CN110511911A - 一种维生素d代谢酶cyp24a1的新应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种维生素D代谢酶CYP24A1的新应用，属于基因工程技术领域。本发明通过敲低CYP24A1抑制卵巢癌细胞的侵袭；CYP24A1与FUS直接相互作用促进卵巢癌细胞的EMT过程，而减少CYP24A1的表达，可以降低CYP24A1与FUS的互作，从而抑制EMT过程，降低卵巢癌细胞的侵袭能力；酵母双杂交明确CYP24A1与FUS的相互作用位点为CYP24A1蛋白质的96‑307位氨基酸；CYP24A1蛋白质的87‑239位氨基酸是与FUS互作的必须结构域，CYP24A1蛋白质的237位氨基酸是CYP24A1与FUS互作的关键位点之一。

Description

一种维生素D代谢酶CYP24A1的新应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种维生素D代谢酶CYP24A1的新应用，通过敲低CYP24A1减少CYP24A1与FUS直接相互作用，抑制卵巢癌细胞的EMT过程，以达到降低卵巢癌细胞的侵袭能力。
背景技术
活性维生素D作为一种平衡体内钙磷代谢的类固醇类衍生物，除了发挥营养物质的重要功能外，其在癌症防治方面的重要功能在近年来逐渐被发掘。活性维生素D的抗肿瘤作用主要表现为：减少肿瘤细胞的增殖能力，促进凋亡，诱导肿瘤细胞分化，抑制炎症、肿瘤细胞的侵袭以及新生血管形成能力。
CYP24A1是细胞色素P450家族的成员，是活性维生素D代谢途径中的关键酶之一，可以把活性维生素D前体25羟基维生素D及活性维生素D即1α,25羟基维生素D代谢为24,25羟维生素D和1α,24,25羟维生素D，从而使活性维生素D失去生理活性。因此，CYP24A1在细胞内的含量也决定了活性维生素D的半衰期。另外，CYP24A1除了在机体发挥维生素D代谢酶作用以外，其表达升高可能与肿瘤发生、转移和预后相关。生物信息分析结果显示，许多肿瘤组织如肺癌、肾脏肿瘤等肿瘤组织的CYP24A1表达量明显高于癌旁组织，而且其表达量的增高明显减少肿瘤患者的生存期。卵巢癌的发病率虽然不是女性肿瘤发病首位，但因其高病死率而被广泛关注，抑制卵巢癌细胞在体内恶性增殖和转移是拯救卵巢癌患者生命的关键，也是现代医学亟待解决的难题。因此，明确CYP24A1对卵巢癌细胞侵袭能力的影响及分子机制是本发明研究的重点。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种维生素D代谢酶CYP24A1的新应用，通过敲低CYP24A1减少CYP24A1与FUS直接相互作用，抑制巢癌细胞的EMT过程，达到降低卵巢癌细胞的侵袭能力。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种维生素D代谢酶CYP24A1的新应用，敲低CYP24A1抑制卵巢癌细胞的侵袭。
进一步，敲低CYP24A1细胞株在制备抗卵巢癌药物中的应用。
进一步，一种维生素D代谢酶CYP24A1的新应用，CYP24A1与FUS直接相互作用促进卵巢癌细胞的EMT过程；而减少CYP24A1的表达，可以降低CYP24A1与FUS的互作，从而抑制EMT过程，降低卵巢癌细胞的侵袭能力。
进一步，CYP24A1蛋白质的87-239位氨基酸与FUS直接相互作用。
进一步，CYP24A1蛋白质的237位氨基酸与FUS直接相互作用。
进一步，一种shRNA在制备抗卵巢癌药物中的应用，所述shRNA为干扰CYP24A1蛋白质87-239位氨基酸的序列。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种维生素D代谢酶CYP24A1的应用，过表达维生素D代谢酶CYP24A1促进卵巢癌细胞侵袭；敲低维生素D代谢酶CYP24A1抑制卵巢癌细胞侵袭；CYP24A1与FUS直接相互作用促进卵巢癌细胞的EMT过程，减少CYP24A1可以降低CYP24A1与FUS的互作，从而抑制卵巢癌细胞的EMT过程；通过pulldown-质谱实验寻找与Flag-CYP24A1存在直接相互作用的蛋白，发现RNA结合蛋白FUS(Fused in Sarcoma)与Flag-CYP24A1存在直接相互作用关系；酵母双杂交实验明确CYP24A1与FUS的相互作用位点为CYP24A1蛋白质的96-307位氨基酸；进一步通过pull down实验研究CYP24A1及其突变体与FUS的互作关系：CYP24A1蛋白质的87-239位氨基酸是与FUS互作的必须结构域，CYP24A1蛋白质的237位氨基酸是CYP24A1与FUS互作的关键位点之一。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1附图为本发明使用RT-PCR对过表达CYP24A1的SKOV-3细胞进行验证；其中，**p<0.01；
图2附图为本发明使用RT-PCR对过表达CYP24A1的OVCAR-8细胞进行验证；其中，**p<0.01；
图3附图为本发明使用Western-blotting对过表达CYP24A1的SKOV-3细胞进行验证；
图4附图为本发明用Western-blotting对过表达CYP24A1的OVCAR-8细胞进行验证；
图5附图为本发明Transwell实验检测过表达CYP24A1后SKOV-3细胞侵袭能力变化的直观图(左图)和定量图(右图)；
图6附图为本发明Transwell实验检测过表达CYP24A1后OVCAR-8细胞侵袭能力变化的直观图(左图)和定量图(右图)；
图7附图为本发明Transwell实验检测敲低CYP24A1后SKOV-3细胞侵袭能力变化的直观图(左图)和定量图(右图)；
图8附图为本发明Transwell实验检测敲低CYP24A1后OVCAR-8细胞侵袭能力变化的直观图(左图)和定量图(右图)；
图9附图为本发明考马斯亮蓝染色确认Flag-CYP24A1及其相关蛋白被Flag抗体沉淀下来，红框内为Flag-CYP24A1蛋白相对应的条带；
图10附图为本发明通过免疫共沉淀实验检测Flag-CYP24A1和FUS在卵巢癌细胞SKOV-3和OVCAR-8中的相互作用；
图11附图为本发明过表达CYP24A1的SKOV-3和OVCAR-8细胞中Flag-CYP24A1和FUS的共定位；
图12附图为本发明CYP24A1截短体示意图；
图13附图为本发明IP实验检测CYP24A1与FUS直接相互作用位点；
图14附图为本发明CYP24A1截短体示意图，将范围缩小到2F-4R(图中红线间隔区)；
图15附图为本发明将GST标签串联的CYP24A1及其突变蛋白进行纯化后SDS-PAGE胶电泳分离的结果；
其中，1，蛋白marker；2，未诱导上清；3，CYP24A1诱导后上清；4，CYP24A1纯化蛋白；5，未诱导上清；6，CYP24A1(N-Y)诱导后上清；7，CYP24A1(N-Y)纯化蛋白；8，未诱导上清；9，CYP24A1-delete诱导后上清；10，CYP24A1-delete纯化蛋白；
图16附图为本发明将His标签串联的FUS蛋白进行纯化后SDS-PAGE胶电泳分离的结果；其中，1，蛋白marker；2，未诱导上清；3，FUS诱导后上清；4，FUS纯化蛋白；
图17附图为本发明CYP24A1的突变体与FUS的相互作用关系；
其中，第一条带表示野生型CYP24A1可以与FUS直接相互作用；第二条带表示CYP24A1蛋白237位的N(天门冬氨酸)突变为Y(酪氨酸)时，与FUS的相互作用明显减弱；第三条表示CYP24A1缺失87-237位氨基酸时无法与FUS相互作用；第四条带表示阴性对照，即GST标签蛋白与FUS无直接互作关系；“+”表示添加该蛋白，“-”表示未添加该蛋白；
图18附图为本发明EMT相关蛋白在过表达或敲低CYP24A1的OVCAR-8细胞中的表达情况(直观图)；*p<0.05；
图19附图为本发明EMT相关蛋白在过表达或敲低CYP24A1的OVCAR-8细胞中的表达情况(定量图)；*p<0.05；
图20附图为本发明EMT相关蛋白在过表达或敲低CYP24A1的SKOV-3细胞中的表达情况(直观图)；*p<0.05；
图21附图为本发明EMT相关蛋白在过表达或敲低CYP24A1的SKOV-3细胞中的表达情况(定量图)；*p<0.05。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
过表达慢病毒GV358-3FLAG-CYP24A1-EGFP-puromycin(Overexpression，OE)和阴性对照慢病毒GV358-EGFP-puromycin(Negative control，NC)，由上海吉凯基因化学技术有限公司构建并提供。
GV113-sh-CYP24A1-RFP(sh-CYP24A1)是CYP24A1基因敲低慢病毒，GV113-RFP(Negative control)是相对应的阴性对照慢病毒，由上海吉凯基因化学技术有限公司制备并提供。
卵巢癌细胞SKOV-3和OVCAR-8购于中科院上海细胞库。
数据统计分析使用GraphPad Prism 7软件，结果用表示，单纯两组之间的比较当统计资料符合方差齐性和正态性时，对照组与实验组之间用T检验来进行分析。当统计资料符合正态性而方差不齐时，使用校正后的T检验。当不符合正态性时采用非参数法Wiloxcon秩和检验。p<0.05即被认为存在统计学差异。
实施例1过表达维生素D代谢酶CYP24A1卵巢癌细胞株的建立
1)慢病毒转染
(1)取对数生长期的SKOV-3和OVCAR-8细胞按照每孔1x105的数量接种到6孔板中，等到过夜贴壁后开始正式转染。
(2)正式转染前2个小时，将存放于-80℃的病毒原液(OE和NC)取出置于冰上融化；将6孔板中RPMI-1640完全培养基(包含10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素)更换为含有病毒的培养基进行转染：SKOV-3细胞加入含有109TU/mL病毒液(OE或NC)4μL及终浓度为5μg/mL的助感染试剂Polybrene的RPMI-1640培养基2mL，OVCAR-8细胞加入含有109TU/mL病毒液(OE或NC)2μL及终浓度同样为5μg/mL的Polybrene的RPMI-1640培养基2mL。
(3)转染8-12小时后将含有病毒的培养基吸弃，同时加入RPMI-1640完全培养基，继续对转染后的细胞进行培养。
(4)由于转染的质粒中含有嘌呤霉素抗性基因，使用含有1μg/mL的嘌呤霉素(puromycin)的培养基继续培养转染后的SKOV-3和OVCAR-8细胞，进而筛选转染成功的细胞。
(5)将筛选后的SKOV-3和OVCAR-8细胞进行总蛋白和RNA的提取，并验证转染后相关蛋白的转录和翻译水平，从而鉴定转染是否成功。
2)Real-Time PCR实验
(1)提取总RNA：将要提取总RNA的细胞吸弃培养基后使用PBS涮洗3次，使用Trizol进行总RNA的提取；
(2)逆转录：根据逆转录试剂盒的说明，选取2μg的总RNA进行逆转录，得到cDNA；逆转录的温度程序为：37℃60分钟，85℃5分钟；
(3)Real-Time PCR：将样品cDNA浓度稀释到500ng/μL左右，取上下游引物各1.5μL(引物序列见表1)，cDNA 2μL，DEPC水5μL，SYBR Green10μL；反应程序为：95℃10分钟；95℃10秒，60℃20秒，72℃30秒，共反应45个循环；将上述体系混匀后按每孔20μL加入到PCR专用的96孔板或8联管中，每个样品中的每个待测基因均设置3个复孔；随后用封膜或8联排盖子将之封闭，以1000r/min的速度将管壁上的液体甩下；放入实时荧光定量PCR仪器中进行检测；记录下每孔的CT值，使用2-ΔΔCT的方法以β-actin为内参对检测基因的转录水平进行定量分析。
结果显示，在SKOV-3细胞中，过表达组CYP24A1(OE CYP24A1)的转录水平较转染空载体的阴性对照组(Negative control)高出3308倍(p<0.01，图1)；而在OVCAR-8细胞中，过表达组CYP24A1的转录水平同样高出阴性对照组2370倍(p<0.01，图2)；说明外源性CYP24A1成功转入人卵巢癌细胞。
表1引物序列
3)Western-blotting实验
(1)取对数生长期生长良好的待检测细胞，吸弃培养基，使用PBS清洗3遍，将培养皿置于冰上，加入适量的IP裂解液，而后刮下细胞；将所得混合物置于冰上静置裂解30分钟，然后在提前预冷的低温离心机中以12000r/min的速度离心10分钟，取蛋白上清；
(2)使用BCA试剂盒测定蛋白质的浓度后，加入蛋白上清液1/4体积的上样缓冲液(5x上样缓冲液：1.2mL 0.5M Tris(pH＝6.8)，5mL甘油，2mL10％SDS，0.5mL-巯基乙醇，溴酚蓝0.01g溶于1mL蒸馏水，0.3mL蒸馏水)，在99℃的恒温孵育器孵育10分钟使蛋白变性；
(3)将制好的蛋白样品上样到提前配置好的10％的SDS-PAGE凝胶的孔中，另外在两侧的孔中加入适量的彩虹预染蛋白(Maker)，而后在60V的电压下使样品在凝胶中电泳至凝胶底部后停止电泳；
(4)在转膜时首先要将PVDF膜置于甲醇中浸泡3～5分钟，而后将PVDF膜置于SDS-PAGE胶上面，上下各夹一层滤纸后进行转膜；转膜条件为330mA，90分钟；
(5)转膜后使用提前配制好的5％脱脂奶粉封闭液(100mL PBST，5g脱脂奶粉；PBST：将预先配制好的1L PBS中添加1mL Tween-20)对PVDF膜进行封闭；
(6)封闭完成后按照Maker标注的位置，将待检测蛋白质所在位置的条带裁下；加入按照一定比例稀释后的一抗(表2)，在4℃的条件下孵育过夜；而后使用PBST清洗三次，每次10分钟；随后加入1:2000稀释后的二抗(anti-mouse IgG,HRP-linked antibody(cat.no.7076)and anti-rabbit IgG，HRP-linked antibody(cat.no.7074)，根据一抗选择抗鼠或抗兔的二抗)，在室温条件下孵育2小时，然后继续用PBST清洗三次，每次10分钟；
(7)将清洗完的条带置于塑料板上，滴加配制好的显影液，放入化学发光成像仪曝光。结果如图3-4所示。
过表达质粒载体中CYP24A1的序列采用了3Flag标签(Flag序列：DYKDDDDK)，与传统CYP24A1的融合序列，转染成功后表达的融合蛋白的分子量较传统CYP24A1的分子量(59kDa)高出6kDa，为65kDa。本发明使用特定的Flag抗体来检测转染质粒载体后SKOV-3和OVCAR-8细胞中的Flag-CYP24A1融合蛋白的表达，通过曝光后的条带可以确定Flag-CYP24A1融合蛋白在SKOV-3和OVCAR-8的过表达组细胞中正常表达，而且高于阴性对照组。同时，本发明也检测了转染后细胞内源性CYP24A1的表达(GAPDH)，各组之间并没有明显差异。以上实验结果表明，稳定过表达CYP24A1的SKOV-3和OVCAR-8细胞系构建成功。
表2 Western-blotting实验中使用的抗体
实施例2Transwell侵袭实验
实验前4个小时将分装好的Matrixgel置于冰上融化，同时将即将使用的枪头和EP管等耗材置于4℃冰箱预冷。待Matrixgel融化后使用预冷的枪头和EP管将之用无血清的RPMI-1640培养基以1:10的比例稀释，将小室放置于24孔板中，而后在Transwell小室(底部薄膜含8m孔径)的上部加入60μL稀释好的Matrixgel，置于培养箱中凝固4小时。选取生长状态良好的对数期细胞在实验前12小时换无血清的RPMI-1640培养基进行饥饿培养，12小时后吸弃培养基，胰酶消化后用无血清培养基重悬制成单细胞悬液，使用细胞计数仪将细胞计数后，在Transwell小室的上室接种1x105个待测细胞，然后在小室下部加入600μL含10％血清的完全培养基。置于培养箱中培养36小时后，将小室取出吸弃上室内的液体并用棉棒将上室内剩余的细胞清理干净，使用PBS将薄膜下部清洗3遍后，使用70％乙醇固定穿透8μm孔径到达薄膜下部的细胞，随后使用甲基紫染色液对细胞进行染色并在显微镜下进行拍照。拍照后使用33％的冰乙酸将薄膜下部的细胞溶解，随后使用酶标仪测定溶解后溶液的吸光度。用吸光度值反映穿过Transwell小室底膜的细胞数量，进而间接反映细胞的侵袭能力。
Transwell实验结果显示，与转染空载体的阴性对照组细胞相比较，过表达CYP24A1的SKOV-3细胞的侵袭能力提高了5.46倍(p<0.01，图5)。在OVCAR-8细胞中也得到了相同的结果，过表达组细胞的侵袭能力相较于阴性对照组提高了6.14倍(p<0.01，图6)。结果表明，过表达CYP24A1可以明显提高卵巢癌细胞的侵袭能力。
实施例3敲低CPY24A1卵巢癌细胞株的建立
(1)转染开始的前一天取对数生长期的SKOV-3和OVCAR-8细胞，将细胞计数后按照每孔1x105的数量接种到6孔板中，等到过夜细胞贴壁后开始转染。
(2)转染，每孔加入1mL含10％FBS的培养基，SKOV-3细胞的培养基中加入109TU/mL病毒液(sh-CYP24A1或GV113-RFP)2μL，OVCAR-8细胞的培养基中加入109TU/mL病毒液(sh-CYP24A1或GV113-RFP)1μL，使助感染试剂polybrene的终浓度为5μg/mL。
(3)由于敲低CYP24A1的质粒载体中不含有抗生素抗性基因，所以使用流式细胞仪对细胞进行筛选。
(4)将筛选后的SKOV-3和OVCAR-8细胞进行扩增，随后收取样品并提取总蛋白和RNA用来验证转染后相关蛋白的转录和翻译水平，从而鉴定转染是否成功。
(5)验证转染成功后对转染阳性细胞进行大量扩增，以便进行后续的实验研究。
实施例4Transwell侵袭实验
将OVCAR-8的阴性对照组和敲低组细胞接种数量均调整到2x105个。此外由于穿过薄膜到达下室的细胞较为密集，因而在拍照后使用ImageJ对有效细胞面积进行定量，进而反映细胞侵袭能力的强弱。
Transwell实验结果显示，与转染空载体的阴性对照组相比较，敲低CYP24A1的SKOV-3细胞的侵袭能力降低了73.2％(p<0.01，图7)。同样，敲低CYP24A1的OVCAR-8细胞的侵袭能力下降了73％(p<0.05，图8)。说明敲低CYP24A1可以明显地降低卵巢癌细胞的侵袭能力。
实施例5CYP24A1与FUS(Fused in Sarcoma)直接相互作用促进卵巢癌细胞的EMT(Epithelial-mesenchymal transition)过程
1)免疫共沉淀实验
(1)取对数生长期过表达CYP24A1的SKOV-3和OVCAR-8细胞，吸弃培养基后用PBS清洗3遍，100mm大皿加入400μL IP裂解液，将裂解后的细胞刮下后置于1.5mL EP管中，随后将EP管置于冰上裂解1小时；
(2)取出80μL蛋白作为Input，直接加入20μL上样缓冲液，然后置于恒温孵育器中99℃10分钟，使蛋白变性；
(3)取磁珠250μL，加入IP裂解液后将磁珠置于摇床上进行清洗，清洗3次后吸弃上清并使用250μL IP裂解液将磁珠重悬；
(4)SKOV-3和OVCAR-8剩余的蛋白分别取160μL作为IgG组，另取160μL作为实验组；取清洗好的磁珠20μL分别加入其中，并置于4℃摇床孵育2小时以除去与磁珠结合的非特异性蛋白；
(5)同时取清洗好的磁珠置于4只不同的EP管中，40μL/只，其中2只加入鼠二抗6μL，另外2只加入Flag(DYKDDDDK)抗体6μL，在4℃条件下孵育4小时，使抗体与磁珠相结合；
(6)将步骤(4)中的磁珠沉淀并丢弃，将上清液保留；并将SKOV-3和OVCAR-8的上清分别加入到步骤(5)的EP管中，其中IgG组加入到含有鼠二抗的EP管中，实验组加入到含有Flag抗体的EP管中；在4℃条件下孵育过夜；
(7)过夜后，将磁珠沉淀并保留，上清液丢弃；使用IP裂解液清洗3次，每次10分钟；
(8)加入80μL IP裂解液重悬磁珠，并加入20μL上样缓冲液；随后置于恒温孵育器99℃10分钟，使蛋白变性；而后将磁珠沉淀并丢弃，制得的样品进行Western-blotting实验(抗体及稀释比例见表4)。
2)pull down-质谱技术
由于在过表达CYP24A1的卵巢癌细胞SKOV-3中表达了携带Flag标签的CYP24A1(Flag-CYP24A1)，本发明使用Flag抗体pull down过表达Flag-CYP24A1的SKOV-3细胞内的蛋白，将pull down得到与CYP24A1互作的蛋白使用10％SDS-PAGE胶进行分离，使用考马斯亮蓝染色液对胶条进行染色(图9)，确认Flag-CYP24A1及其相关蛋白被Flag抗体沉淀下来，红框内为Flag-CYP24A1蛋白相对应的条带，染色要明显深于阴性对照组(IgG)，这说明Flag抗体成功将Flag-CYP24A1沉淀下来。按照分组(Input、IgG和Flag-CYP24A1)将胶条切开，送杭州景杰生物科技有限公司使用质谱技术对蛋白质混合物进行鉴定。并搜索UniProt数据库发现，可能与Flag-CYP24A1存在直接相互作用的蛋白有RNA结合蛋白FUS、RNA结合蛋白EWSR-1、肌动蛋白ACTG-1和肌动蛋白ACTG-2等(表3)。
表3可能与CYP24A1存在直接互作关系的蛋白
本发明通过免疫共沉淀实验验证CYP24A1与FUS的直接互作关系。实验结果发现，在过表达CYP24A1的SKOV-3和OVCAR-8细胞中使用Flag抗体均可以将FUS沉淀下来(图10)，说明在SKOV-3和OVCAR-8两种卵巢癌细胞中Flag-CYP24A1与FUS是存在着直接相互作用关系。
3)免疫荧光实验
(1)预先将细胞爬片消毒并置于24孔板中，随后将过表达CYP24A1的SKOV-3和OVCAR-8细胞接种于24孔板中，使之生长在爬片上；
(2)待细胞贴壁生长后，将培养基吸弃，并用PBS清洗3次；随后加入4％的多聚甲醛在室温下固定细胞20分钟；
(3)固定结束后使用PBS将细胞清洗3次，随后加入0.1％的Triton X-100，在室温下孵育15分钟使细胞通透；
(4)通透结束后使用PBS将细胞清洗3次并加入5％的脱脂奶粉在室温条件下封闭1.5个小时；
(5)封闭结束后在实验孔内加入2种一抗(抗体及稀释比例见表4)，同时设立一个阴性对照质控孔，该孔内加入同类型对照抗体(1：500稀释)，两孔除加一抗不同外其余操作相同；在室温孵育2小时，随后使用PBST清洗3次，每次10分钟；
(6)随后加入抗小鼠IgG-AlexaFluor 555二抗(1:1000稀释)和抗兔IgG-AlexaFluor 647二抗(1:1000稀释)，在室温条件下避光孵育2小时；随后使用PBST清洗3次，每次10分钟；
(7)将DAPI染色液滴于载玻片上，随后将爬片从24孔板中取出置于载玻片上，使细胞所在面与DAPI相接触；
(8)将爬片置于激光共聚焦显微镜下观察并拍片；仪器参数设置如下：DAPI为λEX＝340nm，λEX＝454nm，Alexa Fluor 555为λEX＝553nm，λEX＝568nm，Alexa Fluor 647为λEX＝647nm，λEX＝666nm。
表4 Western-blotting和免疫荧光实验中使用的抗体及稀释倍数
本发明进一步通过免疫荧光实验检测CYP24A1和FUS在过表达CYP24A1卵巢癌细胞内的定位。结果显示在过表达CYP24A1的卵巢癌细胞OVCAR-8中，Flag-CYP24A1(绿色)和FUS(红色)均定位于细胞核及其周边。但在SKOV-3细胞中FUS位于细胞核及其周边，而Flag-CYP24A1主要位于细胞核周边，定位并不完全一致(图11)。质谱分析、免疫共沉淀和免疫荧光的实验结果一致说明，CYP24A1与FUS在卵巢癌细胞中存在着直接的相互作用关系。
4)酵母双杂交实验
(1)载体构建：对CYP24A1全长进行不同长度的截短，并分别设计引物(见图12和表5)。
表5针对不同DNA片段设计的引物序列
注：GGTACC为KpnI酶切位点，CTCGAG为XhoI酶切位点，1F～5F为正向引物，1R～6R为反向引物。
(2)细胞转染：将HEK-293细胞用DMEM培养基制成单细胞悬液，按每孔5×105个细胞，将细胞均匀的接种到6孔板中，37℃、5％CO2饱和湿度条件培养过夜。转染前2小时，换成无血清DMEM培养基。对于每个转染样品，分别按如下的方法进行准备，首先用100μL无血清opti-MEM分别稀释4μg DNA，并用枪头轻轻混匀，在室温下静置5分钟。然后将LipofectamineTM2000轻轻混匀并取5μL稀释在100μL opti-MEM中，在室温下静置5分钟。随后混合LipofectamineTM 2000和DNA的稀释液(总体积为200μL)，轻轻混匀并在室温下静置20分钟。每个培养孔加混合液200μL，前后轻轻摇动细胞培养板使混合液与培养板中细胞培养液相混匀，随后置于培养箱中继续培养。6小时后换为正常培养基继续培养。转染分组为：FUS质粒，质粒1F-1R，质粒2F-1R，质粒3F-1R，质粒4F-1R，质粒5F-1R，质粒1F-2R，质粒1F-3R，质粒1F-4R，质粒1F-5R，质粒1F-6R。处理完成后，收集细胞提取蛋白。
(3)IP实验：按照FUS超表达细胞总蛋白200μg，CYP24A1超表达细胞总蛋白40μg及相关对照在1mL Interaction Buffer(Interaction Buffer为生工公司配制：成分为20mMTris-HCl，100mM NaCl，50mM KCl，0.5mM EDTA，1mM MgCl2，and 5％[v/v]glycerol)中进行混合并在25℃孵育1小时。随后将洗脱液和孵育液分别进行沸水浴(5分钟)，将沸水浴后的蛋白加5×SDS Loading后取20μL进行电泳。
通过酵母双杂交实验确定CYP24A1与FUS的结合位点。根据相对应的截断体序列设计了10对引物，构建10个载体，分别转染到293T细胞中，收取CYP24A1不同表达片段的蛋白进行pull down实验。实验结果显示，1F-1R、2F-1R、1F-2R、1F-3R及1F-4R均与FUS存在着直接相互作用(图13)。根据表6设计引物的重复序列，可以将与FUS结合范围缩小到2F-4R(图14中红线间隔区)。其对应的氨基酸序列为CYP24A1的96-307位氨基酸之间。实验结果说明，与FUS存在直接相互作用的关键位点位于CYP24A1蛋白质的96-307位氨基酸之间。
5)CYP24A1(N237Y)突变体即CYP24A1(N-Y)pull down实验
(1)载体构建
通过设计引物(表6)分别构建GST标签串联的CYP24A1的野生型、定点突变和缺失突变株以及His标签串联的FUS蛋白。
表6针对不同DNA片段设计的引物序列
(2)蛋白表达及纯化
①挑取表达His标签重组蛋白的单克隆，接种到3mL含氨苄西林(Ampicillin，Amp)抗生素的LB培养液中，培养过夜。
②按照1:20的比例取培养过夜的菌液，接种到预热至37℃并含Amp抗生素的LB培养液中(100mL)。
③37℃常规培养约30-60分钟或更长时间，至菌液的OD600达到0.5-0.7，并且OD600最好接近0.6。
④将菌液在冰上静置，加入IPTG至终浓度为0.5mM，在16℃继续培养12小时。收集菌液至离心管中，4℃6000rpm离心3分钟，弃上清，收集沉淀。
⑤冰上超声裂解细菌(binding buffer,1/10体积)。超声功率200-300瓦特，每次超声处理10秒，每次间隔10秒，直至上清不再混浊。
⑥12000rpm离心20分钟，取上清进行后续实验。
⑦His标签的纯化：取适量混合均匀的50％BeyoGold His-tag PurificationResin(碧云天，P2218)，4℃离心(1000g×10秒)弃去储存液，向凝胶中加入一个柱体积的非变性裂解液混匀以平衡凝胶，4℃离心(1000g×10秒)弃去液体，再重复平衡1-2次，弃去液体。随后取1mL凝胶中加入10mL细菌裂解液上清的比例(1:10)，混合His-tag PurificationResin和细菌裂解液上清，并加入3mM终浓度的咪唑。4℃在侧摆摇床缓慢摇动60分钟。然后将裂解液和His-tag Purification Resin的混合物装入15mL的空柱管中，用1倍柱体积的非变性裂解液平衡后加入细菌裂解液上清，后续将穿流液收集后重复上柱3次以充分结合目的蛋白。最后将纯化柱底部的盖子打开，在重力作用下使柱内液体流出，收集约20μL穿流液作后续分析用。
⑧GST标签蛋白纯化：轻轻摇动高亲和力GST纯化介质以充分重悬。吸取适量的浆液至重力柱中。通常1mL柱体积的树脂可以吸附35-45mg GST标签蛋白(26kDa)。用10倍柱体积的冷1×PBS(4℃)洗涤高亲和力GST纯化介质。将制备好的含有GST融合蛋白的澄清细胞裂解液加入到层析柱中，流速控制为10-15cm/h。待裂解液全部流出层析柱后就立刻加入1×PBS清洗柱子，所需量大约为柱体积的20倍。然后用10-15倍柱体积的现配10mM谷胱甘肽洗脱液(0.154g还原性谷胱甘肽溶于50mL 50mM Tris-HCl,pH 8.0)洗脱融合蛋白。最后分别吸取10-20μL GST融合蛋白原液、流出液、洗涤液和洗脱液，通过SDS-PAGE电泳分析各样品，确定是否存在标签蛋白。
CYP24A1融合蛋白及CYP24A1(N-Y)目标大小为86kDa，而CYP24A1-delete融合蛋白目的大小为65kDa(图15)，FUS融合蛋白目的大小为75kDa(图16)，以上结果说明纯化蛋白均为目的大小，符合后续实验要求。
(3)pull down实验
①将20μg S-Tag融合蛋白(FUS)和50μg的GST融合蛋白(CYP24A1及其突变体)以及相关对照在1mL Interaction Buffer中进行混合并在4℃抚育1小时。
②将抚育后的蛋白各取100μL加入到GST resin中进行蛋白漂洗(10次)和洗脱。
③将洗脱液与抚育液分别进行沸水浴(5分钟)。将沸水浴后的蛋白加5xSDSloading后取20μL进行电泳。
以上实验内容委托生工生物工程有限公司完成。
pull down实验结果如图17所示，当CYP24A1缺失87-239位氨基酸时无法与FUS发生直接相互作用，说明87-239位氨基酸是互作的必须结构域，当对CYP24A1蛋白的237位N进行突变时，其与FUS的互作关系相对于野生型CYP24A1明显减弱，这说明237位氨基酸可能是CYP24A1与FUS互作的关键位点之一。
实施例6CYP24A1表达量对EMT相关蛋白和转录因子表达水平的影响
分别检测敲低和过表达CYP24A1的SKOV-3和OVCAR-8细胞中EMT转录因子Snail、上皮细胞标志物E-cadherin和间质细胞标志物Vimentin的表达情况，结果如图18-21所示。
Western-blotting(所用一抗和稀释比例见表4)的实验结果显示，当过表达CYP24A1后，与阴性对照组相比较，SKOV-3和OVCAR-8细胞中Snail的表达量没有明显的差异(p>0.05)。而敲低CYP24A1后，SKOV-3中Snail的表达量明显下降(p<0.05)，敲低组的OVCAR-8细胞中Snail的表达量也下降；说明减少CYP24A1表达可以抑制EMT转录因子Snail的表达。与阴性对照组相比较，过表达CYP24A1后的卵巢癌细胞SKOV-3和OVCAR-8E-cadherin的表达量明显降低(p<0.05)，而Vimentin的表达量有升高趋势，但差异无统计学意义(p>0.05)。相反地，敲低CYP24A1后，SKOV-3和OVCAR-8细胞内E-cadherin的表达量均明显升高，Vimentin的表达水平则明显降低(p<0.05)；说明减少CYP24A1的表达可以增加EMT上皮标志物E-cadherin的表达，抑制间质标志物Vimentin和EMT转录因子Snail的表达。
上述结果表明，在卵巢癌细胞OVCAR-8和SKOV-3中，CYP24A1通过上调Vimentin、Snail和下调E-cadherin促进EMT过程。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 苏州大学
<120> 一种维生素D代谢酶CYP24A1的新应用
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
cgcatcttcc atttggcgtt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gcctggatgt cgtatttggg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
aacggctccg gcatgtgcaa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
cttctgaccc atgcccacca 20
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
cttggtacca tgagctcccc catcagcaag 30
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
cttggtacca tggagtacca caagaagtat ggc 33
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
cttggtacca tggaggtctt ggccgatttt atgg 34
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
cttggtacca tgaaggtctg gcaggaccac ac 32
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
cttggtacca tggagaatca ggtgccacg 29
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
agactcgagt cgctggcaaa acgcg 25
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
agactcgagt cttaatcggc gaccaatgca c 31
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
agactcgagc atattcaccc agaactgttg 30
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
agactcgaga tctgcactag gctgctg 27
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
agactcgagc ctctttcatc acagagctca tc 32
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
agactcgagt gcaccgactc aaaggaac 28
<210> 16
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
caggggcccc tgggatccat gagctccccc atcag 35
<210> 17
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
cacgatgcgg ccgctcgagc tatcgctggc aaaacgc 37
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
acgacaccct ggtggaggat ttcctttg 28
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
gaaatcctcc accagggtgt cgtgctg 27
<210> 20
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
gctgtgtact tcatcatggc catcaaaaca atgatg 36
<210> 21
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
tgatgaagta cacagcttca tcccctgcat tc 32
<210> 22
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
acgacgacaa ggccatgatg gcctcaaacg attatac 37
<210> 23
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
gtggtggtgg tgctcgagat acggcctctc cctg 34

Claims (6)

1.一种维生素D代谢酶CYP24A1的新应用，其特征在于，敲低CYP24A1抑制卵巢癌细胞的侵袭。
2.敲低CYP24A1细胞株在制备抗卵巢癌药物中的应用。
3.一种维生素D代谢酶CYP24A1的新应用，其特征在于，CYP24A1与FUS直接相互作用促进卵巢癌细胞的EMT过程；而减少CYP24A1的表达，能够降低CYP24A1与FUS的互作，从而抑制EMT过程，降低卵巢癌细胞的侵袭能力。
4.根据权利要求3所述的一种维生素D代谢酶CYP24A1的新应用，其特征在于，CYP24A1蛋白质的87-239位氨基酸与FUS直接相互作用。
5.根据权利要求3所述的一种维生素D代谢酶CYP24A1的新应用，其特征在于，CYP24A1蛋白质的237位氨基酸与FUS直接相互作用。
6.一种shRNA在制备抗卵巢癌药物中的应用，其特征在于，所述shRNA为干扰CYP24A1蛋白质87-239位氨基酸的序列。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105087463A (zh) * 2015-08-13 2015-11-25 苏州大学 维生素d的新应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XU JIMING等: "Knockdown of CYP24A1 enhances the anti-invasion effect of 1α,25(OH)2D3 on mouse ovarian cancer cells by inhibiting EMT", 《中国科技论文在线》 *
叶梦璇等: "1α,25(OH)2D3诱导SKOV-3细胞CYP24A1上调相关基因表达谱分析", 《中国科技论文在线》 *
庞田田等: "基于CYP24A1的癌症治疗研究进展", 《陕西理工学院学报(自然科学版)》 *

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