CN115322453B

CN115322453B - 一种具有sod模拟位点的水凝胶及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN115322453B
Application number: CN202210676314.8A
Authority: CN
Inventors: 郭川; 孔清泉; 吴锦荣; 王玉; 伍椰; 李韦龙; 杨清坤
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2022-06-15
Filing date: 2022-06-15
Publication date: 2023-08-18
Anticipated expiration: 2042-06-15
Also published as: CN115322453A

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种具有SOD模拟位点的水凝胶及其制备方法和用途。本发明的水凝胶，是将采用原料组合物制备而成的水凝胶在含Cu²⁺的溶液中反应得到的，所述原料组合物包括：碳量子点0.5～1.5重量份、组氨酸接枝的壳聚糖30～60重量份、氧化透明质酸50～150重量份。原料组合物还可包括负载有丹参醇的ZIF‑8。本发明的水凝胶具有良好的抗感染和清除ROS的能力，具有很好的创面修复效果。且本发明的水凝胶可利用伤口感染产生的酸性微环境释放抗感染的成分，这使得SOD模拟位点相比于SOD本身更加适合用于创面修复。因此，本发明具有很好的应用前景。

Description

一种具有SOD模拟位点的水凝胶及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种具有SOD模拟位点的水凝胶及其制备方法和用途。

背景技术

难治性创伤，造成严重后果，甚至致残和死亡，给患者和社会带来巨大负担。难治性创面原位修复面临着巨大的挑战，包括微环境复杂、局部免疫受损、慢性感染严重、炎症紊乱、血管化受损和组织重塑不足等。

为了解决这些困难，多种临床策略，抗微生物，抗炎和血管生成构建已经被用于难治性伤口。其中，具有智能抗感染和抗炎活性的微环境响应性水凝胶在难治性创面愈合中具有良好的应用前景。对于这些水凝胶，按需释放药物用于抗感染和抗炎症，同时将药物的副作用降至最低。

然而，难治性创面的再感染、免疫紊乱、抗氧化受损、组织重塑不足等复杂问题很难仅靠一种材料来同时解决。特别是现有的材料很少能够智能地应对再感染等偶发事件，这是伤口愈合的主要障碍。由于不能适应复杂多变的微环境，难治性创面的原位修复很难取代瘢痕修复。鉴于这些局限性，我们迫切需要一种绿色水凝胶，能够在难治性伤口微环境中同时智能地处理上述所有问题。因此，人们尝试在水凝胶中复合各种活性材料，以实现对难治性伤口微环境的智能处理。

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)是一组主要的金属酶，能够催化活性氧(reactive oxygen species,ROS)的分解，从而保护细胞免受高活性代谢产生的过度氧化应激。超氧化物歧化酶家族的特征是由过渡金属离子 (Cu/Zn/Mn)与三个组氨酸(His)残基通过咪唑基团配位形成活性位点。该活性位点具有较高的活性氧清除能力。因此，SOD模拟活性位点应该赋予该结构较高的ROS清除能力。

基于SOD的ROS清除功能，中国专利申请“CN103977447A-负载SOD 的γ-聚谷氨酸水凝胶制备方法”将SOD负载在水凝胶中，实现了很好的抗氧化作用。然而，SOD模拟结构中的配位交联可能被感染诱导的酸性环境部分或完全分解，这不利于SOD在难治性创面的修复中长期、稳定地发挥功效。因此，有必要开发新的活性成分或结构，替代SOD在水凝胶中的使用。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明提供一种具有SOD模拟位点的水凝胶及其制备方法和用途，目的在于在水凝胶中构建一种SOD模拟位点，解决现有的SOD用于水凝胶时，容易被酸性环境分解的问题，从而提高水凝胶用于创面修复的效果。

一种具有SOD模拟位点的水凝胶，它是将采用原料组合物制备而成的水凝胶在含Cu²⁺的溶液中反应得到的，所述原料组合物包括：

碳量子点0.5～1.5重量份、

组氨酸接枝的壳聚糖30～60重量份、

氧化透明质酸50～150重量份。

优选的，所述含Cu²⁺的溶液的浓度为0.1-1M。

优选的，所述碳量子点按照如下制备方法得到：以柠檬酸和组氨酸为原料，通过水热法制备而成。

优选的，所述碳量子点的制备方法中，柠檬酸和组氨酸的重量比为1: (2～3)。

优选的，所述组氨酸接枝的壳聚糖按照如下制备方法得到：将n-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与壳聚糖反应得到。

优选的，所述n-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与壳聚糖的重量比为(0.4-0.48):(1.5-1.9):(0.9-1.1)。

优选的，所述氧化透明质酸按照如下制备方法得到：采用NaIO₄(高碘酸钠)氧化原料透明质酸，即得。

优选的，所述NaIO₄与透明质酸的重量比为2：(1～1.5)。

优选的，所述原料组合物还包括：负载有丹参醇的ZIF-8 5～10重量份。

优选的，所述负载有丹参醇的ZIF-8中，丹参醇的负载量为25～35％。

本发明还提供上述水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

步骤1，将所述原料组合物溶解在水中，混合形成水凝胶A；

步骤2，将所述水凝胶A放入含Cu²⁺的溶液中，配位，即得。

优选的，步骤1中，所述水凝胶A是通过将水溶液A-1和水溶液A-2 混合制成的，其中，所述水溶液A-1含有0.09-0.11％w/v的所述碳量子点和4.5-5.5％w/v的所述组氨酸接枝的壳聚糖；所述水溶液A-2含有9-11％w/v 的所述氧化透明质酸。

优选的，步骤1中，所述水溶液A-1还含有0.45-0.55％w/v的所述负载有丹参醇的ZIF-8。

优选的，步骤2中，配位的时间为12～24h。

本发明还提供上述水凝胶在制备用于创面修复的药物中的用途。

本发明还提供一种用于创面修复的药物，它是以上述水凝胶为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制成的。

本发明通过将生物相容的咪唑功能化的碳量子点与Cu²⁺配位，构建了一种SOD的模拟位点。其用于创面修复时，首先通过碳量子点的光热作用杀灭细菌。在愈合过程中，当感染加重时，所带来的酸性微环境可能导致SOD 的模拟位点部分分解，从而释放出具有优良抗菌性能和光热效应的碳量子点，以及对血管再生具有促进作用的Cu²⁺，同时，未被分解的SOD模拟位点继续清除ROS，促进伤口愈合。上述多种效应的整合，能实现抗感染与清除ROS核心功能的相互转换，提高伤口的修复效果。可见，本发明利用了原本对SOD修复伤口不利的微环境，使得SOD模拟位点相比于SOD本身更加适合用于创面修复。

此外，在本申请的优选方案中，还进一步向水凝胶中引入负载有丹参醇的ZIF-8(ZIF-8@Ts)，通过将丹参醇(Ts)加载到pH敏感的金属有机骨架 (MOF)ZIF-8中，由此产生的药物载体(ZIF-8@Ts)可同时被再感染诱导的酸性微环境分解，从而释放出抗氧化的Ts。该优选方案进一步增强了水凝胶对感染导致的酸性微环境的智能响应，提高水凝胶应对各种情况的适用性，具有很好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为SOD-AO水凝胶的构思与设计。a)水凝胶的结构示意图。该水凝胶可促进b)止血，c)通过模拟SOD中心的CQD的光热效应根除感染，和d)通过模拟SOD的几何结构清除ROS，和e)智能地保护伤口免于再感染诱导的愈合停止，从而促进f)难治性伤口的原位再生。

图2为SOD-AO水凝胶制备过程的示意图。

图3为水凝胶的结构和机械特性。a)水凝胶和Cu²⁺配位CQDs的FTIR光谱。b)SOD-AO水凝胶的自愈合过程。c)将SOD-AO水凝胶注射到字母“SCU” 中。流变学分析包括d)频率，e)振荡应变扫描和f)对照和SOD-AO水凝胶的破坏和恢复。

图4为水凝胶a，b)在体外和c，d)在体内的光热效应。

图5为水凝胶清除活性氧的能力。a)水凝胶的超氧阴离子清除作用。b) 超氧根自由基清除能力c)水凝胶的溶胀性能。(*P<0.05，ns:无显著性。)

图6为水凝胶的pH响应性。a)低pH值刺激水凝胶降解。低pH刺激b)CQDs 和c)Ts从SOD-AO水凝胶中释放。(*P<0.05，**P<0.01，ns:无显著性。)

图7为水凝胶的止血性能。a)水凝胶的血液凝固指数。b)水凝胶表面血细胞粘附的SEM图像。c)在大鼠肝出血模型中的体内止血。d)失血的定量分析和e)止血时间。(*P<0.05，**P<0.01)

图8为水凝胶的体外抗菌作用。a)金黄色葡萄球菌和b)铜绿假单胞菌的存活率。c)用不同水凝胶处理的细菌克隆的图像和d)相应的活/死染色图像。 (*P<0.01，SOD-AO水凝胶+IR:SOD-AO水凝胶联合PTT组。)

图9为体外生物相容性和细胞迁移能力测试。a，b)水凝胶的溶血分析。 c)用不同水凝胶处理24小时和48小时的L929细胞的活/死染色。d)L929细胞的CCK-8分析和e)用不同水凝胶处理的LPS感染的L929细胞。f)用不同水凝胶处理的LPS感染的L929细胞的划痕试验和相应的g)定量分析。(*P<0.05，**P<0.01)

图10为体外ROS清除能力和巨噬细胞极化试验。a)水凝胶在LPS刺激的 RAW264.7细胞中的ROS清除作用。b)用不同水凝胶处理的LPS感染的 RAW264.7细胞的表型的流式细胞术分析。

图11为水凝胶治疗慢性感染糖尿病伤口的体内评价。a，b)伤口愈合效果的宏观评估和相应的定量结果。c，d)水凝胶的体内抗感染效果。(**P<0.01)

图12为新生组织的组织学评估。a)H&E染色，b)组织的Masson染色。黑色箭头表示脓肿。蓝色箭头表示再生毛囊；棕色箭头表示腺体，棕色刻度条＝20μm；绿色箭头表示再生的血管，绿色刻度条＝5μm。c)胶原I和胶原 III的免疫组织化学分析。d)再生皮肤的厚度，e)胶原沉积和f)新血管形成的密度。(***P<0.01，SOD-AO水凝胶+IR:SOD-AO水凝胶联合PTT组)。

图13为新生组织的免疫荧光分析。巨噬细胞极化特异性标记的染色，包括a)M1的iNOS和b)M2的CD206。炎症特异性标记物的染色，包括c)TNF- α，d)IN-10。e)血管生成标记CD31的染色。

具体实施方式

材料和试剂：

壳聚糖(CS，脱乙酰度>95％购自阿拉丁C301776)、透明质酸(200万MW 购自阿拉丁H141272)、组氨酸(His)和柠檬酸(CA)、醋酸锌和2-甲基咪唑均购自阿拉丁(中国上海)。透析袋(3500mw、500MW)购自Viskase(美国)。丹参醇(Ts)购自Macklin(中国上海)，改良DMEM培养基(DMEM)和磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)购自美国HyClone。胎牛血清购自美国Gibco公司。所有其他化学品都是分析级的，使用时没有进一步纯化。

其他未特别说明的材料和试剂均为市售品。

实施例1具有SOD模拟位点的水凝胶

本实施例的水凝胶制备方法如下：

1、碳量子点(CQD)的合成

将CA(1g)，His(1g)溶于25ml去离子水中。然后对混合物进行超声处理，并在200℃下在聚四氟乙烯涂层的高压釜中以每分钟1℃的恒定加热速率加热。最后，将溶液在200℃下保持12小时。然后通过过滤器(0.22m)过滤后，将所得CQDs溶液冻干，即得。

2、组氨酸接枝的壳聚糖(CS-His)的合成

将1克His、0.74克N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1.7克1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解在100毫升4-吗啉代乙烷磺酸(MES， 0.5M)缓冲溶液中。然后将溶液在室温下搅拌30分钟。pH值被调节到5.5。接下来，向该溶液中加入1g壳聚糖。将所得混合物在室温下搅拌24小时。然后将产物在透析袋(3500MW)中用去离子水透析6天，每12小时换一次水。

3、氧化透明质酸(OHA)的合成

将透明质酸(1.0克)溶解在100毫升浓度为10毫克/毫升的去离子水中。将NaIO4(534mg)加入到HA溶液中，并在室温下在黑暗中搅拌24小时。为了终止氧化反应，向混合物中加入乙二醇(1.0克)并在室温下搅拌1小时。所得溶液在水中透析48小时(3500MW)，然后冻干。氧化率测定采用之前报道的方法进行评估。4简言之，用0.1摩尔/升的氢氧化钠滴定含有0.05克 OHA和25毫升(0.25摩尔/升)盐酸羟胺的溶液。使用200升甲基橙作为指示剂。氧化率可通过以下公式计算：

其中η表示氧化速率，V_NaOH表示滴定中消耗的氢氧化钠的体积(mL)， N_NaOH表示氢氧化钠的浓度(mol/L)，W表示OHA的质量(g)，400是OHA的基本环状单元的摩尔质量。

4、水凝胶的制备

通过将含有CQDs(0.1％，w/v)的CS-His溶液(5％，w/v)与等体积的10％ (w/v)OHA混合形成水凝胶。在将pH调节至8.5之前，快速加入CuCl₂至0.1M 的终浓度。将水凝胶在37℃静置另外1小时，得到最终的蓝黑色水凝胶。然后用PBS洗涤水凝胶三次以备后用。本实施例制备的水凝胶命名为SOD水凝胶(SOD hydrogel)。

实施例2 SOD-AO水凝胶

本实施例的水凝胶设计思路如图1所示，制备方法如图2所示，具体如下：

1、按照与实施例1相同的方法制备碳量子点、组氨酸接枝的壳聚糖和氧化透明质酸。

2、负载有丹参醇的ZIF-8(ZIF-8@Ts)的合成

参考之前的研究，本文合成了ZIF-8@Ts。具体而言，制备了1mL含2mg Ts溶液的2-甲基咪唑(1.4M)。之后，快速加入1毫升乙酸锌(20mM)，并将混合物搅拌过夜。通过以10，000转/分钟离心30分钟收集产物。在冻干之前，用去离子水洗涤产品3次。以类似的方法合成ZIF-8，不加入Ts。药物负载量 (DLC)和负载效率(DLE)通过紫外分光光度法在280nm处显示，并通过以下方程计算，计算公式为:

DLC(％)＝(载药重量)/(载药NPs量)×100％

DLE(％)＝(载药重量)/(加入药物的总质量)×100％

本实施例合成得到的ZIF-8@Ts的载药量为25％，载药效率为23％。

3、水凝胶的制备

通过将含有CQDs(0.1％，w/v)和ZIF-8@Ts(0.5％，w/v)的CS-His溶液(5％， w/v)与等体积的10％(w/v)OHA混合形成水凝胶。在将pH调节至8.5之前，快速加入CuCl₂至0.1M的终浓度。将水凝胶在37℃静置另外1小时，得到最终的蓝黑色水凝胶。然后用PBS洗涤水凝胶三次以备后用。本实施例制备得到的水凝胶命名为SOD-AO水凝胶(SOD-AOhydrogel)。

对比例1

本对比例的水凝胶由CS-His溶液(5％，w/v)与等体积10％w/v OHA混合形成。CS-His、OHA的制备方法与实施例1相同。本对比例的水凝胶命名为对照水凝胶(Controlhydrogel)。

对比例2

将含有CQDs(0.1％，w/v)的CS-His溶液(5％，w/v)与等体积的10％(w/v) OHA混合形成水凝胶。CQDs、CS-His、OHA的制备方法与实施例1相同。本对比例的水凝胶命名为Hydrogel@CQDs。

对比例3

将CS-His溶液(5％，w/v)与等体积的10％(w/v)OHA混合，在将pH调节至8.5之前，快速加入CuCl₂至0.1mM的终浓度制成Cu²⁺水凝胶。CS-His、OHA 的制备方法与实施例1相同。本对比例的水凝胶命名为Hydrogel-Cu²⁺。

对比例4

将CQDs溶液(0.1％，w/v)与CuCl₂溶液混合至0.1mM的终浓度，在37℃ 静置1h。CQDs的制备方法与实施例1相同。本对比例的样品命名为CQDs-Cu²⁺。

对比例5

本对比例的水凝胶由含有ZIF-8@Ts(0.5％，w/v)的CS-His溶液(5％， w/v)与等体积10％w/v OHA混合形成。ZIF-8@Ts、CS-His、OHA的制备方法与实施例1、2相同。本对比例的水凝胶命名为AO水凝胶(AO hydrogel)。

下面通过实验例，对本发明的技术方案作进一步的说明。以下实验例所用的样品是实施例1、2和对比例1-5制备的样品SOD hydrogel、SOD-AO hydrogel、Controlhydrogel、Hydrogel@CQDs、Hydrogel-Cu²⁺、CQDs-Cu²⁺和AO hydrogel。

实验例1水凝胶的表征

一、实验方法

1、FTIR表征

使用FTIR光谱仪(Thermo Scientific Nicolet was 50FTIR)来鉴定官能团。所有的光谱都是在4000-500cm^-1范围内获得的。

2、结构、荧光、尺寸和zeta电位表征

扫描电子显微镜(SEM，Nova NanoSEM450)用于观察水凝胶和ZIF-8颗粒的切片。用TEM(日立H-600，日本)评估CQD结构。用zeta sizer(Malvern zeta sizer Nano-ZS90instrument，mal vern，uk)检测CQD的zeta电势、ZIF-8@Ts 的zeta电势和尺寸分布。用X射线光电子能谱仪(ThermoFischer，ESCALAB 250Xi)测定CQD的X射线光电子能谱。用荧光光谱仪(PICOQuant FT-300) 测试CQD的荧光光谱。

3、水凝胶流变学评价

检测了水凝胶的流变性能。频率(FREQ)扫描记录了0.5％的应变和0.1至100rad·s-1的振荡频率。用1Hz的振荡FREQ和从0.01到1000％的应变记录应变扫描。在自愈合研究中，水凝胶在0.1％至200％振荡应变之间的五个循环中进行测量。

二、实验结果

对SOD-AO水凝胶进行FTIR表征，通过FTIR光谱上覆盖(单位格式都纠正一下)1590-1690cm^-1的峰说明了席夫碱键的形成，对应于C＝N，C＝O振动的混合峰。同时，由于OHA中醛基的消耗，FTIR光谱上1730cm^-1处的峰几乎消失(图3a)。Cu²⁺配位后，除了在FTIR光谱中对应于咪唑基的1140cm^-1峰之外，在1068cm-1处还出现了一个新的配位峰(图3a)，表明咪唑基与Cu2+ 成功配位。

SEM表征结果表明SOD-AO水凝胶具有多孔微观形态，多孔结构有利于吸收伤口渗出物。此外，动态交联策略使SOD-AO水凝胶具有良好的自愈性和可注射性，从而增加了其适用性。如图3b所示，被切断的水凝胶在重新附着后很快就会自行愈合。注射性通过注射水凝胶形成字母“SCU”来说明(图3c)。

SOD模拟中心的制造令人惊讶地增加了水凝胶的机械性能。如图3d-f所示，与对照水凝胶和AO水凝胶(750Pa)相比，SOD-AO水凝胶和SOD水凝胶表现出显著更高的模量(9400Pa)，但是自愈合性能没有减弱(图3f)。SOD-AO 水凝胶和SOD水凝胶均匀的结构、可注射性、自愈合性和高机械性能增加了临床实用性，并允许水凝胶很好地覆盖不规则形状的伤口。不仅如此，CQDs 的引入使得水凝胶可以通过激发的绿色荧光进行检测，从而智能地指示伤口敷料的更换。

实验例2水凝胶的光热性能

一、实验方法

用IR激光器(780nm，100mw，中山双红电子有限公司)照射浸在PBS中的500L制备的水凝胶。用热成像相机(BritIR，武汉金红外有限公司)测量水凝胶的温度。检测没有CQDs和铜配位的水凝胶作为对照。

二、实验结果

水凝胶的光热性能如图4a、b所示。780nm的红外辐照使SOD-AO水凝胶在离体30s内局部温度从25℃升高到72℃。体内试验表明，局部温度在6 分钟内较室温升高58℃(图4c，d)。

这表明本发明的水凝胶中引入CQDs的同时，也为水凝胶增加了光热作用抗感染的功能。此外，在本发明的水凝胶中，Cu配位的咪唑基增强了CQDs 表面的电子跃迁能力，能够进一步增强光热效应，提升光热作用抗感染的效果。

实验例3水凝胶清除活性氧的作用

一、实验方法

采用SOD活性检测试剂盒(索莱宝，北京，中国)对各组水凝胶粉末的超氧阴离子清除能力进行检测。采用黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶体系生成O^2-，O^2-可还原氮蓝四唑生成蓝色甲臜，后者在560nm处有吸收；SOD可清除O2-，从而抑制了甲臜的形成；反应液蓝色越深，说明SOD活性愈低，反之活性越高。30mg干水凝胶粉用于测试。按照试剂盒说明书进行样本处理和测定计算。利用电子自旋共振(ESR)技术(JEOL jess-fa200)，以5-叔丁基-5-甲基-1-吡咯啉n-氧化物(BMPO)为自旋捕集器，形成BMPO/OOH加合物。

二、实验结果

水凝胶中的SOD模拟中心能够有效抑制黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统产生的超氧阴离子的积累，如图5a所示，这种清除超氧阴离子的能力在ZIF-8@Ts 的加入后会显著增强，这应该归功于Ts的抗氧化能力。此外，高溶胀率使 SOD-AO水凝胶能够吸收大量含有ROS的炎性渗出物，进一步提高了ROS 清除效果(图5c)。

实验例4水凝胶的体外降解和溶胀

一、实验方法

将水凝胶样品(冻干，n＝3)放入装有10mL PBS(pH＝7.4或5.0)的离心管中。称重并记录每个样品的原始重量(M0，毫克)。让所有试管在37℃下不断摇动。每24小时更换一次PBS溶液。在指定的时间点(第1-7天)，取出剩余的水凝胶样品，冷冻干燥后称重(Mt，mg)。

降解率计算如下：

剩下的水凝胶(％)＝(Mt/M0)×100％

采用浸泡法测定水凝胶溶胀率(SRs)。简单地说，将特定的水凝胶质量 (W0)置于PBS中一系列特定的时间。在每个时间点，收集膨胀水凝胶并称重量(Wt)。

计算方法为：

SRs(％)＝Wt/W0×100％。

二、实验结果

伤口感染产生的过度酸性底物，可使慢性创面内的弱碱性微环境变为酸性微环境。本实验例考察水凝胶在酸性微环境下的反应机制，结果如图6所示。结果表明，SOD-AO水凝胶在酸性微环境下可快速降解(图6a)，导致 CQDs快速释放，用于抗感染。用酶标仪在515nm处检测发射的荧光强度来测量CQDs的累积释放。在pH＝5.0的环境中，70％的CQDs在12小时内释放到环境中(图6b)。

为了解决感染引起的炎症，感染引发的Ts释放是通过制造ZIF-8@Ts以及SOD模拟位点来实现的。在pH＝5.0的环境中，80％的Ts在18h内迅速从水凝胶中释放出来(图6c)。

通过本实验例可以看到，本发明提供的水凝胶能够对感染产生的酸性微环境产生智能响应，释放具有抗感染作用的成分。从而大大增强了水凝胶抗感染的能力。

实验例5水凝胶的止血测试

一、实验方法

将等量的水凝胶(n＝3)放入预温的(37℃)聚丙烯管中。然后加入50μL的再钙化全血溶液。在37℃的凝块形成特定时间后，缓慢地将10mL PBS引入管中，使未结合的血液流出，而不破坏凝块。在540nm处检测上清吸光度 (ABS)。

凝血指数(BCI)测量如下:

BCI(％)＝(Is/I_r)×100％.................................(6)

其中Is表示样品吸光度，Ir表示参比ABS。血细胞分析按照之前的报告进行。将1mL水凝胶注射到24孔板后，加入2mL PBS(pH 7.4)，水凝胶在37℃ 下再浸泡1小时。接下来，将稀释的全血轻轻滴在水凝胶表面，并在37℃下再保持4分钟。在3次PBS冲洗后，样品用2.5％戊二醛固定另外2小时，然后在10分钟内用50％、60％、80％和100％乙醇溶液脱水。通过扫描电镜观察凝血结果。建立大鼠肝出血模型，检测水凝胶的体内止血效果。麻醉后，暴露大鼠肝脏，用手术剪刀剪开。在此之后，一张滤纸被放置在肝脏下面以捕捉出血。接下来，向出血部位注射200L水凝胶以开始止血。市售的Hydrosorb凝胶用作对照。最后，监测并分析止血时间和出血量。

二、实验结果

与商业的凝胶(/>Gel，保赫曼(上海)贸易有限公司60015247)相比，SOD-AO水凝胶和对照水凝胶具有优异的止血能力。如图7a所示，血液凝固指数(BCI)在SOD-AO水凝胶和对照水凝胶组中显著降低。同时，CQD、Cu²⁺和ZIF-8@Ts的引入对止血能力几乎没有影响。这些结果通过SEM进一步说明，其揭示了在对照水凝胶和SOD-AO水凝胶中更好的红细胞(RBCs)表面粘附和形态。大量血细胞在对照水凝胶和SOD-AO水凝胶的表面上形成不规则聚集体(图7b)。相比之下，在Hydrosorb凝胶的表面上观察到很少的RBCs团块。止血能力通过在大鼠肝出血模型中的体内试验得到进一步验证(图7c)。类似地，与Hydrosorb凝胶相比，对照水凝胶以及SOD-AO水凝胶表现出显著更少的失血(图7d)和更快的止血(图7e)。总的来说，SOD-AO水凝胶表现出高止血能力，这应归因于带正电荷的CS-His和水凝胶的高溶胀率，它们一起促进了带负电荷的RBCs在血液中的截留。总的来说，SOD-AO水凝胶显示出较高的止血能力。

实验例6水凝胶的抗菌效果

一、实验方法

金黄色葡萄球菌(ATCC25923)和铜绿假单胞菌(ATCC27853)用于抗菌试验。这些细菌在LB肉汤中于37℃培养，同时不断搅拌，然后将每种细菌悬液的浓度调节至10⁸CFU/毫升。然后，将细菌培养基的pH调节至5.0。水凝胶抗菌实验分为六组:(1)细菌，(2)细菌+对照水凝胶，(3)细菌+SOD水凝胶，(4) 细菌+AO水凝胶，(5)细菌+SOD-AO水凝胶和(6)细菌+SOD-AO水凝胶+IR。在SOD-AO+IR组中加入SOD-AO水凝胶12分钟后，立即进行IR照射。

二、实验结果

在模拟慢性感染的pH＝5.0的环境中，通过体外杀菌试验来测试SOD-AO 水凝胶的微生物杀灭能力。如图8a-c所示，在结合PTT光热治疗的SOD-AO 水凝胶组中发现很少的微生物克隆。细菌活/死染色证实了这种强大的微生物根除能力(图8d)，这说明在结合PTT的SOD-AO水凝胶组中几乎所有的细菌都死了。不含PTT的SOD-AO水凝胶也表现出有效的杀菌能力，其次是SOD水凝胶。总的来说，这些数据证实了结合PTT的SOD-AO水凝胶和随后的单纯SOD-AO水凝胶的优异抗微生物能力。高的微生物杀灭效率应主要归功于CQD 固有的抗菌能力，这可通过PTT显著增强。

上述结果表明，经红外照射的SOD-AO水凝胶能够有效遏制早期感染，并在无IR照射的情况下有效应对再感染。

实验例7体外测试

一、实验方法

1、水凝胶介导溶血评价

为了评估水凝胶介导的溶血，将红细胞(RBCs)以1200转/分钟离心10分钟。随后，用PBS冲洗它们三次，并稀释至5％v/v的浓度。用组织研磨机粉碎冻干的水凝胶(n＝3),并制备等浓度的四种水凝胶溶液。然后将0.5mL水凝胶溶液和500L RBC悬浮液引入3mL管中并混合，随后在37℃下持续振荡1h，然后离心10min。将所得上清液进一步离心以除去水凝胶颗粒，然后用酶标仪在540nm下读取ABS。0.1％Triton X-100代表阳性对照，PBS代表阴性对照。溶血定量如下进行：

溶血率(％)＝(Ap-Ab)/(At-Ab)×100％

其中，Ap表示水凝胶组上清液ABS，At表示阳性对照ABS，Ab为阴性对照ABS。

2、体外生物相容性检测

完全培养基由添加有FBS(10％)和青霉素-链霉素(1％)的DMEM制备。我们收集了单独的水凝胶提取物。暴露于消毒辐射后，将水凝胶(0.2g/ml)浸没在完全DMEM细胞培养基(pH 5.0)中24小时。然后将提取物用于进一步分析。在96孔培养板的每个孔中接种8000个小鼠成纤维细胞L929细胞。在37℃ (5％CO2)孵育24小时后，将培养基换成各种水凝胶提取物，然后再孵育24 小时、48小时在每个时间点，根据试剂盒说明，通过CCK-8和钙黄绿素-AM/PI 染色(Solarbio，中国)评估细胞增殖。最后，在荧光显微镜下观察细胞并拍照。

3、细胞划痕实验

将5×10⁵个细胞的L929细胞在6孔板的每一孔中镀上，随后进行24小时的培养，以达到至少90％的汇合度。在含有脂多糖(LPS，10ug/mL)的完全DMEM中浸泡2小时后，用100μL移液器吸头划伤细胞表面，并测量划痕面积(C0)。接下来，将细胞置于37℃，与不同的水凝胶共培养，然后在0、12、24和48小时成像，再测量划痕面积(Ct)。在每个时间点，划痕愈合率的计算方法如下。

细胞划痕愈合率(％)＝(C0-Ct)/C0×100

4、活性氧清除能力测定

小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系用于ROS清除分析。将3×10⁶个细胞接种在24孔培养板的盖玻片上。在正常完全培养基中培养24小时后，用LPS(10 g/ml)刺激细胞2小时以产生ROS。接下来，将200L制备的水凝胶注射到预先放置在孔中的trans-well的上室中，并与刺激的细胞共培养48小时。DCFH-DA (二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯)活性氧ROS荧光探针用于分析细胞内ROS。未刺激的RAW264.7细胞作为对照。用荧光显微镜(Ni-E，Nikon)检测荧光。

5、巨噬细胞极化试验

细胞的培养和处理同ROS清除试验部分。使用流式细胞仪(LSRFortessa， BD，USA)对单细胞悬液进行流式细胞仪分析。将收集的巨噬细胞洗涤并重新悬浮在冰上。包括PE/Cy7标记的抗小鼠CD68抗体(137015，Biolegend)和FITC标记的抗小鼠CD86抗体(105005，Biolegend)的初级抗体在冰上与细胞一起孵育1小时。接下来，用4％中性多聚甲醛在冰上固定细胞5分钟，然后用1％Triton-X处理5分钟。然后将细胞洗涤并重悬于冰上，随后将APC标记的抗小鼠CD206一抗(141707，Biolegend)与细胞一起再孵育1小时。洗涤三次后，将细胞用PBS重悬并使用流式细胞仪进行分析。使用FlowJo软件分析流式细胞仪数据。

二、实验结果

基本上，溶血分析显示所有水凝胶都表现出轻微溶血(<5％)，如图9a、b 所示。对于成纤维细胞在伤口愈合中的关键作用，将L929细胞(小鼠成纤维细胞系)与水凝胶提取物一起培养，以测试生物相容性。活/死染色显示，在水凝胶提取物中培养的细胞表现出与在正常完全培养基中培养的细胞相同的增殖趋势 (图9c)。CCK-8试验进一步验证了这种生存力趋势(图9d)。综上所述，这些结果表明SOD-AO水凝胶具有良好的生物相容性。

然后，用脂多糖(LPS，10μg/mL)(其他地方的单位也需要检查一下)对 L929细胞进行预处理，以模拟伤口的感染和炎症状态，然后分析细胞存活力和划痕愈合能力。结果表明，LPS感染显著损害L929细胞的正常增殖和迁移能力，这可以通过SOD-AO水凝胶完全挽救(图9e-g)。

用LPS(10μg/mL)预刺激的RAW264.7评价SOD-AO水凝胶的ROS清除能力。通过用SOD-AO水凝胶处理，LPS刺激产生的高ROS水平被下调至与未刺激的巨噬细胞相当的正常水平。(图10a)。这一结果意味着SOD-AO水凝胶具有清除难治性伤口中高水平ROS的潜力。高ROS水平可能通过两种方式得到缓解。一方面，水凝胶中的超氧化物歧化酶模拟中心可以催化释放到环境中的活性氧的分解，从而减轻线粒体氧应激。另一方面，释放的Ts可以直接减少产生的活性氧并抑制活性氧的产生。

ROS清除能力使得SOD-AO水凝胶能够将M1表型巨噬细胞转化为M2 型。这通过分析RAW264.7细胞中M1(CD86)和M2(CD206)的特异性标记的表达得到了证实。如图10b所示，在LPS刺激后，60％的细胞为CD86阳性，只有39.3％的细胞为CD206阳性，而泛巨噬细胞(CD68+)细胞的频率在各组之间没有显著差异。用SOD-AO水凝胶处理后，CD86+细胞的频率下调至14.8％，而CD206+细胞的频率上调至84.6％。这些结果表明，SOD-AO水凝胶能够将极化的M1表型巨噬细胞转化为M2表型，从而促进愈合过程。

以上体外测试结果表明，本发明的水凝胶具有很好的抗感染和ROS清除能力，能够有效地促进创面愈合。

实验例8体内测试

一、实验方法

我们的动物实验方案获得了四川大学动物护理和使用委员会的伦理批准，并遵守了国家医学研究学会(20220303009)规定的实验动物护理原则。将 280～320g SD大鼠随机分为6个队列(n＝10)，即空白对照组、对照水凝胶组、 SOD水凝胶组、AO水凝胶组、SOD-AO水凝胶组和SOD-AO水凝胶+IR组。所有大鼠每天静脉注射60ug/g体重链脲佐菌素至尾静脉，直至空腹血糖上升至>16.7mM。腹腔注射戊巴比妥(3％)麻醉后，每只大鼠产生4个直径1.5cm 的创面,24小时后，在每只动物的四个糖尿病伤口上注射500μL PBS或等量的水凝胶(n＝8)。在SOD-AO水凝胶+IR组中，应用SOD-AO水凝胶后，用780nm激光照射(0.3W cm^-2)15分钟,水凝胶的温度由热成像仪(BritIR，武汉金红外股份有限公司)测量。24h后在SOD-AO水凝胶+IR组中进行第二轮照射。48h后刷新所有水凝胶或PBS(空白对照)，在SOD-AO水凝胶 +IR组进行第三轮辐照。在伤口创建后的第0、3、5、7和14天，对伤口面积进行监测和拍照。伤口愈合率(％)的计算方法如下:

(％)＝(A₀-A_t)/A0×100

其中，A₀表示第0天的伤口面积，A_t表示指定时间点的伤口面积。在第 5天，从受感染的伤口上取下组织，放入装有2毫升LB肉汤的无菌离心管中。然后，将LB肉汤稀释1000倍，携带感染伤口的细菌，在LB琼脂平板上37℃下放置12小时。为了进行组织学分析，在第7天和第14天将伤口组织切开，用4％多聚甲醛固定，包埋和切片处理，用苏木精和伊红(H&E) 和马松三色染色来探索伤口愈合。采用IL-10、TNF-α、CD31、iNOS和CD206 免疫荧光染色来检测伤口处的炎症和血管生成反应。

二、实验结果

采用大鼠慢性感染糖尿病创面模型进一步评估了SOD-AO水凝胶在体内的治疗效果。宏观伤口闭合分析显示，与其他组相比，结合PTT的SOD-AO 水凝胶能够实现更快的伤口闭合(图11a、b)，在第7天达到约90％的伤口闭合，在第10天伤口完全愈合。在第14天，在SOD-AO水凝胶结合PTT组的新生皮肤上发现旺盛的毛发，这意味着在新再生的皮肤中毛囊再生。不含PTT的SOD-AO水凝胶组显示出相对较慢的伤口闭合速率，但仍比其余组快，在第7天达到约80％的伤口闭合，在第10天伤口几乎完全愈合。即使在14天后，空白组和对照组的伤口仍未完全愈合。

通过分析第5天伤口处的细菌数量，进一步研究体内抗微生物效率。类似于体外抗菌结果，具有PTT组的SOD-AO水凝胶显示出最少的细菌菌落，几乎没有观察到细菌菌落(图11c，d)，表明该策略在体内具有优异的抗微生物效率。

组织学分析用于评估第14天伤口中新生组织的细节。苏木精-伊红(H&E) 染色显示，在结合PTT的SOD-AO水凝胶组中，上皮细胞原位再生，大量胶原沉积，大量成纤维细胞和模糊的伤口边界(图12a，d)。此外，观察到密集的新生毛囊形成、高新生血管形成和腺体再生，表明皮肤再生功能性。相比之下，空白对照组的伤口充满疤痕，甚至形成脓肿。

使用Masson染色检测在伤口收缩和基底层重建中起作用的胶原纤维(图 12b，e)。结果显示，与其他组相比，SOD-AO水凝胶结合PTT可明显促进新生组织中胶原的沉积(约90％)。相比之下，空白对照组显示出较差的胶原沉积。 COL-I和COL-III(图12c)，皮肤中胶原的主要类型，进一步用免疫组织化学(IHC) 染色进行特异性区分，其显示出与Masson染色相似的趋势。此外，在结合PTT 的SOD-AO水凝胶组中观察到显著更高程度的新血管形成(图12a，f)。

利用免疫荧光进一步探索促进皮肤原位再生的机制。与其他组相比，我们发现与空白对照组相比，在SOD-AO水凝胶结合PTT组中，再生组织中细胞 CD206阳性和iNOS阴性的频率显著更高(图13a，b)，表明在该组中实现了 M2转化。M2巨噬细胞发挥抗炎作用，这通过与对照组相比，在SOD-AO水凝胶结合PTT组中IL-10阳性细胞的显著较高频率和TNF-α阳性细胞的较低频率来说明(图13c，d)。这种抗炎作用可以促进组织的增殖。16此外，M2表型巨噬细胞一方面与Zn²⁺协同调节组织重塑，另一方面，与Cu²⁺协同促进新再生组织中的血管形成，如图13e所示，与其他组相比，CD 31+内皮细胞出现在 SOD-AO水凝胶组合PTT组中显著更大的群体中。总的来说，SOD-AO水凝胶可以通过调节转化M2巨噬细胞来促进皮肤的原位再生，这促进了组织的增殖、血管形成和重塑。

通过上述动物实验结果可以看到，本发明的水凝胶具有良好的抗感染能力和清除ROS的作用，对创面具有很好的修复效果。

综上所述，本发明构建了一种具有SOD模拟位点的新型水凝胶，该水凝胶为原位伤口修复的所有阶段提供了足够的支持。结合PTT，这种水凝胶可以彻底根除感染并有效清除ROS，从而促进M2转化。通过智能和有效地应对紧急再感染，水凝胶可以保护伤口免受再感染诱导的愈合停止，确保伤口愈合过程的顺利进行。结合这些优点，SOD-AO水凝胶结合PTT确实可以在大鼠慢性感染的糖尿病伤口中原位诱导功能性皮肤再生。这项工作的结果揭示了一个普遍的策略，它具有多种生物修复应用的巨大潜力，而不仅仅局限于伤口修复。

Claims

1.一种具有SOD模拟位点的水凝胶，其特征在于，它是将采用原料组合物制备而成的水凝胶在含Cu²⁺的溶液中反应得到的，所述原料组合物包括：

碳量子点 0.5~1.5重量份、

组氨酸接枝的壳聚糖 30~60重量份、

氧化透明质酸 50~150重量份；

所述碳量子点按照如下制备方法得到：以柠檬酸和组氨酸为原料，通过水热法制备而成。

2.按照权利要求1所述的水凝胶，其特征在于：所述含Cu²⁺的溶液的浓度为0.1~1 M。

3.按照权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述组氨酸接枝的壳聚糖按照如下制备方法得到：将n-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与壳聚糖反应得到。

4.按照权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述原料组合物还包括：负载有丹参醇的ZIF-8 5~10重量份；所述负载有丹参醇的ZIF-8中，丹参醇的负载量为25~35%。

5.如权利要求1-4任一项所述的水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，将所述原料组合物溶解在水中，混合形成水凝胶A；

步骤2，将所述水凝胶A放入含Cu²⁺的溶液中，配位，即得。

6.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤1中，所述水凝胶A是通过将水溶液A-1和水溶液A-2混合制成的，其中，所述水溶液A-1含有0.09-0.11% w/v的所述碳量子点和4.5-5.5% w/v的所述组氨酸接枝的壳聚糖；所述水溶液A-2含有9-11% w/v的所述氧化透明质酸。

7.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤1中，水溶液A-1还含有0.45-0.55% w/v的所述负载有丹参醇的ZIF-8。

8.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤2中，配位的时间为12-24 h。

9.如权利要求1-4任一项所述的水凝胶在制备用于创面修复的药物中的用途。

10.一种用于创面修复的药物，其特征在于：它是以权利要求1-4任一项所述的水凝胶为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制成的。