ES2305836T3 - Procedimiento de identificacion de linfocitos tr1 reguladores mediante la presencia y la sobreexpresion de moleculas especificas y sus aplicaciones. - Google Patents

Procedimiento de identificacion de linfocitos tr1 reguladores mediante la presencia y la sobreexpresion de moleculas especificas y sus aplicaciones. Download PDF

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Abstract

Procedimiento de identificación de linfocitos Tr1 reguladores presentes en una muestra biológica que comprende linfocitos, caracterizado porque comprende las etapas siguientes: a) determinar la presencia simultánea de los productos de expresión por dichos linfocitos de los genes que codifican para la molécula CD4 y el conjunto de las moléculas del grupo A, estando dicho grupo A constituido por las moléculas CD18 y/o CD11a, y CD49b; y b) identificar como linfocitos Tr1 reguladores los linfocitos que expresan simultáneamente los genes que codifican para la molécula CD4 y el conjunto de las moléculas del grupo A.

Description

Procedimiento de identificación de linfocitos Tr1 reguladores mediante la presencia y la sobreexpresión de moléculas específicas y sus aplicaciones.
La invención tiene por objeto un procedimiento de identificación de linfocitos Tr1 reguladores en una muestra biológica basándose en la determinación de la presencia simultánea del grupo de moléculas CD4, CD18 y/o CD11a, CD49b y, llegado el caso, mediante la puesta en evidencia de una sobreexpresión de los genes que codifican para las moléculas CD4, PSGL-1, PECAM-1 y alfaV/beta3. La invención tiene igualmente por objeto un procedimiento de cuantificación y un procedimiento de pronóstico o de diagnóstico de enfermedades autoinmunitarias o inflamatorias basándose en dicho procedimiento de identificación. La invención tiene igualmente por objeto un procedimiento de enriquecimiento en linfocitos Tr1 reguladores basándose en la determinación de la presencia simultánea de estas moléculas. La invención tiene finalmente por objeto el uso de una composición enriquecida según dicho procedimiento de enriquecimiento para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria, especialmente la enfermedad de Crohn.
La tolerancia inmunitaria se obtiene mediante diferentes mecanismos que permiten al sistema distinguir lo propio de lo que no es propio. Además, el sistema inmunitario se expone a estimulaciones repetidas de antígenos no patógenos. Con el fin de evitar activaciones celulares e inflamaciones crónicas no deseadas, el sistema inmunitario presenta mecanismos que colaboran en el mantenimiento de una tolerancia que hace participar células T anérgicas (Blackman et al., 1990, Nature 345, 540-542; Jones et al, 1990b, J Exp Med 172, 1277-1285), la inactivación de las células T por apoptosis (Jones et al, 1990a, Science 250, 1726-1729; Webb et al, 1990, Cell 63, 1249-1256), y una supresión inmunitaria activa (Rocken et al, 1996, Immunol Rev 149, 175-194; Weiner et al, 1997, Annu Rev Med 48, 341-351). La supresión inmunitaria activa está mediada por células T especializadas cuya función es suprimir la proliferación y la activación de las células T efectoras. Estudios recientes han demostrado que células reguladoras denominadas Tr1 forman parte de las células T CD4+ (Chen et al, 1994, Science 265, 1237-1240; Groux et al., 1997, Nature 389, 737-742; Mc Guirck et al, 2002, J Exp Med 195, 221-231; Powrie et al, 1994, J Exp Med 179, 589-600), y que su función depende de la presencia de IL-10 (Asseman et al, 1999, J Exp Med 190, 995-1004; Barrat et al, 2002 J Exp Med 195, 603-616; Groux at al, 1997) y de TGF-\beta (Groux et al, 1997; Kitani et al, 2000, J Immunol 165,
691-702).
Entre los linfocitos T CD4+, igualmente denominados linfocitos T auxiliares ("T helpers"), se distinguen normalmente 2 tipos principales de linfocitos T auxiliares: los linfocitos Th1, implicados en el desarrollo de la respuesta inmunitaria celular, producen citocinas proinflamatorias tales como la interleucina-2 (IL-2) y el interferón gamma (IFN\gamma) y presentan efectos activadores de los macrófagos; los linfocitos Th2, que producen citocinas tales como las interleucinas IL-4, IL-6, IL-10 y IL-13, favorecen la secreción de anticuerpos.
En el timo, la tolerancia central es un mecanismo bien establecido que implica una deleción de las células T autorreactivas tras la interacción con células dendríticas (DC) derivadas de la médula ósea.
No obstante, todavía falta definir los mecanismos por los cuales las células Tr se forman in vivo y ejercen sus efectos inmunorreguladores y son objeto de intensas investigaciones.
En particular, ciertas enfermedades autoinmunitarias y/o inflamatorias hacen intervenir células Tr1.
Las enfermedades autoinmunitarias se deben a una desregulación del sistema inmunitario, que se traduce por una respuesta inmunitaria indeseable de un organismo frente a sus propios antígenos. Se ha intentado manipular los antígenos causantes de estas patologías o las células T agresivas específicas de estos antígenos, pero los resultados obtenidos han sido a menudo muy limitados especialmente por la ausencia de un conocimiento de todos los antígenos implicados en la patología en cuestión. De hecho, no siempre se conocen los autoantígenos propiamente dichos, o los antígenos responsables de los trastornos inflamatorios o autoinmunitarios, o son diferentes de un individuo a otro (parte de la herencia genética).
Los tratamientos utilizados actualmente en estas enfermedades son o bien tratamientos paliativos (insulina en el caso de la diabetes, antihistamínicos en el caso de trastornos alérgicos) o bien tratamientos sistémicos con antiinflamatorios (AINS) y/o inmunosupresores (glucocorticoides, ciclosporina, anticuerpos...). Existe por tanto claramente una necesidad de un tratamiento inmunosupresor potente pero limitado al órgano afectado o más precisamente a la zona de hiperactividad del sistema inmunitario.
Las células Tr1, cuando vuelven a estimularse por el antígeno utilizado para su inducción, sólo proliferan débilmente, producen cantidades muy elevadas de IL-10, cantidades muy bajas de IL-2, y no producen de IL-4. Cuando las células Tr1 activadas se cultivan en presencia de otras células T CD4+ suprimen la proliferación de las mismas en respuesta a un antígeno; este efecto resulta de la secreción de citocinas, y especialmente de IL-10, por los linfocitos Tr, y no de una acción directa de los mismos sobre las células T CD4+; por tanto puede obtenerse sin necesidad de conocer el antígeno responsable de la proliferación de estas células. Esto presenta una ventaja importante en el caso de enfermedades autoinmunitarias, para las que puede concebirse por tanto el tratamiento sin que sea necesario conocer el antígeno exacto contra el que se dirigen las células patógenas.
Por tanto se ha observado, en un modelo experimental de enfermedad de Crohn en un ratón en el que las células proinflamatorias se dirigen contra bacterias comensales de la flora digestiva, que la administración a los animales de las células Tr1 dirigidas contra la ovoalbúmina, acompañada de la administración de ovoalbúmina en la alimentación, permitía prevenir el establecimiento de una inflamación crónica del colon (Groux et al, 1997, Nature 389, 737-742).
Por otra parte, en trabajos sobre diferentes modelos animales de enfermedad de Crohn, de esclerosis en placas, o de reacción de injerto contra el huésped, los inventores han demostrado que las células inhibidoras Tr1 no solamente podían prevenir, sino también curar estas diferentes patologías (Foussat et al. Submitted, Barrat et al. J. Exp. Med. 2002, 4, 603). El documento MOTTET et al. (Journal of Immunology, vol. 170, n° 8, 15 de abril de 2003, páginas 3939-3943) se refiere al estudio de la capacidad de las células TCD4+CD25+ reguladoras, conocidas por su papel en la prevención de patologías inmunitarias mediadas por células T, para mejorar una inflamación establecida. El estudio demuestra que las células T CD4+CD25+ pueden tratar una inflamación intestinal y sugiere que tales células CD4+CD25+ pueden ser beneficiosas en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas.
Por tanto las células Tr1 obtenidas a partir de las células T de un paciente pueden usarse potencialmente en el marco de una terapia celular para regular la respuesta inmunitaria en este paciente. Por tanto pueden usarse especialmente para prevenir o curar, no solamente las enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias mencionadas anteriormente, sino igualmente cualquier otra patología caracterizada por una respuesta inflamatoria aberrante, tal como la diabetes, la psoriasis, la aterosclerosis, la poliartritis reumatoide o el asma; pueden usarse igualmente en el tratamiento de los rechazos de injerto o de la reacción de injerto contra huésped.
Por tanto, entre las enfermedades autoinmunitarias en las cuales pueden utilizarse las células Tr1, se citan las enfermedades seleccionadas del grupo constituido por la hepatitis activa crónica, la enfermedad de Addison, el síndrome de antifosfolipido, la alergia atópica, la gastritis atrófica autoinmunitaria, la aclorhidria autoinmunitaria, la enfermedad celíaca, la enfermedad de Crohn, el síndrome de Cushings, la dermatomiositis, la diabetes tipo I, el lupus discoide, la eritematosis, el síndrome de Goodpasture, la enfermedad de Grave, la tiroiditis de Hashimoto, la atrofia adrenal idiopática, la diabetes insulinodependiente, el síndrome de Lambert-Eaton, la hepatitis lupoide, ciertos casos de linfopenia, la esclerosis en placas, el pénfigo vulgar o foliáceo, el penfigoide bulloso, la anemia perniciosa, la uveitis facogénica, la poliartritis, la cirrosis biliar primaria, la colangitis esclerosante primaria, la psoriasis, el síndrome de Reiter, la policondritis, la artritis reumatoide, el síndrome de Schmidt, la esclerodermia, el síndrome de Sjogren, el lupus eritematoso sistémico, la arteritis de Takayasu, la arteritis temporal, la tirotoxicosis, la resistencia a la insulina tipo B, la colitis ulcerosa, la granulomatosis de Wegener, la miastenia grave, la enfermedad de Guillain-Barré, la ureitis autoinmunitaria, la anemia autoinmunitaria hemolítica, la trombocitopenia autoinmunitaria, la ooforitis autoinmunitaria, la enfermedad de Behcet, la dermatitis herpetiforme, la polimiositis, la dermatomiositis, las espondiloartropatías tales como la espondilitis anquilosante, el vitíligo.
Una de las dificultades en el uso de los linfocitos Tr1 reguladores es poder identificarlos de manera simplificada y segura a partir de una población linfocítica. Las técnicas actuales de identificación de los linfocitos Tr1 reguladores consisten en estudiar el perfil de producción de los citocinas por una población de linfocitos susceptible de comprender linfocitos Tr1 reguladores. Especialmente, Groux et al. (Nature, 389, 737-742, 1997) describen que esta población de linfocitos produce cantidades muy elevadas de interleucina 10 (IL-10), cantidades importantes de TGF-\beta ("tumor growth factor \beta" - factor de crecimiento tumoral \beta), cantidades muy bajas de interleucina 2 (IL-2) y no producen interleucina 4 (IL-4). El experto en la técnica puede confirmar la presencia de linfocitos Tr1 reguladores en una población linfocítica estudiando la respuesta proliferativa de los linfocitos T CD4+ presentes en dicha población: cuando los linfocitos Tr1 reguladores se cultivan en presencia de linfocitos T CD4+, suprimen la proliferación de los mismos en respuesta a un antígeno (Groux et al., Nature, 389, 737-742, 1997). Estas técnicas de identificación presentan el inconveniente de ser largas y laboriosas.
Por tanto, actualmente existe una necesidad de disponer de una técnica rápida y eficaz para identificar la presencia o la ausencia de linfocitos Tr1 reguladores a partir de una muestra que contiene una población linfocítica. Un procedimiento de este tipo podría ser igualmente ventajoso ya que permitiría enriquecer una población linfocítica en linfocitos Tr1 reguladores.
Éste es precisamente el objeto de la presente invención.
La invención tiene por tanto por objeto un procedimiento de identificación de linfocitos Tr1 reguladores presentes en una muestra biológica que comprende linfocitos, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
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a) determinar la presencia simultánea de los productos de expresión por dichos linfocitos de los genes que codifican para la molécula CD4 y el conjunto de las moléculas del grupo A, estando dicho grupo A constituido por las moléculas CD18 y/o CD11a, y CD49b; y
b) identificar como linfocitos Tr1 reguladores los linfocitos que expresan simultáneamente los genes que codifican para la molécula CD4 y el conjunto de las moléculas del grupo A.
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Por grupo A constituido por las moléculas CD18 y/o CD11a, y CD49b, se entiende designar el grupo A constituido por:
- o bien las moléculas CD18 y CD49b;
- o bien las moléculas CD11a y CD49b;
- o bien las moléculas CD18, CD11a y CD49b.
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Entre las muestras biológicas que comprenden linfocitos en las que se pretende identificar la presencia de linfocitos Tr1 reguladores, se prefieren las muestras biológicas procedentes de sangre periférica extraída de un sujeto, las muestras biológicas procedentes de un procedimiento de preparación in vitro de linfocitos Tr1 reguladores a partir de una población de células, especialmente de linfocitos, llegado el caso procedentes de una extracción de un sujeto, o incluso procedentes de células progenitoras.
El procedimiento de identificación de linfocitos Tr1 reguladores según la presente invención puede realizarse sobre cualquier muestra biológica que comprende una población de linfocitos de la que se pretende determinar si contiene linfocitos Tr1 reguladores.
El sujeto del que se realiza la extracción de la muestra biológica puede ser cualquier mamífero, especialmente el ratón, preferiblemente el ser humano. Preferiblemente, este sujeto puede o bien estar sano, o bien padecer una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria. La expresión "sujeto sano" según la invención comprende cualquier sujeto, preferiblemente el ser humano, que no padece una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria. Anteriormente se proporcionó una lista de enfermedades autoinmunitarias; las enfermedades inflamatorias son enfermedades en las que se observa una infiltración de células mononucleares, una proliferación de fibroblastos y de nuevos vasos sanguíneos, que conducen a un aumento de los tejidos conjuntivos, y una destrucción tisular. Se observan especialmente las enfermedades inflamatorias crónicas del intestino.
La muestra biológica puede proceder igualmente de procedimientos de preparación in vitro de linfocitos Tr1 reguladores, conociéndose bien estos procedimientos por el experto en la técnica. Entre estos procedimientos de preparación, puede citarse por ejemplo el procedimiento descrito en la publicación de un inventor (Groux et al., Nature, 389, 737-742, 1997), que consiste en estimular de manera repetida células T CD4+ con el antígeno en presencia de IL-10. Igualmente puede citarse el procedimiento de preparación in vitro de linfocitos Tr1 reguladores descrito en la solicitud de patente internacional de un inventor publicada el 21 de noviembre 2002 con el número WO 02/092793: este procedimiento consiste en cultivar linfocitos T CD4+ en presencia de células presentadoras de antígeno artificiales que expresan una molécula de HLA de clase II y la molécula LFA-3 (CD58) humana, pero no expresan ninguna de las moléculas coestimuladoras B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), B7-H1, CD40, CD23 e ICAM-1 (CD54). Otro procedimiento de preparación in vitro de linfocitos Tr1 reguladores se facilita en el ejemplo 5 a continuación, procedimiento que consiste en obtener in vitro una población de células dendríticas humanas a partir de células progenitoras humanas, células dendríticas que pueden inducir la diferenciación de linfocitos T humanos en linfocitos Tr1 reguladores.
Por producto de expresión de un gen que codifica para una molécula en el procedimiento de identificación de linfocitos Tr1 reguladores según la presente invención, se entiende designar, para cada una de estas moléculas, el producto de expresión del gen que codifica para dicha molécula, pudiendo ser éste o bien el producto de traducción de dicho gen, es decir el péptido codificado por dicho gen, o incluso el producto de transcripción de dicho gen, es decir el ARNm que codifica para dicha molécula. Preferiblemente, el producto de expresión es dicha molécula expresada en la superficie de dichos linfocitos o uno de sus fragmentos representativos, es decir un fragmento de dicha molécula cuya presencia en la superficie de los linfocitos permite determinar la expresión de esta molécula en la superficie de los linfocitos (fenotipo "+" para dicha molécula).
De hecho los inventores han puesto en evidencia que los linfocitos Tr1 reguladores pueden identificarse determinando la presencia simultánea del producto de expresión por dichos linfocitos del gen que codifica para la molécula CD4 y de los genes que codifican para las moléculas del grupo A (véanse los ejemplos 2 y 3).
Las moléculas CD11a y CD18 están asociadas a la superficie de los linfocitos para formar la \beta2-integrina dimérica CD 11a/CD 18, que lleva igualmente el nombre de LFA-1 por "Lymphocytes Function Associated Antigen-1" (antígeno 1 asociado a la función de linfocitos). La presencia de esta \beta2-integrina podrá identificarse por tanto determinando la presencia o bien del producto de expresión por dichos linfocitos del gen que codifica para la molécula CD11a, o bien del producto de expresión del gen que codifica para la molécula CD 18, o bien simultáneamente de estos dos productos de expresión.
Los inventores han puesto en evidencia además que los linfocitos Tr1 reguladores pueden identificarse igualmente independientemente del procedimiento de identificación anterior por la sobreexpresión de al menos 1, preferiblemente de al menos 2, 3, 4 o de todos los genes que codifican para las moléculas CD11a, CD18, PSGL-1, PECAM-1 y/o alfaV/beta 3, mediante comparación con la expresión por de los linfocitos que se sabe que son de tipo Th1 o Th2, especialmente de los linfocitos Th1 o Th2 procedentes de clones (véase el ejemplo 4).
La molécula PSGL-1, o "P-selectin glycoprotein-ligand-1" (ligando principal de tipo glicoproteina para la P-selectina) es una molécula de adhesión celular (CAM por "Cell Adhesion Molecule") perteneciente a la familia de las selectinas.
La molécula PECAM-1 o "Platelet-Endothelial Cell D Adhesion Molecule-1" (molécula de adhesión celular del endotelio y de las plaquetas) igualmente denominada molécula CD31, es una molécula CAM perteneciente a la familia de las moléculas Ig-like.
La molécula alfaV/beta3 igualmente denominada molécula CD51/CD61, o VNR por "vitronectin receptor" (receptor de la vitronectina), es una molécula CAM perteneciente a la subfamilia de las \beta_{3}-integrinas.
Según un modo de realización particular de la invención, el procedimiento de identificación de linfocitos Tr1 reguladores anterior basado en la expresión de las moléculas del grupo A se caracteriza porque:
- en la etapa (a) se compara además la expresión por dichos linfocitos de al menos un gen seleccionado de los genes que codifican para las moléculas del grupo B siguiente: CD11a, CD18, PSGL-1, PECAM-1 y alfaV/beta 3, comparándose dicha expresión con la expresión de dicho mismo gen por linfocitos de tipo Th1 o Th2; y
- porque en la etapa (b) se identifican como linfocitos Tr1 reguladores los linfocitos que sobreexpresan al menos uno de dichos genes que codifican para las moléculas del grupo B.
Por linfocitos que sobreexpresan al menos uno de los genes que codifican para las moléculas del grupo B se entiende denominar linfocitos cuya expresión de al menos uno de dichos genes es significativamente más importante que la expresión de estas mismas moléculas por los linfocitos de tipo Th1 o Th2; preferiblemente, dicha sobreexpresión por los linfocitos Tr1 reguladores con respecto a la obtenida por los linfocitos Th1 o Th2 es al menos 2, 3, 4, 5, 7 ó 10 veces superior a la expresión en los linfocitos de tipo Th1 o Th2.
Preferiblemente, los linfocitos Th1 o Th2 son linfocitos Th1 o Th2 procedentes de clones habitualmente obtenidos en los sitios inflamatorios especialmente cutáneos que se diferencian in vitro en presencia de IL-4 para los Th2 o de IL-12 para los Th1.
Según otro modo de realización particular de la invención, el procedimiento de identificación de linfocitos Tr1 reguladores se caracteriza porque en la etapa (a) se compara la expresión de al menos dos de dichos genes del grupo B y porque en la etapa (b) se identifican como linfocitos Tr1 reguladores los linfocitos que sobreexpresan los dos dichos genes del grupo B.
Según aún otro modo de realización particular de la invención, el procedimiento de identificación de linfocitos Tr1 reguladores se caracteriza porque en la etapa (a) se compara la expresión de todos los genes del grupo B y porque en la etapa (b) se identifican como linfocitos Tr1 reguladores los linfocitos que sobreexpresan todos los genes del grupo B.
De manera preferida, el procedimiento de identificación según la invención se caracteriza porque en la etapa (a) se compara la expresión de al menos tres de dichos genes del grupo B y porque en la etapa (b) se identifican como linfocitos Tr1 reguladores los linfocitos que sobreexpresan los tres dichos genes del grupo B.
De manera aún preferida, el procedimiento de identificación según la invención se caracteriza porque en la etapa (a) se compara la expresión de al menos cuatro de dichos genes del grupo B y porque en la etapa (b) se identifican como linfocitos Tr1 reguladores los linfocitos que sobreexpresan los cuatro dichos genes del grupo B.
La invención puede tener igualmente por objeto un procedimiento de identificación de linfocitos Tr1 reguladores presentes en una muestra biológica que comprende linfocitos, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
a) comparar la expresión por dichos linfocitos de al menos un gen seleccionado de los genes que codifican para las moléculas del grupo B siguiente: CD11a, CD18, PSGL-1, PECAM-1 y alfaV/beta 3, comparándose dicha expresión con la expresión de dicho mismo gen por linfocitos de tipo Th1 o Th2; y
b) identificar como linfocitos Tr1 reguladores los linfocitos que sobreexpresan al menos uno de dichos genes que codifican para las moléculas del grupo B.
Además, los linfocitos Tr1 reguladores pueden identificarse igualmente por el procedimiento de identificación según la invención en el que se determina además la presencia del producto de expresión por dichos linfocitos del gen que codifica para la molécula CD3.
Por tanto, de manera aún preferida, la invención tiene por objeto un procedimiento de identificación según la invención caracterizado porque en la etapa (a) se determina además y simultáneamente la presencia del producto de expresión por dichos linfocitos del gen que codifica para la molécula CD3 y porque en la etapa (b) se identifican como linfocitos Tr1 reguladores los linfocitos que expresan además simultáneamente el gen que codifica para la molécula CD3.
Según el procedimiento según la invención, la identificación de las moléculas en la superficie de los linfocitos podrá realizarse mediante cualquier método apropiado que permita identificar específicamente la presencia simultánea de estas moléculas.
Entre estos métodos, se prefieren los métodos para los cuales la identificación de estas moléculas en la superficie de los linfocitos se realiza con ayuda de anticuerpos, policlonales, monoclonales o recombinantes, o sus fragmentos, o incluso de ligandos, que pueden reconocer específicamente estas moléculas, pudiendo, llegado el caso, marcarse estos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.
Preferiblemente, el procedimiento de identificación según la invención se caracteriza porque en la etapa (a) se determina la presencia simultánea de dichas moléculas del grupo A expresadas en la superficie de dichos linfocitos.
En un modo preferido de realización del procedimiento de identificación según la invención, caracterizado porque en la etapa (a) se determina la presencia simultánea de dichas moléculas expresadas en la superficie de dichos linfocitos por medio de anticuerpos específicos de dichas moléculas.
Entre los anticuerpos específicos de dichas moléculas que pueden utilizarse en el procedimiento de identificación según la invención, pueden citarse especialmente, pero sin limitarse a los mismos, los anticuerpos anti-CD4 humano o murino tales como los secretados por los clones RPA-T4 y H129-19 (Becton Dickinson, Le Pont de Claix - FR), los anticuerpos anti-CD18 humano o murino tales como los secretados por los clones 6.7, C71/16, y Game-46 (Becton Dickinson), los anticuerpos anti-CD11a murino tales como los secretados por el clon M17/4 (Biocompare, South San Fransisco - US), los anticuerpos anti-CD49b humano o murino tales como los secretados por los clones AK-7 y Hal/29 (Becton Dickinson), los anticuerpos anti-CD31 murino tales como los secretados por el clon MEC 13.3 (Becton Dickinson), y los anticuerpos anti-CD3 humano tales como los secretados por el clon UCHT-1 (Caltag, Burlingame, US).
Como ejemplos de ligandos naturales distintos de los anticuerpos que pueden reconocer estas moléculas, podrán citarse por ejemplo, pero sin limitarse a los mismo, para la molécula CD18 (LFA-1), los ligandos hu-soluble ICAM-1 (CD54), quimera hu-ICAM-1Fc, quimera hu-ICAM-2Fc (CD102), quimera hu-ICAM-3Fc (CD50), mu-ICAM-1 (CD54), quimera mu-ICAM-2Fc (CD102), quimera mu-ICAM-3Fc (CD50), quimera mu-ICAM-SFc (CD50), JAM-1, JAM-2, JAM-3; todos estos ligandos están disponibles en el mercado (especialmente R&D Systems, Minneapolis - US).
En un modo de realización particularmente preferido del procedimiento de identificación según la invención, la identificación de las moléculas de las que se pretende determinar la presencia simultánea en la superficie de los linfocitos presentes en dicha muestra biológica que va a someterse a prueba se realiza preferiblemente por inmunofluorescencia, o incluso por un método radioinmunológico o inmunoenzimático.
En general, para la preparación de anticuerpos policlonales, monoclonales, o sus fragmentos, o incluso recombinantes, podrá hacerse referencia a las técnicas bien conocidas por el experto en la técnica, técnicas que se describen particularmente en el manual "Antibodies" (Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications págs. 726, 1988) o a la técnica de preparación a partir de hibridoma descrita por Kohler et al. (Kôhler y Milstein. Nature, 256: 495-497, 1975). Pueden obtenerse anticuerpos específicos del procedimiento según la invención por ejemplo a partir de suero o de célula de un animal inmunizado específicamente contra estas moléculas.
Por fragmento de anticuerpos que puede reconocer específicamente estas moléculas, se entiende designar en particular los fragmentos de anticuerpos comprendiendo cualquier fragmento de dicho anticuerpo que puede fijarse específicamente sobre el epítopo de dicha molécula sobre la que se fija el anticuerpo del que procede dicho fragmento. Ejemplos de tales fragmentos incluyen particularmente anticuerpos de cadena sencilla (scFv) o fragmentos monovalentes Fab o Fab' y fragmentos divalentes tales como F(ab')2, que presentan la misma especificidad de fijación que el anticuerpo del que proceden. Estos fragmentos de anticuerpos pueden obtenerse a partir de los anticuerpos policlonales o monoclonales mediante métodos tales como la digestión por enzimas, tales como la pepsina o la papaína y/o mediante escisión de los puentes disulfuro por reducción química. De otra manera estos anticuerpos, o sus fragmentos, podrán obtenerse igualmente mediante recombinación (anticuerpos recombinantes).
Los anticuerpos o sus fragmentos, que pueden reconocer específicamente estas moléculas, pueden presentarse igualmente en forma de anticuerpos marcados con el fin de obtener una señal detectable directa o indirectamente y, preferiblemente, cuantificable.
Los anticuerpos marcados, o sus fragmentos, que pueden utilizarse en el procedimiento de identificación según la presente invención son por ejemplo y preferiblemente anticuerpos denominados inmunoconjugados que se conjugan con marcadores fluorescentes que incluyen especialmente la fluoresceína y sus derivados, tales como el isotiocianato de fluoresceína (FITC), o incluso la aloficocianina (APC), la ficoeritrina-cianina 5 (PC5) y la ficoeritrina (PE), el diacetato de fluoresceína fluorescente verde, la calceína AM, la tetrametilrodamina fluorescente roja o incluso la rodamina y sus derivados, la GFP (GFP por "Green Fluorescent Protein" - "proteína verde fluorescente"), el dansilo, la umbeliferona etc.
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Tales anticuerpos inmunoconjugados están disponibles en el mercado, especialmente el anticuerpo anti-CD4 conjugado con APC (RPA-T4, Beckton Dickinson), el anticuerpo anti-CD3 conjugado con PC5 (UCHT-1, Caltag, Burlingame, US), el anticuerpo anti-CD18 conjugado con PE (6.7, Beckton Dickinson) y el anticuerpo anti-CD49b conjugado con FITC (AK-7, Beckton Dickinson) en el ser humano, y el anticuerpo anti-CD4 de ratón conjugado con PC5 (H129-19, Beckton Dickinson), el anticuerpo anti-CD18 de ratón conjugado con PE (C71/16, Beckton Dickinson) y el anticuerpo anti-CD49b de ratón conjugado con FITC (Hal/29, Beckton Dickinson).
Los anticuerpos marcados, o sus fragmentos, que pueden utilizarse igualmente en el procedimiento de identificación según la presente invención incluyen igualmente anticuerpos inmunoconjugados conjugados con enzimas tales como la peroxidasa, la fosfatasa alcalina, la \beta-D-galactosidasa, la glucosa oxidasa, la glucosa amilasa, la anhidrasa carbónica, la acetil-colinesterasa, la lisozima, la malato deshidrogenasa o la glucosa-6 fosfato deshidrogenasa o por una molécula tal como la biotina, la digoxigenina o la 5-bromo-desoxiuridina.
En tales conjugados, los anticuerpos o sus fragmentos pueden prepararse mediante los métodos conocidos por el experto en la técnica. Pueden acoplarse a las enzimas o a los marcadores fluorescentes directamente o por medio de un grupo espaciador o de un grupo de unión tal como un polialdehído, tal como el glutaraldehído, el ácido etilendiaminatetraacético (EDTA), el ácido dietilentriaminapentaacético (DPTA), o en presencia de agentes de acoplamiento tales como el peryodato etc. Los conjugados que comprenden marcadores de tipo fluoresceína pueden prepararse mediante reacción con un isotiocianato.
Otros conjugados pueden incluir igualmente marcadores quimioluminiscentes tales como el luminol y los dioxetanos o marcadores bioluminiscentes tales como la luciferasa y la luciferina.
Entre los marcadores que pueden fijarse sobre estos anticuerpos o sobre sus fragmentos que pueden utilizarse en el procedimiento de identificación según la presente invención, pueden citarse igualmente los marcadores radiactivos tales como ^{14}C, ^{36}Cl, ^{57}Co, ^{58}Co, ^{51}Cr, ^{152}Eu, ^{59}Fe, ^{3}H, ^{125}I, ^{131}I, ^{32}P, ^{35}S, ^{75}SE y ^{99m}Tc que pueden detectarse mediante medios conocidos tales como el contador gamma o mediante centelleo, mediante autorradiografía, etc.
Puede ponerse en práctica cualquier método clásico que depende de la formación de un complejo inmunitario anticuerpo-molécula (antígeno) para realizar una identificación de este tipo. Dicho método, si es de tipo radioinmunológico o inmunoenzimático, puede ser un método por competición o de tipo sándwich, o cualquier método conocido por el experto en la técnica.
En un modo de realización particularmente preferido, la etapa (a) de determinación del procedimiento de identificación según la presente invención se realiza con ayuda de anticuerpos marcados con marcadores fluorescentes. Aún preferiblemente, cada uno de dichos anticuerpos o fragmento de anticuerpo específico de una molécula cuya presencia quiere determinarse, estará marcado con un marcador diferente para cada una de las especificidades. De manera aún más preferida, dicho método de identificación permite igualmente cuantificar en la muestra biológica que va a someterse a prueba el número o la proporción de linfocitos que presentan simultáneamente moléculas de las que se pretende identificar la presencia, tales como por ejemplo, pero sin limitarse a los mismos, el método de identificación y de cuantificación utilizado en los ejemplos 2, 3 y 4 a continuación.
Según un modo particular de realización de la invención, el procedimiento se caracteriza porque dichos marcadores son fluorescentes y se seleccionan del grupo constituido por el isotiocianato de fluoresceína (FITC), la aloficocianina (APC), la ficoeritrina-cianina 5 (PC5), la ficoeritrina (PE), el diacetato de fluoresceína fluorescente verde, la calceína AM, y la tetrametilrodamina fluorescente roja.
Entre los procedimientos de identificación que pueden utilizarse, existe la técnica FACS ("fluorescence-activated cell sorter" - separador celular activado por fluorescencia), que consiste en un sistema electrónico para separar las células según su tamaño y la intensidad de la fluorescencia que emiten tras diversos marcajes. El aparato prepara microgotas de la suspensión celular que se diluyen de manera que sólo contienen una única célula. La microgota pasa por delante de un haz luminoso de rayo láser y se analizan las células (histograma) y se separan basándose en su fluorescencia y/o en su tamaño.
En un modo preferido de realización, el procedimiento de identificación según la invención se caracteriza porque en la etapa (a) la determinación de la presencia simultánea de dichas moléculas del grupo A expresadas en la superficie de dichos linfocitos se pone en práctica mediante citometria de flujo.
Por citometria de flujo se entiende cualquier técnica que permite el recuento y la medición de células, especialmente la técnica FACS tal como se describió anteriormente.
Cuando la etapa (a) de determinación del procedimiento de identificación según la presente invención se realiza con ayuda de inmunoconjugados fluorescentes (tales como anticuerpos fluorescentes), se prefiere un procedimiento de identificación según la invención en el que, en la etapa (a) de dicho procedimiento, se determina que la molécula CD18 está presente en la superficie de dichos linfocitos cuando el nivel de intensidad de fluorescencia obtenido para esta molécula corresponde al obtenido para esta misma molécula en la superficie de las células monociticas ("CD18bright").
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Según un modo preferido de realización, el procedimiento de identificación según la invención se caracteriza porque en la etapa (a) de dicho procedimiento se determina, para la molécula CD18, la presencia de una intensidad de fluorescencia de tipo CD18bright.
Por tanto, por ejemplo, se entiende por fenotipo "CD3+ CD4+ CD18bright" para linfocitos T humanos designar linfocitos que expresan moléculas o antígenos CD3, CD4 y CD18 en la superficie celular, siendo la intensidad de fluorescencia del marcaje de la molécula CD18 igual a la intensidad de fluorescencia de este mismo marcaje encontrado en las células monocíticas (véase la figura 15).
La comparación de la expresión por dichos linfocitos de los genes que codifican para las moléculas del grupo B puede realizarse mediante comparación de la cantidad de ARNm expresada para dichos genes.
Una comparación de este tipo de la expresión de ARNm puede realizarse utilizando la técnica de amplificación en cadena de la polimerasa precedida por una etapa de transcripción inversa (RT-PCR).
Según un modo de realización, el procedimiento de identificación según la presente invención se caracteriza porque:
- en la etapa (a) la comparación de la expresión por dichos linfocitos de al menos un gen que codifica para las moléculas del grupo B se realiza mediante comparación de la cantidad de ARNm expresado para dicho gen; y
- porque en la etapa (b) se identifican como linfocitos Tr1 reguladores los linfocitos que sobreexpresan el ARNm de dicho gen.
Según otro modo de realización, el procedimiento de identificación según la presente invención se caracteriza porque se mide la cantidad de ARNm mediante RT-PCR cuantitativa.
Según otro modo preferido de realización, el procedimiento de identificación según la invención se caracteriza porque la muestra biológica procede de una extracción de sangre periférica o de un órgano inflamatorio en un sujeto.
Preferiblemente, la extracción de dicha muestra biológica en el procedimiento según la invención se realiza en un sujeto que padece o susceptible de padecer una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria.
De manera aún más preferida, dicho sujeto padece la enfermedad de Crohn o de la esclerosis en placas.
En otro modo de realización, el procedimiento de identificación de linfocitos Tr1 reguladores según la invención se caracteriza porque la muestra biológica procede de un procedimiento de preparación in vitro de linfocitos Tr1 reguladores a partir de una población de linfocitos procedentes de una extracción en un sujeto.
Preferiblemente, dicho procedimiento de preparación in vitro de linfocitos Tr1 reguladores a partir de la población de linfocitos comprende al menos una etapa de activación de linfocitos T CD4+ de dicha población de linfocitos en presencia de un antígeno y de interleucina 10.
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Igualmente, dicho procedimiento de preparación in vitro de linfocitos Tr1 reguladores comprende las etapas siguientes:
a) obtener una muestra biológica que contiene células presentadoras de antígeno artificiales que expresan una molécula del sistema HLA de clase II y una molécula de LFA-3 humana y que no expresan ninguna de las moléculas de coestimulación B7-1, B7-2, B7-H1, CD40, CD23 o ICAM-1;
b) activar in vitro los linfocitos T CD4+ de dicha población de linfocitos en presencia del antígeno seleccionado, presentado por las células presentadoras de antígeno artificiales obtenidas en (a); y
c) recuperar, a partir de dichos linfocitos, una población de linfocitos CD4+ activados que comprende al menos el 10% de linfocitos Tr1 específicos del antígeno seleccionado.
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De manera aún preferida, dicho procedimiento de preparación in vitro de linfocitos Tr1 reguladores comprende las etapas siguientes:
a) obtener in vitro una población de células progenitoras humanas que pueden diferenciarse en células dendríticas;
b) cultivar dichas células progenitoras humanas en presencia de IL-10 para obtener una población de dichas células dendríticas; y
c) colocar dicha población de linfocitos humanos en presencia de la población de células dendríticas obtenidas en (b).
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En un ejemplo a continuación (ejemplo 5) se proporciona un procedimiento de preparación de este tipo.
En otro modo de realización, el procedimiento de identificación según la invención se caracteriza porque los productos de expresión por dichos linfocitos de los genes que codifican para las moléculas del grupo A son ARNm, y porque en la etapa (a) la determinación de la presencia simultánea de dichos ARNm se realiza mediante RT-PCR.
Un procedimiento de identificación según la invención mediante el cual se determina la presencia simultánea de los ARNm puede ser por ejemplo la técnica de amplificación en cadena de la polimerasa precedida por una etapa de transcripción inversa (RT-PCR).
En otro aspecto, la invención tiene igualmente por objeto un procedimiento de cuantificación de linfocitos Tr1 reguladores presentes en una muestra biológica que comprende linfocitos, caracterizado porque comprende las etapas que consisten en:
a) identificar los linfocitos Tr1 reguladores mediante un procedimiento de identificación según la invención; y
b) determinar la proporción de los linfocitos Tr1 reguladores identificados en (a) con respecto a la cantidad total de los linfocitos o de una fracción particular de los linfocitos, presentes en dicha muestra biológica.
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Un procedimiento de cuantificación de este tipo puede realizarse por ejemplo por medio de la citometría de flujo tal como se describió anteriormente.
La invención tiene igualmente por objeto un procedimiento de pronóstico o de diagnóstico in vitro de una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria en un sujeto a partir de una muestra biológica previamente extraída de dicho sujeto, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
a) determinar la proporción de linfocitos Tr1 reguladores presentes en dicha muestra biológica con respecto a la cantidad total de los linfocitos, o de una fracción particular de los linfocitos, según el procedimiento de cuantificación según la invención, o según cualquier procedimiento que permite la cuantificación de dichos linfocitos Tr1 reguladores; y
b) comparar la proporción de dichos linfocitos Tr1 reguladores obtenida en la etapa (a) con respecto a la presente en una muestra biológica extraída de un sujeto sano.
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En el procedimiento de pronóstico o de diagnóstico anterior, en la etapa (a), se entiende designar mediante cualquier procedimiento que permite la cuantificación de dichos linfocitos Tr1 reguladores un procedimiento tal que especialmente evaluando la proporción de linfocitos que tienen un perfil de producción de citocinas y/o que pueden disminuir la proliferación de las células T CD4+ tal como se describe en "Groux et al., 1997" y en el documento de patente publicado con el número WO 02/092793.
En un modo de realización preferido, el procedimiento de pronóstico o de diagnóstico in vitro de una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria según la invención se caracteriza porque en la etapa (b) de dicho procedimiento se observa una disminución de dicha proporción en el sujeto que va a someterse a prueba.
En efecto, ha podido observarse que pacientes que padecen una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria presentan una disminución de la proporción de linfocitos Tr1 reguladores con respecto a la presente en un sujeto sano, es decir que no padece dicha enfermedad.
El procedimiento de pronóstico o de diagnóstico in vitro de una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria presenta la ventaja principal de ser rápido y eficaz, y de poder realizarse por ejemplo a partir de una extracción de sangre realizada en un sujeto que padece o susceptible de padecer dicha enfermedad. Por tanto, pueden evitarse los métodos invasivos o que necesitan una hospitalización.
La invención tiene aún por objeto un procedimiento de enriquecimiento en linfocitos Tr1 reguladores presentes en una muestra biológica que comprende linfocitos, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
a) identificar los linfocitos Tr1 reguladores mediante el procedimiento de identificación según la invención; y
b) eliminar de dicha muestra una parte significativa de los linfocitos que no presentan simultáneamente dichas moléculas.
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Entre los procedimientos que pueden ponerse en práctica en el procedimiento de enriquecimiento según la presente invención, se prefiere un procedimiento que pone en práctica un clasificador de células basándose en el reconocimiento simultáneo de dichas moléculas, tal como especialmente un citómetro de flujo que puede clasificar y separar todas las células que presentan simultáneamente las moléculas cuya presencia se pretende determinar en su superficie.
No obstante, el procedimiento de enriquecimiento según la invención puede ponerse en práctica igualmente de otro modo distinto a mediante citometría de flujo. En efecto, el enriquecimiento de los linfocitos Tr1, especialmente por ejemplo los linfocitos Tr1 identificados según el procedimiento de identificación de la invención mediante la expresión en su superficie de las moléculas CD3, CD4, CD18 y CD49b (CD3+CD4+CD18brightCD49b+) a partir de una población linfocítica puede realizarse con ayuda de bolas magnéticas siguiendo dos etapas: la primera etapa permitirá reducir de la población total con ayuda de bolas magnéticas adsorbidas por un anticuerpo anti-Ig de ratón las células marcadas por los anticuerpos de ratón anti-CD8, anti-CD14, anti-CD56 y anti-CD19 humano. En efecto, las células Tr1 no expresan las moléculas CD8, CD14, CD56 y CD19 humanas. La segunda etapa es una selección positiva de las células que expresan CD49b (CD49b+) mediante un marcaje de las células enriquecidas por un anticuerpo de ratón anti-CD49b humano y selección positiva de las células marcadas mediante bolas magnéticas adsorbidas por un anticuerpo anti-Ig de ratón. Los métodos de separación celulares mediante bolas magnéticas y citometría de flujo pueden complementarse para la purificación de linfocitos Tr1, por ejemplo los identificados mediante la expresión CD3+CD4+CD18brightCD49b+. Por ejemplo mediante una selección positiva mediante bolas magnéticas de las células que expresan CD4 (CD4+) y después la detección en citometría de flujo de las moléculas CD3, CD18 y CD49b o bien selección positiva mediante bolas magnéticas de las células que expresan (CD3+) y después la detección en citometria de flujo de las moléculas CD4, CD18 y CD49b o bien incluso la selección positiva mediante bolas magnéticas de las células que expresan (CD49b+) y después la detección en citometría de flujo de las moléculas CD3, CD18 y CD49b. Un procedimiento de este tipo puede aplicarse igualmente a la detección de las otras moléculas del procedimiento de identificación según la invención (CD11a, PSGL-1, PECAM-1, alfaV/beta3,...).
La patente describe el uso de una población enriquecida en linfocitos Tr1 reguladores mediante un procedimiento de enriquecimiento según la invención para la fabricación de un medicamento destinado a prevenir y/o a tratar una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria tales como las citadas anteriormente.
Preferiblemente, dicho uso se caracteriza porque los linfocitos Tr1 reguladores se administran a nivel de una zona de inflamación.
En la presente solicitud, por zona de inflamación o inflamada se define una zona que presenta una acumulación de fluidos, de proteínas de plasma, de células inmunitarias, de sustancias tales como proteínas, acumulación que se debe a una lesión local, una infección, o una lesión inmunitaria local. La inflamación podrá ser episódica o crónica.
De manera aún más preferida, dicho uso se caracteriza porque los linfocitos Tr1 reguladores se administran con un antígeno que puede activar in vivo dichos linfocitos.
Por tanto, los linfocitos Tr1 reguladores presentes a nivel de la zona de inflamación podrán activarse in vivo por dicho antígeno.
Pueden administrarse los linfocitos Tr1 reguladores previamente activados in vitro o in vivo.
Finalmente, la patente también describe un método de tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria que comprende la etapa de administración a un paciente de una población enriquecida en linfocitos Tr1 reguladores mediante un procedimiento de enriquecimiento según la invención.
Las leyendas de las figuras y ejemplos que siguen están destinadas a ilustrar la invención sin limitar de ninguna manera su alcance.
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Leyendas de las figuras Figura 1 Caracterización de las células T CD4+CD18^{bright}CD49b+ como células Tr1 en el ratón
A) Análisis mediante FACS de las células T CD4+CD18bright CD49b+ con ayuda de los anticuerpos anti-CD4 anti-CD18 y anti-CD49b.
B) Perfil de producción de las citocinas de las células T CD4+CD18brightCD49b+.
C) Medida de la proliferación de células T CD4+ cultivadas solas (control) o en cocultivo separado por una membrana permeable con células CD4+CD18brightCD49b+ o CD4+CD18int durante 48 horas
D) Estudio del engrosamiento de la oreja tras la aplicación epicutánea de haptenooxazolona en el ratón y tras la inyección de células T CD4+CD18brightCD49b+ y en ratones tratados con hapteno pero sin inyecciones.
E) Estudio de la proporción de linfocitos T CD4+ en el colon de los ratones a los que se les indujo una inflamación crónica del intestino y se les inyectaron o no células T CD4+CD18bright CD49b+.
Figura 2 Caracterización de las células T CD4+CD18^{bright} CD49b+ como células Tr1 en el ser humano
A) Análisis mediante FACS de las células T CD3+CD4+CD18brightCD49b+ con ayuda de los anticuerpos anti-CD3, anti-CD4, anti-CD18 y anti-CD49b.
B) Perfil de producción de las citocinas de las células T CD4+CD18bright CD49b+.
C) Análisis comparativo mediante FACS de las poblaciones de células T CD3+CD4+CD18brightCD49b+ presentes en la sangre de los sujetos sanos y de pacientes que padecen la enfermedad de Crohn.
D) Estudio comparativo mediante FACS de las poblaciones de células T CD3+CD4+CD18bright y CD4+CD25+ presentes en la sangre de los sujetos sanos y de pacientes que padecen la enfermedad de Crohn (análisis mediante citometría de flujo).
Figura 3 Las células Tr1 migran preferiblemente hacia el colon inflamado
A-B) Los ratones scid CB-17 restaurados con células T CD4+CD45Rb^{hi} se trataron cuatro semanas después con 5 x 10^{5} clones de células T Tr1 (Tr1 l:N10-7 y Tr1-2:A-10-9), Th1 (N12-8) y Th2 (N4-9) tal como se indica. O bien se alimentó a los ratones con OVA en su agua potable (100 ng/ml) (A) o bien no se les alimentó con OVA (B). Una semana después, se sacrificaron los ratones y se combinaron las células presentes en el colon y los ganglios linfáticos mesentéricos (MLN) a partir de cada grupo de 5 ratones. Se analizó la presencia de células CD4^{+}KJ-1,26^{+} mediante citometría y se indican los resultados en los cuadrantes. Los resultados representan un experimento representativo de 4 que emplea poblaciones de células T Tr1, Th1 o Th2 o clones de células T, A-10-11, N-10-11 para células T Tr1, N-12-4 y N-4-12 respectivamente para los clones de células T Th1 y Th2.
C) Los ratones scid CB-17 se restauraron con células T CD4+CD45RB^{hi} y se trataron con un clon Tr1 (Nice-2, 4x10^{5} células/ratón) el día O. Un grupo de ratones (1 y 3) no se alimentó con OVA mientras que el otro grupo de ratones (2 y 4) se alimentó con OVA en su agua potable. Ocho semanas después, se sacrificaron los ratones y se examinaron sus cólones mediante histología (grupos 1 y 2). Se analizó la presencia de células Tr1 mediante inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo KJ-1,26 biotinilado (grupos 3 y 4). Se detectó una inflamación elevada en los cólones de los ratones que no se alimentaron con OVA (1,3) mientras que una activación específica de los clones Tr1 inhibe la inflamación (2,4). A pesar de la ausencia de OVA, se detectaron numerosas células KJ-1,26+ en los cólones inflamados (grupo 3). Se obtuvieron resultados similares en otros experimentos empleando las mismas poblaciones o clones Tr1 o diferentes.
Figura 4 La migración de células Tr1 es independiente del antígeno
A) Se recuperaron las células que infiltraron el colon inflamado de los ratones scid CB-17 reconstituidos con células T CD4+CD45Rb^{hi} cuatro semanas después de la reconstitución. Se marcaron estas células que contenían una mezcla de neutrófilos, basófilos y linfocitos mediante calceína fluorescente, AM. Se inyectaron conjuntamente 10^{6} de estas células fluorescentes (barras grises) por vía intraperitoneal con 10^{6} células Tr1 (barras negras) marcadas con CMTMR naranja en los ratones scid C.B.-17 reconstituidos cuatro semanas antes con células T CD4+CD45RB^{hi}. Se realizaron experimentos similares con células T CD4+ aisladas a partir de un colon inflamado de 4 semanas (barras blancas). Veinticuatro horas más tarde, se examinó mediante citometría el contenido celular del colon inflamado de los grupos de dos ratones. Histogramas muestran el número absoluto de células fluorescentes recuperadas por millón de células totales adquiridas. Los resultados representan un experimento representativo de 3.
B) Las tasas de números absolutos de células fluorescentes Tr1 recuperadas con respecto al número total de células fluorescentes recuperadas se representan para cada órgano analizado.
Figura 5 Las células Tr1 migran en dirección de las orejas inflamadas
A) Cinética de la sensibilidad de contacto a la oxazolona. Se trataron los ratones BALB/c con oxazolona (1 mg/oreja) el día 0, 1 y 2. Se comparó la hinchazón de la oreja tratada con oxazolona (\sqbullet) con la oreja tratada con el vehículo de control durante 22 días.
B) Análisis histológico de oxazolona o de las orejas tratadas con el vehículo (aumento X40) tal como se indica.
C-E) La migración in vivo de las células Th1, Th2 y Tr1. Se marcaron respectivamente las células T Tr1, Th1 y Th2 con azul de calceína, AM y CMTMR naranja y se inyectaron conjuntamente en ratones BALB/c tratados 5 días antes con oxazolona. Veinticuatro días más tarde, se analizó mediante citometría el contenido en los linfocitos T fluorescentes de las orejas tratadas con oxazolona, de los ganglios linfáticos drenantes y de los bazos, tal como se representa en C. Los experimentos se realizaron con un clon Tr1 (A-10-11, primeras barras negras) o poblaciones de células T Tr1 (segundas barras negras), Th1 y Th2 tal como se indica (D) - Números absolutos de células Tr1, Th1 y Th2 medidos en las orejas inflamadas, los ganglios linfáticos drenantes y los bazos por l0^{6} acontecimientos adquiridos. Los resultados representados son medias de grupos de 4 a 10 ratones. (E) - Las tasas de números absolutos de células fluorescentes Th1, Th2 o Tr1 con respecto al número total de células fluorescentes recuperadas se representan para cada órgano analizado.
Figura 6 Las células Tr1 presentaron una fijación firme aumentada sobre células endoteliales vasculares activadas en condiciones de flujo
A) Se utilizaron dos colorantes fluorescentes diferentes en este estudio: calceína, AM y CMTMR naranja para marcar células Th1 y Tr1. Se mezclaron las células en número igual y se realizó una perfusión en una cámara de flujo sobre una línea celular endotelial murina activada mediante TNF-\alpha, SVEC4-10 a un caudal de 2 dyn/cm^{2} durante 15 min. Se cuantificó el número de células fijadas firmemente en 10 campos independientes. Los resultados representan la media \pm DE de cinco mediciones independientes para dos clones y dos poblaciones en cada grupo. Se marcaron las células de manera indiferente con los diferentes colorantes y se obtuvieron resultados similares.
B) Campo típico que representa células Th1 marcadas mediante calceína verde y células Tr1 marcadas mediante CMTMR naranja fijadas firmemente en la línea celular endotelial murina activada mediante TNF-\alpha, SVEC4-10, aumento X10.
C) Para los clones de células T humanas, se analizó una adhesión firme en la línea celular endotelial murina activada mediante TNF-\alpha EA empleando el mismo procedimiento experimental que anteriormente. Se utilizaron varios clones, respectivamente JDV 15, BJF 308 y BJF 161 para los clones Tr1 y JDV305, BJF180 y HAT203 para los clones Th1. Los resultados representan un experimento de 4 resultados similares.
Figura 7 Mecanismos para la adhesión aumentada de las células Tr1 sobre el endotelio activado
Se utilizó la prueba de adhesión en la cámara de flujo con una tasa de 2 dyn/cm^{2} para examinar los mecanismos de adhesión Tr1. Se compararon la circulación y la adhesión para las células Th1 y Tr1 respectivamente con AM calceína y CMTMR naranja. Los resultados representan una media \pm DE de un experimento representativo para dos clones y dos poblaciones para cada grupo.
A) Se contaron los acontecimientos de circulación de las células Th1 y Tr1 sobre la línea celular endotelial SVEC4-10 activada mediante TNF-\alpha (EC) o sobre láminas recubiertas con la molécula P-selectina recombinante tras la grabación en vídeo de 9 campos diferentes. Un experimento de cinco.
B) Se analizó la adhesión firme de las células Th1 y Tr1 con flujo sobre láminas recubiertas de mICAM-1 o mVCAM-1 recombinante. Un experimento de tres.
C) Se analizó con flujo los efectos inhibidores de las cadenas de integrina Acm anti-\beta2, anti-\beta1 y la molécula sVCAM-1 sobre la fijación firme de los linfocitos Tr1 y Th1 sobre SVEC4-10 activado mediante TNF-\alpha. Un experimento de cinco.
D) Migración inhibida por LEA-1 que bloquea células Tr1 en las orejas inflamadas. Se trataron las células Tr1 con ICAM-Fc (10 \mug/ml) durante 30 min a 4°C y se marcaron con azul calceína. Se marcaron las células Tr1 no tratadas con CMTMR naranja. Se inyectó conjuntamente una mezcla de células Tr1 tratadas con ICAM-1 Fe y no tratadas en ratones BALB/c sensibilizados 5 días antes con oxazolona tal como en la figura 5. Veinticuatro horas más tarde, se analizó mediante citometría el contenido en células T fluorescentes de las orejas tratadas con oxazolona. Los resultados muestran los números absolutos de células Tr1 medidos en las orejas inflamadas por 10^{6} acontecimientos adquiridos. Los resultados representados se extraen de grupos de 4 ratones y se repitieron con dos clones Tr1 diferentes (A10.11 y A10.9).
Figura 8 Expresión de las moléculas de adhesión sobre las células Tr1
A-B) Niveles de expresión genética de las moléculas alfa L, beta 2, alfa V, beta 3, PECAM-1 y PSGL-1 sobre clones y poblaciones de células T humanas y de ratón Tr1 (barras grises), Th2 (barras blancas) y Th1 (barras negras). Para los clones de células T de ratón, los resultados representan una media de dos de los tres clones diferentes analizados. Para las poblaciones de ratones, se analizaron dos poblaciones diferentes y los resultados presentan la media de dos valores. Para los clones de células T humanas, se analizaron tres clones Tr1 diferentes y un clon representativo Th1 y Th2. Los valores se expresan en tasas de aumento de la expresión con respecto a un control negativo y representan un experimento de tres. De los 45 genes diferentes que codifican para las moléculas de adhesión sometidas a prueba para las células T humanas y de ratón, sólo se representan aquéllos para los que la diferencia entre las células Tr1 y Th1/Th2 era muy elevada.
C) Análisis FACS de las cadenas de la integrina alfaL, beta2 y PECAM-1 en un clon Tr1 de ratón representativo y la cadena de la integrina alfaV en un clon Tr1 humano representativo en comparación con los clones Th1 y Th2 representativos. Un experimento de dos.
Figura 9 La IL-10 induce la diferenciación de las células dendriticas CD11c^{low}CD45RB^{+}
A) Se cultivaron células de médula ósea con GM-CSF y TNF-\alpha en presencia o en ausencia de IL-10 (50 o 500 ng/ml) tal como se indica durante 6 días, después se activaron durante 24 h con LPS. Se colorearon las células dendriticas de médula ósea así generadas con un anticuerpo anti-CD11c biotinilado, después con un conjugado de streptavidina-peroxidasa (PE). A continuación se conjugaron las células a un anticuerpo anti-CD45RB acoplado a FITC y se analizaron mediante citometría de flujo. Los datos representan los resultados de un estudio representativo de siete.
B) Se clasificaron las células dendríticas en función de la expresión de CD11c y de CD45RB, tal como se indica en la figura 11A. Se centrifugaron las células clasificadas indicadas y se colorearon con May Gründwald Giemsa. 1 - células dendríticas CD11c^{low}CD45RB+ tras 6 días de diferenciación, 2 - células dendríticas CD11c^{low}CD45RB+ tras la activación mediante LPS, 3 - células dendríticas CD11c^{high}CD45RB- tras 6 días de diferenciación, 4 - células dendríticas CD11c^{high}CD45RB+ tras la activación mediante LPS.
C) Se clasificaron las células dendríticas obtenidas tras la diferenciación in vitro en presencia de GM-CSF y de TNF-\alpha con o sin IL-10, en función de la expresión de CD11c y de CD45RB, tal como se indica en figura 11A. Se colorearon las células clasificadas con los anticuerpos marcados con FITC indicados, y volvieron a analizarse mediante FACS; se estimularon igualmente mediante LPS (1 \mug/ml) durante 24 h, se colorearon con los AcM indicados y volvieron a analizarse. Los histogramas sombreados representan las células coloreadas con los AcM control de isotipo correspondientes. Los datos representan los resultados de un experimento representativo de tres.
Figura 10 Identificación de las células dendríticas derivadas de la IL-10 in vivo
A) Se aislaron células dendríticas (DC) esplénicas de ratones BALE/c o C57B1/6 transgénicos para IL-10, IL-10 ^{-/-} y normales, se enriquecieron mediante reducción celular con un cóctel de anticuerpos (AcM anti-B220, Gr1 y CD3) y se analizó mediante citometría de flujo la expresión de superficie del marcador específico CD11.
B) Se aislaron preparaciones de DC enriquecidas mediante reducción celular con un cóctel de anticuerpos (AcM anti-B220, Gr1 y CD3) del bazo de ratones BALB/c o C57B1/6 transgénicos para IL-10, IL-10 ^{-/-} y normales y se analizaron para determinar la expresión de CD11c-cy5 y de CD45RB-PE con el fin de distinguir dos poblaciones de DC separadas. Se indican los porcentajes en los diferentes cuadrantes. Los resultados (de más de 10 experimentos) son normales. No se observó ninguna diferencia entre los ratones BALB/c no transgénicos y los de control.
C) Se centrifugaron las células CD11c^{low} CD45RB^{+} (1) y CD1lc^{high}CD45RB^{-} (3) clasificadas aisladas del bazo de ratones BALB/c y se colorearon con May-Grunwald-Giemsa. Las células CD11c^{low}CD45RB^{+} (2) y CD11c^{high}
CD45RB^{-} (4) clasificadas se estimularon igualmente con LPS (1 \mug/ml) en presencia de GM-CSF durante 24 h, se centrifugaron y se colorearon con May-Grünwald-Giemsa.
D) Se colorearon preparaciones enriquecidas de DC de ratón BALB/c o C57B1/6 IL-10 Tg o control con CD11c-cy5 y CD45RB-PE. Se clasificaron las células con FACS en función de la expresión del CD11c^{low}WCD45RB^{+} o del CD11c^{high}CD45RB^{-} y volvieron a analizarse tal como se presenta. A continuación se colorearon las células clasificadas con el tercer marcador acoplado al FITC y se analizaron mediante citofluorometría (histogramas vacíos). Las DC seleccionadas se estimularon igualmente con LPS (1 \mug/ml) en presencia de GM-CSF durante 24 h, se colorearon con los AcM indicados y volvieron a analizarse (histogramas rellenos). Los histogramas sombreados representan los AcM control de isotipo correspondiente.
Figura 11 Caracterización fenotípica y secreción de citocinas del subconjunto de células dendríticas CD11c^{low}CD45RB^{+}B220^{-}
A) Para comparar las células dendríticas CD11c^{low} CD45RB+ con las células plasmocitoides previamente descritas que expresan débilmente el CD11c pero no los marcadores B220 y Gil, se realizó un análisis en preparaciones de células dendríticas enriquecidas mediante reducción celular con un cóctel de anticuerpos que contenía (AcM anti-CD19 y CD3). Se analizaron las células dendríticas aisladas del bazo de ratones BALB/c o C57B1/6 normales para determinar la expresión de CD11c-cy5 y de B220-PE.
B) Se colorearon preparaciones enriquecidas de células dendríticas de ratones BALB/c o C57BL/6 con CD11c-cy5 y B220-PE y se marcaron con anticuerpos acoplados a FITC tal como se indica. Se clasificaron las células en función de la expresión de CD11c^{low}CD45RB^{+} (histogramas rellenos) o de CD11c^{high}CD45RB^{-} (histogramas vacíos, líneas rectas) y se analizó la coloración para el tercer marcador en las diferentes poblaciones. Los histogramas sombreados representan los AcM control de isotipo correspondiente.
C) Se colorearon preparaciones de células dendríticas aisladas de ratones BALB/c, enriquecidas mediante un cóctel de AcM anti-CD3, CD19, con CD11c-cy5 y B220-PE. Se clasificaron las células con FACS basándose en la expresión de CD11c^{low}B220^{+}, CD11c^{high}B220^{-} o CD 11c^{hi}. A continuación se colorearon las células clasificadas con el tercer marcador acoplado a FITC y se analizaron mediante citofluorometría (histogramas vacíos). Las células dendríticas clasificadas se estimularon igualmente mediante CpG (xxx \mug/ml) en presencia de GM-CSF durante 24 h, se colorearon con los AcM indicados y volvieron a analizarse (histogramas rellenos). Los histogramas sombreados representan los AcM control de isotipo correspondiente.
D-E) Perfil de citocinas de las diferentes subpoblaciones de células dendríticas
D) En una primera serie de experimentos, se clasificaron los subconjuntos de células dendríticas CD11c^{high}
CD45RB^{-} (histogramas vacíos) y CD11c^{low}CD45RB^{+} (histogramas rellenos) en función de la expresión de CD11c y CD45RB a partir de células dendríticas esplénicas enriquecidas con un cóctel de AcM anti-CD3, B220 y Gr1. Las células CD11c^{high}CD45RB^{-} (histogramas sombreados blancos) y CD11c^{low}CD45RB^{+} (histogramas sombreados negros) clasificadas se estimularon igualmente con LPS (1 \mug/ml) en presencia de GM-CSF durante 24 h. Se realizó una RT-PCR cuantitativa en tiempo real en las diferentes muestras y se comparó con un control negativo para cada producto de transcripción dado analizado. Los valores se expresan en factores de aumento de la expresión con respecto a un control negativo y representan las medias \pm DE de tres muestras distintas.
E) Se preparó igualmente una población de células dendríticas con un cóctel que contenía AcM anti-CD3 y CD19 y se clasificaron en función de la expresión de CD11c y B220. Se estimularon las células con LPS o CpG durante 24 ó 48 h y se analizó el sobrenadante tal como se indica, para medir la secreción eventual de IFN-\alpha o de I1-10.
Figura 12 Las células dendriticas CD11c^{low}CD45RB^{+} inducen la diferenciación de las células reguladoras Tr1 in vitro
A) Las células CD11c^{low}CD45RB^{+} tratan y presentan al antígeno in vitro. Se estimularon células T DO11-10 CD4^{+} con DC CD11c^{hi} CD45RB^{-} y CD11c^{low} CD45RB^{+} clasificadas en presencia de péptido OVA (0,6 \muM) o de proteína OVA (500 ó 250 \mug/ml tal como se indica). Se analizó la respuesta proliferativa o la secreción de IFN-\gamma el día 3 ó 48 h tras la estimulación, respectivamente. Los resultados representan la media de 3 mediciones y se expresan en ng/ml para IFN-\gamma. Los datos son representativos de 2 experimentos distintos con resultados similares.
B) Análisis de las citocinas secretadas por poblaciones de células T CD4+ activadas con células dendriticas clasificadas ex vivo
Se diferenciaron células T transgénicas DO11-10 OVA TCR "vírgenes" durante 3 semanas con DC clasificadas CD11c^{high}CD45RB^{-} (barras blancas) o CD11c^{low}CD45RB^{+} (barras negras), en presencia de péptido OVA. Se aislaron las células dendríticas de ratones BALB/c normales con diferentes razones DC/T tal como se indica. Tras tres semanas de cultivo, se recogieron las células T y se estimularon con esplenocitos BALB/c irradiados y péptido OVA (0,3 \muM). Cuarenta y ocho horas más tarde, se analizaron las citocinas mediante ELISA en los sobrenadantes de cultivo. Los resultados representan la media de 3 mediciones y se expresan en ng/ml para IL-10 e IFN-\gamma y en pg/ml para IL-4. Los datos son representativos de 5 experimentos distintos con resultados similares.
B) Citocinas secretadas por poblaciones de células T CD4^{+} diferenciadas con células dendríticas derivadas in vitro
Se obtuvieron las células dendríticas mediante cultivo de células de médula ósea en presencia de GM-CSF, de TNF-\alpha y de IL-10. A continuación se clasificaron en dos subconjuntos: CD11c^{high}CD45RB^{-} y CD11c^{low}CD45RB^{+}. Se utilizaron las células dendríticas clasificadas para diferenciar células T CD4+ DO11-10 "vírgenes", en una razón DC/T de 1/20, en presencia de péptido OVA (0,6 \muM). Al cabo de una semana, se recogieron las células T y se estimularon con CPA esplénicas irradiadas y péptido OVA (0,3 \muM). Cuarenta y ocho horas más tarde, se analizaron las citocinas mediante ELISA en los sobrenadantes de cultivo. Los resultados representan la media de 3 mediciones y se expresan en ng/ml. Los datos son representativos de dos experimentos distintos con resultados similares.
C) Dosificación de las citocinas intracelulares de células T DO11-10 "vírgenes" estimuladas con péptido OVA y DC clasificadas CD11c^{low}CD45RB^{+} o CD11c^{high}CD45RB^{-}
Se aislaron las células dendríticas CD11c^{low}CD45RB^{+} y CD11c^{high}CD45RB^{-} de ratones BALB/c normales, se clasificaron en FACS y se pusieron en cocultivo con células T DO11-10 "vírgenes" en presencia de péptido OVA. Siete días más tarde, se recogieron las células y se estimularon durante 6 h con AcM anti-CD3 y CD28 reticulados. Se añadió monensina durante las 4 últimas horas de cultivo. A continuación se fijaron las células y se colorearon para la dosificación de las citocinas intracelulares mediante AcM específicos acoplados a FITC o a PE, tal como se indica. Aquí se presenta un experimento representativo de tres.
D) Función reguladora de las células T diferenciadas con células dendríticas CD11c^{low}CD45RB^{+}
En el compartimento inferior de un sistema Transwell, se estimularon células T CD4+ purificadas aisladas de ratones BALB/c normales con esplenocitos BALE/c irradiados y AcM anti-CD3 (barras blancas). En el compartimento superior, se estimularon células T CD4+, diferenciadas mediante una estimulación única con células dendríticas CD11c^{low}CD45RB^{+} o CD11c^{hi}CD45RB^{-}, mediante el péptido OVA y esplenocitos irradiados. Se han realizado igualmente experimentos de cocultivo en presencia de AcM de ratón anti-IL-10 (10 \mug/ml) (barras sombreadas blancas), de AcM de ratón anti-TGF-\beta (40 \mug/ml) (barras negras) o de los dos (barras grises). Tres días más tarde, se retiró la cesta y se midió la respuesta proliferativa de las células T CD4+ vecinas tras un pulso con 0,5 \muCi de ^{3}H-timidina durante las 12 últimas horas del cultivo de 72 h. Los resultados representan las medias \pm DE de tres mediciones de un experimento representativo de tres.
E) No se requiere la secreción de IL-10 para la diferenciación de las células Tr1 mediante células dendríticas CD11c^{low}CD45RB^{+}
Se diferenciaron células T DO11-10 CD4+ "vírgenes" durante una semana con células dendríticas CD11c^{low}
CD45RB^{+} en presencia o en ausencia de células T anti-IL10R. Al cabo de una semana, se recogieron las células y se estimularon con esplenocitos BALE/c irradiados y péptido OVA (0,3 \muM). Cuarenta y ocho horas más tarde, se analizaron las citocinas mediante ELISA en los sobrenadantes de cultivo. Los resultados representan la media de 3 mediciones y se expresan en ng/ml para IL-10 e IFN-\gamma y en pg/ml para IL-4. Los datos son representativos de 5 experimentos distintos con resultados similares. Igualmente, se diferenciaron células T CD4+ "vírgenes" aisladas de ratones C57B1/6 con un AcM anti-CD3 soluble y células dendríticas CD11c^{low}CD45RB^{+} clasificadas aisladas de ratones IL-10^{-/-} o C57B1/6. Al cabo de una semana, se recogieron las células y se estimularon con esplenocitos C57B1/6 irradiados y un AcM anti-CD3 soluble (10 \mug/ml). Cuarenta y ocho horas más tarde, se analizaron las citocinas mediante ELISA en los sobrenadantes de cultivo. Los resultados representan la media de 3 mediciones y se expresan en ng/ml para IL-10 e IFN-\gamma y en pg/ml para IL-4.
Figura 13 Análisis de células dendríticas humanas tolerógenas (TDC)
A) Se suprimieron las células T y B de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) con anticuerpos y bolas magnéticas y se analizó la población restante para determinar la expresión de CD11c y CD4 mediante citometría. Los cuadrados representan las dos poblaciones definidas como DC1 y DC2 por "Siegal et al, 1999, Science, 281, 1835-7". Un cuadrado muestra la población de DC tolerógenas (TDC).
B) Se diferenciaron células progenitoras CD34+ in vitro con GM-CSF (800 U/ml) e IL-4 (1000 U/ml) en presencia o en ausencia de IL-10 (200 u/ml) tal como se indica en el ejemplo 8. Se rodearon las poblaciones de TDC y DC1.
C) Se clasificaron las células TDC y DC1 mediante FACS según la expresión de CD11c y se analizaron mediante citofluorometría para determinar la expresión de HLA-DR, CD80 y CD86. Los resultados muestran que las TDC expresan niveles de estas moléculas inferiores a los de las células DC1.
D) Se clasificaron las células TDC y DC1 mediante FACS según la expresión de CD11c y se estimularon mediante LPS durante 24 h. Después se analizaron los sobrenadantes mediante ELISA para determinar la presencia de IL-10 y de IL-12.
Figura 14 TDC inducen la diferenciación de células Tr1 que secretan niveles altos de IL-10
A) Análisis de las citocinas secretadas por las poblaciones de células T CD4+ activadas con células dendríticas clasificadas.
Se estimularon las células T CD4+ humanas durante tres semanas con células clasificadas alogénicas DC1 (columnas blancas) o TDC (columnas negras). Se aislaron las DC a partir de cultivos in vitro en presencia (TDC) o en ausencia (DC1) de IL-10 y se utilizaron a diferentes razones DC/T tal como se indica. Tras el cultivo durante tres semanas, se recogieron las células T y se estimularon con PBMC irradiadas, y un anticuerpo monoclonal anti-CD3 (10 \mug/ml). Tras 48 horas, se analizaron las citocinas en los sobrenadantes de cultivo mediante ELISA. Los resultados representan las medias de tres determinaciones y se expresan en ng/ml.
B) Función reguladora de las células T diferenciadas con las TDC.
En el compartimento inferior de un sistema Transwell células humanas T CD4+ purificadas se estimularon mediante PBMC irradiadas y un anticuerpo monoclonal anti-CD3 (columnas blancas). En el compartimento superior, células T CD4+ diferenciadas con células TDC o DC1 alogénicas tal como se indica se estimularon con PBMC alogénicas irradiadas. También se pusieron en práctica los experimentos de cocultivo en presencia de anticuerpo monoclonal de ratón bloqueante anti-IL-10 (10 \mug/ml) (columnas sombreadas), de anticuerpo monoclonal anti-TGF-\beta (40 \mug/ml) (columna negras) o de los dos (columnas grises). Tras tres días, se recuperó el recipiente y se midió la respuesta proliferativa de las células T CD4+ mediante adición de 0,5 \muCi de ^{3}H-timidina durante las 12 últimas horas del cultivo de 72 h.
Figura 15 Definición de las CD3+CD4+CD18bright en el ser humano
Se definen las células CD3+CD4+CD18bright mediante la expresión de los antígenos CD3 y CD4 en la superficie celular y una intensidad de fluorescencia del marcaje CD 18 igual a la intensidad de fluorescencia del marcaje CD 18 encontrada en la células monocíticas.
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Ejemplos Ejemplo 1 Material y métodos Material y métodos para los ejemplos 2 y 3 Ratones
Los ratones BALB/c y C.B-17 scid se obtuvieron del CERJ (Le Genest Saint Isle, Francia). Los ratones homocigóticos DO11-10 proceden de una donación por parte del Dr. S.D. Hurst (DNAX Research Institute, Palo Alto, CA). Todos los ratones son hembras de 4 a 8 semanas de edad al comienzo de cada experimento.
Anticuerpos, medios y reactivos
El medio utilizado para los cultivos de células T es medio Yssel complementado mediante un 10% de SVF (suero bovino fetal) (Roche, Meylan, Francia) y b-2-mercaptoetanol 2 x 10^{-5} M (Invitrogen). La IL-10 y la IL-4 recombinante de ratón proceden de una donación del Dr R.L. Coffman, DNAX Research Institute, Palo Alto, CA. La IFN-\gamma y la IL-12 recombinante de ratón proceden de R&D Systems. Se utilizaron los anticuerpos purificados anti-IL-4 (11B11), anti-IL-10 (2A5), anti-IFN-\gamma (XGM1.2) y biotinilados anti-IL-4 (24G2), anti-IL-10 (SXC1) y anti-IFN-\gamma (R4-6A2) (Pharmingen Becton Dickinson) para las pruebas de ELISA. Se utilizaron los siguientes anticuerpos monoclonales para la purificación y fenotipado de las células de ratón: anti-I-Ad (AMS-32.1), anti-CD8 (2-43), anti-CD11b (M1/70), anti-B220 (RA36B2), FITC-anti-CD45RB (16A), PC5-anti-CD4 (H129-19), PE-anti-CD18 (C71/16), FITC-anti-CD49b (Hal/29), FITC-anti-clonotipo Kj1-26 y controles isotípicos acoplados a FITC- o PE (BD-Pharmingen, Le Pont de Claix, Francia). Los anticuerpos dirigidos contra las moléculas de superficie humanas son: FITC- o PC5- anti-CD3 (UCHT-1) (Caltag), PC5- o APC-anti-CD4 (RPA-T4), PE-anti-CD18 y FITC-anti-CD49b (AK-7) (BD-Pharmingen). El péptido OVA_{323-339}, la ovoalbúmina y la oxazolona proceden de Sigma (Saint Quentin Fallavier, Francia). El lipopéptido OVA_{323-339} procede de Bachem (Voisin-le-Bretonneux, Francia).
Citometría de flujo y purificación celular
Se purificaron las células CD4+ de ratón tal como ya se describió (Groux et al, Nature, 1997). Se redujeron los esplenocitos en células B220^{+}, Mac-1^{+}, I-Ad^{+} y CD8^{+} mediante selección negativa sobre bolas magnéticas adsorbidas por anticuerpos de oveja anti-Ig de rata (Dynabeads, Dynal Biotech, Oslo, NO). Se marcaron las células restantes mediante los anticuerpos FITC-anti-CD49b, PE-anti-CD18 y PC5-anti-CD4 y se separaron en CD4^{+}CD18^{bright}CD49b^{+} y CD4^{+}CD18^{int}CD49b^{-} mediante clasificación celular en un dispositivo FACStar SE (Becton Dickinson, Francia). Se clasificaron las células humanas CD4^{+}CD18^{bright}CD49b^{+} y CD4^{+} CD18^{int}CD49b^{-} de sangre periférica tras la separación de las células mononucleares mediante céntrifugación en gradiente de Ficoll, selección positiva de las células CD4^{+} sobre bolas magnéticas anti-CD4 (Dynal Biotech) y marcaje de las células CD4+ con los anticuerpos PC5-anti-CD3, PE-anti-CD18 y FITC-anti-CD49b. Según este protocolo, las oblaciones celulares son puras en más del 98%.
ELISA
Se utilizaron pruebas ELISA para medir la IL-4, la IL-l0 y la IFN-\gamma humana y de ratón. Se midieron las concentraciones en citocinas en sobrenadantes de células CD4+CD18brightCD49b+ de Balb/c o humanas (2\cdot10^{5}/pocillo) activadas durante 48 h con un anticuerpo anti-CD3 adsorbido (10 \mug/ml) y un anticuerpo anti-CD28 soluble (1 \mug/ml).
Inducción de colitis inflamatoria crónica
Se indujo colitis inflamatoria mediante inyección intraperitoneal a ratones SCID C.B-17 de 2\cdot10^{5} células T CD4^{+}
CD45RB^{hi} en 100 \mul de PBS. Se trató un grupo de ratones mediante 1\cdot10^{5} células T CD4+CD18brightCD49b+ procedentes de ratones DO11-10. Se alimentaron estos ratones mediante ovoalbúmina en el agua para beber. 5 semanas después del tratamiento, se sacrificaron los ratones y se analizó la proporción de células TCD4+ en el colon mediante citometría de flujo, tras la digestión de la mucosa del colon mediante colagenasa/dispasa.
Reacción de hipersensibilidad retardada
Se indujo la reacción de hipersensibilidad retardada a la oxazolona mediante sensibilización de los ratones en el día 0 mediante aplicación de 25 ml de oxazolona a 20 mg/ml en la piel del abdomen. A continuación se reveló la reacción de hipersensibilidad retardada en el día 5, mediante 4 \mul de oxazolona a 4 mg/ml aplicada en cada uno de los lados de una oreja. 4 horas después, se inyectaron 2.10^{5} células T CD4^{+}CD18^{bright}CD49b^{+} por vía intravenosa a los ratones. Se aplicaron 20 \mul de una disolución de lipopéptido OVA_{323-339} a 500 \muM diluida en aceite de oliva en los días 4, 5 y 6 en la oreja inflamada. Se midió el grosor de la oreja una vez al día durante 6 días.
Cultivos celulares en sistemas Transwell
Se depositaron 5\cdot10^{5} células T CD4+ en un pocillo de cultivo en presencia de 4\cdot10^{5} esplenocitos irradiados y un anticuerpo anti-CD3 soluble (10 \mug/ml). Se activaron 2\cdot10^{5} células T CD4^{+}CD18^{bright}CD49b^{+} o CD4^{+}CD18^{int} de la misma manera y se cultivaron en un inserto Transwell (poros de 0,4 \mum) (Dutscher, Brumath, FR) depositados sobre el pocillo que contiene las células CD4+. Se midió la incorporación de timidina tritiada por las células CD4+ dianas tras 72 horas de cultivo.
Material y métodos para el ejemplo 4 Ratones
Se obtuvieron ratones scid BALB/c y C.B-17 carentes de patógenos específicos a partir de CERJ (Le Genest Saint Isle, Francia). Se mantuvieron los ratones en nuestras instalaciones para animales. Se alojaron los ratones scid C.B-17 en microaisladores con aire filtrado estéril (Rec Biozone, Margate, RU). Los ratones hembras utilizados tenían de 8 a 12 semanas de edad.
Anticuerpos
Se utilizaron los siguientes anticuerpos monoclonales para la purificación de células de ratón: AMS-32.1, anti-Iad, 2-43, anti-CD8 de ratón, MI/70, anti-CD11b de ratón, RA36B2, anti-B220 de ratón, 16A conjugado con FITC, anti-CD45RB de ratón, GK1.5 conjugado con PE o TC, anti-CD4 de ratón, KJ-1,26 AcM biotinilado o FITC revelado mediante estreptavidiria marcada con PE, anticuerpos de control de isotipos conjugados con FITC y PE (BD-Pharmingen, Le Pont de Claix, Francia).
Los anticuerpos dirigidos contra las moléculas de adhesión (BD-Pharmingen) eran los siguientes: la integrina alfaV (23C6), la integrina alfaL (M17/4), la integrina beta2 (Game-46), la integrina betal (HM\beta1-1) y la PECAM-1 (MEC 13.3). Para el análisis de expresión de la PECAM-1, la integrina alfaL y la integrina beta2, la coloración se reveló mediante inmunoglobulinas anti-rata de conejo acopladas con FITC (Dako, Trappes, Francia).
Purificación de las células y citometría
Se purificaron subconjuntos de células T CD4^{+} a partir de bazos de ratón tal como se describió anteriormente (Groux et al, 1997). Resumidamente, se redujeron de las células las células B220^{+}, Mac-1^{+}, I-Ad^{+} y CD8^{+} mediante una selección negativa utilizando las perlas Dynabeads recubiertas con anticuerpo de oveja anti-rata (Dynal, Oslo, Noruega). Se marcaron las células restantes mediante anticuerpos anti-CD45RB (25 \mug/ml) conjugados con FITC y anticuerpos anti-CD4 (10 \mug/ml) conjugados con PE y se separaron en fracciones de CD4^{+}CD45RB^{hi} y CD4^{+}CD45RB^{lo} en clasificaciones de dos colores en el instrumento FACStar SE (Becton Dickinson, Francia). Todas las poblaciones eran puras a más del 98% tras el nuevo análisis. Para el análisis de las células T que infiltran el colon, se estimularon partes de cólones y se digirieron mediante colagenasa (Life Technologies, Cergy Pontoise, Francia) durante 2 h a 37°C. Se redujeron de las células las células B220^{+}, Mac-1^{+}, I-Ad^{+} y CD8^{+} mediante una selección negativa utilizando las perlas Dynabeads recubiertas con anticuerpo de oveja anti-rata. A continuación se analizaron las células T mediante citometria con un anticuerpo tricolor anti-CD4 y AcM KJ-1,26 marcado con FITC. Para el análisis de las células de ganglios linfáticos mesentéricos (MLN), se estimularon ganglios linfáticos mesentéricos combinados y se analizaron las células mediante citometria con un AcM anti-CD4 marcado con FITC y un AcM KJ-1,26 biotinilado revelado mediante estreptavidina PE. Para los estudios de migración, tras la digestión mediante colagenasa, se clasificaron las células CD4+ del colon utilizando anticuerpo anti-CD4 conjugado con PE. Con el fin de recuperar los linfocitos de las orejas inflamadas, se sumergieron ligeramente las orejas en PBS IX. A continuación se lavaron trozos de tejido una vez con PBS IX y se digirieron durante 30 minutos a 37°C con tripsina EDTA en solución salina equilibrada de Hank (ambas de Life Technologies). Se lavaron los tejidos tratados con tripsina con 1 mg/ml de dispasa de colagenasa durante 1 hora a 37°C con agitación constante. Se lavaron las suspensiones celulares en PBS IX y se recuperaron los sobrenadantes que contenían linfocitos.
Las células T
Se obtuvieron los clones de células T de ratón a partir de ratones DO11-10 tras la diferenciación in vitro tal como se describió anteriormente (Groux et al, 1997). Las células KJ-1,26^{+} CD4^{+} no tratadas (MEL-14^{hngnt}) se estimularon de manera repetida con péptido de OVA 323-339 cada semana durante 3 semanas, en presencia de IL-4 y anticuerpo anti-IL-12, IL-12 y anticuerpo anti-IL-4 o IL-10 respectivamente para las células Th2, Th1 o Tr1. Se utilizaron poblaciones diferenciadas de tres semanas en el transcurso del estudio. Con el fin de generar clones de células T, se clonaron las diferentes poblaciones de células T a una célula/pocillo mediante citometría (FACS vantage SE, Becton Dickinson) y se estimularon mediante esplenocitos irradiados (4500 rad) y péptido de OVA. A continuación se dilataron los clones y se analizaron mediante secreción de citocina tras la activación con APC y el péptido de OVA. A continuación se estimularon los clones seleccionados con esplenocitos irradiados y péptido de OVA cada 2 semanas y un poco más dilatados con IL-2 (R&D system, Minneapolis, MN, 10 ng/ml). Se utilizaron los clones de las células T al menos 10 días después de la última estimulación.
Los diferentes clones de células T JDB humanas se describieron anteriormente (Groux et al, 1997) y se obtuvieron tras la estimulación MLR en presencia o en ausencia de IL-10. Los otros clones de células T utilizados se aislaron a partir de biopsias cutáneas tales como las descritas (Lecart et al, J Invest Dermatol. Agosto de 2001; 117(2):318-
25).
Las dosificaciones de citocina
Se utilizaron las pruebas ELISA tipo sándwich para dosificar IL-4, IL-10 e IFN-\gamma humanas y de ratón tal como se describió anteriormente (Groux et al, 1997).
Inducción de la enfermedad inflamatoria del intestino
Se indujo la IBD en los ratones scid CB-17 con células T CD4^{+}CD45RB^{hi} inyectadas por vía intraperitoneal en 100 \mul de depósito PBS. Se proporcionó el control de la inflamación mediante inyección de 2x10^{5} células T CD4^{+}CD45RB^{lo} o diferentes células T específicas de OVA tal como se indica.
Exploración al microscopio de los cólones
Se extirparon cólones de ratón y se fijaron en PBS que contenía el 10% de formaldehído. Se cortaron 6 mm de secciones con inclusión de parafina y se colorearon con hematoxilina y eosina. Se evaluaron los tejidos de manera semicuantitativa de 0 a 5 de manera anónima. Se atribuía un nivel de 0 cuando no se observaba ningún cambio. Los cambios asociados de manera típica con los otros niveles se presentan tal como sigue: nivel 1, infiltrados dispersados de células inflamatorias de las mucosas, con o sin hiperplasia epitelial mínima; nivel 2, infiltrados de células inflamatorias benignas dispersadas con difusión, que se extienden a veces en las submucosas y asociadas con erosiones, con una hiperplasia epitelial de mínima a benigna y una reducción de mucina de mínima a benigna de las células caliciformes; nivel 3, infiltrados de células inflamatorias de benignos a moderados que a veces eran transmurales, a menudo asociados con las úlceras, con una hiperplasia epitelial y una reducción de mucina moderadas; nivel 4, infiltrados de células inflamatorias marcados que a menudo eran transmurales y asociados con las úlceras, con un hiperplasia epitelial y una reducción de mucina marcadas; y nivel 5, inflamación transmural marcada con úlceras agudas y pérdida de las glándulas intestinales.
Inmunohistoquímica
Se congelaron partes de colones en nitrógeno líquido y se almacenaron a -70°C. Se cortaron 5 \mum de las secciones congeladas y se pegaron sobre láminas de vidrio. Se secaron completamente a temperatura ambiente durante 1 hora y se fijaron en acetona a 4°C durante 15 min. Se colorearon las secciones mediante una técnica inmunoenzimática que emplea un sistema de peroxidasa-avidina-biotina. Resumidamente, se lavaron las secciones en PBS durante 5 min. Después se saturaron las secciones con biotina y avidina (Vector) según las instrucciones del fabricante y se incubaron con biotina KJ-1,26 o el isotipo de control. Tras haberse lavado durante 5 min en PBS, se incubaron las secciones con peroxidasa-estreptavidina. Tras un último lavado, se reveló la peroxidasa mediante el kit de coloración de vector DAB (Vectastain, Vector), que proporciona un color marrón.
Coloraciones fluorescentes
Se utilizaron diferentes coloraciones en este estudio a partir de sondas moleculares (Molecular Probes, Eugene OR, EE.UU.). La calceína azul es un marcador azul fluorescente con excitación a 322 nm y emisión a 435 nm; el diacetato de fluorescenta fluorescente verde es un marcador fluorescente verde con excitación a 522 nm y emisión a 529 nm, la calceína AM es un marcador fluorescente verde con excitación a 494 nm y emisión a 517 nm; la tetrametilrodamina fluorescente naranja es un marcador fluorescente rojo con excitación a 541 nm y emisión a 567 nm. Se marcaron las células T en el medio con diferentes sondas (1 \mug/ml) durante 30 min a 37°C en la oscuridad y se limpiaron tres veces antes de usarse.
Estudios de flujo in vitro y cámara de flujo
La línea de células endoteliales de la vena umbilical humana transformada EA hy926 la proporcionó amablemente el Dr Edgell (Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill, N.C.) y se cultivó en DMEM (Life Technologies, Cergy Pontoise, Francia) con adición de un complemento del 20% de FCS. La línea de células endoteliales murina transformada SVEC4-10 se adquirió de la ATCC y se cultivó con DMEM con adición de un complemento del 10% de FCS. La cámara de flujo se adquirió de Immuneties (Cambridge, MA). Se diseñó para permitir un flujo laminar estabilizado entre 0,1 y 2 dyn/cm^{2}. Se perfundieron las células T a una concentración de 1 x 10^{6} en HBSS (Life Technologies) con adición de un complemento de 1 mM de CaCl_{2} y MgCl_{2} a través de la cámara sobre una monocapa de células endoteliales empleando una bomba-jeringuilla de extracción (Harvard Apparatus, Boston, MA). En la mayoría de los experimentos, se marcaron las diferentes líneas de células T de manera fluorescente, se lavaron tres veces, después se mezclaron y se perfundieron sobre la línea de células endoteliales murina SVEC4-10 o la línea de células EA humanas durante 15 min. Se perfundió el medio para extraer los linfocitos que no se adhirieron fuertemente antes de la cuantificación sobre 10 campos aleatorios de 0,65 mm^{2} con objetivo de 10X. Para estudios sobre la inhibición, el recombinante soluble mVCAM-1, las cadenas de integrina anti-betal y anti-beta2 se utilizaron a 10 \mug/mml y se incubaron con células a +4°C, 30 minutos antes del ensayo. Las quimeras recombinantes mICAM-1 Fc, las quimeras recombinantes mVCAM-1 Fc y las quimeras recombinantes de selectina mP Fe se recubrieron a 2 \mug/ml (R&D systems). Para los estudios sobre la circulación, se vigilaron las células perfundidas mediante grabación en vídeo y se contaron las células móviles sobre 9 campos distintos para cada subconjunto de células T fluorescentes.
Pruebas de migración in vivo
En primer lugar se marcaron los linfocitos T mediante colorantes fluorescentes. Se incubaron las células Th1, Th2 y Tr1 a una concentración de 2\cdot10^{6} células / ml en PBS IX y se marcaron o bien con 1 \mug/ml de calceína, AM; 2 \mug/ml de CMTMR naranja o bien 2 \mug/ml de azul de calceína, durante 30 minutos a 37°C. A continuación se lavaron las células dos veces en PBS IX (Life Technologies). Se mezclaron las suspensiones celulares fluorescentes. Los ratones recibieron por vía intravenosa 100 \mul de PBS IX que contenían 1 millón de cada población de células. Veinticuatro horas después de la transferencia de células, se analizó la distribución en tejidos de células fluorescentes mediante citometría en un aparato FACS SE (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, Francia). Con el fin de analizar de manera específica las células T inyectadas, la adquisición de FACS se realizó sobre un portaobjetos definida en parámetros SSC-FSC (SSC para "side light scatter" ("dispersión lateral"); y FSC para "forward light scatter" ("dispersión frontal")) de células fluorescentes mezcladas extraídas antes de la transferencia de células. Se evaluó el número de Th1, Th2 o Tr1 en cada órgano para un total de 10^{6} células adquiridas. Para el bloqueo de la LFA-1, se utilizó la quimera ICAM 1Fc (R&D systems) a 10 \mug/ml durante 30 min a +4°C, antes de la inyección de células.
Sensibilidad de contacto a la oxazolona
Se realizó la sensibilidad de contacto a la oxazolona (Sigma, L'Isle de Abeau, Francia) aplicando 20 \mul de una disolución de oxazolona de 50 mg/ml en aceite de oliva/acetona (4:1, vol:vol) por vía epicutánea en la oreja derecha una vez al día durante tres días. La oreja izquierda sólo recibió el vehículo. Se vigiló el espesor de la oreja todos los días.
Quimiotactismo in vitro
Antes de la migración, se marcaron en primer lugar las células Th1 y Th2 mediante calceína, AM y CMTMR naranja tal como se describió anteriormente. Las células Tr1 permanecen sin marcar. 10^{5} de las células de cada población en 150 \mul de RPMI calentado, Hepes 20 mM, un 1% de FCS (todos de Life Technologies) se aplicaron en un inserto entre pocillos de poros de 5 \mum (Corning Costar, Brumath, Francia). Sólo se distribuyeron 600 \mul de medio de migración o depósito SDF-1/CXCL12 (Prepotech, Rocky Hill, NJ), Mig/CXCL9 o SLC/CCL21 (R&D systems) a la cámara inferior, al lado del inserto entre pocillos. Tras 3 horas a 37°C, se recogieron las células que habían migrado en dirección de la cámara inferior y se analizó mediante citometría la migración diferencial de cada población de células.
Prueba RT-PCR cuantitativa en tiempo real
Se preparó el ARN total empleando TRIZOL (Life Technologies) y se digirió cualquier ADN cromosómico contaminante potencial mediante ADNasa 1 según las instrucciones del fabricante (Gene Hunter, Nashville, TX). Después, se realizó la transcripción inversa del ARN empleando obligo(dT)12-18 y la transcriptasa inversa de Superscript II (Life Technologies). Se realizó la PCR cuantitativa en tiempo real con el kit de reactivos PCR verde SYBR en las placas de microtitulación especiales de 96 pocillos ópticas (Applied Biosystems, Courtaboeuf, Francia) en un sistema de detección de secuencias ABI PRISM 5700 (Applied Biosystems), según las instrucciones del fabricante. Se generaron señales de fluorescencia en el transcurso de cada ciclo de PCR mediante incorporación directa del ADN de cadena doble de verde SYBR con el fin de proporcionar una información de PCR cuantitativa en tiempo real. Los cebadores (MWG Biotech, Ebersbert, Alemania) se diseñaron para medir las uniones exón-intrón con el fin de evitar la amplificación de ADN genómico y para obtener amplímeros de entre 100 y 150 pb con el fin de aumentar la eficacia de la amplificación por PCR. Todos los cebadores se usaron en condiciones que evitaron la formación de dímeros y la exactitud de los productos amplificados se sometió a prueba mediante electroforesis y los mapas de digestión mediante enzimas de restricción. Se valoraron todos los ADNc sobre el valor de la expresión media de 4 genes domésticos diferentes. Las condiciones de PCR eran de 10 min a 94°C, 40 ciclos de 30 seg a 94°C, 30 seg a 60°C y 30 seg a 72°C para cada amplificación en un volumen final de 20 \mul. Se midió la expresión de genes diana tras la normalización de las concentraciones de ARN con 4 genes domésticos diferentes y los valores se expresan en aumento de la expresión por encima de un control negativo.
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Ejemplo 2 Caracterización de las células T CD4^{+}CD18^{bright}CD49b^{+} T como células Tr1 en el ratón Análisis FACS de las células TCD4^{+}CD18^{bright}CD49b^{+} a partir de una muestra biológica de esplenocitos murinos
Se marcaron esplenocitos de ratones BALB/c con anticuerpos anti-CD3 conjugados con FITC, anticuerpos anti-CD4 conjugados con PCS y anticuerpos anti-CD18 conjugados con PE. El análisis FACS de las células T CD3+CD4+ muestra la presencia de una población que puede sobreexpresar el antígeno CD18 y que representa el 14% de la totalidad de las células T CD4+ (figura 1A). Se marcaron esplenocitos de ratones BALB/c con anticuerpos anti-CD4 conjugados con PC5, anticuerpos anti-CD18 conjugados con PE y anticuerpos anti-CD49b conjugados con FITC. El análisis FACS de las células T CD4+ muestra que el 35% de las células T CD18^{bright}CD4^{+} en el ratón sobreexpresa igualmente el antígeno CD49b (figura 1B).
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Perfil de producción de las citocinas por las células T CD4^{+}CD18^{bright}CD49b^{+}
Se clasificaron células T CD4^{+}CD18^{bright}CD49b^{+} mediante la técnica FACS tras la detección de CD4, CD18 y CD49b de los esplenocitos de ratones BALB/c. A continuación se activaron las células T CD4^{+}CD18^{bright}CD49b^{+} in vitro con ayuda de anticuerpos marcados anti-CD3 (10 \mug/ml) y de anticuerpos solubles anti-CD28 (1 \mug/ml). Se recuperaron los sobrenadantes tras 48 horas de cultivo y se realizó una prueba ELISA para determinar la presencia de IL-10, de IL-4 y de IFN\gamma. Los resultados muestran que las células T CD4^{+}CD18^{bright}CD49b^{+} T presentan el mismo perfil de producción de citocinas que las descritas para los linfocitos T Tr1 (producción importante de IL-10, producción de IFN\gamma y ausencia de producción de IL-4) (figura 1C).
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Estudio proliferativo de las células T CD4+ mediante incorporación de ^{3}H-timidina
Se cultivaron las células T clasificadas CD4^{+}CD18^{bright}CD49b^{+} o CD4^{+}CD18^{bright}CD49b^{-} y las células CD4+ en presencia de esplenocitos irradiados y de anticuerpo soluble anti-CD3 (10 \mug/ml). Se separaron las dos poblaciones celulares mediante una membrana de policarbonato (poros de 0,4 \mum). Tras tres días de cultivo, se midió la proliferación de la población total de células T CD4+ por medio de la incorporación de 3H- timidina. Estos experimentos muestran que las células T CD4^{+}CD18^{bright}CD49b^{+} pueden inhibir la proliferación de las células T CD4+ vecinas ("bystander") según un mecanismo dependiente de factores solubles, mecanismo específico de las células Tr1 (figura 1D).
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Inyección de células T CD4^{+}CD18^{bright}CD49b^{+} en ratones que presentan una inflamación de la oreja
Se indujo hipersensibilidad retardada cutánea al hapteno oxazolona en ratones BALB/c mediante aplicación epicutánea de hapteno. A los ratones tratados con oxazolona se les inyectaron células T clasificadas CD4^{+}CD18^{bright}CD49b^{+} a partir de ratones transgénicos D01.1- 10 para un TCR ("T-Cell Receptor" ("receptor de células T")) anti-ovoalbúmina. A continuación se trataron o no los ratones con el lipopéptido ovoalbúmina a nivel de la oreja inflamada con el fin de activar específicamente las células inyectadas. Se midió la hinchazón de la oreja con el tiempo a partir de la inyección celular y durante cuatro días. Los resultados muestran que las células T CD4^{+}CD18^{bright}CD49b^{+} pueden inhibir in vivo la inflamación cutánea únicamente cuando se activan con el lipopéptido ovoalbúmina. Estos resultados están en correlación con el efecto inhibidor in vivo de los clones celulares T Tr1 en el mismo modelo patológico (figura 1E).
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Estudio proliferativo de las células T CD4+ en ratones que padecen la enfermedad del intestino tras la inyección de las células T CD4^{+}CD18^{bright}CD49b^{+}
Se inyectaron ratones SCID con CD4+CD45RB^{high} para inducir la enfermedad inflamatoria del intestino. Se trató igualmente un grupo de ratones con células T clasificadas CD4^{+}CD18^{bright}CD49b^{+} a partir de ratones transgénicos DO11-10 y alimentados con ovoalbúmina. Ocho días después de la inyección celular, se analizó la proporción de células T CD4+ en la mucosa del colon mediante citometría de flujo. Mientras que los ratones control presentan una inflamación grave del colon y una proporción elevada de células T CD4+ en el interior del infiltrado celular, los ratones tratados con las células T CD4^{+}CD18^{bright}CD49b^{+} están protegidos de la inflamación y tienen una pequeña infiltración de células T CD4+ a nivel del colon. Estos experimentos muestran que como células T Tr1, las células T CD4^{+}CD18^{bright}CD49b^{+} pueden proteger a los ratones de la enfermedad inflamatoria del intestino (figura 1F).
Ejemplo 3 Caracterización de las células Tr1 CD4^{+}CD18^{bright}CD49b^{+} T en el ser humano Análisis FACS de las células T CD4^{+}CD18^{bright}CD49b^{+} a partir de una muestra biológica de células PBMC
Se separaron células mononucleares de sangre periférica mediante centrifugación en un gradiente de Ficoll y se marcaron con anticuerpos anti-CD4 conjugados con APC, anticuerpos anti-CD3 conjugados con PC5, anticuerpos anti-CD18 conjugados con PE y anticuerpos anti-CD49b conjugados con FITC. El análisis FACS de las células T CD3+CD4+ muestra la presencia de una población que puede sobreexpresar el antígeno CD18 y que representa el 20% de las células T CD4+CD3+ en la sangre humana (figura 2A). El análisis FACS de las células T CD3+CD4+ muestra que las células T CD18^{bright}CD4+ en la sangre humana sobreexpresan igualmente el antígeno CD49b (figura 2B).
Perfil de producción de las citocinas por las células T CD4^{+}CD18^{bright}CD49b^{+}
Se separaron las células T humanas CD4^{+}CD18^{bight} mediante clasificación celular según la técnica FACS tras el marcaje de CD4 y CD18 de las células mononucleares sanguíneas. A continuación se activaron las células T CD4^{+}CD18^{bright} in vitro con el anticuerpo marcado anti-CD3 (10 \mug/ml) y anticuerpos solubles anti-CD28 (1 \mug/ml). Se recuperaron los sobrenadantes tras 48 horas de cultivo y se realizó una prueba ELISA para detectar la presencia de IL-l0, de IL-4 y de IFN-\gamma. Los resultados muestran que las células T humanas CD4^{+}CD18^{bright}, como sus homólogos murinos, presentan el mismo perfil de producción de citocina que el descrito para los linfocitos T Tr1 (producción importante de IL-10, producción de IFN\gamma y ausencia de producción de IL-4) (figura 2C).
Análisis FACS comparativo de las células T CD4^{+}CD18^{bright}CD49b^{+} presentes en sujetos sanos y en pacientes que padecen la enfermedad de Crohn
Se comparó la proporción de células T CD4^{+}CD18^{bright}CD49b^{+} en la sangre entre sujetos sanos y pacientes que padecen la enfermedad de Crohn. El análisis de las células T CD3+CD4+ muestra, con respecto a un sujeto representativo de cada grupo, que la proporción de células T CD4^{+}CD18^{bright}CD49b^{+} está disminuida en los pacientes que padecen la enfermedad de Crohn (figura 2D).
Población de células T CD25+ CD4+ y de células T CD4^{+}CD18^{bright} en sujetos sanos y pacientes que padecen la enfermedad de Crohn
La proporción de células T CD4^{+}CD18^{bright} en los sujetos sanos y en los pacientes que padecen la enfermedad de Crohn corresponde inversamente a la de las células T activadas CD25+ CD4+, tal como muestra la citometría de flujo. Los pacientes que padecen la enfermedad de Crohn (n=4) muestran un aumento del número de células T sanguíneas CD25+ CD4+ y una disminución del número de células T CD4^{+}CD18^{bright} en comparación con los sujetos sanos (n=5) (figura 2E).
Ejemplo 4 La sobreexpresión de un conjunto de moléculas de adhesión sobre los linfocitos Tr1 reguladores permite su migración específica hacia los tejidos inflamados
Actualmente existe una prueba incontestable de una subpoblación de células T CD4+ reguladoras que, in vivo, modula las respuestas inmunopatológicas nocivas. Estas células tienen las ventajas terapéuticas potenciales para tratar enfermedades autoinmunitarias pero aún se desconoce un gran número de los principales aspectos de sus mecanismos reguladores, particularmente en lo que se refiere a su comportamiento migratorio, su sitio de acción exacto y las vías moleculares implicadas en estos mecanismos. En dos modelos diferentes de inflamación, se compararon los esquemas de migración de las células Tr1 con respecto a los de las células efectoras Th1 y Th2 obtenidas tras la diferenciación in vitro. Se demostró que las células Tr1 migran preferiblemente hacia tejidos inflamados y muy poco hacia órganos inmunitarios secundarios, al contrario que las células Th1 y Th2. El análisis de todos los receptores de quimiocinas conocidos no reveló expresión específica que pudiera explicar la migración específica de las células Tr1. No obstante, en condiciones de flujo, las células Tr1 humanas o de ratón tienen un aumento de fijación sobre el endotelio vascular inflamatorio. El análisis de las moléculas de adhesión reveló un diseño molecular específico en las células Tr1 con función y expresión reguladas por incremento de PSGL-1, LEA-1, alfaV/beta3 y PECAM-1. Estos resultados indican que las células Tr1 representan un subconjunto de células T reguladoras especializadas en el control de los sitios inflamatorios.
Las células Tr1 migran preferiblemente hacia el colon inflamado
En el transcurso de experimentos anteriores, los inventores mostraron que las células Tr1 podían prevenir la inflamación en un modelo de enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) provocado de manera experimental en ratones scid (Groux et al, 1997; Groux et al, Inmunol Today. octubre de 1999; 20(10):442-5). Con el fin de determinar el sitio de acción de las células Tr1 in vivo en el transcurso del control de la IBD, se restablecieron ratones scid CB-17 con células patógenas T^{+} CD4^{+}CD45RB^{hi} para provocar la IBD. Cuatro semanas después de la transferencia, se sometieron a inyecciones por vía intravenosa de diferentes células específicas Th1, Th2 y Tr1 de OVA (2 x 10^{6} células) y se alimentaron con OVA en su agua para beber, una situación en el transcurso de la cual se observó una inhibición completa de la colitis con las células Tr1. Una semana más tarde, se sacrificaron los ratones y se analizó la presencia de células KJ-1,26+ (células T específicas de OVA) en su colon, su bazo y sus ganglios linfáticos mesentéricos. Se observaron numerosas células KJ-1,26+ en el colon inflamado de los ratones tratados con las células Tr1 (figura 3A). Por el contrario, en ratones tratados con células Th1 y Th2 específicas de OVA, se detectaron menos células T CD4+ KJ-1,26+ entre las células que se infiltraron en el colon. El análisis de los ganglios linfáticos mesentéricos drenantes y de los bazos (no representado) reveló una acumulación de células Th1 o Th2 mientras que solamente se observaron algunas células Tr1 (figura 3A). Se observaron resultados similares cuando se inyectaron las diferentes células T en el día 0 al mismo tiempo que las células T patógenas CD4^{+} CD45RB^{hi} T (no representado). Los inventores y otros (Groux et al, 1997; Barrat et al, J Exp Med 2002 Mar 4; 195(5):603-16) mostraron en dos modelos diferentes de inflamación que el antígeno específico (ovoalbúmina) debe inyectarse localmente (por vía oral) en el modelo de IBD (Groux et al, 1997) o por vía intracraneal en el modelo de EAE (Barrat et al, 2002) para introducir el efecto protector de las células Tr1, y que la inyección sistémica del antígeno (inyección i.v. o i.p.) era ineficaz. Estos resultados sugirieron que la activación local de células Tr1 era necesaria. Por tanto los inventores realizaron análisis para ver si se requería igualmente la presencia del antígeno en el sitio de la inflamación para la migración de las células Tr1 en el colon inflamado. Ratones scid CB17 recibieron inyecciones de células T CD4^{+} CD45RB^{hi} y células Tr1 específicas de OVA simultáneamente (figura 3C) o cuatro semanas tras la reconstitución (figura 3B), en presencia o ausencia de OVA. El análisis de las células Tr1 KJ1-26+ inyectadas mediante inmunoquímica (figura 3C) o mediante citometría en flujo (figura 3B) demostró que las células Tr1 migran de manera específica hacia el colon inflamado incluso en ausencia de su antígeno específico. No obstante, fue necesaria la activación del antígeno específico de las células Tr1 para desencadenar su función reguladora tal como se ilustra mediante la infiltración de leucocitos y la inflamación observada en los ratones que no se trataron con ovoalbúmina, a pesar de la presencia de células Tr1 infiltradas (figura 3C).
Teniendo en cuenta que la migración de las células Tr1 no dependía de la presencia de su antígeno específico, los inventores pudieron comparar su migración con células purificadas ex vivo. En primer lugar, con el fin de garantizar que el aumento de migración de las células Tr1 con respecto al de las células Th1 hacia el colon inflamado no se debía a una migración relativamente mala de la población de células Th1 diferenciadas in vitro, los inventores compararon la migración de las células Tr1 en el infiltrado celular total (el 80% de los neutrófilos polinucleares) o de las células T CD4+ purificadas, aisladas a partir del colon inflamado de los ratones scid reconstituidos con células T CD4^{+} CD45RB^{hi} (figura 4A). Se marcaron las diferentes poblaciones de células con diferentes sondas fluorescentes y se coinyectaron por vía intravenosa en ratones scid reconstituidos con células T CD4^{+} CD45RB^{hi} de cuatro semanas. Veinticuatro horas después de la inyección, se analizó mediante citometría de flujo la migración de las células fluorescentes hacia el colon inflamado. Se confirmó el aumento de migración de las células Tr1 hacia los tejidos inflamados ya que su migración hacia el colon inflamado era tres veces superior a la migración de la población total de leucocitos y más de 30 veces superior a la migración de células T CD4+ purificadas aisladas a partir del colon inflamado (figura 4A).
La migración específica de células Tr1 no se limita al intestino inflamado
La inyección de células Tr1, Th1 y Th2 en ratones scid no tratados o en ratones normales BALB/c no reveló tropismos específicos de las células Tr1 hacia los tejidos intestinales normales (datos no representados). Por ello, con el fin de analizar si la migración específica de células Tr1 en ausencia de antígeno se limitaba al tejido intestinal inflamado o si era específica de las señales inflamatorias presentes en cualquier tejido dado, los inventores constituyeron un modelo de inflamación de la piel aplicando oxazolona de hapteno en la piel de la oreja (figura 5A). La inflamación se caracterizaba por una infiltración de leucocitos (figura 5B) a la vez con células T CD4+ CD8+ (no representada).
Con el fin de analizar la migración de las células T en la piel inflamada, se marcaron las células Th1, Th2 y Tr1 mediante calceína fluorescente y se inyectaron 5 días después del tratamiento con oxazolona. De manera similar al modelo de IBD, las células Tr1 presentaron un aumento de la migración hacia la oreja inflamada (figura 5C y D) mediante comparación con las células Th1 y Th2 que migraron preferiblemente hacia los ganglios linfáticos drenantes y el bazo (figura 5C y D). Para cada población, la tasa de células en un tejido dado con respecto al número total de células recuperadas puede tomarse como una medición de la capacidad relativa de esas células para dirigirse hacia esos órganos. Estas tasas se diferencian de manera significativa entre las cuatro poblaciones analizadas: el 90% para las células Tr1, el 60% para las células Th1 y el 30% para las células Th2 en la oreja inflamada, y el 10% para las células Tr1, el 40% para las células Th1 y el 70% para las células Th2 en los órganos linfoides (figura 5E). En total, los datos muestran que las células Tr1 migran hacia los tejidos inflamados y sugieren que la migración especializada de las células Tr1 depende de las señales inflamatorias y no es dependiente de los antígenos ni específica de los tejidos.
Adhesión firme de las células Tr1 sobre las células endoteliales vasculares activadas en condiciones de flujo
La adhesión a las venillas inflamadas es un acontecimiento precoz y esencial en la inclusión de leucocitos circulantes en dirección al sitio de la inflamación. Con el fin de profundizar los análisis de los mecanismos que conllevan el aumento de migración de las células Tr1 hacia los tejidos inflamados, se comparó la interacción entre las células Tr1 y Th1 y las células endoteliales activadas TNF-\alpha. Con el fin de analizar este procedimiento, los inventores realizaron experimentos en una cámara de flujo revestida con una línea celular endotelial vascular activada TNF-\alpha (SVEC4-10) y se analizó mediante imágenes de vídeo la adhesión de las células T con marcaje fluorescente, tal como se describió anteriormente (Ticchioni et al, FASES J. febrero de 2001; 15(2):341-50). En cuanto a los experimentos in vivo, se utilizaron colorantes fluorescentes para marcar las células Tr1 y Th1 de ratón. Se mezclaron las células T en igual número y se realizó la perfusión sobre una monocapa de SVEC4-10 con un caudal de 2 dyn/cm^{2}. Los resultados mostraron que las células Tr1 tenían una capacité aumentada de fijarse sobre células endoteliales vasculares activadas en comparación con las células Th1 (figura 6A y B). En el transcurso de experimentos similares, las células Th2 mostraron una fijación mínima sobre células endoteliales activadas (no representado).
Con el fin de confirmar que esta adhesión firme a las células endoteliales vasculares activadas es una marca de las células Tr1, los inventores realizaron experimentos en cámara de flujo similares sobre células humanas Tr1, Th1 y Th2 (Tabla 1) (Groux et al, 1997; Lecart et al, J Invest Dermatol. agosto de 2001; 117(2):318-25). Se marcaron las células humanas Th1, Th2 y Tr1 aisladas a partir de diferentes donantes mediante diacetato de fluoresceína fluorescente verde y se realizó la perfusión por separado sobre una línea celular transformada humana previamente activada mediante TNF-\alpha. La figura 8C muestra que las células humanas Tr1 presentan niveles superiores de fijación firme sobre células endoteliales activadas en comparación con las células Th1 y Th2. Este resultado sugiere que la acumulación de células Tr1 observada en los tejidos inflamados in vivo se debe en parte al aumento de adhesión de las células circulantes Tr1 al endotelio activado.
Mecanismo de adhesión de las células Tr1
En primer lugar se analizó el acontecimiento precoz de la adhesión, la fase móvil. Se comparó el número de células móviles en el transcurso de pruebas en cámara de adhesión de flujo entre diferentes células Tr1 y Th1 marcadas con calcelna fluorescente. Se hizo circular un mayor número de linfocitos Tr1 sobre células endoteliales activadas en comparación con los linfocitos Th1 (figura 7A). Teniendo en cuenta que la selectina P es una molécula importante que conlleva la circulación de los linfocitos T en venillas inflamadas in vivo (Hirata et al, J Exp Med. 4 de diciembre de 2000; 192(17):1669-76), se numeró el número de células móviles Tr1 y Th1 en las láminas recubiertas con selectina P. Los linfocitos Tr1 presentaron capacidades de circulación superiores en la selectina P con respecto a las células Th1 (figura 7A). El aumento de la circulación de las células Tr1 en las láminas recubiertas con selectina P está en correlación con el aumento de la expresión de ARNm de los PSGL-1 ("P-selectin glycoprotein-ligand-1" ("Ligando 1 de glicoproteína de selectina P")) a la vez en las células Tr1 humanas y de ratón (figura 8A y B). Estos resultados sugieren que la sobreexpresión de PSGL-1 en las células Tr1 desempeña un papel importante en la capacidad superior de estas células para migrar hacia los tejidos inflamados.
Los LFA-1/ICAM-1 y VLA-4/VCAM son mediadores importantes de la adhesión de las células T en el transcurso del proceso inflamatorio (Alon et al, Semin Inmunol. abril de 2002; 14(2):93-104). En consecuencia, se determinó la contribución a la vez de los LFA-1 y VLA-4 al aumento de adhesión de las células Tr1 al endotelio activado. Utilizando pruebas de adhesión de cámara de flujo recubierta con ICAM-1 recombinado como sustrato, se observó un aumento de adhesión de las células Tr1 al ICAM-1 en comparación con las células Th1. Estos resultados están en correlación con los obtenidos con células endoteliales activadas, lo que sugiere que la interacción LFA-1/ICAM-1 desempeña un papel preponderante en la adhesión de las células Tr1 al endotelio inflamado (figura 7B).
El importante papel de la LFA-1 en la adhesión de las células Tr1 se confirmó mediante los experimentos utilizando anticuerpos bloqueantes de cadena de integrina anti-beta-2 que inhibieron la fijación de las células Tr1 en el endotelio activado en los experimentos en cámara de flujo (figura 7C) y mediante experimentos in vivo en los que la incubación previa de células Tr1 con moléculas ICAM-Fc inhibió su migración hacia las orejas inflamadas (figura 7D). A diferencia del papel principal desempeñado por la LEA-1, la interacción VLA-4/ICAM-1 no parece ser importante para la adhesión de las células Tr1 ya que las células Tr1 no se fijan en las láminas recubiertas con VCAM-1 (figura 7B). Además, el anticuerpo bloqueante anti-beta1 o la VCAM-1 soluble no impidieron la fijación de las células Tr1 en el endotelio activado mientras que inhibieron la adhesión de las células Th1 (figura 7C).
Expresión de moléculas de adhesión en células Tr1
Con el fin de realizar el estudio sobre los mecanismos que explican la migración selectiva de las células Tr1 in vivo, se realizó un análisis cuantitativo completo de las moléculas de adhesión más conocidas sobre varias células Tr1, Th1 y Th2 humanas y de ratón (figura 8A y B). De acuerdo con los estudios funcionales, se observó una sobreexpresión del ARNm de las cadenas \alphaL y \beta2 de la integrina (LFA-1) en células Tr1 en comparación con otras poblaciones de células analizadas. Este resultado se confirmó mediante una citometria en flujo mientras que la expresión de la membrana a la vez alfaL y beta2 se reguló por incremento en los linfocitos Tr1 en comparación con las células Th1 y Th2 (figura 8C). Se observaron igualmente expresiones S de membrana y ARNm superiores de la molécula CD31/PECAM-1 en células Tr1 (figura 8A y B) en comparación con las células Th1 y Th2 (figura 8B). La molécula CD31/PECAM-] desempeña un papel crucial en la diapédesis (Liao et al, J Exp Med. 7 de abril de 1997 7; 185(7):1349-57); una expresión más elevada de esta molécula en células Tr1 podría facilitar su paso en el compartimento subendotelial. Los inventores encontraron igualmente expresiones de genes y de membranas más elevadas de las dos cadenas de la integrina alfa V y beta3 (figura 8A, B y C) que producen una vez dimerizadas un receptor de fibronectina, de vitronectina y de otros componentes de la matriz extracelular (Huang et al, Oncogene. 6 de abril de 2000; 19(15):1915-23). Igualmente se confirmó una expresión de membrana más elevada de alfa V en células Tr1 humanas (figura 8B). La expresión elevada de alfaV/beta3 en células Tr1 podría acelerar su avance desde el compartimento subendotelial en dirección a los otros compartimentos celulares en el interior del órgano inflamado.
Discusión
Los inventores mostraron así que las células Tr1 presentan una capacidad aumentada y selectiva para migrar hacia los tejidos inflamados. Esta migración específica de células T Tr1 en los órganos inflamados tal como se observó in vivo en dos modelos diferentes no depende del tipo de tejido, ya que se observó de la misma manera en el colon y en la piel inflamados, ni del tipo de inflamación, ya sea inducida por células T Th1 CD4+ en el modelo de IBD (Powrie, Immunity. octubre de 1994; 1(7):553-62) o principalmente por células T CD8+ en el modelo irritante de la piel (Kehren et al, J Exp Med. 1 de marzo de 1999; 189(5):779-86; Bour et al, Acta Derm Venereol mayo de 1995, 75(3):218-21) y no depende de la presencia del antígeno específico. Estos resultados sugieren que las señales inflamatorias, generadas en la mayor parte de los tejidos y en el transcurso de diferentes tipos de respuestas inmunitarias, pueden desencadenar rápidamente la inclusión de células Tr1 y que, en correlación con sus capacidades migratorias, el efecto inhibidor de estas células se produce localmente y de manera selectiva en tejidos inflamados periféricos. Resulta interesante observar que estudios recientes confirmaron indirectamente estas observaciones utilizando dos modelos diferentes de trasplante: los autores mostraron que las células T reguladoras están enriquecidas en el interior de los injertos tolerados mediante comparación con tejidos linfoides secundarios (Sawitzki, Transplant Proc. mayo de 2001; 33(3):2092-3; Graca, J Exp Med. 17 de junio de 2002; 195(12):1641-6). Este tropismo selectivo hacia los órganos inflamados periféricos ayuda a explicar una de las paradojas de la función de la célula reguladora T. En efecto, desde ahora resulta evidente que las células T reguladoras funcionan mediante un mecanismo de supresión de sus proximidades inducida por el antígeno, lo que significa que las células T reguladas y reguladoras deben estar muy próximas pero no reconocen necesariamente al mismo antígeno (Groux et al, 1997). Además, varios informes sugirieron que las células T reguladoras naturales están dirigidas contra sí mismas o los antígenos comúnmente encontrados (Cong et al, J Inmunol. 1 de diciembre de 2002; 169(11):6112-9). En consecuencia, cabe preguntarse cómo los mecanismos de protección, que dependen de células T reguladoras, permiten todavía el desarrollo de respuestas inmunitarias beneficiosas frente a los patógenos in vivo. La mala migración de células Tr1, en comparación con las células efectoras T Th1 y Th2, en dirección de los órganos linfoides secundarios, en los que comienzan las respuestas inmunitarias de protección, puede explicar estas observaciones.
La migración de leucocitos del flujo sanguíneo hacia los tejidos se facilita por un proceso con varias fases que, en numerosas ocasiones, implica (i) la captura y la circulación de leucocitos por selectinas, (ii) la activación rápida de las integrinas de leucocitos, (iii) la adhesión a ligandos endoteliales a través de las integrinas activadas y (iv) la diapédesis (Kubes, Semin Inmunol. abril de 2002; 14(2):65-72. Review; Springer, Cell. 28 de enero de 1994; 76(2):301-14. Review; Butcher et al, Science. 5 de abril de 1996; 272(5258):60-6. Review). Se mostró que las quimiocinas y los receptores de quimiocinas aportan una contribución importante a la quimioatracción de los subconjuntos selectivos de leucocitos en diferentes tejidos pero igualmente para la activación de las integrinas sobre leucocitos con el fin de inducir una fijación firme sobre las células endoteliales activadas (Constantin et al, Immunity. diciembre de 2000; 13(6):759-69; Campbell, Science. 16 de enero de 1998; 279(5349):381-4). No obstante, el análisis de la expresión de los receptores de quimiocinas sobre las células Tr1, Th1 y Th2 revela una regulación por disminución sorprendente en la expresión de todos los receptores de quimiocinas conocidos sobre las células Tr1, mediante comparación con las células Th1 y Th2. Esta regulación por disminución se confirmó mediante una migración decreciente en respuesta a las quimiocinas implicadas en la inflamación (MIG) o en el direccionamiento hacia los órganos linfoides (SLC y SDF-1) (Baggiolini, 1998). Estos resultados sugieren que ninguna sobreexpresión de un receptor particular de quimiocinas puede explicar la migración específica de las células Tr1 en dirección a los sitios inflamatorios. A pesar de esta falta de sobreexpresión de los receptores de quimiocinas, las células Tr1 a la vez humanas y de ratón presentan una adhesión más elevada sobre células endoteliales vasculares activadas en comparación con las células Th1 y Th2.
Los inventores observaron en primer lugar que las células Tr1 presentaban capacidades de circulación sobre células endoteliales vasculares activadas y la selectina P con flujo. Igualmente se observó una mejor fijación firme de las células Tr1 sobre células endoteliales vasculares activadas en comparación con los linfocitos Th1. En el transcurso del estudio profundo de los mecanismos de adhesión aumentada de las células Tr1 sobre células endoteliales vasculares activadas, se observó que la expresión de la membrana y la función de LEA-1 estaban reguladas por incremento en células Tr1 en comparación con otros subconjuntos de células T. La importancia del papel de LEA-1 para la migración específica de las células Tr1 se confirmó en un entorno in vivo en el que los LEA-1 bloqueantes por las moléculas ICAM-Fc inhibieron la migración de las células Tr1 en dirección al tejido inflamado.
De hecho, un análisis completo de la expresión de las moléculas de adhesión en subconjuntos de células T CD4+ reveló que las células Tr1 sobreexpresan un conjunto específico de moléculas de adhesión que colaboran para inducir su migración hacia los tejidos dañados, PSGL-1, LFA-1, alfaV/beta3 y PECAM-1. En efecto, la sobreexpresión de PSGL-1 aumenta la capacidad de circulación de las células Tr1. Se demostró que el LEA-1 está implicado en las etapas de fijación y de extravasación. La PECAM-1 es igualmente una molécula altamente implicada en la etapa de extravasación y finalmente, la alfaV/beta3 induce la migración de las células al interior de los tejidos a través de la matriz extracelular (Liao et al, 1997; Huang et al, 2000). Resulta interesante observar que de manera controvertida con respecto a la sobreexpresión de varias moléculas de adhesión, las células Tr1 tienen una capacidad decreciente para adherirse a VCAM-1 en comparación con las células Th1. Aunque la expresión de la VCAM-1 está inducida en sitios inflamatorios, se notificó igualmente que la VCAM-1 es una molécula central en la generación de las respuestas humerales a través de las interacciones de las células T-B. Los inventores han formulado por tanto la hipótesis de que la ausencia de la función VLA-4 sobre los linfocitos Tr1 puede garantizar que las células reguladoras T queden excluidas de los compartimentos de las células B en el transcurso del inicio de respuestas inmunitarias con mediación de células B (Leuker et al J Exp Med. 19 de marzo de 2001; 193(6):755-68).
TABLA 1 Perfil de citocina de los clones y poblaciones de células T diferentes utilizadas
1
2
Los clones de células T y las poblaciones de células T humanas y de ratón se generan tal como se describe a continuación. Se estimularon las células T murinas con péptido de OVA (0,6 \muM) y esplenocitos totales irradiados (2x10^{6} células/ml). Se analizaron las citocinas mediante ELISA en sobrenadantes de cultivo recuperados tras 24 h para IL-2 e IL-4 y tras 48 h para IL-10 e IFN-\gamma. Se activaron los clones de las células T humanas con anticuerpos monoclonales reticulados anti-CD3 (10 \mug/ml) y anti-CD28 (1 \mug/ml), se recuperaron los sobrenadantes tras 24 h para IL-2 e IL-4 y tras 48 h para IL-10 e IFN-\gamma. Los resultados representan datos combinados de los 3 experimentos representativos.
Ejemplo 5 Procedimiento de preparación de células T y de células dendríticas para la caracterización de las células Tr1 CD4^{+}CD18^{bright}CD49b^{+} Procedimientos experimentales Ratones
Los ratones BALB/cAnN se obtuvieron del CERJ (Le Genest Saint Isle, Francia), los ratones DO11-10 homocigóticos fueron una generosa donación del Dr S. D. Hurst (DNAX Research Institute, Palo Alto, CA). Los ratones transgénicos BALB/c IL-10 se obtuvieron utilizando el ADNc de hIL-10 bajo el control del promotor 10 del CMH de clase II Ea. Se criaron todos los animales en las condiciones asépticas habituales, en nuestro animalario. Todos los ratones eran hembras de 4 a 8 semanas de edad al comienzo de cada experimento.
Medio, anticuerpos y reactivos
El medio utilizado para los cultivos de células T fue el medio Yssel (Yssel et al., 1984). Se cultivaron las células dendríticas en RPMI 1640 complementado con el 10% de SVF (Roche, Meylan, Francia), 2 mM de L-glutamina, 1% de piruvato de sodio, 2 x 10^{-5} M de \beta2-mercaptoetanol (todos de Invitrogen). Para la purificación de las células dendríticas, los inventores utilizaron medio HBSS sin Ca^{++} ni Mg^{++} que contenía 2 mM de EDTA (todos de Invitrogen) y colagenasa D (Roche, Meylan, Francia).
El GM-CSF, el TNF-\alpha y la IFN-\gamma recombinantes de ratón procedían de R&D Systems, Abington, R.U. La IL-10 y la IL-4 recombinantes de ratón las ofreció generosamente el Dr R. L. Coffman, DNAX Research Institute, Palo Alto, CA.
La purificación y la caracterización de las DC se realizaron por medio de anticuerpos anti-CD3 (17A2), anti-CD4 (GK1.5) anti-CD8 (53-6.7), anti-CD11b (M1/70), anti-CD11c (HL3), CD28 (37.51) anti-I-Ad (AMS-32.1), anti-CD62L (Mel-14), anti-CD80 (16-10A1), anti-CD86 (GL1), anti-B220 (RA3-6B2), CD45RB (16A), anti-Grl (RB6-8C5) (todos de Pharmingen Becton Dickinson) y de DEC-205 (NLDC-145) (Serotec, R.U.).
Las dosificaciones de citocinas se realizaron por medio de anticuerpos anti-TL-4-PP o -FITC (1lB11), anti-IFN-\gamma-PE (XGM1.2), anti-IL-10-FITC (JES-16E3), anti-IL-4 (11B11) y anti-IL-10 (2A5) purificados, anti-IFN-\gamma (XGM1.2) y anti-IL-4 (24G2), anti-IL-lO (SXC1), anti-IFN-\gamma (R4-6A2) biotinilados (todos de Pharmingen Becton Dickinson).
Los anticuerpos anti-IgE (R35-72) y anti-IgG1 (A85-1) utilizados para el análisis de las IgG séricas específicas de la OVA eran de Pharmingen Becton Dickinson.
El tampón de lisis, la metrizamida, el LPS, el péptido OVA_{323-339}, la ovoalbúmina y la alúmina fueron de Sigma, Saint Quentin Fallavier, Francia.
Citometría de flujo
El análisis fenotípico de los subconjuntos de DC se realizó mediante coloración doble o triple con anticuerpos biotinilados anti-CD11c, seguido por estreptavidina-Cy-Chrome, por anticuerpos anti-CD45RB acoplados con PE y por un tercer anticuerpo acoplado con FITC. Todas las etapas de coloración se realizaron a 4°C en tampón PBS con un 0,1% de SAB y 0,02 mM de NaN_{3}. Después de tres lavados, se analizaron las células marcadas en un instrumento FACScan (Becton Dickinson).
Coloración de las citocinas intracelulares
El análisis de las citocinas intracelulares mediante citometria de flujo se realizó tal como se describe (Groux et al., 1997). Se activaron las células (10^{6}/ml) durante 6 h con AcM anti-CD3 y anti-CD28 inmovilizados. Se añadió monensina 10 \mug/ml y, 4 h más tarde, se recogieron las células, se lavaron y se fijaron en formaldehído al 2%. Para la coloración intracelular, se incubaron las células con los siguientes AcM: anti-IL-4-FITC o -PE, anti-IFN-\gamma-PE y anti-IL-10-FITC, o anticuerpos control de isotipo correspondiente, todos a 5 \mug/ml. Se analizaron las muestras en un instrumento FACScan (Becton Dickinson).
Células dendríticas derivadas de la médula ósea (DC-MO)
Se generaron las DC-MO a partir de progenitores medulares, tal como se describió anteriormente, con algunas modificaciones (Inaba et al., 1992). Resumidamente, se extrajo la médula ósea mediante aclarado de tibias y fémures antes de eliminar los glóbulos rojos con el 0,83% de cloruro de amonio. Se cultivaron las células a 37°C, sobre placas de 24 pocillos (Becton Dickinson) (10^{6} células/ml/pocillo), en medio RPMI completo complementado con 10 ng/ml de GM-CSF recombinante murino y 2,5 ng/ml de TNF-\alpha recombinante murino, con o sin IL-10 recombinante murina (500 ng/ml). Se recogieron las DC-MO el día 6.
Purificación de las células dendríticas esplénicas
Se cortaron bazos en fragmentos pequeños que se digirieron mediante colagenasa (1 mg/ml) en HESS durante 20 min a 37°C, con agitación constante. Se filtraron los fragmentos digeridos sobre una rejilla de 0,7 \mum (Becton-Dickinson) y se lavó la suspensión celular dos veces en medio de purificación. Después se depositaron las células en capa sobre un gradiente de metrizamida y se centrifugaron a 600 g durante 10 min. Se recuperaron las células concentradas en la interfase, se lavaron una vez y volvieron a ponerse en suspensión en el medio de purificación, para disociar las DC de los linfocitos. Se redujeron las diferentes líneas de células T, las células B y los granulocitos tratando las células de baja densidad recuperadas, durante 30 min a 4°C, con una mezcla de anticuerpos monoclonales compuesta por anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-B220 y anticuerpo anti-GR-1. Se recuperaron magnéticamente las células positivas, tras la incubación durante 1 h a 4°C con bolas magnéticas recubiertas con Ig anti-rata, en una razón de 10 bolas para 1 célula.
Preparación de las células T transgénicas TCR "vírgenes"
Se prepararon células T esplénicas de ratón DO11\cdot10 transgénicas OVA TCR tal como se describe en otra parte (Groux et al., 1997). Resumidamente, se enriquecieron células T CD4+ mediante selección negativa por medio de bolas magnéticas con una mezcla de AcM anti-CD8, anti-B220 y anti-CD11b, A continuación se clasificaron mediante citometria de flujo las células T CD4+/Mel14^{brigh} utilizando anticuerpos anti-CD4-PE y anti-CD62L-FITC (Mello). Las poblaciones de células T clasificadas eran normalmente positivas al 99% para los dos marcadores.
Diferenciación de las células T transgénicas TCR por las células dendríticas
Se realizaron los ensayos in vitro de diferenciación de las células T en medio Yssel. Los cultivos primarios de estimulación se establecieron procediendo a una activación de células T CD4+ "vírgenes" purificadas (2,5 x 10^{5}) mediante poblaciones de células dendríticas clasificadas, pulsadas con el péptido OVA _{323-339} (0,6 \muM) en un volumen total de 1 ml, sobre placas de 24 pocillos (Becton Dickinson). Se multiplicaron las células, se recogieron el día 7, se lavaron tres veces, se contaron y volvieron a estimularse mediante poblaciones de células dendríticas recién clasificadas + 0,3 \muM de péptido OVA 323-339 para la segunda diferenciación. Se aplicó el mismo procedimiento para el tercer ciclo de diferenciación. Tras la diferenciación, se recogieron las células T, se lavaron y volvieron a estimularse con 0,3 \muM de OVA 323-339 y CPA esplénicas irradiadas. Se midió la proliferación de las células T mediante la incorporación de ^{3}H-timidina en el transcurso de las 12 últimas horas de la incubación de 72 h. Se midió la producción de IL-4, de IL-10 y de IFN-\gamma mediante ELISA en los sobrenadantes recogidos 48 h tras la reestimulación de las células T.
Experimentos Transwell
En el compartimento inferior un sistema Transwell (0,4 \mum Costar-Dutscher, Brumath, Francia), 10^{6} células T CD4+ purificadas aisladas de ratones BALB/c normales se estimularon con 10^{6} esplenocitos irradiados de ratones BALB/c y AcM anti-CD3 (10 \mug/ml). En el compartimento superior, células T CD4+ diferenciadas mediante una estimulación única con células dendríticas se estimularon con 0,3 \muM de OVAp y 10^{6} esplenocitos irradiados. Tres días después, se retiró el panel y se transfirieron (por triplicado) las células T de los pocillos inferiores en placas de 96 pocillos. Se analizó la respuesta proliferativa mediante la incorporación de ^{3}H-timidina en el transcurso de las 12 últimas horas de cultivo.
Citología
Las DC CD11c^{low}CD45RB^{+} y CD11c^{high}CD45RB^{-} clasificadas, generadas in vitro o aisladas de bazos de ratones BALB/c, se incubaron durante 24 h con LPS (1 \mug/ml) en presencia de GM-CSF (10 ng/ml). Se centrifugaron las DC recién clasificadas o estimuladas (Cytospin2, Shandon) y se colorearon con May-Grünwald-Giemsa.
Dosificación mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real
Se preparó el ARN total de los subconjuntos de DC clasificadas (1 x 10^{6}; pureza >99%) con TRIZOL (Life Technologies), tal como se describe en otra parte (Cottrez et al., 1994), y se digirió cualquier resto eventual de ADN cromosómico contaminante mediante ADNasa I, siguiendo las instrucciones del fabricante (Gene Hunter, Nashville, TX). Después se sometió el ARN a una transcripción inversa con un oligo(dT)12-18 y la transcriptasa inversa Superscript II (Life Technologies), tal como se describe en otra parte (Cottrez et al., 1994). Se realizó la PCR cuantitativa en tiempo real con el kit SYBR Green PCR Core Reagents, sobre placas de microtitulación especiales, de 96 pocillos (Applied Biosystems, Courtaboeuf, Francia) en un aparato ABI PRISM 5700 Sequence Detection System (Applied Biosystems), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se generaron las señales de fluorescencia durante cada ciclo de PCR mediante incorporación directa del SYBR Green en la cadena de ADN bicatenario, para proporcionar informaciones cuantitativas en tiempo real. Se diseñaron cebadores (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania) que abarcan las uniones exones-intrones para evitar la amplificación del ADN genómico y proporcionar amplicones de 100 a 150 pb, con el fin de aumentar la eficacia de la amplificación mediante PCR. Todos los cebadores se utilizaron en condiciones que evitaron la formación de dímeros, y se verificó la precisión de los productos de amplificación mediante electroforesis y mapas de restricción enzimática. Se valoraron todos los ADNc sobre el valor de la expresión media de 4 genes ordinarios diferentes ("housekeeping"). Las condiciones experimentales de la PCR fueron las siguientes: 10 min a 94°C, y 40 ciclos de 30 seg a 94°C, 30 seg a 60°C y 30 seg a 72°C para cada amplificación, en un volumen final de 20 \mu1. Se midió la expresión de los genes diana, tras la normalización de las concentraciones de ARN, con los 4 genes ordinarios y los valores se expresan en factores de aumento de la expresión con respecto a un control negativo.
Dosificaciones de las citocinas
Se dosificaron la IL-4, la IL-10 y la IFN-\gamma mediante un método ELISA de tipo sándwich, tal como se describe en otra parte (Cottrez et al., 2000). Resumidamente, se recubrieron placas ELISA (Polylabo, Francia) con AcM anti-citocinas apropiados en tampón carbonato y se incubaron a 4°C durante una noche. Se bloquearon las reacciones durante 30 min a temperatura ambiente con 150 \mul de PBS/SVF al 20% en cada pocillo; a continuación se añadieron a los pocillos 50 \mul de sobrenadantes diluidos de las células T CD4+ estimuladas in vitro, antes de incubar las placas a 4°C durante una noche. Tras una etapa de lavado, se añadieron a cada pocillo 50 \mul del anticuerpo biotinilado de la segunda etapa. Se incubaron las placas durante 1 h a temperatura ambiente y se lavaron. A continuación se añadió a cada pocillo el conjugado enzimático (estreptavidina-peroxidasa). Se incubaron las placas a temperatura ambiente durante 1 h, se lavaron, y se añadieron 100 \mul de sustrato (ABTS, 1 mg/ml) por pocillo. Se leyeron las placas en un lector ELISA a 405 nm, tras la formación del color (Labsystems iEMS reader, Helsinki, Finlandia).
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La IL-10 induce la diferenciación de un subconjunto distinto de DC
Se sabe que la IL-10 induce la diferenciación de las células Tr1 mediante un efecto indirecto (Wakkach et al., 2001). Teniendo en cuenta que las DC son actores esenciales en la diferenciación de las células T, los inventores analizaron el efecto de la IL-10 sobre la diferenciación de las DC a partir de células progenitoras de la médula ósea cultivadas en presencia de GM-CSF y de TNF-\alpha (los experimentos preliminares mostraron que la presencia de TNF-\alpha no influye en el fenotipo y la función de las DC, pero sin embargo ayuda a aumentar el rendimiento y la viabilidad de las poblaciones de células dendríticas [datos no presentados]). La adición de IL-10 en el día 0 del cultivo indujo la diferenciación de una población de DC con una mala expresión de CD11c y una fuerte expresión de CD45RB (figura 9A). En cambio, en ausencia de IL- 10, la adición de GM-CSF y de TNF-\alpha indujo la diferenciación de DC que expresan fuertes concentraciones de CD11c (figura 9A) (Inaba et al., 1992). Tras la clasificación de las células en FACS en función de la expresión específica de CD11c y de CD45RB, las DC CD11c^{low}CD45RB^{+} diferenciadas in vitro presentaban una morfología plasmocitoide, con una membrana plasmática lisa y un núcleo excéntrico (figura 9B-1). Por otro lado, las DC CD11c^{high} tenían una morfología diferente, con presencia de pequeñas dendritas (figura 9B-3). Tras una nueva maduración con LPS, las dos poblaciones adquirieron una morfología de DC completamente maduras, con dendritas largas (figura 9B-2 y 4). El análisis de la expresión de las moléculas del CMH II y de los coestimuladores reveló niveles bajos de expresión de CD80, de CD86 y de I-A en las DC CD11c^{low}CD45RB^{+} (figura 9C) con respecto a las DC CD11c^{high} La maduración de las células dendríticas con LPS no modificó el fenotipo de las DC CD11c^{low}CD45RB^{+} (figura 9C), mientras que reforzó la expresión de las moléculas de CD80, CD86 e I-A en las DC CD11c^{high}. Estos resultados muestran que la IL-10 induce la diferenciación de un subconjunto distinto de DC caracterizadas por la expresión específica de CD45RB, que presentan un fenotipo pseudoinmaduro que no puede modificarse mediante una estimulación con LPS.
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Aislamiento del equivalente natural de las DC derivadas mediante IL-10
Por tanto, los inventores abordaron la cuestión de la influencia de la IL-10 in vivo sobre la diferenciación de las células dendríticas. Se analizaron DC esplénicas enriquecidas aisladas de ratones Tg IL-10 no transgénicos o de ratones BALB/c para determinar la expresión del marcador específico de las DC murinas CD11c (figura 10A). En los ratones Tg TL-10, se observó un mayor número de DC que expresaban débilmente el CD11c con respecto a los ratones BALB/c normales (figura 10A) o a los controles no transgénicos (datos no representados). Tal como para las DC CD11c^{low} diferenciadas in vitro en presencia de IL-10, las DC esplénicas CD11c^{low} expresaban fuertemente el marcador CD45RB (figura 10B). Además, tanto las DC derivadas in vitro como las DC CD11c^{low}CD45RB^{+} esplénicas tienen una morfología plasmocitoide (figura 10C-1), al contrario que las DC CD11c^{high} que presentan pequeñas dendritas (figura 10C-3). Tras una maduración completa con LPS, las dos poblaciones de DC esplénicas se diferencian en DC plenamente maduras con largas dendritas (figuras 10C-2 y 4).
A continuación, los inventores estudiaron la expresión de las moléculas I-A^{d} del CMH y de los coestimuladores CD80 y CD86 sobre las DC esplénicas CD11c^{low}CD45RB^{+} y CD11c^{high}CD45RB^{-} clasificadas en FACS, procedentes de ratones Tg IL-10 y de ratones BALB/c control. Tal como muestra la figura 10D, se constató que las DC CD11^{low}CD45RB^{+} purificadas ex vivo expresaban débilmente las moléculas del CMH de clase II, el CD80 y el CD86, con respecto a las DC CD11c^{high}CD45RB^{-}. Para determinar si las DC CD11c^{low}CD45RB^{+} representan un subconjunto distinto de DC y el producto de una línea de desarrollo separada, o si representan una fase inmadura de DC más convencionales, se indujo la maduración in vitro de las DC aisladas mediante cultivos a corto plazo en presencia de GM-CSF (con el fin de aumentar la vida útil y la tasa de recuperación) y de LPS. En estas condiciones, tras la maduración in vitro con LPS, las DC CD11c^{low}CD45RB^{+} conservaban siempre una baja expresión de las moléculas del CMH de clase II y del CD86, lo que sugiere que su fenotipo pseudoinmaduro es estable, con la excepción de la sobreexpresión del CD80.. En cambio, tras la incubación in vitro con LPS, las DC CD11c^{high}CD45RB^{-} muestran un aumento de la maduración, con aumento de la expresión de las moléculas del CMH de clase II y de los dos coestimuladores (CD80 y CD86) (figura 10D). Globalmente, estos resultados muestran que las DC CD11c^{low}CD45RB^{+} aisladas del bazo representan equivalentes in vivo de las DC derivadas mediante IL-10.
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Caracterización fenotípica y secreción de las citocinas del subconjunto de células dendríticas CD11c^{low}CD45RB^{+}
Para caracterizar mejor el subconjunto de DC CD11c^{low}CD45RB^{+}, los inventores analizaron la expresión de los diferentes marcadores de las células dendríticas en las poblaciones celulares CD11c^{low}CD45RB^{+} y CD11c^{high}CD45RB^{-} clasificadas procedentes de ratones BALB/c (figura 11A). Las DC CD11c^{low}CD45RB^{+} expresan débilmente el CD11b y el DEC 205 y nada del CD8a, lo que sugiere que no pertenecen a la línea "clásica" de las DC mieloides (CD11bhigh) o linfoides (CD8a+) (Shortman and Liu, 2002). Además, al contrario que una población de DC tolerógenas recientemente descrita diferenciada a partir de un precursor de célula B, las DC CD11c^{low}CD45RB^{+} son negativas en B220 (Lu et al., 2001; Martin et al., 2002). Finalmente, estas células no expresan los marcadores específicos de las células T (CD4 y CD2) (datos no presentados).
Una parte importante de la función específica de las DC viene dictada por la secreción de conjuntos distintos de citocinas. Por tanto, los inventores analizaron, mediante RT-PCR cuantitativa, la expresión relativa de varias citocinas importantes sobre células dendríticas CD11c^{low}CD45RB^{+} y CD11c^{high}CD45RB^{-} recién tratadas o activadas mediante LPS. Tras la activación mediante LPS, las DC CD11c^{low}CD45RB^{+} secretaban IL-10 mientras que las DC CD11c^{high}CD45RB secretaban IL-12. Las dos poblaciones mostraron una secreción de IL-1\beta, incluso aumentada mediante la activación mediante LPS, pero no secretaban IFN-a, incluso después de 24 h de activación mediante LPS (figura 11B). Estos resultados muestran que las DC CD11c^{low}CD45RB^{+} representan un subconjunto distinto de células dendríticas que secretan principalmente IL-10 tras la activación.
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Las DC CD11c^{low}CD45RB^{+} diferencian las células Tr1 in vitro
Para analizar la influencia de los diferentes subconjuntos de DC sobre el cebado y la diferenciación de células T específicas que no se han expuesto nunca a OVA ("vírgenes") aisladas de ratones DO11-10, se establecieron varios ciclos de estimulación de las células T con DC CD11c^{low}CD45RB^{+} o CD11c^{high}CD45RB^{-} clasificadas aisladas del bazo de ratones BALB/c (figura 12A) o diferenciadas in vitro (figura 12B). Se estimularon mediante OVA (0,6 \muM) las células T CD4+ "vírgenes" purificadas, a diferentes razones de DC/T, durante una semana. Después se recogieron las células T, se lavaron y se estimularon de nuevo, en las mismas condiciones, con 0,3 \muM de OVA. Tras una tercera estimulación en las mismas condiciones, se recuperaron las poblaciones de células T polarizadas, se lavaron y volvieron a estimularse con esplenocitos irradiados de ratones BALB/c y 0,3 \muM de OVA para analizar su perfil de citocinas (figura 12A). Nuestros resultados muestran que las DC CD11c^{low}CD45RB^{+} purificadas ex vivo o diferenciadas in vitro, independientemente de la razón de DC/T utilizada, inducían la diferenciación de células Tr1 que secretan fuertemente IL-10, débilmente IFN-\gamma y nada de IL-4 (o bien en cantidades despreciables) (Groux et al., 1997) (figuras12 A y B). Al contrario que las células dendríticas CD11c^{low}CD45RB^{+}, las del subconjunto 3 CD11chignCD45RB- actuaban de cebadores para las células Th1 que secretan fuertemente IFN-\gamma (figuras 12A y B). Estos resultados están correlacionaos con el perfil de citocinas de la subpoblación de células dendríticas, es decir CD11c^{low}CD45RB^{+}, que diferencian las células Tr1, secretan IL-10, mientras que la IL-12 secretada por las DC CD11c^{high}CD45RB^{-} induce la diferenciación de las células Th1.
Además, se observó la diferenciación específica de las células Tr1 con las DC CD11c^{low}CD45RB^{+} tras una única estimulación, tal como mostró el análisis intracitoplasmático de la secreción de citocinas en las diferentes subpoblaciones de células T (figura 12C). Para analizar las propiedades funcionales de las células T obtenidas tras una única estimulación mediante DC CD11c^{low}CD45RB^{+}, se realizaron experimentos Transwell. Las células T obtenidas tras la estimulación mediante DC CD11c^{low}CD45RB^{+} de ratones BALB/c inhibieron la proliferación de las células T CD4+ vecinas ("bystander") estimuladas mediante esplenocitos irradiados y un anticuerpo monoclonal anti-CD3 (figura 12D). Por otra parte, la adición de AcM inhibidores de ratón anti-IL-10 y anti-TGF\beta aumentó el efecto supresor de estas células T, confirmando la diferenciación de las células Tr1 en el plano fenotípico y funcional (figura 12D). A título de control, poblaciones de células Th1 (inducidas mediante DC CD11c^{high}CD45RB^{-}) no tuvieron efecto inhibidor sobre la proliferación de las células T CD4+ vecinas (figura 12D). Globalmente, estos resultados muestran que las DC CD11c^{low}CD45RB^{+} inducen la diferenciación de las células Tr1 in vitro.
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Células humanas
Se diferenciaron células dendriticas a partir de células progenitoras CD34+ con GM-CSF e IL-4 en presencia o en ausencia de IL-10, tal como se indica.
Tras 6 días, se clasificaron las células dendríticas en función de la expresión de CD11c y se marcaron con los anticuerpos indicados.
Las células purificadas también se estimularon con LPS durante 24 horas, después se analizaron mediante citofluorometría.
Las células dendríticas tolerógenas diferenciadas en presencia de IL-10 expresaban niveles bajos de CD11c, y niveles bajos de las moléculas HLA-DR, CD80 y CD86.
La activación con LPS no aumentó la expresión de HLA-DR y CD86 para esta población, al contrario que el efecto del LPS sobre otras poblaciones de DC sometidas a prueba.
TABLA Efecto de la activación con LPS sobre las poblaciones de células dendríticas clasificadas diferenciadas en presencia o ausencia de IL-10 
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Claims (26)

1. Procedimiento de identificación de linfocitos Tr1 reguladores presentes en una muestra biológica que comprende linfocitos, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
a) determinar la presencia simultánea de los productos de expresión por dichos linfocitos de los genes que codifican para la molécula CD4 y el conjunto de las moléculas del grupo A, estando dicho grupo A constituido por las moléculas CD18 y/o CD11a, y CD49b; y
b) identificar como linfocitos Tr1 reguladores los linfocitos que expresan simultáneamente los genes que codifican para la molécula CD4 y el conjunto de las moléculas del grupo A.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque:
- en la etapa (a) se compara además la expresión por dichos linfocitos de al menos un gen seleccionado de los genes que codifican para las moléculas del grupo B siguiente: CD11a, CD18, PSGL-1, PECAM-1 y alfaV/beta3, comparándose dicha expresión con la expresión de dicho mismo gen por linfocitos de tipo Th1 o Th2; y
- porque en la etapa (b) se identifican como linfocitos Tr1 reguladores los linfocitos que sobreexpresan al menos uno de dichos genes que codifican para las moléculas del grupo B.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque en la etapa (a) se compara la expresión de al menos dos de dichos genes del grupo B y porque en la etapa (b) se identifican como linfocitos Tr1 reguladores los linfocitos que sobreexpresan los dos dichos genes del grupo B.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque en la etapa (a) se compara la expresión de todos los genes del grupo B y porque en la etapa (b) se identifican como linfocitos Tr1 reguladores los linfocitos que sobreexpresan todos los genes del grupo B.
5. Procedimiento de identificación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque en la etapa (a) se determina además y simultáneamente la presencia de dicho producto de expresión por dichos linfocitos del gen que codifica para la molécula CD3 y porque en la etapa (b) se identifican como linfocitos Tr1 reguladores los linfocitos que expresan además simultáneamente el gen que codifica para la molécula CD3.
6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque en la etapa (a) se determina la presencia simultánea de dichas moléculas del grupo A expresadas en la superficie de dichos linfocitos.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque en la etapa (a) se determina la presencia simultánea de dichas moléculas expresadas en la superficie de dichos linfocitos por medio de anticuerpos específicos de dichas moléculas.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque dichos anticuerpos específicos están marcados por un marcador que puede detectarse de manera directa o indirecta.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque cada uno de dichos anticuerpos está marcado por un marcador diferente.
10. Procedimiento según la reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque dichos marcadores son fluorescentes y se seleccionan del grupo constituido por isotiocianato de fluoresceína (FITC), aloficocianina (APC), ficoeritrinacianina 5 (PC5), ficoeritrina (PE), diacetato de fluoresceína fluorescente verde, calceína AM, y tetrametilrodamina fluorescente roja.
11. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, caracterizado porque en la etapa (a) la determinación de la presencia simultánea de dichas moléculas del grupo A expresadas en la superficie de dichos linfocitos se realiza mediante citometría de flujo.
12. Procedimiento según la reivindicación 10 ó 11, caracterizado porque en la etapa (a) de dicho procedimiento se determina, para la molécula CD18, la presencia de una intensidad de fluorescencia de tipo CD 18bright.
13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 2 a 12, caracterizado porque:
- en la etapa (a) la comparación de la expresión por dichos linfocitos de al menos un gen que codifica para las moléculas del grupo B se realiza mediante comparación de la cantidad de ARNm expresado por dicho gen; y
- porque en la etapa (b) se identifican como linfocitos Tr1 reguladores los linfocitos que sobreexpresan el ARNm de dicho gen.
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14. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque se mide la cantidad de ARNm mediante RT-PCR cuantitativa.
15. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque la muestra biológica procede de una extracción de sangre periférica o de un órgano inflamatorio en un sujeto.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque la extracción se realiza en un sujeto que padece o susceptible de padecer una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado porque dicho sujeto padece la enfermedad de Crohn o esclerosis en placas.
18. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque la muestra biológica procede de un procedimiento de preparación in vitro de linfocitos Tr1 reguladores a partir de una población de linfocitos procedentes de una extracción en un sujeto.
19. Procedimiento según la reivindicación 18, caracterizado porque el procedimiento de preparación de linfocitos Tr1 reguladores comprende al menos una etapa de activación de linfocitos T CD4+ de dicha población de linfocitos en presencia de un antígeno y de interleucina 10.
20. Procedimiento según la reivindicación 18, caracterizado porque el procedimiento de preparación de linfocitos Tr1 reguladores comprende las etapas siguientes:
a) activar in vitro los linfocitos T CD4+ de dicha población de linfocitos en presencia del antígeno seleccionado, presentado por las células presentadoras de antígeno artificiales que expresan una molécula del sistema HLA de clase II y una molécula de LFA-3 humana y que no expresan ninguna de las moléculas de co-estimulación B7-1, B7-2, B7-H1, CD40, CD23 o ICAM-1 obtenida a partir de una muestra biológica; y
b) recuperar, a partir de dichos linfocitos, una población de linfocitos T CD4+ activados que comprende al menos el 10% de linfocitos Tr1 específicos del antígeno seleccionado.
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21. Procedimiento según la reivindicación 18, caracterizado porque el procedimiento de preparación de linfocitos Tr1 reguladores comprende las etapas siguientes:
a) obtener in vitro una población de células progenitoras humanas que pueden diferenciarse en células dendríticas;
b) cultivar dichas células progenitoras humanas en presencia de IL-10 para obtener una población de dichas células dendríticas; y
c) colocar dicha población de linfocitos humanos en presencia de la población de células dendríticas obtenidas en (b).
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22. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque los productos de expresión por dichos linfocitos de los genes que codifican para las moléculas del grupo A son ARNm, y porque en la etapa (a) la determinación de la presencia simultánea de dichos ARNm se realiza mediante RT-PCR.
23. Procedimiento de cuantificación de linfocitos Tr1 reguladores presentes en una muestra biológica que comprende linfocitos, caracterizado porque comprende las etapas que consisten en:
a) identificar los linfocitos Tr1 reguladores mediante un procedimiento de identificación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21; y
b) determinar la proporción de los linfocitos Tr1 reguladores identificados en (a) con respecto a la cantidad total de linfocitos o de una fracción particular de los linfocitos, presente en dicha muestra biológica.
\vskip1.000000\baselineskip
24. Procedimiento de pronóstico o de diagnóstico in vitro de una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria en un sujeto a partir de una muestra biológica previamente extraída de dicho sujeto, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
a) determinar la proporción de linfocitos Tr1 reguladores presentes en dicha muestra biológica con respecto a la cantidad total de linfocitos, o de una fracción particular de los linfocitos, según el procedimiento de cuantificación de la reivindicación 23; y
b) comparar la proporción de dichos linfocitos Tr1 reguladores obtenida en la etapa (a) con respecto a la presente en una muestra biológica extraída de un sujeto sano.
\vskip1.000000\baselineskip
25. Procedimiento de pronóstico o de diagnóstico in vitro de una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria según la reivindicación 24, caracterizado porque en la etapa (b) se observa una disminución de dicha proporción en el sujeto que va a someterse a prueba.
26. Procedimiento de enriquecimiento en linfocitos Tr1 reguladores presentes en una muestra biológica que comprende linfocitos, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
a) identificar los linfocitos Tr1 reguladores mediante un procedimiento de identificación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22; y
b) eliminar de dicha muestra una parte significativa de los linfocitos que no presenta simultáneamente dichas moléculas.
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