CN114853889A

CN114853889A - 针对人gpr48的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN114853889A
Application number: CN202110147974.2A
Authority: CN
Inventors: 陈佺; 杜蕾; 程琪; 郑浩; 王珺; 王晓慧; 刘垒
Original assignee: Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2021-02-03
Filing date: 2021-02-03
Publication date: 2022-08-05
Anticipated expiration: 2041-02-03
Also published as: CN114853889B; US20240101665A1; WO2022166780A1

Abstract

本发明公开了一种针对人GPR48的单克隆抗体及其应用。本发明所提供的抗体，穷轻链可变区中LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1的第27‑32位、第50‑52位、第89‑97位所示，重链可变区中HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.2的第26‑33位、第51‑60位、第99‑108位所示。该抗体与GPR48蛋白有极强的特异性和敏感性，可应用于免疫印迹，免疫荧光和免疫组化等免疫学实验技术中；可应用于流式细胞分析和流式细胞分选等流式细胞学实验技术中；可应用于研究亚细胞定位，蛋白相互作用等信号通路的科学研究中。该抗体可用于人体GPR48阳性肿瘤如结直肠癌的临床药物开发。

Description

针对人GPR48的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种针对人GPR48的单克隆抗体及其应用。

背景技术

结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一，是全球位居第三的致死性肿瘤。肿瘤的靶向治疗是近些年发展起来的治疗癌症的新方法，它很大程度上避免了传统癌症疗法如手术治疗、化疗和放疗所带来的肿瘤细胞扩散和严重毒副作用的产生。而针对肿瘤细胞表面抗原而进行的单克隆抗体治疗是肿瘤靶向治疗的主要方式，表现出了良好的肿瘤治疗效果。

G蛋白偶联受体48(G Protein-Coupled Receptor 48,GPR48)，又称Leucine RichRepeat Containing G Protein-Coupled Receptor 4,GPR48，是一种广泛表达于真核生物细胞表面的7次跨膜蛋白，共有951个氨基酸，其中N端位于细胞膜外，C端7次跨膜，分子量约为104KD。编码人GPR48的基因由106,827个碱基组成，位于11号染色体p14.1区域。与经典G蛋白偶联受体不同，GPR48不通过激活G蛋白异源三聚体介导下游信号通路。GPR48激活经典Wnt信号通路，参与多种器官的发育。根据本实验室的前期研究和其他文献报道，我们发现G蛋白偶联受体48与结直肠等多种恶性肿瘤的发生和发展有密切关系，其主要特征为，(1)G蛋白偶联受体48在结直肠癌、前列腺癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等多种癌症组织中高表达；(2)G蛋白偶联受体48在结直肠癌、前列腺癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等多种癌症组织中与人细胞型朊蛋白PrPc共表达；(3)动物模型中，敲低G蛋白偶联受体48显著抑制结直肠肿瘤生长和肝转移；(4)表达外源G蛋白偶联受体48显著促进肿瘤发生和生长。综上所述，G蛋白偶联受体48可以作为结直肠癌、前列腺癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的治疗靶点。本发明人的前期工作也表明GPR48与PrPc共表达的细胞具有肿瘤干细胞的特性。因此，针对GPR48进行以单克隆抗体为基础的靶向性治疗研究，有望为癌症的治疗提供新的方案。

发明内容

本发明的目的是提供一种针对人GPR48的单克隆抗体及其应用。

第一方面，本发明要求保护一种抗体。

本发明要求保护的抗体为抗GPR48的单克隆抗体。所述抗体的轻链可变区中LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1的第27-32位、第50-52位、第89-97位所示。所述抗体的重链可变区中HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.2的第26-33位、第51-60位、第99-108位所示。

其中，HCDR1、HCDR2和HCDR3为重链可变区中的三个互补决定区，LCDR1、LCDR2和LHCDR3为轻链可变区中的三个互补决定区。互补决定区的序列根据Kabat定义。

在本发明保护范围内，所述抗体可为全长抗体、Fab片段、F(ab’)2片段或单链Fv片段等各种形式。

进一步地，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.1，或者与SEQ ID No.1具有至少90％的一致性(不一致处可在骨架区(FR))。所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNo.2，或者与SEQ ID No.2具有至少90％的一致性(不一致处可在骨架区(FR))。

在本发明的具体实施方式中，所述抗体的重链类型具体为IgG1；所述抗体的轻链类型具体为λ；所述抗体具体为鼠源抗体。

第二方面，本发明要求保护一种杂交瘤细胞株。

本发明要求保护的杂交瘤细胞株具体为小鼠杂交瘤细胞株1H1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.20290。

第三方面，本发明要求保护由所述的杂交瘤细胞株1H1分泌产生的单克隆抗体。

所述单克隆抗体为抗GPR48的单克隆抗体(即实施例中的2-1H1抗体)。

第四方面，本发明要求保护以SEQ ID No.5所示多肽和载体蛋白(如KLH)的偶联物作为免疫原免疫动物(如小鼠)后所得的抗体。

所述抗体为抗GPR48的抗体。

在本发明的具体实施方式中，所述抗体为单克隆抗体。

第五方面，本发明要求保护如下任一生物材料：

(A1)人源化抗体，为将前文第一方面所述抗体或前文第三方面所述单克隆抗体或前文第四方面所述抗体进行人源化改造后所得。

(A2)抗体的活性片段，为源自前文第一方面所述抗体或前文第三方面所述单克隆抗体或前文第四方面所述抗体或(A1)所述人源化抗体的如下任一：单链抗体、抗体Fab区、抗原结合片段等。

(A3)核酸分子，所述核酸分子编码前文第一方面所述抗体或前文第三方面所述单克隆抗体或前文第四方面所述抗体或(A1)所述人源化抗体或(A2)所述抗体的活性片段。

(A4)含有(A3)中所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌。

(A5)试剂盒，含有前文第一方面所述抗体或前文第三方面所述单克隆抗体或前文第四方面所述抗体或(A1)所述人源化抗体或(A2)所述抗体的活性片段或(A3)所述核酸分子或(A4)所述表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌。

含有抗体的试剂盒可用于检测GPR48蛋白，具体可为免疫印迹试剂盒、免疫组化试剂盒、免疫荧光试剂盒、流式细胞检测试剂盒等。

(A6)SEQ ID No.5所示的多肽。

(A7)(A6)所示多肽与载体蛋白(如KLH)的偶联物。

进一步地，在(A3)所述核酸分子中，编码所述抗体的轻链可变区中LCDR1、LCDR2和LHCDR3的核苷酸序列依次可如SEQ ID No.3自5’端起第79-96位、第148-156位、第265-291位所示。在(A3)所述核酸分子中，编码所述抗体的重链可变区中HCDR1、HCDR2和HCDR3的核苷酸序列依次可如SEQ ID No.4自5’端起第76-99位、第151-180位、第295-324位所示。

更进一步地，在(A3)所述核酸分子中，编码所述抗体的所述轻链可变区的核苷酸序列可为SEQ ID No.3或者与SEQ ID No.3具有至少90％的一致性(不一致处可在骨架区(FR))。编码所述抗体的所述重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID No.4或者与SEQ ID No.4具有至少90％的一致性(不一致处可在骨架区(FR))。

第六方面，本发明要求保护药物组合物。

本发明所要求保护的药物组合物包含前文第一方面所述抗体或前文第三方面所述单克隆抗体或前文第四方面所述抗体或前文第五方面(A1)所述人源化抗体或(A2)所述抗体的活性片段。

进一步地，所述药物组合物中还可含有抗肿瘤药物。

在本发明的具体实施方式中，所述抗肿瘤药物具体为细胞型朊蛋白PrPc单克隆抗体Ab-5(抗细胞型朊蛋白单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.4972的杂交瘤细胞系产生，中国发明专利号201110284158.2，发明名称：抗细胞型朊蛋白单克隆抗体在制备抗肿瘤药物中的应用)。

在本发明的具体实施方式中，所述单克隆抗体(即2-1H1抗体)与细胞型朊蛋白PrPc单克隆抗体Ab-5的配比为质量比1：1。

第七方面，本发明要求保护如下任一所示应用：

(B1)前文第五方面中(A3)所述核酸分子或(A4)所述表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或(A6)所述多肽或(A7)所述偶联物在制备前文第一方面所述抗体或前文第三方面所述单克隆抗体或前文第四方面所述抗体或前文第五方面中(A1)所述人源化抗体或(A2)所述抗体的活性片段或(A5)所述试剂盒或前文第六方面所述药物组合物中的应用。

其中，(A6)所述多肽或(A7)所述偶联物作为免疫原免疫动物(如小鼠)制备抗体。

(B2)前文第一方面所述抗体或前文第二方面所述杂交瘤细胞株1H1或前文第三方面所述单克隆抗体或前文第四方面所述抗体或前文第五方面中(A1)所述人源化抗体或(A2)所述抗体的活性片段在制备前文第六方面所述药物组合物中的应用。

(B3)前文第一方面所述抗体或前文第二方面所述杂交瘤细胞株1H1或前文第三方面单克隆抗体或前文第四方面所述抗体或前文第五方面所述生物材料或前文第六方面所述药物组合物在制备抗肿瘤的产品中的应用。

(B4)前文第一方面所述抗体或前文第二方面所述杂交瘤细胞株1H1或前文第三方面单克隆抗体或前文第四方面所述抗体或前文第五方面所述生物材料或前文第六方面所述药物组合物在制备用于抑制肿瘤生长的产品中的应用。

(B5)前文第一方面所述抗体或前文第二方面所述杂交瘤细胞株1H1或前文第三方面单克隆抗体或前文第四方面所述抗体或前文第五方面所述生物材料或前文第六方面所述药物组合物在制备用于抑制肿瘤转移的产品中的应用。

(B6)前文第一方面所述抗体或前文第二方面所述杂交瘤细胞株1H1或前文第三方面单克隆抗体或前文第四方面所述抗体或前文第五方面所述生物材料或前文第六方面所述药物组合物在制备用于抑制肿瘤类器官生长的产品中的应用。

(B7)前文第一方面所述抗体或前文第二方面所述杂交瘤细胞株1H1或前文第三方面单克隆抗体或前文第四方面所述抗体或前文第五方面所述生物材料或前文第六方面所述药物组合物在制备用于抑制肿瘤细胞克隆形成的产品中的应用。

(B8)前文第一方面所述抗体或前文第二方面所述杂交瘤细胞株1H1或前文第三方面单克隆抗体或前文第四方面所述抗体或前文第五方面所述生物材料或前文第六方面所述药物组合物在制备用于抑制GPR48的产品中的应用。

(B9)前文第一方面所述抗体或前文第二方面所述杂交瘤细胞株1H1或前文第三方面单克隆抗体或前文第四方面所述抗体或前文第五方面所述生物材料或前文第六方面所述药物组合物在制备用于检测GPR48的产品中的应用。

(B10)前文第一方面所述抗体或前文第二方面所述杂交瘤细胞株1H1或前文第三方面单克隆抗体或前文第四方面所述抗体或前文第五方面所述生物材料或前文第六方面所述药物组合物在制备用于抑制GPR48阳性细胞活力的产品中的应用。

其中，所述GPR48阳性细胞可为表达GPR48的肿瘤细胞(如GPR48阳性的结直肠癌细胞)。

在本发明的具体实施方式中，所述GPR48阳性细胞具体为GPR48阳性的结直肠癌细胞SW480、HCT116和P6C。

(B11)前文第一方面所述抗体或前文第二方面所述杂交瘤细胞株1H1或前文第三方面单克隆抗体或前文第四方面所述抗体或前文第五方面所述生物材料或前文第六方面所述药物组合物在制备用于抑制WNT信号通路的产品中的应用。

(B12)前文第一方面所述抗体或前文第二方面所述杂交瘤细胞株1H1或前文第三方面单克隆抗体或前文第四方面所述抗体或前文第五方面所述生物材料或前文第六方面所述药物组合物在制备用于抑制Ki67蛋白、LRP6蛋白和/或β-catenin蛋白表达的产品中的应用。

(B13)前文第一方面所述抗体或前文第三方面所述单克隆抗体或前文第四方面所述抗体或前文第一方面中(A1)所述人源化抗体或(A2)所述抗体的活性片段在制备抗肿瘤药物增效辅助制剂中的应用。

进一步地，所述抗肿瘤药物可为细胞型朊蛋白PrPc单克隆抗体Ab-5(抗细胞型朊蛋白单克隆抗体，由保藏号为CGMCC4972的杂交瘤细胞系产生，中国发明专利号2011102841582，发明名称：抗细胞型朊蛋白单克隆抗体在制备抗肿瘤药物中的应用)。

在上述各方面中，所述肿瘤均具体可为GPR48阳性的实体肿瘤；所述肿瘤类器官为GPR48阳性的实体肿瘤类器官；所述肿瘤细胞为GPR48阳性的肿瘤细胞。

进一步地，所述实体肿瘤具体可为结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌等。

在本发明的具体实施方式中，所述肿瘤细胞具体为结直肠癌细胞SW480、HCT116、HT29或P6C。所述肿瘤类器官具体为结直肠癌类器官。

所述肿瘤类器官优选为体外3D培养的实体肿瘤类器官。

本发明通过设计并合成G蛋白偶联受体48抗原肽段，免疫Balb/c小鼠并经过融合、克隆筛选、制备腹水、亲和层析技术纯化腹水获得了一株可分泌特异识别人G蛋白偶联受体48的单克隆抗体的杂交瘤细胞1H1。由1H1所分泌的单克隆抗体2-1H1不仅与QLPEDAFKNFPFLEE肽段具有极强的特异性和敏感性，而且与人组织和细胞中的GPR48蛋白有极强的特异性和敏感性。该单克隆抗体可应用于免疫印迹，免疫荧光和免疫组化等免疫学实验技术中；可应用于流式细胞分析和流式细胞分选等流式细胞学实验技术中；可应用于研究亚细胞定位，蛋白相互作用等信号通路的科学研究中。单克隆抗体2-1H1可用于人体GPR48阳性肿瘤如结直肠癌的临床药物开发。

保藏说明

参据的生物材料(株)：1H1

科学描述：小鼠杂交瘤细胞

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2020年09月03日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.20290

附图说明

图1为2-1H1抗体与GPR48特异性结合的图。A.流式细胞法检测2-1H1抗体(左)和商品化GPR48单克隆抗体(R&D公司，中)与结肠癌细胞系P6C内源性GPR48结合，IgG作为阴性对照(右)；B.流式细胞法检测抗2-1H1抗体分别与野生型P6C(左)和外源表达GPR48的P6C-GPR48(中)的结合。

图2为2-1H1抗体在免疫印迹和免疫组织化学上的应用。A.免疫印迹法检测四种结直肠癌细胞系中2-1H1抗体与GPR48的结合，图中LGR4即为GPR48；B.免疫组织化学法检测抗体与结肠癌标本中GPR48的结合。

图3为免疫荧光显示2-1H1抗体识别结肠癌类器官细胞膜蛋白GRP48。A.GRP48定位于结肠癌细胞质膜上；B.DAPI标记的细胞核染色；C.膜蛋白GPR48与细胞核图片重叠。

图4为流式细胞法检测不同组织中GPR48的表达情况。A.正常结肠；B.结肠癌；C.结肠癌类器官。

图5为免疫荧光法检测不同组织中GPR48的表达情况。第一排为A.正常结肠；B.结肠癌；C.结肠癌类器官中的GPR48；第二排为GPR48与相应的细胞核图片重叠。

图6为2-1H1抗体对三种结直肠癌细胞活力的影响。A.处理时间24h；B.处理时间48h；C.处理时间72h。图中LGR4即为GPR48。

图7为2-1H1抗体对肿瘤类器官生长的抑制效果：A.肿瘤类器官明场图(自上而下第一排为1#-5#肿瘤类器官与2-1H1抗体共培养14天，抗体终浓度10μg/ml、第二排为1#-5#肿瘤类器官与小鼠IgG共培养14天，IgG浓度10μg/ml)；B.肿瘤类器官数量统计图。

图8为2-1H1抗体对小鼠体内肿瘤的治疗效果。A.原位肿瘤图像，第一排为IgG对照组；第二排为2-1H1单克隆抗体实验组；B.原位肿瘤体积大小统计。

图9为2-1H1与PrPc单克隆抗体Ab-5联合治疗能更好地抑制原位肿瘤的生长及肿瘤转移能力。A.单独或联合治疗的小鼠腹部肿瘤荧光；B.单独或联合治疗的小鼠肿瘤体积(自上而下第一排为腹腔注射IgG的小鼠结直肠肿瘤、第二排为腹腔注射2-1H1单克隆抗体的小鼠结直肠肿瘤第三排为腹腔注射PrPc单克隆抗体Ab-5的小鼠结直肠肿瘤、第四排为腹腔注射2-1H1和Ab-5的小鼠结直肠肿瘤；C.单独或联合治疗的小鼠肝脏H&E染色。

图10为2-1H1抑制肿瘤类器官中Ki67的表达(A)，2-1H1处理肿瘤类器官12及24小时后LRP6、β-catenin(B)的表达量,IgG作为阴性对照，β-actin作为上样量参照。C为2-1H1处理HCT116细胞系抑制LRP6和β-catenin表达。

图11为2-1H1单克隆抗体引起GPR48降解。A为2-1H1单克隆抗体处理肿瘤细胞不同时间，免疫印迹检测GPR48的表达水平。B为2-1H1单克隆抗体与肿瘤细胞孵育，免疫荧光显示2-1H1促进细胞膜上GPR48的降解。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用到的细胞系及主要试剂：

本发明所使用的细胞系包括：P6C(该细胞系由本实验室自行自结肠癌病人肿瘤组织中分离得到.中国发明专利号201210033124.0，发明名称：一种人结直肠癌肿瘤细胞系及其制备方法和应用，保藏号为CGMCC No.5558)、SW480(

CCL-228^TM)、HCT116(

CCL-247^TM)、HT-29(

HTB-38^TM)为本实验室购买并长期培养保存。

本发明所使用的主要试剂及其来源为：

Actin单克隆抗体(A-5441)、a-tubulin单克隆抗体、Triton-X 100、PAGE凝胶配制试剂、Pipes，均来自Sigma。

商业化GPR48单克隆抗体为R&D Systems公司产品，克隆号#852229，货号MAB7750。商业化GPR48多克隆抗体为ThermoFisher公司产品，货号PA527177。FITC标记的抗小鼠荧光二抗为ThermoFisher公司产品辣根过氧化物酶偶联的二抗均为KPL公司产品。

EMEM细胞培养液、OPTI-MEM、Western blotting用醋酸纤维素膜、Hepes、100×GlutaMax、100×N2、50×B27来自Gibco公司。。

Coomassie Blue G250、R250、NP-40、Tween 20、DMSO来自Merck。

显色底物AB液来自Pierce。

构建质粒所用的PfuUltra High-Fidelity DNA PolymerasesⅡ，DNA ligase来自Takara公司。

限制性内切酶来自NEB公司。

Lipofectemin2000来自Invitrogen。

FBS(Fetal bovine serum)来自Hyclone。

其他试剂若无特别说明，均为国产分析纯。

实施例1、GPR48抗原多肽靶点的合成

1、根据人GPR48氨基酸序列设计并合成多肽QLPEDAFKNFPFLEE(SEQ ID No.5)。

2、1mg多肽QLPEDAFKNFPFLEE与1mg载体蛋白KLH偶联作为免疫原。

具体偶联方法为：

将1mg的KLH溶于200μl的PBS中；

将0.2mg的Sulfo-SMCC溶于40μl的PBS中；

然后将溶解的SMCC溶液缓慢滴加进入KLH溶液中，边滴加边轻混匀，室温反应1小时；

将溶液加入透析袋中，用PBS透析，除去多余的SMCC，透析过夜；

第二天，更换1-2次透析液后，将200μl PBS溶解的1mg多肽缓慢滴入半偶联物中，边滴加边混匀，室温反应4小时；

反应完全后，将偶联产物分装保存。

偶联结果鉴定：在96孔板中加入100μl Ellman试剂储备液，再加入10μl偶联后的多肽溶液，用分光光度计在λ＝412nm下测定紫外吸收值。OD值<0.03说明多肽和KLH蛋白偶联成功。

3、0.5mg多肽QLPEDAFKNFPFLEE与0.5mg载体蛋白BSA偶联作为检测原。

具体偶联方法为：

将0.5mg的BSA溶于100μl的PBS中；

将0.1mg的sulf-SMCC同样溶于20μl的PBS中；

然后将溶解的SMCC溶液缓慢滴加进入BSA溶液中，边滴加边轻混匀，室温反应1小时；

第二天，更换1-2透析液后，将200μl PBS溶解的1mg多肽缓慢滴入半偶联物中，边滴加边混匀，室温反应4小时；

反应完全后，分装保存。

偶联结果鉴定：在96孔板中加入100μl Ellman试剂储备液，再加入10μl偶联后的多肽溶液，用分光光度计在λ＝412nm下测定紫外吸收值。OD值<0.03说明多肽和BSA蛋白偶联成功。

实施例2、小鼠抗人GPR48抗体的获得

1、免疫动物

将偶联KLH的QLPEDAFKNFPFLEE肽段(以SEQ ID No.5所示多肽质量计210μg)溶于600μl PBS缓冲液中，与600μl完全弗氏佐剂(Sigma公司，货号F5881)混合，在注射器中来回推压5～10min，得到稳定的乳化液，即免疫原。皮下免疫3只SPF级Balb/c雌性小鼠(以下简称多肽免疫小鼠)，编号为：1，2，3；免疫量为70μg蛋白/只(以SEQ ID No.5所示多肽质量计)。免疫后在第14天抽取小鼠尾血，使用ELISA方法进行尾血抗体效价的评价。

2、效价检测

步骤：使用实施例1中的多肽、多肽偶联BSA(偶联剂为SMCC)、偶联剂+BSA分别包被酶标板(1μg/mL)，每孔加入100μL，4℃过夜反应；使用PBS溶液洗板3次，使用5％牛奶-PBS在室温封闭1小时；然后使用PBS溶液洗板1次后，加入使用5％牛奶-PBS溶液梯度稀释的小鼠尾血，室温反应1小时；然后使用PBS溶液洗板3次，并进行拍干后，加入1:2000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG(Fc)二抗，室温反应1小时；PBS溶液洗板5次后，拍干，加入等体积的TMB显色剂(碧云天，货号P0209)，避光、室温条件下反应20分钟；然后加入50μL终止液(碧云天，货号P0215)，混匀后在酶标仪上读取OD450值。

结果表明：多肽免疫组三只小鼠尾血均识别多肽偶联BSA(多肽-BSA)，滴度都达到1:50000，高于未偶联的多肽(1:5000)，说明多肽偶联BSA增强包被效果。同时，多肽免疫小鼠尾血识别偶联剂-BSA的信号微弱，说明小鼠尾血中大部分为特异性识别多肽的抗体。

3、细胞融合实验

根据上述ELISA结果，选择效价最高的1号小鼠进行细胞融合。将小鼠脾细胞与SP2/0细胞，采用PEG法进行融合。

4、挑克隆

融合后，挑取564个单克隆，培养于6块96孔细胞培养板中。

5、单克隆细胞第一次筛选

用实施例1中的检测原(多肽QLPEDAFKNFPFLEE偶联BSA)包板，通过上述ELISA方法对564个细胞培养上清进行评价。筛选细胞培养液上清能够识别多肽-BSA的单克隆细胞株。通过ELISA方法，筛选出8个OD450值高于0.8的阳性单克隆细胞。

6、单克隆细胞第二次筛选

将这8个阳性单克隆细胞扩大至48孔板中，培养2天后，包被检测原重复进行ELISA检测，进行第二次筛选，得到5株OD450值高于1的阳性杂交瘤细胞株。

7、单克隆细胞第三次筛选

将第二次筛选的5个阳性克隆继续扩大至12孔板中，收集细胞上清，12000rpm离心10分钟，取上清。与P6C细胞4℃孵育30分钟，加入山羊抗小鼠IgG-FITC，4℃孵育30分钟。流式细胞仪检测FITC阳性细胞的比例及荧光强度，得到2株分泌特异性识别P6C细胞膜表面内源性GPR48蛋白的单克隆细胞1H1和6E11。其中1H1检测到的阳性信号荧光强度平均值为50.1，显著高于6E11检测到的荧光强度平均值25.18。

8、单克隆细胞亚类鉴定

将三筛得到的2株阳性细胞株培养液上清用试剂盒进行亚类鉴定，最后发现1H1细胞分泌的抗体亚型为IgG1，轻链类型为λ。

9、冻存

冻存液配制，FBS：IMDM：DMSO(体积比)＝8:1:1；

每一株冻存三管，过3天后再冻存三管，冻存方法为冻存盒冻存法，-80℃过夜后，移于液氮柜中保存。

10、测序

对其中抗体分泌能力较强的细胞株进行RNA提取、反转录及抗体可变区PCR扩增与测序，我们获得了小鼠杂交瘤细胞株1H1分泌的单克隆抗体anti-GPR48 m2-1H1(简称2-1H1)的可变区cDNA序列如下：

GPR48 2-1H1 VH(重链可变区)：SEQ ID NO.4

GPR48 2-1H1 VL(轻链可变区)：SEQ ID NO.3

相对应的氨基酸序列如下：

GPR48 2-1H1 VH(重链可变区)：SEQ ID NO.2

GPR48 Ab-L5 VL(轻链可变区)：SEQ ID NO.1

实施例3、2-1H1单克隆抗体的制备

将实施例2中的小鼠杂交瘤细胞株1H1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2020年9月3日，保藏号为CGMCC No.20290。

小鼠杂交瘤细胞株1H1用于制备鼠抗GPR48单克隆抗体2-1H1，具体操作步骤如下：

1、细胞复苏

从-80℃冰箱或液氮罐中迅速取出冻存管；迅速放入37℃水浴锅中快速搅动，使冻存液在2分钟内全部融化成液体。往15mL离心管中加入3mL含15％FBS血清的IMDM培养基，将冻存液吸入离心管，1500转/分钟，离心5分钟。弃上清，用完全培养基悬起细胞，培养于6孔板(3mL)或瓶(5mL)中。

2、腹水制备

对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起；计数大约5×10⁵，1mL。悬浮的细胞腹腔注射小鼠。7-10天后便收集腹水。第一次收集3mL左右，每隔2、3天重复取，最终可收集8mL/只。每次取出的腹水4000转/分钟，离心10分钟；中间为腹水。小心吸出腹水收集于离心管中，进行下一步的Protein G纯化。。

3、单克隆抗体的纯化

取1mL偶联有G蛋白的柱料加入一根空柱子中，使用PBS溶液清洗后，将2mL腹水用8mL的PBS稀释后上柱，然后将流过液重新上柱一次；然后使用pH 2.7的甘氨酸洗脱液(0.1M甘氨酸-HCl)进行洗脱，每1mL洗脱液收集管中预先加入100μL中和液(1.0M Tris-HCl，pH9.0)，共收集5管；紧接着使用pH 1.9的甘氨酸洗脱液(0.1M甘氨酸-HCl)进行洗脱，每1mL洗脱液收集一管(预先加入300μL中和液，1.0M Tris-HCl,pH 9.0)，共收集3管；然后分别对每一管洗脱液进行OD280读数，将OD280大于0.5的洗脱液进行混合，混合后再重新测定混合液的OD280，按照1.4的系数计算抗体浓度；抗体浓度＝OD280/1.4。

实施例4、2-1H1单克隆抗体特异性识别GPR48

1、单克隆抗体效价的测定

将本发明方法制得的2-1H1单克隆抗体用上述ELSIA方法进行评价，发现该抗体识别多肽QLPEDAFKNFPFLEE偶联BSA，灵敏度大于0.0005μg/mL(大于阴性对照的5倍，0.372/0.067＝5.55)，且与偶联剂-BSA无交叉反应(表1)。

表1、OD₄₅₀,稀释度单位μg/mL

2、用本发明方法制得的2-1H1单克隆抗体1mg/ml和商品化小鼠抗GPR48单克隆抗体(R&D公司)，兔抗GPR48多克隆抗体(ThermoFisher公司)，分别以1:100，1:300，1:500，1:1000，1:2000，1:4000，1:10000稀释后与结肠癌细胞P6C裂解液电泳转膜孵育过夜，然后与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育4小时，与ECL发光底物孵育曝光显影，检测抗体的灵敏度。结果显示本发明方法制得的2-1H1单克隆抗体效价是商品化GPR48单克隆抗体的13.3倍，是商品化GPR48多克隆抗体的4倍(本发明方法制得的2-1H1单克隆抗体效价为1:4000，商品化单克隆抗体的效价是1:300，商品化多克隆抗体的效价为1:1000。即4000/300＝13.3，4000/1000＝4)。

2、检测抗体的特异性和灵敏度的测定

结肠癌细胞系P6C培养过夜，胰酶替代物TrypLE Express在37℃消化5分钟，加入血清终止反应。PBS洗3次，用本发明方法制得的2-1H1单克隆抗体和商品化鼠抗GPR48蛋白单克隆抗体(R&D公司)分别以1:100，1:200，1:500，1:1000，1:2000稀释后与结肠癌细胞系P6C共同孵育30分钟，然后与FITC荧光标记的山羊抗小鼠IgG孵育30分钟。流式细胞仪检测荧光强度，检测抗体的灵敏度。本发明方法制得的2-1H1单克隆抗体灵敏度是商品化GPR48单克隆抗体的5倍(本发明方法制得的2-1H1单克隆抗体稀释倍数为500，商品化抗体的稀释倍数是100，即500/100＝5)(图1中A)。

在pcDNA4-TO-myc-his-B载体(Ziheng Chen et al.Mitochondrial E3 ligaseMARCH5 regulates FUNDC1 to fine-tune hypoxic mitophagy.EMBO Rep.2017Mar；18(3):495–509.)的HindIII和EcoI多克隆位点中插入GPR48基因(GeneID:55366)，用lipo2000转染试剂将经测序验证正确的重组载体转染结肠癌细胞系P6C，构建表达外源GPR48的结肠癌细胞系P6C-GPR48。胰酶替代物TripLE-Express消化成单细胞悬液，用本发明方法制得的1mg/ml 2-1H1单克隆抗体以1:500比例稀释，分别与野生型P6C和P6C-GPR48细胞在PBS磷酸盐缓冲液中4℃孵育30分钟，然后与FITC荧光标记的山羊抗小鼠IgG孵育30分钟。流式细胞仪检测GPR48的表达。如图1中B所示，2-1H1单克隆抗体检测到P6C-GPR48细胞中阳性比例上升(与P6C相比),表明该抗体特异性识别GPR48，也表明本发明方法制得的2-1H1单克隆抗体特异性识别外源性GPR48。

实施例5、2-1H1单克隆抗体的用途验证-免疫印迹(Western bloting)

1、实验步骤：

4种结直肠癌细胞系(SW480、HT29、HCT116和P6C)裂解，将裂解液上清中的全蛋白样本30μg上样于12％SDS-PAGE胶；电泳结束后，将胶在1×转移液中浸泡10分钟；PVDF膜甲醇处理后350mA，转膜70分钟；将膜置于含5％脱脂奶粉的TBST封闭液中37℃封闭1小时；2-1H1单克隆抗体(1：2000稀释)37℃孵育1小时或者4℃孵育过夜；相应羊抗小鼠二抗(中杉金桥，1：2500稀释)室温孵育1小时；用发光试剂(Pierce)孵育后X光胶片曝光。

2、实验结果

如图2中A所示，4种结直肠癌细胞系均表达GPR48，其中HT29表达水平较低，SW480表达水平居中，HCT116和P6C表达较高水平的GPR48。

实施例6、2-1H1单克隆抗体的用途验证-免疫组织化学(IHC)

1、材料来源

本发明具体实施方式所用结直肠癌组织标本均购买自西安艾丽娜生物科技有限公司，包括结直肠癌及癌旁正常组织样本。样本取材是手术切除的人结直肠癌及癌旁组织，经生理盐水洗涤后，放入10％福尔马林固定，石蜡包埋切片保存。所有标本均经病理证实。

2、实验步骤

烤片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化。0.3％浓度的H₂O₂甲醇溶液室温孵育10分钟，然后用0.01M PBS(磷酸盐缓冲液)洗3次×5分钟；用5％脱脂奶粉，37℃封闭1小时；1mg/ml抗GPR48单克隆抗体2-1H1(1:2000在PBS中稀释)，湿盒孵育4℃过夜；滴加通用二抗(中杉金桥，PV-6002)，室温孵育30分钟；DAB-H₂O₂(中杉金桥，ZLI-9031)显色，镜下控制1-5分钟，自来水冲洗，终止显色；苏木素(中杉金桥，ZLI-9040)复染45秒，然后1％盐酸酒精分化；自来水冲洗反蓝；95％和100％乙醇脱水各5分钟，二甲苯透明，中性树胶封片。

3、实验结果

如图2中B所示，2-1H1可用于免疫组织化学方法识别结直肠癌石蜡切片中GPR48阳性细胞，GPR48表现为细胞质膜定位。

实施例7、2-1H1单克隆抗体的用途验证-检测蛋白的亚细胞定位

1、材料来源

所用结直肠癌类器官来源于北京肿瘤医院结直肠癌样本(标本均经病理证实)，经生理盐水洗涤后，剪碎，胶原酶和分散酶37℃消化2小时，静置1分钟，取自然沉淀，PBS洗3次，在冰上与100μl Matrigel(Corning，货号356234)混合，接种到24孔板中，37℃固化15分钟，然后覆盖800μl结肠癌类器官培养液(Advanced DMEM/F12+GlutaMax+HEPES+N2+B27)，每2天更换一次新鲜培养液。

2、实验步骤

染色时，将organoid(结直肠癌类器官)从Matrigel中吹打出来，加入胰酶替代物TrypLE Express，37℃消化5分钟，离心，将结肠癌类器官接种到盖玻片上。在结肠癌类器官培养液中培养过夜后，细胞及盖玻片转至冰上，与4℃预冷的2-1H1单克隆抗体(1：1000稀释)冰上孵育2小时，4℃PBS洗3次。-20℃甲醇固定20分钟，PBS洗3次，加FITC标记的山羊抗小鼠二抗(1：200稀释)暗盒中孵育1小时；0.25μg/μL4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液染细胞4分钟；将盖玻片取出盖在滴有10μL抗荧光衰减封片剂的载玻片上，激光扫描共聚焦显微镜下观察。

3、实验结果

如图3所示，2-1H1单克隆抗体识别定位于细胞膜上的GPR48蛋白。

实施例8、2-1H1单克隆抗体的用途验证-流式细胞(FCM)

1、实验步骤

经手术切除的新鲜结直肠癌组织与其对应的癌旁组织(来源于北京肿瘤医院，标本经病理证实)经生理盐水洗涤后，剪碎，胶原酶和分散酶37℃消化2小时，静置1分钟，取自然沉淀。加入胰酶替代物TrypLE Express，37℃消化30分钟。400目细胞筛过滤，磷酸盐缓冲液洗2次。加入2-1H1单克隆抗体1:500，4℃孵育30分钟，加入荧光标记的山羊抗小鼠，4℃孵育30分钟，流式检测荧光信号。

结直肠癌类器官(同实施例7步骤1)经分离和胰酶替代物TrypLE Express消化，400目细胞筛过滤，磷酸盐缓冲液洗2次。加入2-1H1单克隆抗体1:500，4℃孵育30分钟，加入FITC荧光标记的山羊抗小鼠IgG，4℃孵育30分钟，400目细胞筛过滤成单细胞悬液，流式细胞仪检测荧光强度和阳性细胞比例。2、实验结果

如图4所示，2-1H1单克隆抗体可用于流式细胞方法识别正常结肠、原代结肠癌、结肠癌类器官中的GPR48。

实施例9、2-1H1单克隆抗体的用途验证-免疫荧光(IF)

1、实验步骤

结直肠癌组织与癌旁组织来自西安艾丽娜生物科技有限公司、结肠癌类器官(同实施例7步骤1)经福尔马林固定，石蜡包埋，5μm厚度切片。烤片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化。然后用0.01M PBS(磷酸盐缓冲液)洗3次×5分钟；5％脱脂奶粉，37℃封闭2小时；2-1H1单克隆抗体(1：1000稀释)，湿盒孵育4℃过夜；滴加荧光标记的羊抗鼠二抗(Invitrogen)，室温孵育30分钟。0.25μg/μL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液染细胞4分钟；将盖玻片取出盖在滴有10μL抗荧光衰减封片剂的载玻片上，激光扫描共聚焦显微镜下观察荧光信号。

2、实验结果

如图5所示，2-1H1单克隆抗体可用于免疫荧光识别正常结肠、结肠癌和结肠癌类器官GPR48蛋白。

实施例10、GPR48抗体对GPR48阳性结直肠癌细胞系有明显抑制作用

用2-1H1单克隆抗体作为一抗鉴定不同结直肠癌细胞系(SW480、HCT116、HT29及P6C)GPR48的表达情况，经免疫印迹分析得知这四种细胞系中，HT29表达较低，SW480表达水平居中，HCT116和P6C细胞表达水平较高(图2)，因此HCT116和P6C这两种细胞系可以用于GPR48抗体与肿瘤治疗关系的研究。

SW480、HCT116和P6C细胞与商业化GPR48单克隆一抗及荧光标记的二抗孵育，通过流式细胞分选的方法将表达GRP48(GPR48⁺)和不表达GPR48(GPR48^-)的细胞分离，分别加入终浓度为10μg/ml的2-1H1单克隆抗体。24小时，48小时和72小时分别与噻唑蓝(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)孵育，用酶标仪测定490nm处的光密度OD值，计算细胞活力。如图6所示，2-1H1单克隆抗体特异性抑制GPR48⁺细胞的活力。

克隆形成(clone formation)和动物成瘤(tumorigenesis)是检验肿瘤干细胞干性的两个最重要的标准。利用克隆形成技术测定三种GPR48阳性细胞(SW480、HCT116和P6C)及作为对照的阴性细胞MCF7经抗体处理后干性的变化。克隆形成法具体步骤为：消化细胞成单细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗2遍，用培养基重悬。调整细胞密度至1×10⁴/ml，取细胞悬液10μl(1×10²个)加入2ml培养液中。加入终浓度10μg/ml的2-1H1单克隆抗体，混匀后加入6孔板的一个孔中，每个样品重复3孔。每3天更换新鲜培养液，14天后，固定细胞，R-250染色，显微镜下观察，拍照，并计数，统计克隆数。10μg/ml小鼠IgG作为阴性对照，处理时间和更换培养液频率同2-1H1抗体组。商业化GPR48单克隆抗体作为对照组，抗体浓度和处理方式同2-1H1抗体组。

通过对单克隆计数发现，跟IgG对照组比较，所有加2-1H1单克隆抗体的实验组，细胞克隆形成能力都受到了不同程度的抑制。尤其是在GPR48表达水平较高的P6C和HCT116细胞中，2-1H1抗体对克隆形成的抑制率分别达到76.4％和51.3％。对于GPR48表达水平较低的SW480细胞，2-1H1单克隆抗体对克隆形成也有一定的抑制(43.5％)。商业化GPR48单克隆抗体对三种细胞的克隆形成抑制作用都很微弱，尤其在GPR48表达水平较高的P6C和HCT116细胞中，商业化GPR48抗体对克隆形成的抑制率仅为9.7％和15.4％。抑制率结果见表2。

表2、2-1H1抗体对于GPR48阳性结直肠癌细胞的克隆形成抑制影响

实施例11、GPR48抗体对肿瘤类器官的抑制作用

结直肠癌类器官(同实施例7步骤1)经分离和胰酶替代物TrypLE Express消化，400目细胞筛过滤，磷酸盐缓冲液洗2次，计数。取100个细胞接种的基质胶上，同时加入2-1H1单克隆抗体10μg/ml。每2天更换一次新鲜的含2-1H1单克隆抗体的培养液，10μg/ml的IgG作为对照，每个样品重复3孔。20天后，显微镜观察类器官数量及大小，拍照，计数，统计肿瘤类器官数量。

如图7所示，在5个病人的肿瘤类器官中，2-1H1抗体显著抑制类器官的形成率及大小。由图可见，2-1H1抗体对5个病人的肿瘤类器官有不同程度的抑制(抑制率45％-78％)。尤其在类器官形成率最高的4号病人中，抑制作用最为显著，抑制率达到75％，表明2-1H1抗体具有较高的生物学活性。

实施例12、GPR48抗体对小鼠盲肠肿瘤有良好的治疗作用

IgG与单克隆抗体2-1H1溶于PBS缓冲液，每周一次，以10mg/kg体重的剂量分别腹腔注射野生型C57小鼠。6周后，称重，解剖小鼠，并观察肝脾主要脏器，发现两组之间差别不明显，肝脾在颜色大小上并未有明显区别，小鼠平均体重基本一致，都在29g左右。分别取小鼠心脏、肝脏、肺、小肠、大肠等器官，福尔马林固定，石蜡包埋切片，H&E染色，发现小鼠器官组织结构没有明显变化，说明本发明所述的抗体对正常鼠的毒性较低，具有很好的生物安全性。

在NOD/SCID小鼠盲肠原位接种10个肿瘤类器官(实施例7步骤1中的“结直肠癌类器官”)，3周后解剖小鼠，肉眼可见肿瘤形成，表明小鼠盲肠肿瘤模型建立成功。将接种了肿瘤类器官3周的NOD/SCID小鼠随机分成IgG对照组和2-1H1单克隆抗体实验组，进行腹腔注射抗体治疗(IgG和2-1H1单克隆抗体溶于PBS缓冲液中，每周注射一次，剂量为10mg/kg体重)实验。如图8所示，在给药持续5周后，即肿瘤接种后8周，通过解剖观察，和肿瘤剥离称重，我们发现抗体治疗组小鼠肿瘤显著小于IgG对照组。表明本发明中的2-1H1单克隆抗体对小鼠盲肠肿瘤有良好的治疗作用。

实施例13、2-1H1与PrPc单克隆抗体Ab-5联合治疗能更好地抑制原位肿瘤的生长及肿瘤转移

在裸鼠盲肠肠壁各接种2×10⁶个DeRed-P6C细胞，具有荧光标记基团的DeRed-P6C细胞的制备方法为：P6C细胞接种于6孔板，待细胞长至80-90％满时，用lipofectemin2000试剂盒转染pDsRed2-N1载体(本实验室保存)，5h后换液(含10％FBS的HDMEM)，常规培养24h，消化细胞，制成单细胞悬液，利用流式细胞技术分选DeRed阳性细胞，激发光为556nm，发射光为586nm，然后将DsRed阳性细胞扩大培养，连续分选10次以上，当DsRed阳性细胞率稳定于95％以上时，即获得了DsRed-P6C稳定细胞株。DsRed阳性细胞接种后的第三周，利用小动物活体成像技术，观察肿瘤是否接种成功，发现大部分肿瘤接种成功。

联合治疗的动物实验共分4组：①IgG Cont 10mg/kg，②GPR48 2-1H1 10mg/kg，③PrPc Ab-5 10mg/kg，④combination:GPR48 2-1H1+PrPc Ab-5各10mg/kg。每组10只小鼠。在肿瘤接种3周后开始进行注射抗体进行治疗，在治疗8周后，IgG对照组已开始有明显腹水产生，用活体成像仪采集小鼠腹部肿瘤荧光信息，并在解剖后收集离体器官荧光数据。治疗8周后，小鼠腹部肿瘤荧光显示GPR48 2-1H1单克隆抗体实验组和GPR48 2-1H1+PrPc Ab-5联合处理组比IgG对照组显著降低(P<0.01)。解剖小鼠获取皮下肿瘤。通过肿瘤体积测定，我们发现2-1H1治疗组肿瘤体积比IgG对照组显著降低，GPR48 2-1H1+PrPc Ab-5联合处理对肿瘤的抑制作用更为显著(图9)。取小鼠肝脏，经福尔马林固定和石蜡包埋，H&E染色显示联合处理显著降低肿瘤细胞转移到肝脏。上述结果表明，本发明所述的2-1H1抗体在联合PrPc单克隆抗体Ab-5时，能够更好的抑制肿瘤的生长和转移。

实施例14、2-1H1抑制肿瘤细胞Wnt信号通路

为了进一步验证2-1H1抗体对于GPR48阳性细胞生长抑制作用的具体作用机理，我们检测了肿瘤类器官(实施例7步骤1中的“结直肠癌类器官”)中与细胞增殖相关因子Ki67的表达，发现在肿瘤细胞中，该蛋白有较高水平表达。流式细胞仪分选结直肠癌类器官中GPR48阳性的肿瘤细胞，并在类器官培养体系中将GPR48阳性的肿瘤细胞培养成肿瘤类器官。在培养体系中加入2-1H1单克隆抗体(浓度为10μg/ml)，经免疫组织化学检测，发现相对于IgG对照组，2-1H1降低Ki67蛋白表达水平(图10中A)。LRP6是Wnt信号通路的受体，传导Wnt下游信号通路。经免疫印迹检测发现，在10μg/ml浓度2-1H1作用下，LRP6在12小时时出现下降，WNT信号通路关键蛋白β-catenin在24小时出现显著下降，表明2-1H1单克隆抗体抑制WNT信号通路(图10中B)。这一现象解释了2-1H1处理后，GPR48阳性的细胞克隆形成能力下降、肿瘤类器官发生率降低、裸鼠肿瘤生长被抑制的原因。同样的结果，在GPR48阳性的肿瘤细胞系HCT116细胞中也得到了验证(图10中C)。

实施例15、2-1H1单克隆抗体引起抗原GPR48的降解

为验证2-1H1单克隆抗体对抗原的中和活性，我们将2-1H1以10μg/ml的终浓度处理肿瘤细胞系P6C，分别在0，1，2，3，4小时用免疫印迹的方法检测GPR48的表达水平。结果发现4小时时2-1H1显著降低肿瘤细胞GPR48的表达(图11中A，IgG处理4小时作为阴性对照)。为验证这一结果，我们将2-1H1偶联绿色荧光蛋白GFP(常规生物学方法)。在4℃条件下用2-1H1-GFP孵育肿瘤细胞P6C 30分钟，用4℃预冷的PBS洗去未结合细胞的2-1H1-GFP抗体，对照组立即用-20℃甲醛固定，实验组(1)加入37℃含有终浓度为10μg/ml 2-1H1的细胞培养液，实验组(2)加入37℃含有终浓度为10μg/ml商业化GPR48单克隆抗体(R&D)的细胞培养液，15分钟后用-20℃甲醛固定，DAPI染细胞核，共聚焦显微镜观察GFP荧光信号。结果表明对照组GPR48定位在细胞膜上，2-1H1孵育细胞15分钟后，显著促进GPR48的降解(图11中B,左图是对照组，中图是商业化GPR48单克隆抗体孵育组，右图是2-1H1孵育组)，说明2-1H1具有降解GPR48抗原的中和活性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国科学院动物研究所

<120> 针对人GPR48的单克隆抗体及其应用

<130> GNCLN210546

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr Leu Ala Ser Asn Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Leu Gln His Trp Asn Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 2

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr His

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Gly Asp Gly Tyr Tyr Gly Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 3

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60

atcacctgca aggccagtca gaatgttcgt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120

gggcagtctc ctaaagcact gatttacttg gcatccaacc ggcacactgg agtccctgat 180

cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattagcaa tgtgcaatct 240

gaagacctgg cagattattt ctgtctgcaa cattggaatt atcctctcac gttcggtgct 300

gggaccaagt tggagctgaa a 321

<210> 4

<211> 357

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

gaggtgcagc ttcaggagtc aggtggagga ttggtgcagc ctaaagggtc cttgaaactc 60

tcatgtgcag cctctggatt caccttcaat acccatgcca tgaactgggt ccgccaggct 120

ccaggaaagg gtttggaatg ggttgctcgt ataagaagta aaagtaataa ttatgcaaca 180

tattatgccg attcagtgaa agacaggttc accatctcca gagatgattc acaaagcatg 240

ctctatctgc aaatgaacaa cttgaaaact gaggacacag ccatgtatta ctgtgtgggg 300

gatggttact acgggtttac ttattggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 5

Gln Leu Pro Glu Asp Ala Phe Lys Asn Phe Pro Phe Leu Glu Glu

1 5 10 15

Claims

1.抗体，其特征在于：所述抗体的轻链可变区中LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1的第27-32位、第50-52位、第89-97位所示；

和/或

所述抗体的重链可变区中HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.2的第26-33位、第51-60位、第99-108位所示。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于：所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNo.1，或者与SEQ ID No.1具有至少90％的一致性；

和/或

所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.2，或者与SEQ ID No.2具有至少90％的一致性。

3.根据权利要求1或2所述的抗体，其特征在于：所述抗体的重链类型为IgG1；和/或

所述抗体的轻链类型为λ；和/或

所述抗体为鼠源抗体。

4.小鼠杂交瘤细胞株1H1，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.20290。

5.单克隆抗体，由权利要求1所述的小鼠杂交瘤细胞株1H1分泌产生。

6.抗体，以SEQ ID No.5所示多肽和载体蛋白的偶联物作为免疫原免疫动物后所得。

7.如下任一生物材料：

(A1)人源化抗体，为将权利要求1-3中任一所述抗体或权利要求5所述单克隆抗体或权利要求6所述抗体进行人源化改造后所得；

(A2)抗体的活性片段，为源自权利要求1-3中任一所述抗体或权利要求5所述单克隆抗体或权利要求6所述抗体或(A1)所述人源化抗体的如下任一：单链抗体、抗体Fab区、抗原结合片段；

(A3)核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1-3中任一所述抗体或权利要求5所述单克隆抗体或权利要求6所述抗体或(A1)所述人源化抗体或(A2)所述抗体的活性片段；

(A4)含有(A3)中所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌；

(A5)试剂盒，含有权利要求1-3中任一所述抗体或权利要求5所述单克隆抗体或权利要求6所述抗体或(A1)所述人源化抗体或(A2)所述抗体的活性片段或(A3)所述核酸分子或(A4)中所述表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌；

(A6)SEQ ID No.5所示的多肽；

(A7)(A6)所示多肽与载体蛋白的偶联物。

8.根据权利要求7所述的生物材料，其特征在于：在(A3)所述核酸分子中，编码所述抗体的轻链可变区中LCDR1、LCDR2和LHCDR3的核苷酸序列依次如SEQ ID No.3自5’端起第79-96位、第148-156位、第265-291位所示；和/或

在(A3)所述核酸分子中，编码所述抗体的重链可变区中HCDR1、HCDR2和HCDR3的核苷酸序列依次如SEQ ID No.4自5’端起第76-99位、第151-180位、第295-324位所示；

进一步地，在(A3)所述核酸分子中，编码所述抗体的所述轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID No.3或者与SEQ ID No.3具有至少90％的一致性；和/或

进一步地，在(A3)所述核酸分子中，编码所述抗体的所述重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID No.4或者与SEQ ID No.4具有至少90％的一致性。

9.药物组合物，其特征在于：所述药物组合物包含权利要求1-3中任一所述抗体或权利要求5所述单克隆抗体或权利要求6所述抗体或权利要求7或8中(A1)所述人源化抗体或(A2)所述抗体的活性片段；

进一步地，所述药物组合物中还含有抗肿瘤药物；

更进一步地，所述抗肿瘤药物为细胞型朊蛋白PrPc单克隆抗体Ab-5。

10.应用，为如下任一所示：

(B1)权利要求7或8中(A3)所述核酸分子或(A4)所述表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或(A6)所述多肽或(A7)所述偶联物在制备权利要求1-3中任一所述抗体或权利要求5所述单克隆抗体或权利要求6所述抗体或权利要求7或8中(A1)所述人源化抗体或(A2)所述抗体的活性片段或(A5)所述试剂盒或权利要求9所述药物组合物中的应用；

(B2)权利要求1-3中任一所述抗体或权利要求4所述小鼠杂交瘤细胞株1H1或权利要求5所述单克隆抗体或权利要求6所述抗体或权利要求7或8中(A1)所述人源化抗体或(A2)所述抗体的活性片段在制备权利要求9所述药物组合物中的应用；

(B3)权利要求1-3中任一所述抗体或权利要求4所述小鼠杂交瘤细胞株1H1或权利要求5所述单克隆抗体或权利要求6所述抗体或权利要求7或8所述生物材料或权利要求9所述药物组合物在制备抗肿瘤的产品中的应用；

(B4)权利要求1-3中任一所述抗体或权利要求4所述小鼠杂交瘤细胞株1H1或权利要求5所述单克隆抗体或权利要求6所述抗体或权利要求7或8所述生物材料或权利要求9所述药物组合物在制备用于抑制肿瘤生长的产品中的应用；

(B5)权利要求1-3中任一所述抗体或权利要求4所述小鼠杂交瘤细胞株1H1或权利要求5所述单克隆抗体或权利要求6所述抗体或权利要求7或8所述生物材料或权利要求9所述药物组合物在制备用于抑制肿瘤转移的产品中的应用；

(B6)权利要求1-3中任一所述抗体或权利要求4所述小鼠杂交瘤细胞株1H1或权利要求5所述单克隆抗体或权利要求6所述抗体或权利要求7或8所述生物材料或权利要求9所述药物组合物在制备用于抑制肿瘤类器官生长的产品中的应用；

(B7)权利要求1-3中任一所述抗体或权利要求4所述小鼠杂交瘤细胞株1H1或权利要求5所述单克隆抗体或权利要求6所述抗体或权利要求7或8所述生物材料或权利要求9所述药物组合物在制备用于抑制肿瘤细胞克隆形成的产品中的应用；

(B8)权利要求1-3中任一所述抗体或权利要求4所述小鼠杂交瘤细胞株1H1或权利要求5所述单克隆抗体或权利要求6所述抗体或权利要求7或8所述生物材料或权利要求9所述药物组合物在制备用于抑制GPR48的产品中的应用；

(B9)权利要求1-3中任一所述抗体或权利要求4所述小鼠杂交瘤细胞株1H1或权利要求5所述单克隆抗体或权利要求6所述抗体或权利要求7或8所述生物材料或权利要求9所述药物组合物在制备用于检测GPR48的产品中的应用；

(B10)权利要求1-3中任一所述抗体或权利要求4所述小鼠杂交瘤细胞株1H1或权利要求5所述单克隆抗体或权利要求6所述抗体或权利要求7或8所述生物材料或权利要求9所述药物组合物在制备用于抑制GPR48阳性细胞活力的产品中的应用；

(B11)权利要求1-3中任一所述抗体或权利要求4所述小鼠杂交瘤细胞株1H1或权利要求5所述单克隆抗体或权利要求6所述抗体或权利要求7或8所述生物材料或权利要求9所述药物组合物在制备用于抑制WNT信号通路的产品中的应用；

(B12)权利要求1-3中任一所述抗体或权利要求4所述小鼠杂交瘤细胞株1H1或权利要求5所述单克隆抗体或权利要求6所述抗体或权利要求7或8所述生物材料或权利要求9所述药物组合物在制备用于抑制Ki67蛋白、LRP6蛋白和/或β-catenin蛋白表达的产品中的应用；

(B13)权利要求1-3中任一所述抗体或权利要求5所述单克隆抗体或权利要求6所述抗体或权利要求7或8中(A1)所述人源化抗体或(A2)所述抗体的活性片段在制备抗肿瘤药物增效辅助制剂中的应用；

进一步地，所述抗肿瘤药物为细胞型朊蛋白PrPc单克隆抗体Ab-5。