CN113604420B - 体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的方法及含五味子乙素的组合物 - Google Patents

体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的方法及含五味子乙素的组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN113604420B
CN113604420B CN202110768300.4A CN202110768300A CN113604420B CN 113604420 B CN113604420 B CN 113604420B CN 202110768300 A CN202110768300 A CN 202110768300A CN 113604420 B CN113604420 B CN 113604420B
Authority
CN
China
Prior art keywords
vitro
inducing
composition
induction
mesenchymal stem
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110768300.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113604420A (zh
Inventor
周树勤
金美先
彭青
高毅
张莹
陈琦
李阳
黎少
梁康檐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southern Medical University Zhujiang Hospital
Original Assignee
Southern Medical University Zhujiang Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southern Medical University Zhujiang Hospital filed Critical Southern Medical University Zhujiang Hospital
Priority to CN202110768300.4A priority Critical patent/CN113604420B/zh
Publication of CN113604420A publication Critical patent/CN113604420A/zh
Priority to PCT/CN2022/090995 priority patent/WO2023279826A1/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113604420B publication Critical patent/CN113604420B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
    • C12N2500/62—DMSO
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/12—Hepatocyte growth factor [HGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/237—Oncostatin M [OSM]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1392—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from mesenchymal stem cells from other natural sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请公开一种体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的方法，通过在类肝细胞化诱导阶段起加入五味子乙素，能有效提高人胎盘间充质干细胞诱导分化为具有功能性的肝细胞的效果，且使用的干细胞为人胎盘间充质干细胞，其来源丰富、提取方便，诱导组合物成分明确、诱导操作简单，具有工业化和商业化的前景。

Description

体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的方法及含五味 子乙素的组合物
技术领域
本申请涉及一种干细胞生物学领域，尤其涉及一种体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的方法及含五味子乙素的组合物。
背景技术
对于终末期肝脏疾病，原位肝移植是唯一有效的治疗手段，但由于肝脏供体严重缺乏、移植后免疫排斥反应及较高的病死率使原位肝移植受到一定限制。肝细胞移植作为一种肝移植的替代疗法，在肝衰竭治疗中被证明是一种较为可行的方法。相比于肝脏原位移植，肝细胞移植不涉及复杂的手术，操作更加简单，费用更低，能够弥补供体肝脏短缺等问题。但肝细胞无法在体外大量增殖，面临着肝细胞来源不足的普遍问题。而且肝细胞提取困难，存活时间短，在体外培养后表型迅速发生变化，以至于肝细胞功能减退，无法达到预期治疗效果。随着干细胞技术的发展，人们把目光转向了具有自我更新和多向分化潜能的干细胞，其来源丰富，易于扩增，干细胞来源的肝细胞移植为治疗肝脏疾病带来了新的希望。
目前常用于肝脏疾病治疗的干细胞有胚胎干细胞(ESC)、诱导多能干细胞(iPSC)，但因存在提取不便或涉及伦理问题而受到限制，而胎盘间充质干细胞(PDMSCs)具有非侵入性、易获取、来源丰富、低免疫原性等优点，正逐渐成为细胞移植治疗理想的细胞来源。干细胞可分化为肝细胞，在体内行使肝细胞功能，发挥治疗作用。一般来说，肝细胞的诱导分为三个阶段，即内胚层分化阶段，肝向分化阶段，肝细胞成熟阶段，诱导的方法为在细胞培养基中添加特定的细胞因子或生长因子来促进细胞的分化，但至今尚无报道表明干细胞来源的肝细胞在表型和功能上能完全复制原代肝细胞，获得功能成熟的肝细胞是用于肝脏疾病治疗的关键，因此如何得到真正成熟的肝细胞还需要进一步探索。近年来干细胞向肝细胞分化技术不断发展，其中改变培养体系是提高干细胞肝向诱导分化效率的主要方法，如三维培养、添加小分子化合物、添加细胞基质等，此外，多种中药单体及复方在干细胞定向诱导分化中也有一定作用，但目前的诱导方法效果并不显著，因此开发一种高效、简便的将干细胞诱导分化为成熟肝细胞的方法显得尤为重要。
发明内容
本申请的目的是，至少部分克服现有技术的不足，提供一种体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的方法，以及含五味子乙素的诱导用的组合物，还包括将五味子乙素应用于肝细胞的体外诱导药物中。
为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：
第一方面，提供五味子乙素在制备体外促进肝细胞的细胞色素氧化酶表达的药物中的应用。
第二方面，提供五味子乙素在制备体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的药物中的应用。
第三方面，提供一种体外诱导分化的组合物，其包含肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、激活素A、烟酰胺和五味子乙素。
优选地，包含具备以下终浓度的组分：20ng/ml的肝细胞生长因子、10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、50ng/ml的激活素A、0.61g/ml的烟酰胺和10μM的五味子乙素。
可选择地，被处理的细胞为人源的全能干细胞或多能干细胞。
第四方面，提供一种体外诱导成熟的组合物，包含肝细胞生长因子、抑瘤素M、地塞米松、胰岛素铁硒转移蛋白、二甲基亚砜和五味子乙素。
优选地，包含具备以下终浓度的组分：20ng/ml的肝细胞生长因子、20ng/ml的抑瘤素M、1μM地塞米松、1％的胰岛素铁硒转移蛋白、1％的二甲基亚砜和10μM五味子乙素。
可选择地，被处理的细胞为类肝细胞。
第五方面，一种体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的方法，包括以下步骤：
获取人胎盘间充质干细胞，并进行预处理2～3d；
对预处理之后的人胎盘间充质干细胞利用体外诱导分化的组合物进行类肝细胞化诱导10d；
对类肝细胞化诱导之后的细胞利用体外诱导成熟组合物进行肝向成熟诱导15d；
其中，所述体外诱导分化的组合物采用如前所述的体外诱导分化的组合物，所述体外诱导成熟组合物采用如前所述的体外诱导成熟组合物。
进一步地，预处理时，采用含有如下成分的预处理液：20ng/ml的表皮生长因子、10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、含有1％抗生素的无血清培养基。
更进一步地，预处理时，当所述人胎盘间充质干细胞的融合度达到80～90％时，终止预处理阶段。
优选地，所述人胎盘间充质干细胞为传代扩增2～7代的细胞。
进一步地，所述类肝细胞化诱导过程和肝向成熟诱导过程，分别向含有1％抗生素的无血清培养基加入所述体外诱导分化组合物和体外诱导成熟组合物。
优选地，所述类肝细胞化诱导过程和肝向成熟诱导过程，每3～4d更换新鲜的培养基。
与现有技术相比较，本申请具有如下优势：
1.本申请的体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的方法，证实能成功将人胎盘间充质干细胞诱导分化为具有功能性的肝细胞，特别是能提升肝细胞药物代谢相关酶基因的表达水平；
2.本申请的体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的方法所获得的肝细胞，其细胞色素酶的表达更高，使得所获得的肝细胞更接近体内状态，更适合用于构建体外药物安全性评价模型，可以实现药物研发及安全性评价的个性化，提高药物研发、药物治疗的针对性；
3.本申请的体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的方法，使用的干细胞为人胎盘间充质干细胞，其来源丰富、提取方便，诱导组合物成分明确、诱导操作简单，具有工业化和商业化的前景，能够大规模生产。
附图说明
图1为采用本申请的体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的方法的细胞形态变化图；
图2为采用本申请的体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的方法中五味子乙素作用于PDMSCs后细胞活力统计图；
图3为采用本申请的体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的方法中五味子乙素作用于PDMSCs后细胞形态变化图；
图4为采用本申请的体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的方法中不同阶段加入Schisandrin B后肝细胞标志物qPCR检测结果；
图5为采用本申请的体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的方法后细胞干性标志物、肝细胞标志物及细胞色素酶相关基因表达的qPCR检测结果；
图6为采用本申请的体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的方法后荧光显微镜下肝细胞表面标志物ALB、CK18、CYP3A4的表达情况；
图7为采用本申请的体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的方法后肝细胞白蛋白分泌和尿素合成结果图；
图8为采用本申请的体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的方法后PAS检测肝细胞的糖原储存能力结果图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式对本申请作进一步详细描述。
下文自始至终相同或类似的名词表示相同或类似的物质或具有相同或类似功能的物质。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1：体外诱导人胎盘间充质干细胞(PDMSCs)分化为肝细胞
一种体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的基本方法，包括以下三个步骤：
预处理阶段：将人胎盘间充质干细胞在含有浓度为20ng/ml EGF(表皮生长因子)、10ng/ml bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)的人间充质干细胞无血清培养基中进行诱导培养，培养时间为2-3天。具体为：
1)选取P3代的PDMSCs细胞用含有0.25％Trypsin和0.04％EDTA的混合液体进行消化，以1×104cells/cm2密度接种于六孔板，用人间充质干细胞无血清培养基于37℃，5％CO2，饱和湿度的培养箱中培养24h。其中人间充质干细胞无血清培养基由人间充质干细胞无血清基础培养基、人间充质干细胞无血清添加物、体积比为1％的抗生素配制而成。
2)在人间充质干细胞无血清培养基的基础上配制含有浓度为20ng/ml EGF、10ng/ml bFGF的预处理液，并用0.22μm的微孔滤膜过滤，现配现用。
3)细胞在人间充质干细胞无血清培养基中培养24h后，即人胎盘间充质干细胞传代2～7代之后，将培养基更换为预处理液，在37℃，5％CO2，饱和湿度的培养箱中培养2d。
4)2d后观察细胞融合度为80％-90％，若细胞融合度未达到80％-90％，则继续培养1d。
类肝细胞化诱导阶段：完成预处理阶段的细胞在含有浓度为10ng/ml HGF(肝细胞生长因子)、10ng/mlbFGF、50ng/ml Activin A(激活素A)、0.61g/Lnicotinamide(烟酰胺)的人间充质干细胞无血清培养基中继续诱导培养，培养时间为10d，获得类肝细胞。具体为：
1)在人间充质干细胞无血清培养基的基础上加入体外诱导分化组合物，该体外诱导分化组合物含有具备以下终浓度的组分：10ng/ml HGF、10ng/mlbFGF、50ng/ml ActivinA、0.61g/L nicotinamide，混合之后用0.22μm的微孔滤膜过滤，现配现用。
2)继续培养10d，每3-4d更换培养基。
肝向成熟诱导阶段：完成类肝细胞诱导阶段的类肝细胞在含有浓度为10ng/mlHGF、20ng/ml OSM(抑瘤素M)、1μM DEX(地塞米松)、1％ITS(胰岛素铁硒转移蛋白)、1％DMSO(二甲基亚砜)的人间充质干细胞无血清培养基中继续诱导培养，培养时间为15d。具体为：
1)在人间充质干细胞无血清培养基的基础上加入体外诱导成熟组合物，该体外诱导成熟组合物含有具备以下终浓度的组分：10ng/ml HGF、20ng/mlOSM、1μMDEX、1％ITS、1％DMSO，混合之后用0.22μm的微孔滤膜过滤，现配现用。
3)继续培养15d，每3-4d更换培养基，诱导类肝细胞的肝向成熟。
整个诱导过程中在显微镜下观察细胞形态变化并拍照记录，细胞形态变化如图1所示。
结果显示诱导初期细胞形态变化不明显，细胞成多角形或长梭形，增殖速度较快；进入类肝细胞分化阶段后，细胞体积逐渐变大，长梭形更加明显，排列不规则，胞浆丰富，有黑色颗粒堆积，核仁清楚且有双核仁出现；进入肝向成熟诱导阶段后，细胞逐渐变为多边形，呈铺路石样改变，细胞进一步变大，与人原代肝细胞形态类似。
实施例2：体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的条件优化
为了确定Schisandrin B(五味子乙素)能促进PDMSCs向肝细胞分化，促进细胞色素酶的表达，提高肝细胞的药物代谢功能，设计了不同诱导阶段培养基中添加SchisandrinB进行比较，并确定最终加入Schisandrin B的时机和剂量。
利用CCK-8测定Schisandrin B的细胞毒性，具体为：
1)分别以0、1、10、25、50、100、200μM浓度的Schisandrin B作用于细胞，在37℃，体积分数5％CO2培养箱中培养3d，并在显微镜下观察细胞形态。
2)去除培养基，在避光条件下加入含10％CCK-8试剂的培养基，于培养箱中孵育2h，使用酶标仪测量在450nm处的吸光度。
3)计算细胞活力，根据细胞活力选择合适的药物浓度。
结果显示：PDMSCs对Schisandrin B呈现出剂量相关的毒性反应，Schisandrin B浓度大于25μM时细胞活力显著下降(图2)。显微镜下观察到在Schisandrin B浓度在0-25μM时细胞生长状态良好，当Schisandrin B浓度大于25μM时细胞不贴壁，大量死亡(图3)。根据CCK-8测定结果计算出Schisandrin B的IC50为32.91μM，结合文献资料，在后续的实验中采用10μM浓度进行下一步实验。
测定诱导过程中Schisandrin B作用的最佳时间，具体为：
1)根据CCK-8结果选择10μM浓度的Schisandrin B进行下一步实验，以未分化的PDMSCs作为对照组，测定在不同诱导阶段开始加入Schisandrin B对诱导分化的影响，实验分组：
Figure BDA0003152776490000071
2)Schisandrin B组1
预处理阶段：将人胎盘间充质干细胞在含有浓度为20ng/ml EGF、10ng/ml bFGF、10μM Schisandrin B的人间充质干细胞无血清培养基中进行诱导培养，培养时间为2-3d。
类肝细胞化诱导阶段：完成预处理阶段的细胞在含有浓度为10ng/ml HGF、10ng/mlbFGF、50ng/ml Activin A、0.61g/L nicotinamide、10μMSchisandrin B的人间充质干细胞无血清培养基中继续诱导培养，培养时间为10d。
肝向成熟诱导阶段：完成类肝细胞化诱导阶段后在含有浓度为10ng/ml HGF、20ng/mlOSM、1μMDEX、1％ITS、1％DMSO、10μM Schisandrin B的的人间充质干细胞无血清培养基中继续诱导培养，培养时间为15d。
3)Schisandrin B组2
预处理阶段同实施例1。
类肝细胞化诱导阶段：完成预处理阶段的细胞在含有浓度为10ng/ml HGF、10ng/mlbFGF、50ng/ml Activin A、0.61g/L nicotinamide、10μM Schisandrin B的人间充质干细胞无血清培养基中继续诱导培养，培养时间为10d。
肝向成熟诱导阶段：完成类肝细胞诱导阶段后在含有浓度为10ng/ml HGF、20ng/mlOSM、1μMDEX、1％ITS、1％DMSO、10μM Schisandrin B的肝人间充质干细胞无血清培养基中继续诱导，培养时间为15d。
4)Schisandrin B组3
预处理阶段同实施例1。
类肝细胞化诱导阶段同实施例1。
肝向成熟诱导阶段：完成类肝细胞诱导阶段后在含有浓度为10ng/ml HGF、20ng/mlOSM、1μMDEX、1％ITS、1％DMSO、10μM Schisandrin B的人间充质干细胞无血清培养基培养基中继续诱导，培养时间为15d。
5)收集诱导分化终末期不同阶段加Schisandrin B的细胞进行总RNA提取，用qPCR方法对肝细胞标志物进行测定。操作方法为：
1)对分化成熟的肝细胞利用Trizol提取细胞RNA。具体地，吸去培养细胞的培养基，用PBS(磷酸盐缓冲液)冲洗细胞三次，加入Trizol用于提取细胞RNA。加入体积为Trizol1/5的氯仿，用力震荡30s，静置5min，4℃，12000g，离心15min。吸取上层无色水相溶液，加入等体积异丙醇，震荡混匀，室温下静置15min，然后4℃，12000g，离心15min。加入75％乙醇混匀，然后4℃，7500g，离心5min。弃上清，留取底部RNA沉淀，晾干。利用20-30μlDEPC水充分溶解RNA。
2)采用Takara试剂盒对所提取的RNA进行逆转录。采用SYBRGreen染色法进行荧光定量PCR，对ALB、CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9进行测定。表1中列出所采用的引物序列。
检测结果：如图4所示，MSC表示未分化PDMSCs，HLC-A表示不加Schisandrin B组，HLC-B1表示Schisandrin B组1，HLC-B2表示Schisandrin B组2，HLC-B3表示Schisandrin B组3。与未诱导的PDMSCs相比，诱导后各组肝脏标志物增加，但类肝细胞化诱导阶段开始加Schisandrin B肝细胞基因表达水平最高，因此我们认为在类肝细胞诱导阶段开始加Schisandrin B诱导效果最佳。
实施例3：诱导分化肝细胞的鉴定
根据实施例1和实施例2实验结果得到优化的诱导方案，进一步对诱导后的肝细胞进行鉴定，通过荧光定量PCR、细胞免疫荧光方法鉴定肝细胞标志物的表达，通过糖原染色、白蛋白分泌检测、尿素合成检测等来鉴定肝细胞功能。
1.优化后的诱导方案
Figure BDA0003152776490000091
2.实验分组
空白对照组(MSC组)：以未诱导的PDMSC作为空白对照
对照组(HLC-A)：不加Schisandrin B诱导PDMSC向肝细胞分化作为对照组
实验组(HLC-B)：类肝细胞分化阶段开始加入10μM Schisandrin B诱导PDMSC向肝细胞分化作为实验组
3.荧光定量PCR检测肝细胞标志物
操作方法为：同实施例2中操作方法，对干细胞分化能力相关的干性基因OCT-4、Nanog、SOX2，肝祖细胞相关基因AFP，成熟肝细胞相关基因ALB、CK18，I相代谢酶CYP3A4、CYP2E1、CYP2C9、CYP2D6基因表达水平进行测定。表1中列出所采用的引物序列。
检测结果：如图5所示诱导之后干细胞干性基因OCT-4、Nanog、Sox2的表达降低，与不加Schisandrin B的诱导方法相比，加Schisandrin B组细胞干性基因降低更加明显，表明干细胞逐渐失去多向分化能力，变为成熟的终末细胞。肝祖细胞标志物AFP基因无明显变化，成熟肝细胞标志物ALB、CK18的表达增加，肝细胞药物代谢相关基因CYP3A4、CYP2E1、CYP2C9、CYP2D6在诱导之后表达也增加，与不加Schisandrin B的诱导方法相比，Schisandrin B组细胞肝细胞成熟标志物及肝功能相关基因表达增加均更明显。
4.免疫荧光法检测肝细胞标志物
操作方法为：
1)对诱导分化成熟的肝细胞用PBS洗5min×3遍。
2)4％多聚甲醛固定20min，然后用PBS洗5min×3遍。
3)破膜液进行破膜20min，PBS洗5min×3遍。
4)用免疫染色封闭液封闭1h。
5)吸走封闭液，加入稀释后的一抗(ALB、CK18、CYP3A4)，4℃孵育14-16h，PBS洗5min×5遍。
6)加入对应稀释后的二抗，37℃避光孵育1h，PBS洗5min×5遍。
7)加入DAPI染色15min，PBS洗5min×3遍。
8)封片，荧光显微镜下观察并拍照。
检测结果：诱导之后肝细胞成熟标志物ALB、CK18诱导之后蛋白表达量增加，肝细胞功能标志物CYP3A4蛋白表达也增加，与不加Schisandrin B相比，加Schisandrin B诱导的细胞各种肝细胞标志物表达更高(图6)。
5.白蛋白检测
操作方法为：
1)收集诱导分化终末期培养24h的细胞上清液，用于白蛋白酶联免疫吸附实验(ELISA)。
2)按照人白蛋白ELISA检测试剂盒的操作步骤检测上清液中白蛋白的含量。
检测结果：分化之后的细胞均具有白蛋白分泌功能，且Schisandrin B组白蛋白分泌量更多(图7-a)
6.尿素合成功能检测
操作方法为：
1)诱导分化终末期的细胞加入含5mM氯化铵浓度的人间充质干细胞培养基，于37℃，体积分数5％CO2培养箱中培养24h，收集上清液
2)按照人尿素氮ELISA检测试剂盒的操作步骤检测上清液中尿素氮的含量。
检测结果：分化之后的细胞均具有尿素氮合成功能，且Schisandrin B组尿素氮合成量更多(图7-b)
7.糖原染色
对诱导分化终末期的肝细胞按照糖原染色(PAS)染色试剂盒的操作说明进行染色。
检测结果：分化之后得到的肝细胞糖原染色均呈阳性，表明均具有糖原合成功能，但Schisandrin B组糖原染色更深，表明糖原含量更高(图8)。
以上所述仅是本发明的部分实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
表1引物序列
Figure BDA0003152776490000111
综上所述，本申请的体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的方法，通过在类肝细胞化诱导阶段起加入五味子乙素，能有效提高人胎盘间充质干细胞诱导分化为具有功能性的肝细胞的效果，且使用的干细胞为人胎盘间充质干细胞，其来源丰富、提取方便，诱导组合物成分明确、诱导操作简单，具有工业化和商业化的前景。
上述实施例为本申请较佳的实施方式，但并不仅仅受上述实施例的限制，其他的任何未背离本申请的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，均包含在本申请的保护范围之内。

Claims (8)

1.五味子乙素在制备体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的药物中的应用。
2.一种体外诱导分化的组合物，其特征在于，其包含肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、激活素A、烟酰胺和五味子乙素；
所述的组合物，其特征在于，包含具备以下终浓度的组分：20ng/ml的肝细胞生长因子、10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、50ng/ml的激活素A、0.61g/ml的烟酰胺和10μM的五味子乙素。
3.一种体外诱导成熟的组合物，其特征在于，包含肝细胞生长因子、抑瘤素M、地塞米松、胰岛素铁硒转移蛋白、二甲基亚砜和五味子乙素；
所述的组合物，其特征在于，包含具备以下终浓度的组分：20ng/ml的肝细胞生长因子、20ng/ml的抑瘤素M、1μM地塞米松、1%的胰岛素铁硒转移蛋白、1%的二甲基亚砜和10μM五味子乙素；
所述的组合物，其特征在于，被处理的细胞为类肝细胞。
4.一种体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
获取人胎盘间充质干细胞，并进行预处理2~3d；
对预处理之后的人胎盘间充质干细胞利用体外诱导分化的组合物进行类肝细胞化诱导10d；
对类肝细胞化诱导之后的细胞利用体外诱导成熟组合物进行肝向成熟诱导15d；
其中，所述体外诱导分化的组合物采用如权利要求2所述的体外诱导分化的组合物，所述体外诱导成熟组合物采用如权利要求3所述的体外诱导成熟组合物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，预处理时，采用含有如下成分的预处理液：20ng/ml的表皮生长因子、10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子和含有1%抗生素的无血清培养基。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，预处理时，当所述人胎盘间充质干细胞的融合度达到80~90%时，终止预处理阶段。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述类肝细胞化诱导过程和肝向成熟诱导过程，分别向含有1%抗生素的无血清培养基加入所述体外诱导分化组合物和体外诱导成熟组合物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述类肝细胞化诱导过程和肝向成熟诱导过程，每3~4d更换新鲜的培养基。
CN202110768300.4A 2021-07-07 2021-07-07 体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的方法及含五味子乙素的组合物 Active CN113604420B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110768300.4A CN113604420B (zh) 2021-07-07 2021-07-07 体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的方法及含五味子乙素的组合物
PCT/CN2022/090995 WO2023279826A1 (zh) 2021-07-07 2022-05-05 体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的方法及含五味子乙素的组合物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110768300.4A CN113604420B (zh) 2021-07-07 2021-07-07 体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的方法及含五味子乙素的组合物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113604420A CN113604420A (zh) 2021-11-05
CN113604420B true CN113604420B (zh) 2022-07-08

Family

ID=78304095

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110768300.4A Active CN113604420B (zh) 2021-07-07 2021-07-07 体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的方法及含五味子乙素的组合物

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN113604420B (zh)
WO (1) WO2023279826A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113604420B (zh) * 2021-07-07 2022-07-08 南方医科大学珠江医院 体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的方法及含五味子乙素的组合物

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102008577A (zh) * 2010-12-03 2011-04-13 南方医科大学 一种防治苯丙胺类和阿片类药物依赖的药物
CN102627625A (zh) * 2012-03-27 2012-08-08 贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室 五味子醇甲、五味子酚和五味子乙素的衍生物及其用途
CN105456481A (zh) * 2015-12-07 2016-04-06 中山大学 南五味子提取物在制备肝再生药物中的应用
CN111132685A (zh) * 2017-04-25 2020-05-08 瑞阳公司 五味子提取物的组合物和其方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1281210C (zh) * 2003-11-29 2006-10-25 胡汛 五味子乙素在制备治疗肿瘤药物中的应用
CN104223297B (zh) * 2014-09-05 2016-09-14 杨高林 一种延缓衰老的五味子保健口服液及其制备方法
CN110035763B (zh) * 2016-09-27 2022-11-15 瑞阳公司 用于治疗寄生虫病的组合物
KR101918817B1 (ko) * 2016-10-06 2018-11-14 (주) 넥셀 인간 줄기세포 유래 간세포 분화 방법 및 간세포
CN112111444B (zh) * 2020-08-28 2022-03-04 广东乾晖生物科技有限公司 脐带间充质干细胞重编程为肝脏细胞的方法及所制备的肝脏类器官
CN113604420B (zh) * 2021-07-07 2022-07-08 南方医科大学珠江医院 体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的方法及含五味子乙素的组合物

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102008577A (zh) * 2010-12-03 2011-04-13 南方医科大学 一种防治苯丙胺类和阿片类药物依赖的药物
CN102627625A (zh) * 2012-03-27 2012-08-08 贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室 五味子醇甲、五味子酚和五味子乙素的衍生物及其用途
CN105456481A (zh) * 2015-12-07 2016-04-06 中山大学 南五味子提取物在制备肝再生药物中的应用
CN111132685A (zh) * 2017-04-25 2020-05-08 瑞阳公司 五味子提取物的组合物和其方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
五味子乙素对CYP450药物代谢酶诱导作用的体外研究;王卓等;《药学研究》;20171031;第36卷(第10期);559-564、574 *
五味子乙素对小鼠肝细胞微粒体细胞色素P-450的诱导作用;刘耕陶等;《药学学报》;19800430(第4期);206-211 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113604420A (zh) 2021-11-05
WO2023279826A1 (zh) 2023-01-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Gao et al. In vitro cultivation of islet-like cell clusters from human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells
Pettinato et al. Scalable differentiation of human iPSCs in a multicellular spheroid-based 3D culture into hepatocyte-like cells through direct Wnt/β-catenin pathway inhibition
CA2969194C (en) Primitive gut endoderm cells and method for producing same
CN108486037B (zh) 一种利用小分子化合物诱导人多能干细胞分化为肝细胞的方法
CN112111444B (zh) 脐带间充质干细胞重编程为肝脏细胞的方法及所制备的肝脏类器官
WO2015180636A1 (zh) 人肝细胞长期维持和增殖传代培养的专用培养基和培养方法
KR101918817B1 (ko) 인간 줄기세포 유래 간세포 분화 방법 및 간세포
CN109082401B (zh) 一种羊膜上皮干细胞诱导分化为功能性肝细胞的方法及其应用
Varaa et al. Wharton’s jelly mesenchymal stem cell: Various protocols for isolation and differentiation of hepatocyte-like cells; narrative review
CN107142240A (zh) 将消化道来源上皮细胞重编程为内胚层干/祖细胞的方法及应用
Meng et al. The differentiation and isolation of mouse embryonic stem cells toward hepatocytes using galactose-carrying substrata
Mun et al. Long-term expansion of functional human pluripotent stem cell-derived hepatic organoids
CN114395523B (zh) 一种诱导干细胞分化为肝细胞的试剂盒及其应用
CN113604420B (zh) 体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为肝细胞的方法及含五味子乙素的组合物
KR102586507B1 (ko) Ｒｎａ를 사용한 줄기 세포 분화에 의한 간세포의 유도
KR101227047B1 (ko) 간세포의 제조방법 및 이로부터 제조된 간세포
CN111875675B (zh) 表皮干细胞向胰腺细胞分化的改进方法
Xiao et al. Establishing a human pancreatic stem cell line and transplanting induced pancreatic islets to reverse experimental diabetes in rats
EP3919612A1 (en) Composition and application thereof
KR101970642B1 (ko) 줄기세포 배양용 배지조성물 및 그를 이용한 줄기세포 배양방법
Shi et al. Generation of Hepatocytes and Nonparenchymal Cell Codifferentiation System from Human‐Induced Pluripotent Stem Cells
Kim et al. Generation and differentiation of chemically derived hepatic progenitors from mouse primary hepatocytes
US20080311625A1 (en) Immortal Pluripotent Stem Cell Line, Cell Lines Derived Therefrom, Methods of Preparing Thereof and Their Uses
CN116240163B (zh) 一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液及其用途
KR102145134B1 (ko) 소포체 스트레스 완화제를 이용한 생체 외 배양 간세포 제조방법 및 이를 통해 마련된 생체 외 배양 간세포

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant