JP5900865B2 - T細胞の分化誘導方法、t細胞の製造方法、t細胞、医薬組成物、及び、スクリーニング方法 - Google Patents
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Description
IL:インターロイキン
TGF-β:トランスフォーミング増殖因子ベータ
atRA:オールトランスレチノイン酸又はトレチノイン
Treg:制御性T細胞
TCR:T細胞受容体
IFN-γ:インターフェロンガンマ
FACS:蛍光活性セルソーター(フローサイトメトリーと同義)
本開示は、一又は複数の実施形態において、CD4+CD8- T細胞をIL-2、TGF-β1、及びatRAが存在する条件下でin vitro培養することを含む、CD4+CD8- T細胞からCD4-CD8αα+ T細胞を分化誘導する方法(以下、「本開示にかかる分化誘導方法」ともいう)に関する。
前記CD4+CD8- T細胞は、一又は複数の実施形態において、ナイーブCD4 T細胞である。本開示において「ナイーブCD4 T細胞」は、未成熟T細胞が胸腺で成熟した後、末梢に放出され、一度も抗原により活性化されていないCD4+ T細胞をいう。ナイーブCD4 T細胞の取得方法は、特に制限されず、従来知られた又は今後開発されるナイーブCD4 T細胞の取得方法を適用できる。ナイーブCD4 T細胞の取得方法は、一又は複数の実施形態において、例えば動物個体の脾臓、リンパ節又は末梢血を採取し、適切な培地又は希釈液を用いて細胞の懸濁液を調製し、該懸濁液から細胞特異的表層マーカーを用いて単離する方法などが挙げられる。マーカー陽性とマーカー陰性のナイーブT細胞の分離する方法としては、例えば、マーカーに対する抗体を結合したマグネティックビーズを上記細胞懸濁液に添加し、マグネティックビーズを磁石で集めることにより、マーカーを発現しているT細胞を分離する方法(マグネティックビーズ法)が挙げられる。
本開示にかかる分化誘導方法における前記培養は、一又は複数の実施形態において、TCRを刺激する手段がコーティングされた培養プレート上で行われる。TCRを刺激する手段が培養プレートにコーティングされることで、CD4-CD8αα+ T細胞への分化誘導効率を向上できるとい利点がある。前記TCRを刺激する手段は、CD4+CD8- T細胞に発現しているTCRを刺激できるもので有れば特に限定されず、一又は複数の実施形態において、CD4+CD8- T細胞に発現している分子に対する抗体である。前記抗体は、特に限定されず、一又は複数の実施形態において、抗CD3抗体である。前記抗CD3抗体は、一又は複数の実施形態において、抗CD3ε抗体である。
本開示にかかる分化誘導方法における前記培養の時間は、一又は複数の実施形態において、6日以上、7日以上、8日以上、又は9日以上である。CD4-CD8αα+ T細胞への分化誘導効率を向上する点からは、前記培養の時間はiTregの誘導よりも長い培養日数であることが好ましい。前記培養時間の上限は、特に制限されず、CD4-CD8αα+ T細胞への分化誘導を阻害しない程度であり、一又は複数の実施形態において、20日以下である。
本開示にかかる分化誘導方法における前記培養において、オールトランスレチノイン酸(atRA)は必須の成分である。前記培養開始時におけるatRAの存在量は、一又は複数の実施形態において、10 nM以上、100 nM以上、1μM以上、1μMを超える、2μM以上、5μM以上、又は、10μM以上である。CD4-CD8αα+ T細胞への分化誘導効率を向上する点からは、atRAの存在量は、多いほど好ましい。atRNの存在量の上限は、特に制限されず、CD4-CD8αα+ T細胞への分化誘導を阻害しない程度であり、一又は複数の実施形態において、100μM以下である。
本開示にかかる分化誘導方法における前記培養において、IL-2は必須の成分である。前記培養開始時におけるIL-2の存在量は、一又は複数の実施形態において、10 ng/mL以上、又は15 ng/mL以上である。IL-2の存在量の上限は、特に制限されず、CD4-CD8αα+ T細胞への分化誘導を阻害しない程度であり、一又は複数の実施形態において、100 ng/mL以下である。
本開示にかかる分化誘導方法における前記培養においてTGF-β1は必須の成分である。前記培養開始時におけるTGF-β1の存在量は、一又は複数の実施形態において、0.5 ng/mL以上、又は1 ng/mL以上である。TGF-β1の存在量の上限は、特に制限されず、CD4-CD8αα+ T細胞への分化誘導を阻害しない程度であり、一又は複数の実施形態において、50 ng/mL以下である。
本開示にかかる分化誘導方法における前記培養は、一又は複数の実施形態において、さらに、共刺激抗体及び/又はサイトカインのブロッキング抗体の存在下で行う。前記共刺激抗体は、限定されない一又は複数の実施形態において、抗CD28抗体である。前記サイトカインのブロッキング抗体は、限定されない一又は複数の実施形態において、抗IFN-γ抗体、及び抗IL-4抗体である。本開示にかかる分化誘導方法における前記培養は、一又は複数の実施形態において、抗CD28抗体、抗IFN-γ抗体、及び抗IL-4抗体から選択される一種類若しくは二種類、又は、三種類全ての抗体の存在下で行う。CD4-CD8αα+ T細胞への分化誘導効率を向上する点からは、これらの三種類の抗体(抗CD28抗体、抗IFN-γ抗体、及び抗IL-4抗体)が存在することが好ましい。すなわち、本開示にかかる分化誘導方法における前記培養は、一又は複数の実施形態において、「CD4+CD8- T細胞をIL-2、TGF-β1、atRA、抗CD28抗体、抗IFN-γ抗体、及び抗IL-4抗体が存在する条件下でin vitro培養すること」である。
本開示にかかる分化誘導方法における前記培養の温度は、一又は複数の実施形態において、35〜39℃、36〜38℃、又は37℃で行う。前記培養の培地は、特に制限されず、T細胞の培養に使用できる従前知られた又は今後開発される培地が使用できる。
本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示にかかる分化誘導方法を行うことを含む、CD4-CD8αα+ T細胞の製造方法に関する。本開示にかかる製造方法は、一又は複数の実施形態において、前記分化誘導方法後にCD4-CD8αα+ T細胞を分離又は単離する工程を含んでもよい。或いは、本開示にかかる製造方法は、一又は複数の実施形態において、前記分化誘導方法後にCD4-CD8αα+ T細胞を含む細胞集団を製造対象物としてもよい。よって、本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示にかかる製造方法により製造されるCD4-CD8αα+ T細胞、又はCD4-CD8αα+ T細胞を含む細胞集団に関する。
本開示は、一又は複数の実施形態において、in vitroで存在する、CD4+CD8- T細胞由来のCD4-CD8αα+ T細胞に関する。また、本開示は、一又は複数の実施形態において、in vitroで存在する、CD4+CD8- T細胞由来のCD4-CD8αα+ T細胞を含む細胞集団に関する。本開示にかかるCD4+CD8- T細胞由来のCD4-CD8αα+ T細胞は、一又は複数の実施形態において、Runx3が発現している。
したがって、本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示にかかるCD4+CD8- T細胞由来のCD4-CD8αα+ T細胞、又は該T細胞を含む細胞集団を含む医薬組成物に関する。また、本開示は、一又は複数の実施形態において、自己免疫疾患、悪性腫瘍、又は、ウイルス感染症の予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療のための医薬組成物であって、本開示にかかるCD4+CD8- T細胞由来のCD4-CD8αα+ T細胞、又は該T細胞を含む細胞集団を含む医薬組成物に関する。
本開示は、一又は複数の実施形態において、CD4+CD8- T細胞からCD4-CD8αα+ T細胞への分化誘導を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法に関する。前記スクリーニング方法は、一又は複数の実施形態において、本開示にかかる分化誘導方法を行うことを含む。前記スクリーニング方法は、その他の一又は複数の実施形態において、本開示にかかる分化誘導方法を行い、分化誘導の効果を指標として、テスト物質から候補物質を選択することを含む。
本開示にかかるスクリーニング方法におけるテスト物質は、特に限定されない。本開示において「物質」は、一又は複数の実施形態において、化合物、組成物、混合物、抽出物、天然物、又は合成物であってよい。テスト物質は、一又は複数の実施形態において、スクリーニングライブラリーを利用してもよく、特に限定されないが、化合物若しくはその塩、組成物、混合物、抽出物、天然物、又は合成物のライブラリーが利用できる。
本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示にかかる分化誘導方法を行うためのキット、又は、本開示にかかるスクリーニング方法を行うためのキットに関する。本開示にかかるキットは、一又は複数の実施形態において、CD4+CD8- T細胞、IL-2、TGF-β1、atRA、TCRを刺激する手段がコーティングされた培養プレート、抗CD28抗体、抗IFN-γ抗体、抗IL-4抗体、培地、及び、本開示にかかる分化誘導方法の説明書から選択される少なくとも1つを含みうる。
[A1] CD4+CD8- T細胞をIL-2、TGF-β1、及びatRAが存在する条件下でin vitro培養することを含む、CD4+CD8- T細胞からCD4-CD8αα+ T細胞を分化誘導する方法;
[A2] 前記CD4+CD8- T細胞が、ナイーブCD4 T細胞である、[A1]記載の分化誘導方法;
[A3] 前記CD4+CD8- T細胞として、抗原特異的CD4+CD8- T細胞又は抗原特異的CD4+CD8- T細胞を増殖させた細胞集団を使用する、[A1]記載の分化誘導方法;
[A4] 前記培養が、TCRを刺激する手段がコーティングされた培養プレート上で行われる、[A1]から[A3]のいずれかに記載の分化誘導方法;
[A5] 前記培養が、6日以上である、[A1]から[A4]のいずれかに記載の分化誘導方法;
[A6] 培養開始時のCD4+CD8- T細胞の数が、5.0 x 105個/mL以下である、[A1]から[A5]のいずれかに記載の分化誘導方法;
[A7] atRAの濃度が、1μMを超える、[A1]から[A6]のいずれかに記載の分化誘導方法;
[A8] 前記培養が、さらに、抗CD28抗体、抗IFN-γ抗体、及び抗IL-4抗体からなる群から選択される一種類、二種類、又は三種類の抗体が存在する条件下で行われる、[A1]から[A7]のいずれかに記載の分化誘導方法;
[A9] [A1]から[A8]のいずれかに記載の分化誘導方法を行うことを含む、CD4-CD8αα+ T細胞の製造方法;
[A10] [A1]から[A8]のいずれかに記載の分化誘導方法により製造される、CD4-CD8αα+ T細胞;
[A11] in vitroで存在する、CD4+CD8- T細胞由来のCD4-CD8αα+ T細胞;
[A12] in vitroで存在する、CD4+CD8- T細胞由来のCD4-CD8αα+ T細胞を含む細胞集団;
[A13] Runx3が発現している、[A11]のT細胞、又は、[A12]記載の細胞集団;
[A14] [A11]から[A13]のいずれかに記載のT細胞又は細胞集団を含む医薬組成物;
[A15] 自己免疫疾患、悪性腫瘍、又は、ウイルス感染症の予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療のための[A14]記載の医薬組成物;
[A16] CD4+CD8- T細胞からCD4-CD8αα+ T細胞への分化誘導を促進又は抑制する物質のスクリーニングにおける、[A1]から[A8]のいずれかに記載の分化誘導方法の使用;
[A17] CD4+CD8- T細胞からCD4-CD8αα+ T細胞へのin vivoでの分化誘導を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法であって、テスト物質の存在下で[A1]から[A8]のいずれかに記載の分化誘導方法を行うこと、及び、テスト物質の非存在下と比べてCD4-CD8αα+ T細胞の分化誘導の効率を促進又は抑制したテスト物質を候補物質として選択することを含む、スクリーニング方法;
[A18] [A1]から[A8]のいずれかに記載の分化誘導方法又は[A16]又は[A17]記載のスクリーニング方法を行うためのキットであって、CD4+CD8- T細胞、IL-2、TGF-β1、atRA、及びTCRを刺激する手段がコーティングされた培養プレートからなる群から選択される少なくとも1つを含むキット。
C57BL/6脾臓細胞よりナイーブCD4 T細胞を分離調製し、in vitroにてCD8ααT細胞を分化誘導した。ナイーブCD4 T細胞からCD4-CD8αα+ T細胞へのin vitro分化誘導条件は下記の条件であった。
ナイーブCD4+TCRαβ+ T細胞は、Magntic Activated Cell Sorting(MACS)法の適切なキットを用い、C57BL/6脾臓細胞より調製した。ナイーブCD4 T細胞(1 x 105 個/mL)を、抗CD28抗体(1μg/mL)、抗IFN-γ抗体(3μg/mL)、抗IL-4抗体(3μg/mL)、TGF-β(3 ng/mL)、IL-2(20 ng/mL)、atRA(10 nM-10μM)存在下で抗CD3抗体コーティングプレート(5μg/mL)を用いて7-9日間培養した。
ナイーブCD4 T細胞に換えて、ナイーブCD4 T細胞と同様に調製したCD8αβ+TCRαβ+ T細胞を用いた以外は図1aで採用した前記in vitro分化誘導条件と同様に誘導処理を行った。そのFACS解析(同上)の結果を図1bに示す。図1bに示す通り、CD8αβ+ T細胞を使用した場合には、CD8αα+ T細胞の発生は観察されなかった。
ヘルパーT細胞サブセットの分化にはインターロイキン(IL)が重要な役割をしている。そこで、IL2に換えて様々なILを採用した図1aで採用した前記in vitro分化誘導条件にてナイーブCD4 T細胞を刺激した。そのFACS解析(同上)の結果を図1cに示す。図1cに示すとおり、IL-2がCD8αα+ T細胞の発生に最も強力な効果を有していた。
CD8αα+ T細胞のin vitro分化誘導におけるTCRシグナル強度(抗CD3抗体濃度)及びatRA濃度と誘導効率を検討した。その結果を図1dに示す。図1dは、CD8αα+ T細胞のin vitro分化誘導効率は、TCRの刺激が強い(抗CD3抗体が多い)ほど、また、atRAの濃度が高いほど向上した。
in vitroで分化したCD4-CD8αα+ T細胞の遺伝子発現を確認した。ナイーブCD4 T細胞を図1aで採用した前記in vitro分化誘導条件で刺激し、様々な遺伝子の発現をFACS解析で評価した。その結果の一例を図2aに示す。図2aに示すとおり、CD8αα集団において、Granzyme A及びBの発現が増加する一方、Foxp3の発現が減少した。また、CD8αα集団において、CD122及びICOSLの細胞表面における発現が増加した。
腹腔内に100μgのNP-チキンガンマグロブリン(CGG)(in alum)を注入することで免疫した野生型C57BL/6マウスの脾臓からリンパ球を回収し、該脾臓にCD8αα+CD8αβ-CD4-TCRαβ T細胞の存在することを確認した。その結果図3に示す。図3に示すとおり、免疫後の脾臓内のCD8αα T細胞の割合は、未免疫の脾臓に比べて増加した。
C57BL/6脾臓細胞よりナイーブCD4 T細胞を分離調製し、RAG2欠損(Rag2-/-)マウス(リンパ球が出来ないマウス)に移植後、in vivoでCD8ααT細胞に再分化出来るか評価した。移植には、0.5-2.5 x 106個のナイーブCD4 T細胞(CD45.2)を使用した。ナイーブCD4 T細胞を移植して6カ月経過したRag2-/-マウス(CD45.1)のリンパ球のFACS解析を行った。その結果を図4に示す。移植後20日後ではCD8ααT細胞は検出できなかったが、移植後6カ月後においては、図4に示すとおり、CD8ααT細胞の発生が確認された。すなわち、in vitroの分化誘導と同様に、in vivoにおいてもナイーブCD4 T細胞からCD4-CD8αα+ T細胞への分化転換が起きることが確認された。
Runx3欠損マウスより調製したナイーブCD4 T細胞を用いて、CD4-CD8αα+ T細胞をin vitroで分化誘導できるかどうかを確認した。野生型又はRunx3-/-の胎仔肝臓(FL)由来のナイーブCD4 T細胞を図1aで採用した前記in vitro分化誘導条件で刺激した。誘導後の細胞集団をFACSで解析した。その結果を図5に示す。図5に示すとおり、Runx3-/-ナイーブCD4 T細胞は、CD4-CD8αα+ T細胞へのin vitro分化転換をすることはできなかった。
Runx3欠損マウスよりナイーブCD4 T細胞を分離調製し、RAG2欠損(Rag2-/-)マウス(リンパ球が出来ないマウス)に移植後、in vivoでCD4-CD8αα+ T細胞に分化転換できるか評価した。野生型又はRunx3-/-の胎仔肝臓(FL)由来の0.5-2.5 x 106個のナイーブCD4T細胞(CD45.2)をRag2-/-マウス(CD45.1)に移植した。大豆オイルに溶解した200μg/100μLのatRAを腹腔内に注入して免疫し、その6日後にリンパ球を回収してFACS解析を行った。脾臓、パイエル板(PP)、小腸及び大腸の上皮内リンパ球(IEL)、並びに、小腸及び大腸の固有層リンパ球(LPL)のリンパ球の結果を図6に示す。
C57BL/6脾臓細胞よりナイーブCD4 T細胞(CD45.2)を分離調製し、RAG2欠損(Rag2-/-)マウス(CD45.1)に上記と同様に移植後、大豆オイルに溶解した200μg/100μLのatRAを腹腔内に注入して免疫し、その免疫後の1、3、及び6日後にリンパ球(CD45.2)を回収してFACS解析を行った。その結果を図7a及びbに示す。図7aに示すとおり、脾臓では、1、3、及び6日後に約1%のCD8ααT細胞が検出された。この値は、通常の免疫時の値である。図7bに示すとおり、6日後のパイエル板、IEL、LPLには、1及び3日後に比べて著しく大きなCD4-CD8αα+ T細胞集団が確認された。これらの結果は、ナイーブCD4 T細胞からCD4-CD8αα+ T細胞への分化転換が免疫応答の部位で起こり、新たに発生したCD4-CD8αα+ T細胞が腸へ移動していること示唆する。
多発性硬化症マウス疾患モデル(実験的自己免疫性脳炎(EAE))にて、Runx3欠損マウスと野生型マウスを比較した。EAEは、CD8T細胞が病態の抑制に重要であることが知られている。したがって、この自己免疫疾患モデルは、CD4-CD8αα+ T細胞の制御性T細胞としての機能を調べるために適している。
Claims (12)
- CD4+CD8- T細胞をIL-2、TGF-β1、及びatRAが存在する条件下でin vitro培養することを含む、CD4+CD8- T細胞からCD4-CD8αα+ T細胞を分化誘導する方法。
- 前記CD4+CD8- T細胞が、ナイーブCD4 T細胞である、請求項1記載の分化誘導方法。
- 前記CD4+CD8- T細胞として、抗原特異的CD4+CD8- T細胞又は抗原特異的CD4+CD8- T細胞を増殖させた細胞集団を使用する、請求項1記載の分化誘導方法。
- 前記培養が、TCRを刺激する手段がコーティングされた培養プレート上で行われる、請求項1から3のいずれかに記載の分化誘導方法。
- 前記培養が、6日以上である、請求項1から4のいずれかに記載の分化誘導方法。
- 培養開始時のCD4+CD8- T細胞の数が、5.0 x 105個/mL以下である、請求項1から5のいずれかに記載の分化誘導方法。
- 培養開始時のatRAの濃度が、1μMを超える、請求項1から6のいずれかに記載の分化誘導方法。
- 前記培養が、さらに、抗CD28抗体、抗IFN-γ抗体、及び抗IL-4抗体からなる群から選択される一種類、二種類、又は三種類の抗体が存在する条件下で行われる、請求項1から7のいずれかに記載の分化誘導方法。
- 請求項1から8のいずれかに記載の分化誘導方法を行うことを含む、CD4-CD8αα+ T細胞の製造方法。
- CD4+CD8- T細胞からCD4-CD8αα+ T細胞への分化誘導を促進又は抑制する物質のスクリーニングにおける、請求項1から8のいずれかに記載の分化誘導方法の使用。
- CD4+CD8- T細胞からCD4-CD8αα+ T細胞へのin vivoでの分化誘導を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法であって、テスト物質の存在下で請求項1から8のいずれかに記載の分化誘導方法を行うこと、及び、テスト物質の非存在下と比べてCD4-CD8αα+ T細胞の分化誘導の効率を促進又は抑制したテスト物質を候補物質として選択することを含む、スクリーニング方法。
- 請求項1から8のいずれかに記載の分化誘導方法、請求項10に記載の分化誘導方法の使用又は請求項11に記載のスクリーニング方法を行うためのキットであって、CD4+CD8- T細胞、IL-2、TGF-β1、atRA、及びTCRを刺激する手段がコーティングされた培養プレートからなる群から選択される少なくとも1つを含むキット。
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