CN106039289A - 干细胞制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种干细胞制剂及其制备方法，其中，所述干细胞制剂包括：角膜缘干细胞；碱性成纤维细胞生长因子；含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基，其中，所述FBS的质量分数为1～14％，Ca²⁺在所述含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基中的浓度为0.01～0.09mmol/L；在所述干细胞制剂中，所述角膜缘干细胞的浓度为(1×10⁵)～(1×10⁹)个/ml，所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为1～100ng/ml。本发明干细胞制剂提供了体外培养的角膜缘干细胞，进而通过施行角膜缘干细胞移植，可以改善或重建眼表结构，提高了移植成功率，从而有效地治疗眼表泪液病以及角膜病。

Description

干细胞制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及一种干细胞制剂及其制备方法。

背景技术

角膜由外而内依次包括：上皮层、前弹力层(Bowman膜)、基质层、后弹力层(Decemet膜)和内皮层。角膜上皮层具有多层细胞，包括与前弹力层连接的基底层细胞。角膜上皮层具有保护眼球，稳定泪膜，维持角膜透明性等功能，是一种不断自我更新的组织，而且，角膜上皮层的完整性的维持依赖于表浅细胞不断脱落和基底层细胞不断增殖以取代脱落细胞来实现，而上皮细胞持续不断的水平向心运动和垂直向上运动就源于角膜缘基底层干细胞的增殖和分化。

角膜缘是角膜和结膜的移行区，角膜缘上皮层多于10层，干细胞存在于角膜缘上皮层的基底层，在保持角膜的生理生化和角膜的营养及完整性的维持、免疫反应中占有重要地位。角膜缘干细胞不仅可以分化、增殖为角膜上皮细胞，更重要的是干细胞像一道屏障，阻止结膜上皮细胞移行至角膜表面，这对于保持角膜的透明性与正常生理功能有着重要的意义。

角膜病是我国第二位致盲眼病。随着现代眼科学的发展，许多角膜病所致的视力降低及盲目可以通过角膜移植复明，但对于某些角膜缘干细胞缺乏或功能障碍的疾病如眼表泪液病、无虹膜、化学和热烧伤、辐射损害、Stevens-Johnson综合征、眼瘢痕性天疱疮等，进行穿透性角膜移植和角膜成形术往往失败。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种干细胞制剂，旨在提供体外培养的角膜缘干细胞，以提高治疗角膜缘干细胞缺乏或功能障碍的疾病的成功率。

为实现上述目的，本发明提供一种干细胞制剂，所述干细胞制剂包括：

角膜缘干细胞；

碱性成纤维细胞生长因子；

含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基，其中，所述FBS的质量分数为1～14％，Ca²⁺在所述含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基中的浓度为0.01～0.09mmol/L；

在所述干细胞制剂中，所述角膜缘干细胞的浓度为(1×10⁵)～(1×10⁹)个/ml，所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为1～100ng/ml。

优选地，所述角膜缘干细胞的浓度为(0.8～1.2)×10⁷个/ml。

优选地，所述Ca²⁺在所述含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基中的浓度为0.06mmol/L。

优选地，所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10～60ng/ml。

优选地，所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为15ng/ml。

优选地，所述碱性成纤维细胞生长因子为重组牛碱性成纤维细胞生长因子。

优选地，所述干细胞制剂还包括：PBS缓冲液。

本发明还提供一种上述干细胞制剂的制备方法，包括步骤如下：

获取角膜缘干细胞；

将所述角膜缘干细胞加入含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基中；

再向所述含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基中加入碱性成纤维细胞生长因子，而制得干细胞制剂。

优选地，所述获取角膜缘干细胞的步骤包括：

获取可增殖角膜缘组织；

将所述可增殖角膜缘组织置于所述含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基中；

向所述含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基中加入所述碱性成纤维细胞生长因子，培养10～20天后，分离提纯得到角膜缘干细胞。

优选地，所述获取可增殖角膜缘组织的步骤，包括：

获取角膜缘组织；

将所述角膜缘组织置于无钙MEM培养基中培养，当所述角膜缘组织的上皮层的基底层细胞和与所述基底层细胞相连的上层细胞出现间隙时，除去所述上层细胞，而获得可增殖角膜缘组织。

本发明技术方案，通过将角膜缘干细胞、碱性成纤维细胞生长因子和含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基制成干细胞制剂，由于该含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基为低钙培养基，抑制角膜缘干细胞的分化，避免角膜缘干细胞因分化而产生其他细胞，可以保证制剂中角膜缘干细胞的纯度；而且，该碱性成纤维细胞生长因子可以促进角膜缘干细胞的增殖，增加干细胞的数量，且可以保证角膜缘干细胞的活性；因此，本发明干细胞制剂可以通过施行角膜缘干细胞移植，改善或重建眼表结构，提高移植成功率，从而有效地治疗眼表泪液病以及角膜病。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的内容获得其他的附图。

图1为本发明实施例1制备的干细胞制剂进行免疫细胞染色后的扫描电镜示意图，图中箭头标示了染色的细胞膜；

图2为本发明实施例2制备的干细胞制剂进行免疫细胞染色后的扫描电镜示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种干细胞制剂，该干细胞制剂包括原料如下：

角膜缘干细胞；碱性成纤维细胞生长因子；含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基，其中，FBS(胎牛血清)的质量分数为1～14％，Ca²⁺在含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基中的浓度为0.01～0.09mmol/L；

在干细胞制剂中，角膜缘干细胞的浓度为(1×10⁵)～(1×10⁹)个/ml，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为1～100ng/ml，换而言之，在本发明1ml的干细胞制剂中，含有角膜缘干细胞(1×10⁵)～(1×10⁹)个，碱性成纤维细胞生长因子1～100ng。需要说明的是，根据本领域技术人员的公知常识，角膜缘干细胞的浓度和碱性成纤维细胞生长因子的浓度仅为干细胞制剂刚刚配置好时的浓度，由于干细胞具有活性，因此，不能理解为配置放置一段时间后的浓度。

本发明通过将角膜缘干细胞、碱性成纤维细胞生长因子和含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基制成干细胞制剂，当该角膜缘干细胞的浓度为(1×10⁵)～(1×10⁹)个/ml时，可以保证治疗因角膜缘干细胞缺失或功能障碍导致的眼部疾病所需的角膜缘干细胞的数量，进而该干细胞制剂可以通过施行角膜缘干细胞移植，改善或重建眼表结构，提高移植成功率，从而有效地治疗眼表泪液病以及角膜病；其中，由于该含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基为低钙培养基，可以抑制角膜缘干细胞的分化，避免角膜缘干细胞因分化而产生其他细胞，进而保证了角膜缘干细胞的纯度；而且，该碱性成纤维细胞生长因子可以促进角膜缘干细胞的增殖，增加干细胞的数量，且可以保证角膜缘干细胞的活性。

需要说明的是，该含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基的用量可以根据本领域技术人员的实际需求而定，只要满足制备后的干细胞制剂中角膜缘干细胞的浓度为(1×10⁵)～(1×10⁹)个/ml，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为1～100ng/ml即可。

进一步地，角膜缘干细胞的浓度为(0.8～1.2)×10⁷个/ml。

在该角膜缘干细胞的浓度下，该干细胞制剂对角膜缘干细胞缺失或功能性障碍的治疗效果更好，完全满足所需的角膜缘干细胞的数量。

进一步地，钙离子在含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基中的浓度为0.06mmol/L。

该钙离子浓度下，抑制角膜缘干细胞的分化效果最好，干细胞制剂中角膜缘干细胞的纯度最高。

进一步地，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10～60ng/ml。

当碱性成纤维细胞生长因子浓度保持在10～60ng/ml可以保持对干细胞较高的增殖促进作用，且保持干细胞较高的活性。

进一步地，本发明干细胞制剂还包括：PBS缓冲液。

通过该PBS缓冲液可以有效地调节角膜缘干细胞的浓度，同时不影响干细胞的活性，需要说明的是，该PBS缓冲液的用量可以根据本领域技术人员的实际需求而定。

本发明还提供一种上述干细胞制剂的制备方法，包括步骤如下：

S1、获取角膜缘干细胞；

S2、将角膜缘干细胞加入含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基中；

S3、再向含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基中加入碱性成纤维细胞生长因子，而制得干细胞制剂。

本发明干细胞制剂的制备方法简单、高效，只需将角膜缘干细胞与其他试剂混合即可，且制备成本低。

需要说明的是，该角膜缘干细胞可以直接来源于商品化的角膜缘干细胞，也可以通过角膜缘组织的培养而获取。

进一步地，该步骤S1具体包括步骤如下：

S10、获取可增殖角膜缘组织；

S12、将可增殖角膜缘组织置于该含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基中；

S14、向该含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基中加入该碱性成纤维细胞生长因子，培养10～20天后，分离提纯得到角膜缘干细胞。

该角膜缘干细胞的培养过程中始终采用低钙培养液进行干细胞培养，可以制得较纯的角膜缘干细胞，干细胞的分化程度低；另外，通过碱性成纤维细胞生长因子培养角膜缘干细胞，发现其细胞增殖面积远大于未经碱性成纤维细胞生长因子培养的角膜缘干细胞的增殖面积，进而该碱性成纤维细胞生长因子可以促进角膜缘干细胞的增殖，加速角膜缘干细胞的增殖，可迅速增加角膜缘干细胞的数量，提高培养效率。

需要说明的是，该干细胞分离提纯方法为本领域技术人员通常采用的细胞分离提纯技术，由于已为本领域技术人员所熟知，在此不做赘述。

再进一步地，该步骤S10具体包括：

S100、获取角膜缘组织；

S102、将角膜缘组织置于无钙MEM培养基中培养，当角膜缘组织的上皮层的基底层细胞和与基底层细胞相连的上层细胞出现间隙时，除去上层细胞，而获得可增殖角膜缘组织。

该可增殖角膜缘组织的获取方法简单，只需将角膜缘组织培养一段时间，即上层细胞和基底层细胞即可自行脱离。需要说明的是，本发明角膜缘组织块上皮层具有多层细胞，其中，角膜缘干细胞产生于角膜缘组织块上皮层的基底层细胞，而基底层细胞以上的上层细胞会随着基底层细胞的增殖或分化而脱落。

现通过实施例对本发明的干细胞制剂及其制备方法做进一步解释，以详细说明其技术方案及带来的技术效果。

实施例1

一、获取角膜缘组织：

取因各种原因死亡的婴幼儿及儿童的眼球，均无眼部疾患，于死后24h内取材；

将人眼球置于洁净工作台上，严格无菌下操作，沿角巩膜缘灰白交界后1mm处剪切，取下包括角膜缘在内的眼前段组织，将眼前段组织小心移至另一盛有培养液的平皿中，解剖显微镜下去除虹膜、晶状体等附属组织，再撕去角膜内皮层及后弹力层；

然后，沿透明角膜内1mm环状剪取约2.0～2.5mm宽的角膜缘组织，并将其分成2mm×2mm×2mm的角膜缘组织块。整个操作中注意尽量避免钳夹培养组织。

二、获取可增殖角膜缘组织：

用无钙MEM培养基培养角膜缘组织块14h，可见角膜缘组织块上皮层的基底层细胞与其上方的上层细胞出现间隙，除去上层细胞，获得可增殖角膜缘组织；

三、细胞培养：

将可增殖角膜缘组织置于20g含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基中，其中，胎牛血清2g，钙离子的浓度为0.01mmol/ml；

向该含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基中加入1ml浓度为60ng/ml的重组牛碱性成纤维细胞生长因子(珠海东大生物制药有限公司)，培养至第15天，分离提纯培养得到角膜缘干细胞；

四、干细胞制剂制备：

将分离提纯得到的(1.6～2.4)×10⁸个角膜缘干细胞加入20ml含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基中，其中，胎牛血清1.5g，钙离子的浓度为0.01mmol/ml；然后，向培养基中加入300ng的重组牛碱性成纤维细胞生长因子(珠海东大生物制药有限公司)，进而得到角膜缘干细胞的浓度为(0.8～1.2)×10⁷个/ml，重组牛碱性成纤维细胞生长因子的浓度为15ng/ml。

比对例1

制备比对制剂：

提供与实施例1相同的20ml含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基，并向含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基中加入与实施例1相同的300ng的重组牛碱性成纤维细胞生长因子，而制得比对制剂。

验证例1

选取健康SD大鼠5只，分为五组进行验证，即组1、组2、组3、组4和对照组A，然后对五组SD大鼠均进行操作如下：

采用陆眠宁5mg/kg、氯胺酮50mg/kg混合液肌肉注射麻醉。消毒结膜囊，吸取5ulmol/L氢氧化钠溶液滴于已消毒的滤纸片上，待滤纸片中氢氧化钠达饱和状态时，将滤纸片置于SD大鼠单侧角膜中央30s，弃去滤纸，立即用30ml的生理盐水冲洗烧伤区及结膜囊；

组1至组4的SD大鼠分别给予结膜下注射实施例1制备的干细胞制剂的PBS溶液0.1ml；对照组A的SD大鼠给予结膜下注射比对例1制备的比对制剂的PBS溶液0.1ml；

对五组SD大鼠用裂隙灯显微镜观察角膜透明度，并进行分级评价，其中，该分级评价标准如下：

0级：全角膜透明，眼内结构清楚可见；

Ⅰ级：角膜轻度混浊，虹膜纹理不清，但能看清瞳孔缘，房水状态尚可看清；

Ⅱ级：瞳孔缘模糊不清，房水状态无法看清，虹膜纹理不清；

Ⅲ级：隐约看出虹膜颜色，余窥不清；

Ⅳ级：看不到任何前房结构。

请参见如下表1，表1为验证例1的五组SD大鼠的角膜透明度随时间的变化关系。

表1

	组1	组2	组3	组4	对照组A
						3天	Ⅳ级	Ⅳ级	Ⅳ级	Ⅳ级	Ⅳ级
7天	Ⅲ级	Ⅳ级	Ⅳ级	Ⅳ级	Ⅳ级
						14天	Ⅱ级	Ⅲ级	Ⅲ级	Ⅲ级	Ⅳ级
28天	Ⅰ级	Ⅰ级	Ⅰ级	Ⅱ级	Ⅳ级

由上表1可知，实施例1制备的干细胞制剂可以有效地恢复SD大鼠因碱烧伤的角膜，且角膜透明度可以达到Ⅰ级，因此，该干细胞制剂可以有效地治疗各种因角膜缘干细胞缺失或功能障碍引起的疾病。

验证例2

上皮性钙粘附蛋白(E-cadherin)在人角膜上皮层的分化与增殖过程中发挥着重要的作用，是角膜缘干细胞及短暂扩充细胞不断分化、迁移，并最终成为终末分化细胞过程的一个关键角色，它的大量表达起着促进干细胞分化的作用。

将实施例1制备的干细胞制剂放置20～30天后，采用小鼠抗人单克隆抗体E-cadherin(北京中山)对角膜缘干细胞进行免疫细胞化学染色，染色后，在扫描电镜下，可以见到只有少量细胞的细胞膜着色，即只有少量表达了的E-cadherin被染色，大部分细胞未见着色，如图1所示。

因此，对角膜缘组织使用0.01mmol/ml的低钙培养液培养出的细胞只有少量的E-cadherin表达，进而证明了实施例1制得的干细胞制剂在放置一段时间后，其角膜缘干细胞较纯，分化程度低。

实施例2

本实施例2的获取角膜缘组织、获取可增殖角膜缘组织的步骤与实施例1相同，不同之处在于：

三、细胞培养：

将可增殖角膜缘组织置于20g含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基中，其中，胎牛血清2g，钙离子的浓度为0.06mmol/ml；

向该含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基中加入1ml浓度为60ng/ml的重组牛碱性成纤维细胞生长因子(珠海东大生物制药有限公司)，培养至第15天，分离提纯培养得到角膜缘干细胞；

四、干细胞制剂制备：

将分离提纯得到的(1.6～2.4)×10⁸个角膜缘干细胞加入20ml含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基中，其中，胎牛血清1.5g，钙离子的浓度为0.06mmol/ml；然后，向培养基中加入1200ng的重组牛碱性成纤维细胞生长因子(珠海东大生物制药有限公司)，进而得到角膜缘干细胞的浓度为(0.8～1.2)×10⁷个/ml，重组牛碱性成纤维细胞生长因子的浓度为60ng/ml。

比对例2

制备比对制剂：

提供与实施例2相同的20ml含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基，并向含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基中加入与实施例1相同的1200ng的重组牛碱性成纤维细胞生长因子，而制得比对制剂。

验证例3

选取健康SD大鼠5只，分为五组进行验证，即组5、组6、组7、组8和对照组B，然后对五组SD大鼠均进行操作如下：

采用陆眠宁5mg/kg、氯胺酮50mg/kg混合液肌肉注射麻醉。消毒结膜囊，吸取5ulmol/L氢氧化钠溶液滴于已消毒的滤纸片上，待滤纸片中氢氧化钠达饱和状态时，将滤纸片置于SD大鼠单侧角膜中央30s，弃去滤纸，立即用30ml的生理盐水冲洗烧伤区及结膜囊；

组5至组8的SD大鼠分别给予结膜下注射实施例2制备的干细胞制剂的PBS溶液0.1ml；对照组B的SD大鼠给予结膜下注射比对例2制备的比对制剂的PBS溶液0.1ml；

对五组SD大鼠用裂隙灯显微镜观察角膜透明度，并进行分级评价，其中，该分级评价标准与验证例1相同。

请参见如下表2，表2为验证例3的五组SD大鼠的角膜透明度随时间的变化关系。

表2

	组5	组6	组7	组8	对照组B
						3天	Ⅳ级	Ⅳ级	Ⅳ级	Ⅳ级	Ⅳ级
7天	Ⅲ级	Ⅲ级	Ⅲ级	Ⅳ级	Ⅳ级
						14天	Ⅲ级	Ⅱ级	Ⅲ级	Ⅲ级	Ⅳ级
28天	Ⅱ级	Ⅰ级	Ⅰ级	Ⅰ级	Ⅳ级

由上表2可知，实施例2制备的干细胞制剂可以有效地恢复SD大鼠因碱烧伤的角膜，且角膜透明度可以达到Ⅰ级，因此，该干细胞制剂可以有效地治疗各种因角膜缘干细胞缺失或功能障碍引起的疾病。

验证例4

将实施例2制备的干细胞制剂放置20～30天后，采用小鼠抗人单克隆抗体E-cadherin(北京中山)对角膜缘干细胞进行免疫细胞化学染色，染色后，在扫描电镜下，没有细胞的细胞膜着色，即没有E-cadherin被染色，如图2所示。

因此，对角膜缘组织使用0.06mmol/ml的低钙培养液培养出的细胞没有E-cadherin表达，进而证明了实施例2制得干细胞制剂在放置一段时间后，其角膜缘干细胞未发生分化，纯度最高，而该浓度的低钙培养基的抑制分化效果最好。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种干细胞制剂，其特征在于，包括：

角膜缘干细胞；

碱性成纤维细胞生长因子；

含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基，其中，所述FBS的质量分数为1～14％，Ca²⁺在所述含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基中的浓度为0.01～0.09mmol/L；

在所述干细胞制剂中，所述角膜缘干细胞的浓度为(1×10⁵)～(1×10⁹)个/ml，所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为1～100ng/ml。

2.如权利要求1所述的干细胞制剂，其特征在于，所述角膜缘干细胞的浓度为(0.8～1.2)×10⁷个/ml。

3.如权利要求1所述的干细胞制剂，其特征在于，所述Ca²⁺在所述含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基中的浓度为0.06mmol/L。

4.如权利要求1所述的干细胞制剂，其特征在于，所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10～60ng/ml。

5.如权利要求4所述的干细胞制剂，其特征在于，所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为15ng/ml。

6.如权利要求5所述的干细胞制剂，其特征在于，所述碱性成纤维细胞生长因子为重组牛碱性成纤维细胞生长因子。

7.如权利要求1至6任意一项所述的干细胞制剂，其特征在于，还包括：PBS缓冲液。

8.一种如权利要求1至6任意一项所述的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：

获取角膜缘干细胞；

将所述角膜缘干细胞加入含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基中；

再向所述含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基中加入碱性成纤维细胞生长因子，而制得干细胞制剂。

9.如权利要求8所述的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述获取角膜缘干细胞的步骤包括：

获取可增殖角膜缘组织；

将所述可增殖角膜缘组织置于所述含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基中；

向所述含有FBS和Ca²⁺的MEM培养基中加入所述碱性成纤维细胞生长因子，培养10～20天后，分离提纯得到角膜缘干细胞。

10.如权利要求9所述的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述获取可增殖角膜缘组织的步骤，包括：

获取角膜缘组织；

将所述角膜缘组织置于无钙MEM培养基中培养，当所述角膜缘组织的上皮层的基底层细胞和与所述基底层细胞相连的上层细胞出现间隙时，除去所述上层细胞，而获得可增殖角膜缘组织。