 환원 알킬화(알데히드) 및 말레산 무수물로의 처리로 이루어진 군으로부터 선택되는 과정을 통한 효소의 라이신의 ε-아미노기의 변형이다. 일부 실시형태에서, 변형은 음전하의 수를 감소시키기 위한 효소의 카복실산을 함유하는 하나 이상의 측쇄의 변형이다.
일부 실시형태에서, 변형은 변형된 효소 분자로의 적어도 하나의 분자 또는 모이어티의 공유적 또는 비-공유적 부착을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형은 변형된 효소 분자로의 변형 분자의 공유적 부착을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 효소 분자는 비-변형된 효소에 비하여 감소된 확산율 및 감소된 가교율을 갖지만, 비-변형된 효소에 비하여 적어도 유사한 측정된 효소 활성을 갖는다(예를 들어, 이에 국한되지 않지만, 비-변형된 효소에 비하여 약 20% 내지 100%의 활성).
일부 실시형태에서, 감소된 가교율은 비-변형된 효소 가교율의 적어도 10%이다. 일부 실시형태에서, 감소된 가교율은 비-변형된 효소 가교율의 10% 내지 40%이다.
일부 실시형태에서, 변형 분자는 운반체 또는 폴리머를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리머는 합성 폴리머, 셀룰로스 폴리머, 단백질, 다당류 또는 그들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 셀룰로스 폴리머는 카복시메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 메틸 셀룰로스 또는 그들의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다당류는 덱스트란, 콘드로이틴 설페이트, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트, 헤파린, 헤파란 설페이트, 히알루론산, 전분 유도체 또는 그들의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 조성물의 일부 실시형태에서, 변형 분자는 PEG(폴리에틸렌 글리콜)를 포함한다. 일부 실시형태에서, PEG는 PEG 유도체를 포함한다. 일부 실시형태에서, PEG 유도체는 활성화된 PEG를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화된 PEG는 메톡시 PEG(mPEG), 그의 유도체, mPEG-NHS, mPEG의 석신이미딜(NHS) 에스테르(mPEG-석시네이트-NHS), mPEG-글루타레이트,-NHS, mPEG-발레레이트-NHS, mPEG-카보네이트-NHS, mPEG-카복시메틸-NHS, mPEG-프로피오네이트-NHS, mPEG-카복시펜틸-NHS), mPEG-니트로페닐카보네이트, mPEG-프로필알데히드, mPEG-토실레이트, mPEG-카보닐이미다졸, mPEG-이소시아네이트, mPEG-에폭사이드 또는 그들의 조합 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화된 PEG는 효소 상의 아민기 또는 티올기와 반응한다. 일부 실시형태에서, 활성화된 PEG 대 활성화된 효소의 라이신 잔기의 몰 비는 0.5 내지 25의 범위이다. 일부 실시형태에서, 활성화된 PEG는 단일작용성, 이종이작용성, 동종이작용성 또는 다작용성이다. 일부 실시형태에서, 활성화된 PEG는 분지형 PEG 또는 다중-아암(arm) PEG이다. 일부 실시형태에서, 활성화된 PEG는 1000 달톤 내지 40,000 달톤 범위의 크기를 갖는다.
일부 실시형태에서, 다공성 스캐폴드는 효소에 또는 기질 폴리머에 공유적으로 결합되지 않은 코-폴리머를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 코-폴리머는 다당류 또는 셀룰로스 폴리머를 포함한다. 일부 실시형태에서, 다당류는 덱스트란, 콘드로이틴 설페이트, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트, 헤파린, 헤파란 설페이트, 히알루론산, 전분 유도체 또는 그들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 셀룰로스 폴리머는 카복시메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 메틸 셀룰로스를 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 효소 분자는 복수의 다른 효소 분자로의 변형된 효소 분자의 가교에 의해 변형되어, 복수의 가교된 효소 분자의 응집물을 형성한다. 일부 실시형태에서, 효소 분자의 변형은 매트릭스의 적어도 하나의 특성에 영향을 미친다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 특성은 인장 강도, 강성, 기질 분자의 가교 정도, 점도, 탄성, 유연성, 파괴 변형률, 파괴 응력, 푸아송비, 팽윤 능력 및 영률 또는 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 변형된 효소의 변형 정도는 다공성 스캐폴드 내의 변형된 효소의 이동성 또는 다공성 스캐폴드로부터의 확산을 결정한다. 일부 실시형태에서, 변형된 효소의 변형은 비-변형된 효소 및 단백질의 용액 또는 다공성 스캐폴드와 비교하여, 변형된 효소 및 단백질의 용액에서의 또는 변형된 효소 및 단백질의 다공성 스캐폴드에서의 변형된 효소의 확산 계수를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 변형된 효소의 변형 정도는 하나 이상의 폼 기계적 특성을 결정한다. 일부 실시형태에서, 변형된 효소 분자는 비-변형된 효소 분자에 비하여 용액에서보다 가교된 폴리머에서 가교율의 더 큰 차이를 보여준다.
일부 실시형태에서, 분말화된 가교제는 분말화된 폴리머와 반응하기 위한 효소 및/또는 변형된 효소일 수 있다. 일부 실시형태에서, 분말화된 폴리머는 단백질, 예를 들어, 이에 국한되지 않지만, 젤라틴일 수 있다.
본 발명의 적어도 일부 실시형태에 따르면, 효소 분자를 매트릭스가 형성되는 경우 가교된 매트릭스 내 효소 분자의 인지 부피를 변경시키는 변형으로 변형시키는 단계; 변형된 효소 분자를 변형된 효소 분자의 기질인 적어도 하나의 기질 폴리머와 혼합하는 단계; 및 변형된 효소 분자에 의한 적어도 하나의 기질 폴리머의 가교를 통하여 매트릭스를 형성하는 단계로서, 매트릭스의 형성이 효소 분자의 변형에 의해 적어도 부분적으로 제어되는 단계를 포함하는 매트릭스의 형성의 제어 방법("매트릭스"는 하이드로겔 또는 다공성 스캐폴드를 지칭함)이 제공된다. 일부 실시형태에서, 변형은 적어도 하나의 기질 폴리머의 가교 정도가 증가하는 경우, 변형된 효소 분자의 가교율을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 변형된 효소 분자 및 적어도 하나의 기질 폴리머를 미분화된 분말 형태에서 혼합하여, 용액의 점도가 증가하는 경우, 변형이 적어도 하나의 기질 폴리머의 가교 정도를 제어하게 한다. 일부 실시형태에서, 변형은 7 내지 9 범위의 pH에서의 효소의 PEG화를 포함한다. 일부 실시형태에서, PEG화 반응의 pH는 7.5 내지 8.5이다.
치료를 필요로 하는 환자의 치료 방법
일부 실시형태에서, 본 발명은
a) 환자의 폐 내의 표적 영역을 붕괴시키는 단계;
b) 조성물을 붕괴된 영역의 제1 부분을 붕괴된 영역의 제2 부분에 접착시키기에 충분한 양으로 붕괴된 영역의 부위에 환자 내로 도입하는 단계로서,
붕괴된 영역의 제2 부분으로의 붕괴된 영역의 제1 부분의 접착이 환자의 폐 용적을 감소시키며,
조성물이 섬유아세포 부착 및 콜라겐 합성을 촉진하도록 구성되며,
섬유아세포 부착 및 콜라겐 합성이 염증을 예방하는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 환자에서 폐 용적을 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 본 발명은
a) 조성물을 폐 용적을 감소시키기에 충분한 양으로 폐 영역의 부위에 환자 내로 도입하는 단계로서,
조성물이 섬유아세포 부착 및 콜라겐 합성을 촉진하도록 구성되며,
섬유아세포 부착 및 콜라겐 합성이 염증을 예방하는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 환자에서 폐 용적을 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 본 발명은
a) 환자의 폐 내의 표적 영역을 붕괴시키는 단계;
b) 조성물을 붕괴된 영역의 제1 부분을 붕괴된 영역의 제2 부분에 접착시키기에 충분한 양으로 환자에서 붕괴된 영역의 부위에 형성하는 단계로서,
붕괴된 영역의 제2 부분으로의 붕괴된 영역의 제1 부분의 접착이 환자의 폐 용적을 감소시키며,
조성물이 섬유아세포 부착 및 콜라겐 합성을 촉진시키도록 구성되며,
섬유아세포 부착 및 콜라겐 합성이 염증을 예방하는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 환자에서 폐 용적을 감소시킨다.
일 실시형태에서, 본 발명은
a) 조성물을 환자에서 폐 영역의 부위에 폐 용적을 감소시키기에 충분한 양으로 형성하는 단계로서,
조성물이 섬유아세포 부착 및 콜라겐 합성을 촉진시키도록 구성되며,
섬유아세포 부착 및 콜라겐 합성이 염증을 예방하는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 환자에서 폐 용적을 감소시킨다.
적어도 일부 실시형태에 따르면, 본원에 기재된 바와 같은 다공성 스캐폴드를 조직에 적용하는 단계를 포함하는 체액의 누출에 대한 조직의 밀봉 방법이 제공된다. 더 높은 농도의 가교제를 포함하는 일부 실시형태에서, 매트릭스가 지혈제이도록 체액은 혈액을 포함한다. 적어도 일부 실시형태에 따르면, 본원에 기재된 바와 같은 매트릭스를 포함하는 지혈제 또는 수술용 실란트 또는 벌킹제가 제공된다. 적어도 일부 실시형태에 따르면, 본원에 기재된 바와 같은 매트릭스를 포함하는 상처를 밀봉하기 위한 조성물이 제공된다. 적어도 일부 실시형태에 따르면, 조직 내의 봉합선 또는 스테이플 선을 밀봉하기 위한 조성물의 용도가 제공된다. 일부 실시형태에서, 수술용 메쉬, 예를 들어, 탈장교정술 메쉬를 조직에 접착시키기 위한 조성물의 용도가 제공된다. 일부 실시형태에서, 젤라틴 및 효소 분말이 함침된 메쉬가 제공될 수 있다.
적어도 일부 실시형태에 따르면, 본원에 기재된 바와 같은 다공성 스캐폴드를 포함하는 국소화된 약물 전달을 위한 비히클용 조성물이 제공된다. 적어도 일부 실시형태에 따르면, 주사가능한 다공성 스캐폴드로서 조정된 본원에 기재된 바와 같은 매트릭스를 포함하는 조직 공학용 조성물이 제공된다. 적어도 일부 실시형태에 따르면, 조성물의 변형 방법은 가교성 작용기를 갖는 변형된 효소 및 변형된 효소에 의해 가교가능한 적어도 하나의 모이어티를 갖는 단백질을 제공하는 단계; 및 변형된 효소 및 단백질을 혼합하는 단계로서, 변형된 효소가 단백질을 가교시키고, 또한 가교성 작용기를 통하여 단백질에 가교 되는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 조성물은 국소화된 약물 전달을 위한 비히클로서 사용된다. 일부 실시형태에 따르면, 조성물은 조직 공학 및 회복을 위한 주사가능한 스캐폴드 또는 조직 재형성제이다. 일부 실시형태에 따르면, 조성물은 지혈 조성물이다. 일부 실시형태에 따르면, 조성물은 체액 밀봉 조성물이다. 본 발명의 조성물은 신속한 지혈을 제공하여, 이에 의해, 상해 또는 수술 후에 혈액 손실을 최소화할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 안정한 새로운 뼈 형성의 동일계 내 물리적 구조화를 가능하게 하도록 구성된 접착성 골 이식편을 포함하며, 조성물은 생체적합성이며; 2 내지 6개월 이내에 생분해성이어서, 완전히 형성된 천연 뼈에 의한 대체를 가능하게 하며; 이식편의 생분해와 협력하여 천연 뼈의 내부 성장을 가능하게 하도록 구성된 다공성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 조성물은 적어도 하나의 추가의 물질과 함께 적용될 수 있으며, 젤라틴 하이드로겔 또는 젤라틴 폼은 젤라틴-트랜스글루타미나제 매트릭스의 동일계 내 안정화 기능으로 인하여 개선된 물리적 특성을 갖는 골전도성 및/또는 골유도성 스캐폴드 아교를 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 폼에 적용될 수 있으며, 안정화된 젤라틴 폼은 충분한 내부 성장과 골모세포에 대한 지지를 제공하여, 하버스계(골단위)를 활성화시켜, 새로운 소주골 구조를 증식시키고 이를 생성할 수 있다. 실시예 3 및 도 6을 참조한다.
본원에 사용되는 "벌킹제"는 조직 벌크를 증가시키기 위해 사용되는 공간-충전 주사가능 물질이다. 그들을 개선된 미용 결과를 위하여 피부 하에, 요실금을 치료하기 위하여 요도 주위에, 그리고 대변 실금을 치료하기 위하여 항문 주위에 주사할 수 있다. 도 5는 돼지의 항문으로 점막하 주사되는 벌킹제를 보여주는 본 발명의 실시형태이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 벌킹제를 또한 임의의 조임근 또는 관에 주사하여, 인공의 협착을 생성하고, 자제를 회복할 수 있다.
예시적인 실시형태에서, 도 2A는 인간의 방광 경부의 점막하 내로 진입하는 주사바늘을 보여준다. 도 2B는 인간의 방광 경부 및 근위 요도의 점막하 내로 주사되는 벌킹제를 보여준다. 동일한 개념이 동물에 적용될 수 있다. 도 7은 돼지의 요도로의 주사를 보여준다. 따라서, 일부 실시형태에서, 조성물은 집안 애완동물에서 요실금 문제에 대한 해결책을 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 요도 벌킹제는 자가 지방, 글루타르알데히드 가교된 소 콜라겐, 칼슘 수산화인회석, 열분해 탄소-코팅된 비드, 폴리디메틸실록산, 에틸렌 비닐 알코올 코폴리머, 덱스트라노머 히알루론산 및 폴리테트라플루오로에틸렌을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 비-이동성, 내구성, 분해성이도록 구성되거나, 지속적인 기간에 걸쳐 연결 연조직에 의해 대체되도록 구성되거나, 그들의 임의의 조합인 벌킹제이다. 일부 실시형태에서, 이동은 입자 크기 및 수의 함수이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 시간이 지남에 따라 증식하고 부피 효과를 유지하는 내인성 또는 외인성 세포를 위한 스캐폴드를 제공한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 안정한 단일의 통합된 물리적 형성을 초래하기 위한 동일계 내 가교된 겔이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 분해성이며, 이탈의 위험 없이 점차 섬유모세포 및 면역 세포에 의해 침윤될 수 있으며, 조직에 의해 대체되도록 구성된다.
일부 실시형태에서, 벌킹제의 조성물은 안정한 단일의 통합된 물리적 형성을 초래하기 위한 동일계 내 가교 다공성 스캐폴드, 폼 또는 겔일 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 젤라틴 및 가교제의 건조 미분화된 분말로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 조성물은 액체 상태 젤라틴 및 가교제로 이루어진다(바람직한 실시형태에서, 가교제는 트랜스글루타미나제이다). 일부 실시형태에서, 조성물은 액체 상태 젤라틴 및 가교제로 이루어지며, 다른 부형제를 젤라틴과 함께 사용하여 그의 천연 고체-겔 전이점을 감소시켜(예를 들어, 우레아 및 칼슘), 그의 점도를 감소시키고, 액체 트랜스글루타미나제는 부형제를 함유하여, 그의 안정성을 증진시키고 그의 점도를 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 조성물은 수술용 접착제이다. 일부 실시형태에서, 수술용 접착제는 젤라틴-트랜스글루타미나제일 수 있다. 일부 실시형태에서, 젤라틴은 분말화된 미분화 젤라틴일 수 있다. 일부 실시형태에서, 젤라틴은 액체 형태로 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 젤라틴은 고체이지만 열 가역적 형태로 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 젤라틴은 선택적으로 분말화된 트랜스글루타미나제에 의해 가교된다. 일부 실시형태에서, 젤라틴은 액체 중 용해된 트랜스글루타미나제에 의해 가교된다. 일부 실시형태에서, 젤라틴은 변형된 트랜스글루타미나제에 의해 가교된다. 일부 실시형태에서, 젤라틴 및 트랜스글루타미나제는 분말 건조 형태로부터 또는 액체 형태로부터 직접 혼합한다.
일부 실시형태에서, 발포된 젤라틴은 길고 얇은 카테터 또는 주사바늘을 통해 전달될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 길이가 적어도 10 ㎝이고 직경이 최대 10 프렌치(French)인 중공 전달 관을 통해 젤라틴 동일계 내 안정화 폼을 전달하는 것이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 길이가 적어도 15 ㎝이고 직경이 최대 6 프렌치인 중공 전달 관을 통해 젤라틴 동일계 내 안정화 폼을 전달하는 것이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 길이가 적어도 25 ㎝이고 직경이 최대 6 프렌치인 중공 전달 관을 통해 젤라틴 동일계 내 안정화 폼을 전달하는 것이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 적어도 30 ㎝ 길이이고 직경이 최대 6 프렌치인 중공 전달 관을 통해 젤라틴 동일계 내 안정화 폼을 전달하는 것이다.
일부 실시형태에서, 어플리케이터(applicator)를 사용할 수 있으며, 어플리케이터는 내시경 보조의 이용 없이 주사된 물질을 적소에 안내하도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 어플리케이터 투여는 표준화되며, 임의의 외래환자 임상 환경에서 행해질 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리머의 주사 위치는 방광에 근접한 요도의 근위부의 조임근에 근접하다. 본 발명의 장치의 일부 실시형태에서, 장치는 요도 내로의 위치 결정을 가능하게 하고, 방광으로의 개구부와 정렬되도록 구성된 실린더이다. 일부 실시형태에서, 일단 장치가 적소에 존재한다면, 2 내지 4개의 주사바늘이 실린더의 주요 내강 밖으로 강제될 것이며, 요도 근위부에서(즉, 방광 개구부에 가장 가까운) 요도의 점막하 내로 나올 것이다. 일부 실시형태에서, 주사바늘은 방광 개구부로부터 1 ㎜ 내지 25 ㎜ 떨어져 배치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 원통형 장치 및 주사바늘이 대상체 내에 적소에 존재한다면, 폴리머를 함유하는 주사기는 실린더 내측의 채널에 연결될 수 있고, 이 채널은 폴리머가 여전히 유동가능한 액체 형태로 존재하는 경우, 즉, 폴리머가 가교 되고 고형화되기 전에 폴리머를 조직에 전달하도록 구성된다. 일 실시형태에서, 주사기와 실린더 사이에 정적 혼합기 또는 활성 혼합기가 존재할 것이며, 정적 혼합기는 아교의 액체 폴리머 성분이 가교제 현탁액과의 혼합을 필요로 하는 경우에 사용되도록 구성된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 동물 및 인간에서 대변 실금을 치료하기 위한 최소 침습 용액을 전달하도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 생체적합성 벌킹제를 항문관의 점막하층에 주사하여, 신체 조직 팽창을 제공하여 결함이 있는 항문의 협착을 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 벌킹제는 동일계 내 안정화 접착제 폼 또는 겔에 기초한다. 일부 실시형태에서, 벌킹제는 이동에 저항하고, 부피 무결성을 유지하도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 벌킹제는 경쟁 제품보다 제작이 상당히 더 저렴하다(최종 멸균이 가능하기 때문에). 일부 실시형태에서, 본 발명의 작용제는 생체적합성이면서 조직에 강력하게 접착하도록 구성된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 벌킹제는 여드름 흉터를 제거하거나 개선하고, 주름을 보정하고, 기존의 흉터를 향상시키거나, 얼굴 윤곽을 재표면화하거나, 또는 이들의 임의의 조합을 위해 구성된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 벌킹제는 하기의 특성을 갖는 충전 물질이다: (i) 생리학적 - 그 자체가 신체 조직에 혼입; (ii) 간단한 절차 - 주사가능; (iii) 위험-부재 - 합병증 또는 유해 효과 부재; (iv) 반영구적 - 시간이 지남에 따라 분해; (v) 세포의 내부 성장 및 조직 재형성제를 위한 스캐폴드로서 제공 또는 이들의 임의의 조합.
일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 필러, 예를 들어, 피내 필러이다. 일부 실시형태에서, 필러는 젤라틴 및 트랜스글루타미나제 안정화제로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 가정 애완동물, 예를 들어, 이에 국한되지 않지만, 고양이 및 개를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 필러를 요도가 방광에 연결되는 곳 바로 뒤 또는 바로 앞의 요도의 내벽 하에 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 어플리케이터를 사용하여) 주사할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리머는 영역을 '팽화시켜', 이러한 요도의 부분에서 압력을 증가시키며, 이는 요실금을 개선시킨다. 또한, 폴리머가 가교된 젤라틴이기 때문에, 폴리머는 영역 내로의 신규 혈관 성장을 자극하도록 구성되며, 천연 조직 보강은 결국 폴리머를 대체할 것이다.
비-독성 조직 실란트 폼에 대한 또 다른 용도는 조직 용적 감소, 예를 들어, 폐 용적 감소용이다. 폐기종이 있는 환자는 현재 치료 선택이 제한적이다. 많은 환자는 스테로이드 및 흡입형 약제로 치료되며, 이는 종종 이익을 거의 제공하지 않거나, 이익을 제공하지 않는다. 최근에, 폐 용적 감소 수술(LVRS)이 진행된 폐기종을 위하여 허용된 치료법이 되었다. LVRS는 폐의 환부의 제거를 수반하여, 남아 있는 더 건강한 폐의 부분이 더 잘 기능하게 할 수 있다(예를 들어, 문헌[Cooper et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 109: 106-116, 1995] 참조). 그러나, LVRS 수술은 대수술이고, 침습성이고, 위험하다. 최소 침습 수단, 구체적으로, 실란트 폼에 의한 비기능성 폐기종 폐 조직의 용적의 감소는 덜 손상된 폐 조직을 위한 공간이 더 효율적으로 팽창하고 기능하게 한다. 그것은 환기관류불균형을 개선시킨다. 알부민 실란트를 사용한 RCT에서의 지금까지의 결과에 의해, 유의미한 개선이 나타났다. 일부는 FEV1의 100% 초과의 증가의 개선을 경험하였다. 그렇지만, 유의미한 위험(아마도 독성 가교제의 이용으로 인한 염증성)은 그의 현재의 이용을 제한한다. 실란트를 사용한 폐의 부분의 제거에 의해 호흡 기능이 개선되는 것이 직관에 반대되는 것으로 여겨질 수 있지만, 과도-팽창된 조직(이질성 폐기종이 있는 환자에서 관찰되는 바와 같음)의 제거는 건강한 폐의 인접 영역이 팽창되게 한다. 차례로, 이러한 팽창은 개선된 반동 및 기체 교환을 가능하게 한다. 본원에 기재된 비-독성 젤라틴 폼은 기도 및/또는 기관지경 작동 채널을 통해 폐 내로 전달될 수 있다. 그것은 섬유아세포 증식을 유도할 것이며, 결과적으로, 처리된 폐의 세그먼트는 기능장애가 되고 붕괴될 것이다. 일부 실시형태에서, 상기 폐의 표적 영역은 표면 영역을 항-계면활성제로 세척함으로써 붕괴 된다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 상처의 치료 방법이며, 약제학적 건조 분말 조성물은 건조 접착제 코팅, 에어로졸, 건조 에어로졸, 펌프 스프레이, 의료용 압박붕대, 필름, 코팅된 플라스터, 약제가 든 스펀지 또는 수술용 패치, 지혈 플리스, 거즈, 고약, 세미-겔, 겔, 폼, 페이스트, 현탁액, 연고, 에멀젼, 주조가능한 형태, 비강 플러그, 수술용 드레싱, 상처 패킹, 밴드, 면봉, 카테터, 광섬유, 주사기, 페서리, 좌제 및 액체 또는 비수성 액체 중 현탁액으로부터 선택되는 제형에 존재한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 단독으로 또는 다른 골전도성 물질과 함께 사용될 수 있으며, 복합물에 응집 강도를 제공하여 골 이식편 제조를 가능하게 하는 가교성 조성물이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 젤라틴 및 트랜스글루타미나제의 조성물이며, 둘 모두 액체 형태이다. 일부 실시형태에서, 젤라틴의 조성물은 그의 전이점을 낮추는 의도의 첨가제(예를 들어, 이에 국한되지 않지만,, 우레아 및/또는 칼슘)와 함께 액체 형태로 존재한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 젤라틴 및 트랜스글루타미나제의 조성물이며, 둘 모두 건조 분말 형태이다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 골전도 물질에는 수산화인회석(HA), 트리칼슘 포스페이트(TCP), CCC, 생체활성 유리, 생체활성 세라믹 및/또는 그들의 혼합물이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 발명과 함께 사용하기에 적합한 골유도성 물질에는 DBM 및 성장 인자, 예를 들어, 골 형성 단백질(BMP), TGF-베타, PDGF, 혈소판 풍부 혈장(PRP) 및/또는 그들의 혼합물이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 조성물은, (예를 들어, 외과술에 사용하기 수 분 또는 수 시간 전에) 의사가 조성물을 형상에 순응하게 하도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 글리코사미노글리칸을 포함할 수 있으며, 조성물로의 글리코사미노글리칸의 부가는 스캐폴드의 개선된 소정의 특성 및 수분 흡수를 가능하게 한다.
이제 상기 설명과 함께 본 발명의 일부 실시형태를 비제한적인 방식으로 예시하는 하기의 실시예를 참조한다.
실시예
실시예 1: 본 발명의 일부 실시형태에 따른 조성물에 대한 인발 시험.
성분
(i) 0.25 g의 ACTIVA WM 효소 제제(스트렙토베르티실리움 모바라엔세(Streptoverticillium mobaraense)로부터의 미생물 트랜스글루타미나제 1%, 말토덱스트린 99%)(일본 소재의 아지노모토(Ajinomoto))
(ii) 0.25 g의 슈퍼파인 리미티드(Superfine Ltd)에 의해 하기의 입자 크기 범위로 제트 밀링된 젤리타(Gelita) 275 블룸, A형 돼지 젤라틴(미국 수시티 소재의 젤리타) 의료 등급 저 내독소: d(0.1)=4.24 ㎛, d(0.5)=16.61 ㎛, d(0.9)=31.51 ㎛
(iii) 1 ㎖ 염수(+ 및 액체 첨가제)
방법
분말을 L-3 커뮤니케이션즈(Communications)에 의해 제작된 9.93 킬로그레이(KiloGray) e-빔에 의해 멸균시켰다. 무균성을 아미노랩 리미티드(AminoLab Ltd.)(이스라엘 르호봇 소재)에 의해 확인하였으며, 시험을 SOP 번호 50.WI.110-건강 관리 제품의 무균성 시험에 따라 행하였다. 혼합물을 하나의 주사기로부터 다른 주사기로 10 내지 12회 푸싱함으로써 분말을 수동으로 혼합하였다. 그 직후에, 혼합물을 2개의 콜라겐 시트 사이에 적용하여, 아교 처리된 중첩부가 대략 2 ㎝*2.5 ㎝이고, 대략 10분 동안 경화되게 하였다. 조성물을 힘 측정기 루트론(Lutron) FG-20KG를 사용하여 최대 인장(전단)력에 대하여 시험하였다.
결과에 의해, 유의미한 활성의 소실 없이 미분화된 분말을 최종 멸균시키는 능력이 입증된다.
실시예 2: 본 발명의 일부 실시형태에 따른 거즈 내로의 건조 분말의 함침.
하기의 젤라틴은 슈퍼파인 리미티드에 의해 하기의 입자 크기 범위로 제트 밀링된 젤리타 275 블룸, A형 돼지 젤라틴(미국 수시티 소재의 젤리타) 의료 등급 저 내독소를 지칭한다: d(0.1)=4.24 ㎛, d(0.5)=16.61 ㎛, d(0.9)=31.51 ㎛. mTG는 ACTIVA WM 효소 제제(스트렙토베르티실리움 모바라엔세로부터의 미생물 트랜스글루타미나제 1%, 말토덱스트린 99%)(일본 소재의 아지노모토)를 지칭한다.
A) 젤라틴 및 mTG 분말을 둘 모두 에틸 알코올 70%(헨 쉬무엘 케미컬즈(Hen Shmuel Chemicals))를 사용하여 표준 수술용 거즈 내로 함침시켰다.
B) 젤라틴 및 mTG 분말을 HFE 7000(3M 노벡(Novec) 7000 엔지니어드 플루이드(Engieered Fluid)), 고도로 증발가능한 용매를 사용하여 표준 수술용 거즈 내로 함침시켰다.
결과: 용매는 완전히 증발되며, 분말 입자는 거즈에 부착된 채 남아있었다. 일단 염수로 수화되면, 젤라틴이 재구성되고, mTG와 혼합되어, 거즈에 부착된 생체접착제 층을 형성한다.
실시예 3: 추가의 골 보강 물질을 사용하는, 그리고 이를 사용하지 않는, 뼈 결손의 치료에서의 가교된 젤라틴 폼의 효과
하기의 젤라틴은 슈퍼파인 리미티드에 의해 하기의 입자 크기 범위로 제트 밀링된 젤리타 275 블룸, A형 돼지 젤라틴(미국 수시티 소재의 젤리타) 의료 등급 저 내독소를 지칭한다: d(0.1)=4.24 ㎛, d(0.5)=16.61 ㎛, d(0.9)=31.51 ㎛. 하기의 mTG는 ACTIVA WM, 100 U/g의 활성 수준을 갖는 분말(일본 도쿄 소재의 아지노모토)을 지칭한다. mTG는 1%의 효소 및 99% 말토덱스트린을 함유한다. 젤라틴 및 mTG 미분화된 분말을 9.93 킬로그레이 e-빔(이스라엘 소재의 소르반(Sorvan))에 의해 멸균시켰다.
연구 목적은 동일계 내 가교 젤라틴 기초의 접착제 폼의 잠재적인 성능을 평가하는 것이었다. 물질을 뼈 성장을 행하고 이를 유도하기 위한 그리고 임의의 다른 골-유도성 또는 전도성 골 보강 물질을 수술 부위에 접착시키기 위한 스캐폴드로서 제공할 것이다. 그것은 서로, 그리고 조직에 아교 처리함으로써 임상의가 골-보강 입자(생물학적 또는 합성)를 원하는 위치에 고정화되게 하고, 그들의 위치가 유지되게 할 것이다. 예상되는 효과는 두 물질 모두에 대하여 상승적이지만; 가교된 젤라틴 폼의 효과는 이러한 목적을 위하여 독립적으로 사용하기에 충분할 수 있다.
4 BONE BCH(MIS, 이스라엘)를 골 보강 물질로서 사용하였으며, 이는 수산화인회석(HA) 및 베타트리(BetaTri) 인산칼슘(TCP)(60/40)으로 제조된 완전 합성 뼈 대체제이다.
체중이 대략 14 내지 15 ㎏인 대략 1년생의 아메리칸 폭스 하운드를 이러한 연구를 위하여 사용하였다. 통상의 치과 침윤 마취를 수술 부위에 시행하였다. 하악 소구치 및 대구치 발치(P2, P3, P4, M1)를 절반-치열궁에서 행하였다. 도 6a에 제시된 바와 같이 소켓은 6 ㎜ 직경 및 약 7 ㎜ 깊이로 구멍을 뚫고 생체재료를 소켓 내로 적용하였다. 마지막으로, 연조직을 소켓 위에서 봉합하였다.
3가지 조성의 생체재료 및 대조군을 시험하였다:
소켓 A형: 0.2 g의 mTG + 0.25 g의 젤라틴 + 0.0125 g의 콘드로이틴 설페이트 A + C(GAG)와 혼합된 4 BONE + 1.25 ㎖의 염수.
소켓 B형: 4 BONE 단독.
소켓 C형: 0.25 g의 mTG를 0.25 g의 젤라틴과 폼으로 혼합.
소켓 D형: 음성 대조군으로서 제공하기 위하여 비워둠.
동물은 수술로부터 잘 회복되었으며, 그들의 입원 동안 유해 사례가 보고되지 않았다. 그들을 이식 수술 8주 후에 희생시켰다. 두 하악골 모두를 완충 포르말린에서 7일 동안 고정시켰다. 물에서 헹군 후에, 시료를 상승하는 농도의 에탄올에서 각각 대략 24시간 탈수시키고(70%, 83%, 96% 및 100% 2회), 탈수 후에, 시료를 자일렌에서 1일 동안 고정한 다음, 실온에서 100 ㎤의 메틸 메타크릴레이트, 10 ㎤의 폴리에틸렌글리콜 및 1 g의 벤조일 퍼옥사이드의 혼합물에 포매시켰다. 두 하악골 모두의 원위 및 근위 측으로부터 3-4, 200 ㎛ 두께의 단면 슬라이드를 물로 냉각되는 저속 다이아몬드 정밀 톱날(미국 일리노이주 소재의 뷸러(Buehler)로부터의 아이소메트(Isomet))을 사용하여 컷팅하였다. 슬라이드를 아크릴계 아교를 사용하여 지지체 퍼스펙스(Perspex) "밀키(milky)" 슬라이드 상으로 아교 처리한 다음, 정밀 그라인더(미국 일리노이주 소재의 뷸러)에서 50 ㎛의 두께로 분쇄 및 연마하였다. 슬라이드를 광학 현미경 하의 조직학적 분석을 위하여 톨루이딘 블루(Toluidine blue) 또는 헤모톡실린(Hemotoxylin) 및 에오신(Eosin)으로 염색하였다. 또한, 하악골을 X-선, CT 스캔으로 분석하고, 조직학적 분석을 위하여 취하였다.
결과
방사선 분석에 의해, 최상의 뼈 재생이 본 발명의 젤라틴 폼으로 처리한 A형 및 C형으로부터의 소켓에서 발생하는 것이 드러났다. 무손상 뼈, 빈 대조군 소켓, 4 Bone 단독의 소켓, 동시의 4 Bone 및 젤라틴 폼 및 젤라틴 폼 단독으로부터의 대표적인 CT 단면은 도 6b 및 도 6c에 제시되어 있다. 그들 CT 스캔에서 가장 강한 새로운 뼈 형성이 A형 및 C형의 소켓에서 발생하는 것이 관찰될 수 있다.
조직학적 분석
4 BONE 이식물 단독: 보강 물질은 인접 뼈와 그의 직접적인 접촉에도 불구하고, 뼈 신생형성(즉, 뼈 활성화 부재 및 신규 골단위 성장 형성 부재)의 명백한 자극 없이 빈 공동의 존재에 의해 나타나는 불균일한 과립 스프레딩을 보여준다.
4 BONE + 0.2 g의 mTG를 0.5 g의 젤라틴 + 0.0125 g의 콘드로이틴 설페이트 A + C와 함께 폼으로 혼합하였다: 합성 4 BONE 과립 물질은 단독으로 적용되는 경우보다 명백하게 더욱 균일하게 스프레딩되며, 인접 뼈에 부착된다. 가교된 젤라틴 폼은 무정형 외양이다. 기존의 공동에 명백한 침투 및 영향력이 존재한다. 염증 반응, 예를 들어, 이물질 육아종 또는 파골세포 존재가 소켓 용적의 도처에서 검출되지 않는다. 두꺼운 섬유주 형성과 함께 거대한 새로운 직골 형성이 명백하게 보인다. 또한, 신규한 활성화된 하버스계가 용이하게 검출되며, 생체재료로 충전된다. 모든 하버스계의 중앙에서의 생체재료의 존재는 조합물이 강력하게 골전도성 및 골유도성 물질로서 수행하는 것을 뒷받침한다.
0.25 g의 mTG를 0.25 g의 젤라틴과 함께 폼으로 혼합하였다: 생체재료는 우수한 공동의 침투와 함께, 이전에 A형 소켓에 기재된 무정형 물질로서 용이하게 확인된다. 새로운 직골 형성이 명백하게 보이며, 생체재료는 생체재료 주변에 단단히 형성되는 활성화된 하버스계의 중앙에 명백하게 스포팅 되어 있다. 각 골단위의 중심에서의 생체재료의 존재는 그것이 독립형 제품으로서 매우 골유도성임을 강력하게 시사한다. 이러한 결과의 대표적인 이미지는 도 6d에서 명백하게 관찰될 수 있으며, 이는 하버스관의 중심 내의 젤라틴 폼(화살표로 표시)과 함께 골단위의 조직학 슬라이드 단면을 나타낸다.
실시예 4: 본 발명의 일부 실시형태에 따른 조성물의 성능에 대한 GAG의 효과.
하기의 젤라틴은 슈퍼파인 리미티드에 의해 하기의 입자 크기 범위로 제트 밀링된 젤리타 275 블룸, A형 돼지 젤라틴(미국 수시티 소재의 젤리타) 의료 등급 저 내독소를 지칭한다: d(0.1)=4.24 ㎛, d(0.5)=16.61 ㎛, d(0.9)=31.51 ㎛.
재료
(i) 소 기관지로부터의 0.034 g의 콘드로이틴 설페이트 A 나트륨 염(시그마(Sigma))
(ii) 0.233 g의 젤라틴(젤리타 아게)
(iii) 0.233 g의 mTG(ACTIVA; 1% mTG; 아지노모토)
(iv) 1 ㎖의 물
상기 물질을 주사기 대 주사기 방법에 의해 혼합하고, 가교시켰다.
결과
복합물은 (예를 들어, 한 컵의 50℃ 물에서 침수시킴으로써) 열 안정성이었다. 물리적 구조의 측정 가능한 변화 없이, 그것은 주위의 실온의 물에서 2시간 동안 침수되었다. 또한, 복합물은 고형화되고, 2장의 콜라겐을 함께 접착시킬 수 있었다.
실시예 5: 서지플로우(Surgiflow)를 포함하는 조성물.
하기의 실험에 의해, 젤라틴 과립에 기초한 다른 시판되는 제품이 재구성되고, mTG와 가교되는 능력을 시험하였다.
재료
(i) 0.25 g의 건조 서지플로 지혈 매트릭스(에티콘 인코포레이티드(Ethicon Inc))를 하나의 주사기에서 0.25 g의 분말화 mTG(ACTIVA WM; 아지노모토)와 혼합하였다.
(ii) 다른 주사기에서 1 ㎖의 염수를 로딩하였다.
결과
서지플로 및 mTG 가교제를 염수와 잘 혼합하여, 균일한 폼을 형성하고, 1시간 동안 추적하였다. 폼은 전혀 안정화되거나 점착성이 되지 않았다.
실시예 6: 본 발명의 일부 실시형태에 따른 폼의 장기간 기계적 특성화.
하기의 젤라틴은 슈퍼파인 리미티드에 의해 하기의 입자 크기 범위로 제트 밀링된 젤리타 275 블룸, A형 돼지 젤라틴(미국 수시티 소재의 젤리타), 의료 등급 저 내독소를 지칭한다: d(0.1)=4.24 ㎛, d(0.5)=16.61 ㎛, d(0.9)=31.51 ㎛. 하기의 mTG는 ACTIVA(일본 도쿄 소재의 아지노모토)를 지칭한다.
재료
0.25 g의 젤라틴 및 0.25 g의 mTG를 1 ㎖의 물과 혼합하고, 폼으로의 가교 직후에, 수 중 7일의 인큐베이션 후에, 25일 후에, 60일의 인큐베이션 후에, 유연성 파라미터 180도 굽힘 시험을 측정하였다.
결과
가교된 폼은 매우 유연성이었으며, 180도 굽힘 시험을 통과하는 한편, 둥근(대략 2 ㎝ 직경), 1 ㎜ 두께의 폼 유닛을 가능한 최대의 정도로 구부렸으며, 이는 파괴 없이 180도까지의 굽힘 변형을 의미한다. 그것은 7일, 25일, 60일 후에, 초기의 교차 직후에서와 같이 동일한 수준의 유연성을 달성하였다.
실시예 7:
젤라틴(젤리타 275 블룸, A형 돼지 젤라틴)을 그라인딩 막자사발 공을 사용하여 30분 동안 분당 3600회의 진동으로 미분화하였다. 0.25 g의 생성된 젤라틴 분말을 0.25 g의 ACTIVA(일본 소재의 아지노모토)와 혼합하였다. mTG+젤라틴 혼합물을 도 3에 나타낸 방법에 따라 19℃의 온도에서 1 ㎖의 물과 폼으로 혼합하였다. 폼-아교를 사용하여 2장의 콜라겐을 접착시키고, 열안전성에 대하여 시험하였다.
결과
밀링된 젤라틴은 부분적으로 용해되었다. 막자사발 밀링으로부터 수득 되는 입자 크기가 매우 가변적인 것이 육안으로 보였으며, 더 큰 입자가 잘 용해되지 않는 것이 명백하였다.
생성되는 폼은 연질의 통합된 물리적 형성으로 안정화되었다. 폼이 가교되었으며, 50℃의 물 온도에서의 침수 후에 열안정성으로 남아 있었다. 폼은 콜라겐 시트를 간신히 함께 접착시켰다.
실시예 8: 현미경 관찰.
하기의 젤라틴은 슈퍼파인 리미티드에 의해 하기의 입자 크기 범위로 제트 밀링된 젤리타 275 블룸, A형 돼지 젤라틴(미국 수시티 소재의 젤리타), 의료 등급 저 내독소를 지칭한다: d(0.1)=4.24 ㎛, d(0.5)=16.61 ㎛, d(0.9)=31.51 ㎛. 하기의 mTG는 ACTIVA(일본 소재의 아지노모토)를 지칭한다.
젤라틴-mTG 폼을 제조하고, 광학 현미경에서 10x 및 40x 배율에서 가시화시켜 그의 폼 특성을 평가하였다.
결과
버블은 신체 요소를 가로질러 무작위 방식으로 고정되는 것으로 검출되었다. 그들은 크기가 2 내지 500 미크론 직경으로 다양하다. 도 8은 생성되는 버블의 이미지를 보여주는 본 발명의 실시형태를 보여준다.
실시예 9: 위장 실란트로서의 본 발명의 일부 실시형태에 따른 조성물의 용도.
하기의 젤라틴은 슈퍼파인 리미티드에 의해 하기의 입자 크기 범위로 제트 밀링된 젤리타 275 블룸, A형 돼지 젤라틴(미국 수시티 소재의 젤리타), 의료 등급 저 내독소를 지칭한다: d(0.1)=4.24 ㎛, d(0.5)=16.61 ㎛, d(0.9)=31.51 ㎛. 하기의 mTG는 ACTIVA WM, 100 U/g의 활성 수준을 갖는 분말(일본 도쿄 소재의 아지노모토)을 지칭한다. mTG는 1%의 효소 및 99% 말토덱스트린을 함유한다. 젤라틴 및 mTG 미분화된 분말을 9.93 킬로그레이 e-빔(이스라엘 소재의 소르반)에 의해 멸균시켰다.
급성 시험: mTG 및 젤라틴 분말을 1 ㎖의 주사용수와 함께 1:1 비로 혼합하였다.
약 0.9 ㎖의 폼을 60 ㎏ LW 돼지의 GI 관에 적용하고 약 1분 후에 무결성에 대하여 시험하였다.추후 수술용 실란트가 폼을 대체한다.
결과: 폼이 안정화되고 조직에 접착되었다. 그것은 매우 유연성이었으며, 조직에 순응하였다. 대표적인 사진은 도 4에 제시되어 있다.
만성 시험:
방법
멸균된 0.25 g의 젤라틴 및 0.25 g의 mTG 분말을 도 3에 입증된 바와 같이 주사기를 특수 잠금장치를 사용하여 주사기에 연결함으로써 1 ㎖의 WFI와 접착제 폼으로 수동으로 혼합하였다. 실란트 폼을 50 ㎏ 돼지의 창자에서 3 ㎝ 봉합선 상에 적용하였다. 돼지를 7일 후에 안락사시켰다. 실란트를 탄성 시험을 포함하여 육안으로 평가하였다. 시편을 절개하고, 조직병리학에 대한 현미경 평가를 요청하였다.
결과
안전성: 돼지는 건강하게 유지되었으며, 수술에서 잘 회복되었다. 염증의 징후가 존재하지 않았으며, 봉합선 또는 그 주위의 실란트에 대한 수술 후 접착이 존재하지 않았다. 현미경 평가(H&E 염색)에서, 실란트는 괴사 또는 거대 세포 축적의 증거 없이 경증(2 등급) 조직구성 반응에 의해 둘러싸여 있었으며, 이는 우수한 용인성을 시사한다. 조직구는 경증 내지 중등도의 다형핵 세포(2 내지 3 등급)의 존재와 관련이 있었다. 피막 반응(섬유아세포 증식이 있는 섬유증(2 등급, 경증))이 장막 표면 경계면에서 관찰되었다.
효능: 시각적으로 실란트는 봉합선에 계속 접착되었으며, 그것은 조직만큼 유연성이 있었다. 그것은 조직-실란트를 약 180도로 구부리는 경우 박리 되지 않았음을 의미한다. 현미경 평가(H&E 염색)에서, 재료는 장막 표면에 부착된 것으로 관찰되었다. 재료는 1주일이 지나도 분해되지 않았다. 이러한 시점(7일)은 분해 프로파일을 예상하기에 너무 조기이다.
실시예 10: 본 발명의 일부 실시형태에 따른 다양한 조성물의 시험.
하기의 젤라틴은 슈퍼파인 리미티드에 의해 하기의 입자 크기 범위로 제트 밀링된 젤리타 275 블룸, A형 돼지 젤라틴(미국 수시티 소재의 젤리타), 의료 등급 저 내독소를 지칭한다: d(0.1)=4.24 ㎛, d(0.5)=16.61 ㎛, d(0.9)=31.51 ㎛.
실시예 11: 주사바늘을 통한 본 발명의 일부 실시형태에 따른 조성물의 전달.
하기의 젤라틴은 슈퍼파인 리미티드에 의해 하기의 입자 크기 범위로 제트 밀링된 젤리타 275 블룸, A형 돼지 젤라틴(미국 수시티 소재의 젤리타), 의료 등급 저 내독소를 지칭한다: d(0.1)=4.24 ㎛, d(0.5)=16.61 ㎛, d(0.9)=31.51 ㎛. 하기의 mTG는 ACTIVA(일본 도쿄 소재의 아지노모토)을 지칭한다.
젤라틴 분말을 mTG와 1:1 비로 혼합하였다. 0.75 g의 혼합물을 26℃에서 2.63 ㎖의 물과 함께 수동으로 폼으로 혼합하였다. 폼을 주사바늘 18G(D=1.03 ㎜); 150 ㎜ 길이를 통해 푸싱하였다.
결과: 폼을 주사바늘을 통해 주사기로부터 성공적으로 전달하였다. 폼은 약 3분 후에 안정화되었으며, 50℃의 물에서 안정하게 유지되었다(그것은 열 가역성이 아님을 의미함).
실시예 12: 대변 실금을 위한 치료로서 본 발명의 일부 실시형태에 따른 조성물의 용도.
하기의 젤라틴은 슈퍼파인 리미티드에 의해 하기의 입자 크기 범위로 제트 밀링된 젤리타 275 블룸, A형 돼지 젤라틴(미국 수시티 소재의 젤리타), 의료 등급 저 내독소를 지칭한다: d(0.1)=4.24 ㎛, d(0.5)=16.61 ㎛, d(0.9)=31.51 ㎛. 하기의 mTG는 ACTIVA WM, 100 U/g의 활성 수준을 갖는 분말(일본 도쿄 소재의 아지노모토)을 지칭한다. mTG는 1%의 효소 및 99% 말토덱스트린을 함유한다. 젤라틴 및 mTG 미분화된 분말을 9.93 킬로그레이 e-빔(이스라엘 소재의 소르반)에 의해 멸균시켰다.
멸균 mTG 및 젤라틴 분말을 1 ㎖ 물과 함께 1:1 비로 혼합하고, 도 3에 입증된 바와 같이 주사기를 특수 잠금장치를 사용하여 주사기에 연결함으로써 수동으로 발포시켰다.
벌킹 젤라틴 폼의 주사를 2마리의 대형(65 ㎏) 흰(LW) 돼지(N=2)에서 항문에 주사하였다. 소수의 대표적인 사진이 도 5에 제시되어 있다.
결과: 폼은 동일계 내에서 유연성 벌크로 안정화되고, 조직에 접착되었다. 이식물은 항문 통과 직경을 감소시켰으며, 관의 인공의 접합(협착)을 야기하였다. 주사 위치를 100일 및 120일 후에 수집하였다. 돼지를 안락사시키고, 조직을 포르말린에서 고정시키고, 파라핀 블록에 포매시키고, 조직학적 분석을 위하여 슬라이드를 제조하였다. 동물 중 어느 것도 유해 효과를 보이지 않았다. 생체재료는 우수한 용인성을 나타내며, 분해성이다. 괴사 또는 공동 형성 또는 생체재료의 이동 중 어느 것도 존재하지 않았다. 생체재료는 섬유아세포, 즉, 증식되고, 섬유성 조직을 생성하는 섬유아세포를 이식 부위에 유인하였다. 급성기에서 주사 후에, 재료는 2급 염증 반응을 야기하며, 이후에 만성기에서 섬유아세포가 생체재료 용적을 대체하는 작용을 하는 동안, 경증(1 내지 2급) 염증이 계속된다.
실시예 14: 요실금을 위한 치료로서 본 발명의 일부 실시형태에 따른 조성물의 용도.
하기의 젤라틴은 슈퍼파인 리미티드에 의해 하기의 입자 크기 범위로 제트 밀링된 젤리타 275 블룸, A형 돼지 젤라틴(미국 수시티 소재의 젤리타), 의료 등급 저 내독소를 지칭한다: d(0.1)=4.24 ㎛, d(0.5)=16.61 ㎛, d(0.9)=31.51 ㎛. 하기의 mTG는 ACTIVA WM, 100 U/g의 활성 수준을 갖는 분말(일본 도쿄 소재의 아지노모토)을 지칭한다. mTG는 1%의 효소 및 99% 말토덱스트린을 함유한다. 젤라틴 및 mTG 미분화된 분말을 9.93 킬로그레이 e-빔(이스라엘 소재의 소르반)으로 멸균시켰다.
0.4 g의 mTG 및 1 g의 젤라틴 멸균 분말을 8 ㎖의 염수와 혼합하고, 도 3에 입증된 바와 같이 주사기를 특수 잠금장치를 사용하여 주사기에 연결하고, 수동으로 혼합함으로써 발포시켰다.
만성 돼지 연구
약 0.3 내지 0.5 ㎖의 폼을 방광경의 작동 채널에 삽입된 4F/ 33 ㎜ 길이의 주사바늘을 통하여 전달하였다. 폼을 하나의 단일의 스폿에서 근위 요도(삼각부로부터 2 내지 3 ㎝)에 점막하 전달하였다. 인간에서의 이식 방법 및 해부학적 위치의 개략도는 도 2에 제시되어 있다. 동물 환자의 경우, 처리되는 위치는 유사해야 한다: 방광으로의 개구부에 근접한 요도의 근위단. 내시경으로 취한 대표적인 사진은 도 7에 나타나 있다.
조직을 주사 22일 후에 수집하였다. 주사 위치를 육안으로 평가하고, 이후에 조직병리학적 평가를 요청하였다.
결과
폼은 동일계 내에서 유연성 벌크로 안정화되고, 조직에 접착되었다. 이식물은 요도 통과 직경을 감소시켰으며, 관의 인공의 접합(협착)을 야기한다. 요도를 동물로부터 절개하고, 이식물을 면밀히 검사하였다.
생체재료는 우수한 용인성을 보여주며, 분해성이다. 괴사 또는 공동 형성 또는 이동 중 어느 것도 존재하지 않았다. 생체재료는 섬유아세포, 즉, 증식되고, 섬유성 조직을 생성하는 섬유아세포를 이식 부위에 유인하였다.
주요 조임근 기능 저하(Primary Sphincter Mechanism Incompetence; PMSI)가 있는 개의 치료
11살의 잡종 암컷 개를 연구에 등록시켰다. 개는 처리 이전에 약 2년 동안 PMSI를 앓고 있었다.
약 0.3 내지 0.5 ㎖의 폼을 방광경의 작동 채널에 삽입된 4F/ 33 ㎜ 길이의 주사바늘을 통하여 전달하였다. 폼을 주변에 3개의 스폿에서 근위 요도(삼각부로부터 2 내지 3 ㎝)에 점막하 전달하였다. 일부의 폼을 동물의 외측에 배치하여, 그의 가교 능력을 확인하였다. 폼은 안정화되고, 50℃에서 열안정성이 유지되었다.
결과
유해 사례가 존재하지 않았다. 1주 추적 후에, 개의 주인은 소변 누출이 해결되었음을 보고하였다.
실시예 15: 본 발명의 일부 실시형태에 따른 다양한 조성물의 시험.
하기의 젤라틴은 슈퍼파인 리미티드에 의해 하기의 입자 크기 범위로의 제트 밀링된 젤리타 275 블룸, A형 돼지 젤라틴(미국 수시티 소재의 젤리타), 의료 등급 저 내독소를 지칭한다:
(A): d(0.1) = 4.24 ㎛, d(0.5) = 16.61 ㎛, d(0.9) = 31.51 ㎛.
(B): d(0.1) = 4.415 ㎛, d(0.5) = 13.064 ㎛, d(0.9) = 29.621 ㎛.
(C): d(0.1) = 13.451 ㎛, (C): d(0.5) = 94.66 ㎛, d(0.9) = 423.785 ㎛.
젤라틴 분말을 mTG 효소 : ACTIVA(일본 도쿄 소재의 아지노모토)와 혼합하였다.
수동의 혼합(2개의 주사기를 연결하는데, 하나에는 분말이 존재하고, 하나에는 물이 존재함)에 의해 수화시켰다. 결과는 폼이었으며, 이를 2장의 콜라겐을 접착시키는 그의 능력에서 시험하고, 용품을 50℃의 수조에서 침수시킴으로써 열-가역성에 대하여 시험하였다.
실시예 16: 트랜스글루타미나제로 가교된 젤라틴 폼의 접합 및 기계적 특성의 특성화.
하기의 젤라틴은 슈퍼파인 리미티드에 의해 하기의 입자 크기 범위로 제트 밀링된 젤리타 275 블룸, A형 돼지 젤라틴(미국 수시티 소재의 젤리타), 의료 등급 저 내독소를 지칭한다: d(0.1)=4.24 ㎛, d(0.5)=16.61 ㎛, d(0.9)=31.51 ㎛. 하기의 mTG는 100 U/g의 활성 수준을 갖는 ACTIVA 분말(일본 도쿄 소재의 아지노모토)을 지칭한다. mTG는 1%의 효소 및 99% 말토덱스트린을 함유한다. 멸균된 분말이 특정된다면 - 젤라틴 및 mTG 미분화된 분말을 감마 방사선 9.38 킬로그레이(이스라엘 소재의 소르반)를 사용하여 멸균시켰다.
생물학적 재료의 기계적 특성을 시험하기 위해 사용되는 로이드(Lloyed) 재료 시험 LSI 장치(아메테크 테스트 앤드 캘리브레이션 인스트루먼츠(Ametek Test & Calibration Instruments)), 1kN 고 정밀 재료 시험 장치를 사용하여 가교된 폼의 유동학 파라미터를 측정하였다. 생물학적 재료를 하기의 표에 특정된 비에 따라 수동의 혼합에 의해 제조하고, 혼합과 시험 사이에 40분을 허용하였다. 그것을 테플론-커버된 유리 플레이트 상에 스페이서와 테플론 표면이 있는 유리 커버 사이에 주입하여, 일단 안정화되면, 3 ㎜ 두께의 직사각형 형상을 생성하였다. 표준 개-뼈 형성물을 생물학적 재료로부터 천공시키고, 기계적 시험을 위해 사용하였다. 상부 그립을 상향으로 이동시키고, 생물학적 재료를 파괴될 때까지(완전 파열) 연신시킴으로써 인장 시험을 수행하였다. 최대 로드 및 최대 힘에서의 총 연신 백분율을 시료 너비 및 두께에 기초하여 결정하였다. 그래프의 가장 직선형 부분을 나타내는 2개의 점을 선택함으로써 영률을 계산하였다. 시험 속도는 45 ㎜/분이었으며, 10N 로드 셀(시리얼 번호 10N0360)을 사용하였다.
파열 압력 시험을 ASTM F2392-04, 수술용 실란트의 파열 강도에 대한 표준 시험 방법에 기초하여 행하였다. 각 파열 압력 시험을 위하여, 콜라겐 소시지 케이싱(미국 뉴저지주 소재의 니타 케이싱즈(Nitta Casings))을 기질로서 사용하였다. 3-㎜ 직경의 홀을 각 케이싱 시편에 천공시키고, 각 시편을 시편 고정 매니폴드에 클램프로 고정시켰다. 성분을 수동으로 혼합함으로써 폼을 제조하여, 40분 경화 시간을 가능하게 하였다. 그 다음, 조직 매니폴드를 이중 증류수로 채우고 120 ㎖/시간의 속도로 활성화된 주사기 펌프(케이디 사이언티픽(KD Scientific) 모델 100 시리즈)로 가압하였다. 실리콘 튜브를 통해 물로 시험 고정부를 채우고, 압력계를 사용하여, 파괴될 때까지 최대 압력(PSI)을 결정하였다. 각 시험 후에 파괴(점착성, 접착성)의 유형을 기록하였다. 각 그룹을 위하여 3회 반복 시험하였다.
결과는 하기의 표에 도시되어 있으며, 이는 조직 공학 또는 수술 밀봉의 분야에서의 상이한 요구에 맞도록 제어하기 용이한 기계적 특성을 갖는 본 발명에 따른 생물학적 재료를 제작하는 능력을 명백하게 보여준다.
로이드 기계적 시험:
파열 압력 시험:
실시예 17: 가교된 젤라틴 폼의 영양소 침투의 특성화.
이러한 실시예에서는 본 발명의 결과로 영양소 순환을 가능하게 하는 조성물의 능력이 입증된다. 트랜스글루타미나제/젤라틴 조성물을 함유하는 하나의 주사기로부터 다른 연결된 주사기로 PBS를 10회 통과시키는 방법에 의해 건조 성분을 수동으로 혼합시킴으로써 하기의 조성의 폼을 제조하고, 유색 배지를 첨가하기 전 15분 동안 가교 되게 하였다. 4 ㎖의 PBS + 1 g의 젤라틴 및 1 g의 mTG를 혼합하였다. 생물학적 재료는 21 ㎜의 직경 및 26 ㎜의 두께를 가졌다. 레드 마이몬(Red Maimon)의 식용 착색 액상 염료를 수 중에 희석하고, 생물학적 재료를 유색 액체에 24시간 동안 침수시킨 다음, 절반으로 절단하여, 색 확산을 측정하였다.
도 10은 색상이 생물학적 재료 내측으로 확산하는 능력을 나타내는 절반으로 절단한 생물학적 재료의 사진을 보여준다.
실시예 18: 젤라틴 성분과의 혼합 후의 세포 생존.
하기의 젤라틴은 슈퍼파인 리미티드에 의해 하기의 입자 크기 범위로 제트 밀링된 젤리타 275 블룸, A형 돼지 젤라틴(미국 수시티 소재의 젤리타), 의료 등급 저 내독소를 지칭한다: d(0.1)=4.24 ㎛, d(0.5)=16.61 ㎛, d(0.9)=31.51 ㎛. 젤라틴 미분화된 분말을 감마 방사선 9.38 킬로그레이(이스라엘 소재의 소르반)를 사용하여 멸균시켰다.
하기의 실시예는 정상 인간 피부 섬유아세포(NHDF)가 본 발명에 따른 조성물을 생성하기 위한 혼합으로 인한 전단력을 견디는 능력을 입증하고, 직접적인 혼합또는 삼방 스톱코크를 사용함으로써 생물학적 재료 내측의 최적의 세포 혼입 방법을 평가하는 것이 목적이다. 조직 공학 목적을 위한 세포 스캐폴드로서 사용되는 경우 이러한 혼합 방법은 스캐폴드 용적 내측의 세포의 균질한 스프레딩 및 생존력을 보장한다.
NHDF 세포를 80%의 컨플루언스에 도달시 3 내지 5분 동안 2 ㎖의 트립신(트립신 EDTA 용액 B(0.25%), EDTA(0.05%), 페놀 레드 존재, 바이올로지컬 인더스트리즈(Biological industries), 03-052-lA) 처리를 사용하여 100 ㎜ 플레이트로부터 분리한 후에, 6 ㎖의 혈청 함유 배지(10% 인증된 우태아혈청, 카탈로그 번호: 04-001-1A 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액, 바이올로지컬 인더스트리즈, 03-031-1C가 보충된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified eagle's medium), 고농도 포도당, 바이올로지컬 인더스트리즈 롯트 1530279)를 사용하여 트립신을 중화시켰다. 세포를 1500 RPM에서 5분 동안 원심분리하고, 6 ㎖의 사전 가열된 배지 중에 재현탁화시켜, 360,000개의 NHDF 세포/㎖의 원액 농도를 제공하였다.
하기 표에 기재된 바와 같이 젤라틴 분말과 세포를 함유하는 배지의 혼합을 3회 수행했고, 세포 함유 배지로 1:1 희석된 트립판 블루(0.5%) 및 씨딩 4, 24시간 후의 육안 검사를 사용하여 세포 생존력을 입증하였다. 웰 1에서, 젤라틴 및 세포를 함유하는 배지를 2개 주사기 시스템(암형 루어 락과 연결된 수형 루어 락)을 사용하여 직접 혼합하였다. 웰 2-3에서, 젤라틴을 먼저 2.5 ㎖의 배지를 사용하여 가용화시키고, 8회 동안 혼합한 직후에, 삼방 스톱코크(엘캄 메디컬(Elcam medical))를 사용하여 세포를 함유하는 추가의 1.5 ㎖의 배지를 첨가하고, 2회의 추가의 혼합을 행하였다. 세포 함유 젤라틴 혼합물을 조직 배양 처리 플라스틱(코닝 인코포레이티드, 코스타, 제품 번호: 3516)의 상측 6 웰 플레이트 상에 씨딩하였다.
세포의 부착성이 씨딩 4시간 후에 용이하게 발견되는 한편, 씨딩 24시간 후에, 세포는 플레이트 상에 완전히 스프레딩된 것으로 보였으며, 이는 세포가 생존가능하며, 그들이 혼합 동안 겪는 전단 응력을 견딜 수 있음을 입증한다.
전단 응력으로 인한 세포 생존력 검정
실시예 19: 가교된 젤라틴 폼 내측의 세포 생존력.
하기의 젤라틴은 슈퍼파인 리미티드에 의해 하기의 입자 크기 범위로 제트 밀링된 젤리타 275 블룸, A형 돼지 젤라틴(미국 수시티 소재의 젤리타), 의료 등급 저 내독소를 지칭한다: d(0.1)=4.24 ㎛, d(0.5)=16.61 ㎛, d(0.9)=31.51 ㎛. 하기의 mTG는 ACTIVA WM, 100 U/g의 활성 수준을 갖는 분말(일본 도쿄 소재의 아지노모토)을 지칭한다. mTG는 1%의 효소 및 99% 말토덱스트린을 함유한다. 젤라틴 및 mTG 미분화된 분말을 감마 방사선 9.38 킬로그레이 e-빔(이스라엘 소재의 소르반)으로 멸균시켰다. 하기의 배지는 혈청 함유 배지(10% 인증된 우태아혈청, 카탈로그 번호: 04-001-lA 및 1%의 페니실린-스트렙토마이신 용액, 바이올로지컬 인더스트리즈, 03-031-lC가 보충된 둘베코 변형 이글 배지, 고농도 포도당, 바이올로지컬 인더스트리즈(이스라엘 소재))를 지칭한다.
하기의 실시예는 섬유아세포가 7일 이상 동안 본 발명에 따른 조성물에 매립되거나 씨딩 되어 생존하고 번성할 수 있음을 입증하는 것이 목적이다.
NHDF 세포를 80%의 컨플루언스에 도달시 3 내지 5분 동안 2 ㎖의 트립신(트립신 EDTA 용액 B, 바이올로지컬 인더스트리즈, 03-052-1A) 처리를 사용하여 100 ㎜ 플레이트로부터 분리한 후에, 혈청 함유 배지로 트립신을 중화시켰다. 세포를 1500 RPM에서 5분 동안 원심분리하고, 배지에 재현탁화시켜, 1,000,000개 세포/㎖의 원액 농도를 제공하였다.
그룹 A: 120 ㎎의 멸균된 mTG와 혼합된 200 ㎎의 멸균된 젤라틴의 조성을 갖는 젤라틴 생물학적 재료를 수형 루어 락 주사기 상에 로딩하고, 1 ㎖의 세포 원액 배지(둘베코 변형 이글 배지, 고농도 포도당, 바이올로지컬 인더스트리즈 롯트 1530279)와 10회 동안 혼합하여, 생물학적 재료를 제작하고, 미처리 플라스틱(코닝 인코포레이티드, 코스타, 참조 번호: 3736, 롯트 번호: 30015036)의 6 웰 플레이트 상으로 주입하였다.
그룹 B: 동일한 조성의 생물학적 재료를 세포가 존재하지 않는 배지와 혼합하고, 40분 동안 가교되게 하고, 1x10^6개 세포를 진탕기 상에 둔 3 ㎖의 배지(10% 인증된 우태아혈청, 카탈로그 번호: 04-001-lA 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액, 바이올로지컬 인더스트리즈, 03-031-1C가 보충된 둘베코 변형 이글 배지, 고농도 포도당, 바이올로지컬 인더스트리즈 롯트 1530279)에 37℃에서 2시간 동안 첨가한 다음, 하룻밤 5% CO2 및 37℃ 인큐베이터로 옮겼다. 이러한 방법은 세포가 젤라틴 스캐폴드 상으로 부착되고 그의 용적 내에 매립되기보다는 오히려 그의 주변부에서 성장하게 한다.
그룹 C: 대조군으로 사용하였으며, 세포를 함유하지 않지만, 그룹 A 및 B에서와 동일한 조성의 생물학적 재료를 가졌다.
그룹 A, B, C를 5% C02 및 37℃ 인큐베이터에서 인큐베이션 하였다.
씨딩 24시간 후에, 모든 그룹을 메스를 사용하여 4분의 1로 절단하고, 그룹 B 생물학적 재료를 세포 배양물에 대하여 처리되지 않은 신규한 플라스틱 6 웰 플레이트로 옮겨, 생물학적 재료에 부착되지 않은 세포로부터 시험 되는 용품을 분리한 다음, 10 v/v% 알라마블루(Alamarblue)를 모든 웰에 첨가하였다. 알라마블루 환원을 세포 씨딩 3일 및 6일 후에 측정하였다. 알라마블루 반응을 대략 24시간 가능하게 하였다.
도 10에 도시된 결과는 생물학적 재료 내측의(그룹 A) 및 생물학적 재료 상의(그룹 B) 세포가 가시적이며, 지정된 시점에 환원될 수 있음을 명백하게 입증하며, 이는 대조군(그룹 C)에 비한 알라마블루 함유 배지의 상이한 착색에 의해 나타난다. 그들 결과는 가교된 젤라틴 폼 생물학적 재료가 조직 공학 목적을 위한 우수한 스캐폴드로서 작용할 수 있다는 주장을 뒷받침한다.
실시예 20: 폐기종의 치료를 위한 수술용 실란트로서의 용도의 실시형태.
이러한 실시예는 폐 용적 감소를 달성하기 위한 본 발명에 따른 생체적합성 의료용 실란트 조성물의 생체 내 입증을 제공한다. 상기 기재된 바와 같이, 폐 용적 감소는 특히 폐 조직이 만성적으로 팽창되는 질환 또는 병증, 예를 들어, 폐기종을 위한 많은 치료적 응용을 갖는다.
하기의 젤라틴은 슈퍼파인 리미티드에 의해 하기의 입자 크기 범위로 제트 밀링된 젤리타 275 블룸, A형 돼지 젤라틴(미국 수시티 소재의 젤리타), 의료 등급 저 내독소를 지칭한다: d(0.1)=4.24 ㎛, d(0.5)=16.61 ㎛, d(0.9)=31.51 ㎛. 하기의 mTG는 ACTIVA WM, 100 U/g의 활성 수준을 갖는 분말(일본 도쿄 소재의 아지노모토)을 지칭한다.
대형 90 Kg LW 돼지를 사용하였다.
젤라틴 성분 및 효소 성분의 혼합물을 특징으로 하는 본 발명의 일부 실시형태에 따른 의료 실란트 폼을 사용하였다. 1.2 g의 젤라틴 분말을 0.4 g의 mTG와 배합하고, 8 ㎖의 염수와 혼합하였다. 약 12 ㎖의 생성되는 폼을 200 ㎝ 길이 및 7F 직경의 아주 긴 카테터를 통해 폐 내로 주입하였다.
결과
폼을 긴 카테터를 통해 성공적으로 주입하였다. 폼은 기관지경을 사용하여 표적 내부 폐 세그먼트에 도달하는 것으로 가시화되었다. 수술 후에, 동물을 안락사시키고, 폐를 절개하였다. 세기관지를 노출시켰으며, 폼은 세기관지에 유입되고 적소에 계속 접착되어 있는 것으로 보였다.
실시예 21: 본 발명의 일부 실시형태에 따른 조성물의 피하 주사.
하기의 젤라틴은 슈퍼파인 리미티드에 의해 하기의 입자 크기 범위로 제트 밀링된 젤리타 275 블룸, A형 돼지 젤라틴(미국 수시티 소재의 젤리타), 의료 등급 저 내독소를 지칭한다: d(0.1)=4.24 ㎛, d(0.5)=16.61 ㎛, d(0.9)=31.51 ㎛.
하기의 mTG는 ACTIVA WM, 100 U/g의 활성 수준을 갖는 분말(일본 도쿄 소재의 아지노모토)을 지칭한다. mTG는 1%의 효소 및 99%의 말토덱스트린을 함유한다. 젤라틴 및 mTG 미분화된 분말을 9.93 킬로그레이 e-빔(이스라엘 소재의 소르반)에 의해 멸균시켰다. 시험 되는 조성물은 다음을 포함하였다: 하나의 주사기에서 0.25 g의 젤라틴 분말 + 0.25 mTG 분말을 1 ㎖의 멸균 염수와 혼합하였다.
2마리의 60 ㎏ SW 돼지를 연구를 위해 사용하였다. 동물을 마취시키고, 좌측 앞다리에서 주사바늘을 사용하여 시험되는 조성물(0.3 내지 0.5 ㎖의 폼)의 주사를 피부 하에 수행하였다. 90일 추적 기간 후에, 동물을 안락사시키고, 현미경 분석을 위하여 조직을 수집하였다. 조직 시료를 포르말린에서 고정화시키고, 슬라이드의 제조 및 H&E 염색을 요청하였다.
결과
동물 중 어느 것도 어떠한 유해 효과도 나타내지 않았다. 생체재료는 우수한 용인성을 나타내었으며, 대부분 분해되었다. 괴사 또는 공동 형성 또는 이동 중 어느 것도 언급되지 않았다. 물질은 섬유아세포를 주사된 표적에 유인할 수 있었으며, 그들은 증식되고, 섬유성 조직을 생성하여, 생체재료를 대체하였다. 만성 육아종 반응 및 섬유아세포는 생체재료 용적을 대체하는 작용을 한다. 두 동물 모두에서, 섬유증은 최소의 염증 반응을 나타내는 최소의 림프구 존재와 함께 이식 부위의 도처에 균일하게 스프레딩된다(단면에 2 내지 2.5 ㎜ 직경).
본 명세서의 도처에 열거된 간행물은 그들 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본 발명의 다양한 양태가 실시예 및 바람직한 실시형태를 참조하여 상기에 예시되어 있지만, 본 발명의 범주가 상기의 설명에 의해 정의되지 않고, 특허법의 원칙하에, 적절하게 해석되는 하기의 청구범위에 의해 정의되는 것이 이해될 것이다.

Claims (37)

  1. a. 콜라겐 및 젤라틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 가교성 단백질;
    b. 상기 가교성 단백질의 가교를 유도하는 가교제; 및
    c. 액체를 포함하는 조성물로서,
    상기 조성물이 다공성 스캐폴드이며,
    상기 스캐폴드의 포어가 2 내지 500 미크론인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 액체가 생리학적 완충제인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 폼(foam)인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 가교성 단백질이 5 내지 200 미크론의 평균 입자 크기를 갖는 미분화된 단백질 분말로서 조성물 내로 도입되는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 가교성 단백질이 200 내지 300 블룸(bloom)의 젤라틴을 포함하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 가교성 젤라틴이 0.5 wt% 내지 25 wt%의 범위로 상기 조성물에 존재하는 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 가교제가 트랜스글루타미나제인 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 트랜스글루타미나제가 0.0001 wt% 내지 2 wt%의 범위로 상기 조성물에 존재하는 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 환자에서 상기 환자가 조직 결손의 치료를 필요로 하는 부위에 동일계 내에서 형성되는 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 조성물을 환자가 조직 결손의 치료를 필요로 하는 부위에서 상기 환자 내로 도입하기 이전에 상기 조성물이 형성되는 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 세포 유형이 상기 조성물 내로 침윤되거나, 상기 조성물 내에서 성장하는 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 적어도 하나의 상기 세포 유형이 췌장 줄기세포, 장내분비 세포, 뼈세포, 간세포, 건세포, 근세포, 혈구, 연골세포, 상피 세포, 내피세포, 뉴런, 배아 줄기세포, 중간엽 줄기세포, 자가 골수-유래 중간엽 줄기세포, 전구 세포, 조혈 줄기세포, 중간엽 줄기세포, 신경 줄기세포, 골계(bone system) 줄기세포, 연골세포주 줄기세포, 상피 줄기세포 및 간 줄기 세포로 이루어진 군으로부터의 세포 유형인 조성물.
  13. a. 가교성 젤라틴;
    b. 상기 가교성 젤라틴의 가교를 유도하는 트랜스글루타미나제; 및
    c. 액체를 포함하는 조성물로서,
    상기 조성물이 2 내지 500 미크론의 포어 크기를 갖는 다공성 스캐폴드이며,
    상기 가교성 젤라틴이 5 내지 200 미크론의 입자 크기를 갖는 미분화된 젤라틴 분말로서 상기 조성물 내로 도입되며,
    상기 가교성 젤라틴이 200 내지 300 블룸이며,
    상기 가교성 젤라틴이 0.5 wt% 내지 25 wt%의 범위로 상기 조성물에 존재하며,
    상기 트랜스글루타미나제가 0.0001 wt% 내지 2 wt%의 범위로 상기 조성물에 존재하는 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 액체가 생리학적 완충제인 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 조성물이 폼인 조성물.
  16. 제13항에 있어서, 상기 조성물이 환자에서 상기 환자가 조직 결손의 치료를 필요로 하는 부위에 동일계 내에서 형성되는 조성물.
  17. 제13항에 있어서, 상기 조성물을 환자가 조직 결손의 치료를 필요로 하는 부위에서 상기 환자 내로 도입하기 이전에 상기 조성물이 형성되는 조성물.
  18. a. 제1항의 조성물을 조직 결손 또는 질환을 치료하기에 충분한 양으로 조직 결손의 부위에서 환자 내로 도입하는 단계로서,
    상기 조성물이 상기 결손의 부위에서 상기 조직에 접착되는 단계를 포함하는 방법으로서,
    상기 방법이 조직 결손 또는 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 조직 결손 또는 질환을 치료하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 조직 결손이 상처인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 조직이 손상되며, 재생을 필요로 하는 방법.
  21. 제18항에 있어서, 상기 조직 결손이 뼈 결손인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 조성물이 상기 환자에서 뼈의 재생을 유도하는 방법.
  23. 제18항에 있어서, 상기 질환이 대변 실금인 방법.
  24. 제18항에 있어서, 상기 질환이 요실금인 방법.
  25. 제18항에 있어서, 상기 질환이 폐기종인 방법.
  26. a. 제1항의 조성물을 환자에서 조직 결손의 부위에 조직 결손 또는 질환을 치료하기에 충분한 양으로 형성하는 단계로서,
    상기 조성물이 상기 결손의 부위에서 상기 조직에 접착되는 단계를 포함하는 방법으로서,
    상기 방법이 조직 결손 또는 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 조직 결손 또는 질환을 치료하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 조직 결손이 상처인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 조직이 손상되고, 재생을 필요로 하는 방법.
  29. 제26항에 있어서, 상기 조직 결손이 뼈 결손인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 조성물이 상기 환자에서 뼈의 재생을 유도하는 방법.
  31. 제26항에 있어서, 상기 질환이 대변 실금인 방법.
  32. 제26항에 있어서, 상기 질환이 요실금인 방법.
  33. 제26항에 있어서, 상기 질환이 폐기종인 방법.
  34. a. 환자의 폐 내의 표적 영역을 붕괴시키는 단계; 및
    b. 제1항의 조성물을 상기 붕괴된 영역의 제1 부분을 상기 붕괴된 영역의 제2 부분에 접착시키기에 충분한 양으로 상기 붕괴된 영역의 부위에서 상기 환자 내로 도입하는 단계로서,
    상기 붕괴된 영역의 제2 부분으로의 상기 붕괴된 영역의 제1 부분의 접착이 상기 환자의 폐 용적을 감소시키며,
    상기 조성물이 섬유아세포 부착 및 콜라겐 합성을 촉진하도록 구성되며,
    상기 섬유아세포 부착 및 콜라겐 합성이 염증을 예방하는 단계를 포함하는 방법으로서,
    상기 방법이 상기 환자에서 폐 용적을 감소시키는 방법.
  35. a. 제1항의 조성물을 폐 용적을 감소시키기에 충분한 양으로 폐 영역의 부위에서 환자 내로 도입하는 단계로서,
    상기 조성물이 섬유아세포 부착 및 콜라겐 합성을 촉진시키도록 구성되며,
    상기 섬유아세포 부착 및 콜라겐 합성이 염증을 예방하는 단계를 포함하는 방법으로서,
    상기 방법이 상기 환자에서 폐 용적을 감소시키는 방법.
  36. a. 환자의 폐 내의 표적 영역을 붕괴시키는 단계; 및
    b. 제1항의 조성물을 상기 붕괴된 영역의 제1 부분을 상기 붕괴된 영역의 제2 부분에 접착시키기에 충분한 양으로 상기 환자에서 상기 붕괴된 영역의 부위에 형성하는 단계로서,
    상기 붕괴된 영역의 제2 부분으로의 상기 붕괴된 영역의 제1 부분의 접착이 상기 환자의 폐 용적을 감소시키며,
    상기 조성물이 섬유아세포 부착 및 콜라겐 합성을 촉진시키도록 구성되며,
    상기 섬유아세포 부착 및 콜라겐 합성이 염증을 예방하는 단계를 포함하는 방법으로서,
    상기 방법이 상기 환자에서 폐 용적을 감소시키는 방법.
  37. a. 제1항의 조성물을 폐 용적을 감소시키기에 충분한 양으로 환자에서 폐 영역의 부위에 형성하는 단계로서,
    상기 조성물이 섬유아세포 부착 및 콜라겐 합성을 촉진시키도록 구성되며,
    상기 섬유아세포 부착 및 콜라겐 합성이 염증을 예방하는 단계를 포함하는 방법으로서,
    상기 방법이 상기 환자에서 폐 용적을 감소시키는 방법.
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