CN118307677A - 一种针对间皮素的单克隆抗体及应用 - Google Patents
一种针对间皮素的单克隆抗体及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种针对间皮素的单克隆抗体及应用。本发明所提供的抗人间皮素的单克隆抗体或其抗原结合部分,含有名称为VH的重链可变区和名称为VL的轻链可变区,所述VH和VL均由决定簇互补区和框架区组成;所述VH和所述VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成;所述VH的CDR1、CDR2和CDR3如SEQ ID No:5的第31‑35位所示、第50‑66位所示、第99‑109位所示;所述VL的CDR1、CDR2和CDR3如SEQ ID No:7的第24‑34位所示、第50‑56位所示、第89‑97位所示。基于间皮素是极具研究价值的抗肿瘤新靶点,本发明制备的抗间皮素单克隆抗体可作为靶向抗肿瘤药的新型理想载体,为靶向抗肿瘤药物研究与开发打下坚实基础,具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及一种针对间皮素的单克隆抗体及应用。
背景技术
在探索单克隆抗体治疗实体瘤的进程中,间皮素(mesothelin,MSLN)首次发现在卵巢癌中有特异性表达。人间皮素基因位于染色体16p 13.3上,长度约为8kb,由16个长度为7733bp的外显子组成。间皮素的前体蛋白是约69kD的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的膜糖蛋白,可以在精氨酸295(Arg 295)处被蛋白水解酶水解成两部分,分别为30kD的巨核细胞增强因子(megakaryocyte potentiating factor,MPF)和40kD的具有细胞黏附性的间皮素膜结合片段。此片段也可在肿瘤坏死因子“转化蛋白酶”的作用下从细胞表面脱落。间皮素在正常组织中很少表达,但是在恶性间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌和肺癌等多种肿瘤中高表达。间皮素生物学功能目前尚不清楚,间皮素基因敲除小鼠不显示任何可检测的表型,且雌性和雄性都能繁殖出正常的后代,这也表明间皮素是生长发育非必需蛋白。间皮素在肿瘤细胞增殖、粘附及耐药性方面起着重要作用,因此可作为相关肿瘤标志物,进行癌症早期诊断、评估癌症治疗效果、检测原发肿瘤和转移病灶的分布,成为治疗新靶点进行肿瘤免疫靶向治疗(J Clin Oncol.2016Dec 1;34(34):4171–4179.)。
近年来以间皮素为靶点的抗肿瘤药物研究如抗体、抗体偶联药物(ADC)、免疫毒素、肿瘤疫苗等逐步发展,尤其是ADC药物研究进展突飞猛进。目前正处于临床II期试验阶段的ADC药物DMOT4039A是由人源化抗间皮素单抗h7D9.v3与抗微管蛋白药物MMAE偶联而成,该药物具有良好的抗肿瘤效果,临床应用于治疗乳腺癌和卵巢癌,患者用药后客观缓解率达38%,临床有效率为55%,并且患者在用药最高剂量时有很好的耐受性。因此,DMOT4039A具有很好的安全性和抗肿瘤活性,有较好的发展前景。
杂交瘤融合技术于1975年由Kohler和Milstein首创,并于1984年荣获得若贝尔医学生物学奖。由于B细胞不能无限增殖,体外存活时间不超多20天,不能大规模产生单克隆抗体,而肿瘤细胞可以无限增殖存活,因此在PEG(聚乙二醇)融合剂作用下使能够产生特异性抗体的B细胞与骨髓瘤细胞发生细胞融合(或电融合),并经多次阳性克隆筛选获得可以稳定分泌抗特定抗原的单克隆杂交瘤细胞株,所产生的抗体即为针对一种抗原决定簇的单克隆抗体,其具有高特异性、高纯度、均质性好、高亲和力、高效价以及成本低等特点。近年来基于单克隆抗体的肿瘤靶向治疗被认为最有潜力和最受瞩目的肿瘤治疗策略之一。据统计截止2018年,FDA共批准24款治疗实体肿瘤的单抗药物,分别靶向了CD抗原(包括CD19,CD20,CD30,CD33,CD38和CD53)、肿瘤细胞表面分子(HER2,EGFR,PD-L1,GD2,PMSA以及SLAMF7)、靶向免疫细胞表面抑制性受体PD-1和CTLA-4以及抑制肿瘤血管生成。但现阶段可以用于单抗药物研发的靶点非常有限,因此发现新的肿瘤特异性抗原,尤其在肿瘤组织中表达量高且发挥重要作用的抗原并研究制备靶向这些抗原的单克隆抗体,用于扩大单抗在肿瘤靶向治疗领域中的应用具有重要意义。
力达霉素(Lidamycin,LDM)是高效抗肿瘤抗生素,包括辅基蛋白(LDP)和发色团(AE)两部分。其LDP可以通过基因工程的方法制备,LDP的空间结构可以形成一个疏水口袋,保护其活性的烯二炔发色团(AE),LDP和AE通过非共价键结合,两者结合具有特异性和牢固性,并可以拆分和进行分子重建。LDM以其独特的分子结构适合作为“弹头”药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种针对间皮素的单克隆抗体及应用。
本发明所提供的抗人间皮素的单克隆抗体或其抗原结合部分,其特征在于:所述单克隆抗体或其抗原结合部分含有名称为VH的重链可变区和名称为VL的轻链可变区,所述VH和VL均由决定簇互补区和框架区组成;所述VH和所述VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成;
所述VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:5的第31-35位所示;
所述VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:5的第50-66位所示;
所述VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:5的第99-109位所示;
所述VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:7的第24-34位所示;
所述VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:7的第50-56位所示;
所述VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:7的第89-97位所示。
所述CDR的命名系统为kabat系统。
所述抗人间皮素的单克隆抗体可为人源化单克隆抗体。所述人源化单克隆抗体是将鼠源单克隆抗体进行人源化改造得到的。
具体的,所述抗人间皮素的单克隆抗体,其重链可变区如SEQ ID No:5的第1-120位所示,其轻链可变区如SEQ ID No:7的第1-104位所示。
具体的,所述抗人间皮素的单克隆抗体,其重链如SEQ ID No:5所示,其轻链如SEQIDNo:7所示。
所述抗人间皮素的单克隆抗体可为鼠源单克隆抗体。
鼠源单克隆抗体中,所述VH和所述VL的框架区来源于小鼠。
具体的,所述抗人间皮素的单克隆抗体,其重链可变区如SEQ ID No:1的第20-139位所示,其轻链可变区如SEQ ID No:3的第21-127位所示。
具体的,所述抗人间皮素的单克隆抗体,其重链可变区如SEQ ID No:1所示,其轻链可变区如SEQ ID No:3所示。
本发明还保护生物材料,为如下(a)、(b)、(c)、(d)或(e):
(a)编码以上任一所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的核酸分子;
(b)具有(a)所述核酸分子的表达盒;
(c)具有(a)所述核酸分子的重组载体;
(d)具有(a)所述核酸分子的重组微生物;
(e)具有(a)所述核酸分子的转基因细胞系。
编码重链可变区的核酸分子具体可为如下(f1)或(f2):
(f1)SEQ ID No:2的第58-417位所示;
(f2)SEQ ID No:2所示。
编码轻链可变区的核酸分子具体可为如下(f3)或(f4):
(f3)SEQ ID No:4的第61-381位所示;
(f4)SEQ ID No:4所示。
编码重链可变区的核酸分子具体可如SEQ ID No:6的第1-360位所示。
编码轻链可变区的核酸分子具体可如SEQ ID No:8的第1-312位所示。
编码重链的核酸分子具体可如SEQ ID No:6所示。
编码轻链的核酸分子具体可如SEQ ID No:8所示。
本发明还保护杂交瘤细胞QJW-520-3B7,已于2019年06月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所),保藏登记号为CGMCC No.18168。
本发明还保护杂交瘤细胞QJW-520-3B7分泌的单克隆抗体。
本发明还保护以上任一所述的单克隆抗体或者以上任一所述抗原结合部分或者以上任一所述杂交瘤细胞或者以上任一所述生物材料的应用,为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)或(Ⅳ):
(Ⅰ)在制备用于靶向肿瘤或肿瘤细胞的载体中的应用;
(Ⅱ)在制备用于检测间皮素的产品中的应用;
(Ⅲ)在制备用于检测肿瘤组织或肿瘤细胞的产品中的应用;
(Ⅳ)在制备用于抑制肿瘤或抑制肿瘤细胞的产品中的应用。
本发明还保护一种产品,其活性成分包括其活性成分包括以上任一所述的单克隆抗体或者以上任一所述抗原结合部分;
所述产品为如下(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ):
(ⅰ)用于靶向肿瘤或肿瘤细胞的载体;
(ⅱ)用于检测间皮素的产品;
(ⅲ)用于检测肿瘤组织或肿瘤细胞的产品。
本发明还保护抗体和药物的偶联物;所述抗体为以上任一所述的单克隆抗体或者以上任一所述抗原结合部分。
具体的,所述药物可为力达霉素。
所述偶联物具体可由抗体重链、LDP融合抗体轻链和力达霉素的发色团组装而成。
所述抗体重链中具有重链可变区和重链恒定区。
所述重链可变区可为以上任一所述的重链可变区。
具体的,所述重链可变区如SEQ ID No:9所示。
LDP融合抗体轻链中具有LDP、轻链可变区和轻链恒定区。
LDP,即力达霉素的辅基蛋白。
具体的,所述LDP如SEQ ID No:11的第22-131位所示。
所述轻链可变区可为以上任一所述的轻链可变区。
具体的,LDP融合抗体轻链如SEQ ID No:11的第22-243位所示或者如SEQ ID No:11所示。
具体的,所述力达霉素的发色团如式(I)所示。
所述偶联物的制备方法具体可为:
(1)将质粒pIZDHL的NheI和XhoI酶切识别序列间的小片段替换为序列表的序列10所示的DNA分子,并且将MluI和BsiWI酶切识别序列间的小片段替换为序列表的序列12所示的DNA分子,保持其它序列不变,得到重组质粒pIZDHL-MSLN-IgG-LDP;
(2)将重组质粒pIZDHL-MSLN-IgG-LDP进行pvuI酶切,然后转染CHO细胞,得到表达VH蛋白和LDP-VL蛋白的细胞株,命名为CHO-Anti-MSLN-LDP细胞株;
(3)培养CHO-Anti-MSLN-LDP细胞株,从培养上清中纯化抗体;
(4)将步骤(3)得到的抗体与力达霉素的发色团共孵育,通过LDP和力达霉素的发色团的亲和作用,得到偶联物。
本发明还保护以上任一所述偶联物在制备药物中的应用。
本发明还保护一种药物,其活性成分为所述偶联物。
以上任一所述药物为抑制肿瘤的药物。
以上任一所述药物可为抑制肿瘤细胞的药物。
以上任一所述肿瘤可为表达或高表达间皮素的肿瘤。
以上任一所述肿瘤可为卵巢癌、胰腺癌或肺癌等。
以上任一所述肿瘤细胞为表达或高表达间皮素的肿瘤细胞。
示例性的,所述肿瘤细胞可为人卵巢癌细胞、人胰腺癌细胞或人大细胞肺癌细胞等。
示例性的,所述肿瘤细胞可为SKOV3细胞、AsPC-1细胞、OVCAR-3细胞、SW1990细胞或H460-1细胞等。
本发明通过杂交瘤融合技术,利用间皮素抗原免疫BALB/C小鼠制备免疫脾脏细胞,与SP2/0细胞融合,建立分泌抗间皮素单克隆抗体杂交瘤细胞株库,从中筛选出稳定且高分泌抗体的杂交瘤细胞3B7。进一步,本发明利用杂交瘤细胞株3B7,通过腹水诱生法扩大生产单抗,制备了高效价、高亲和活性、高特异性的鼠源抗间皮素单克隆抗体,并且完成了该单克隆抗体的氨基酸序列测定。更进一步,本发明将上述鼠源单克隆抗体进行了人源化改造。基于间皮素是极具研究价值的抗肿瘤新靶点,本发明制备的抗间皮素单克隆抗体可作为靶向抗肿瘤药的新型理想载体,为靶向抗肿瘤药物研究与开发打下坚实基础,具有良好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中8株可高表达抗间皮素抗体的单克隆杂交瘤细胞株制备的抗体浓度。
图2为实施例2中检测抗体效价的结果。
图3为实施例2中HPLC法检测抗体纯度的结果。
图4为实施例2中电泳检测抗体纯度的结果。
图5为实施例3中检测供试细胞表达间皮素的情况的结果。
图6为实施例3中流式细胞术检测抗体与肿瘤细胞结合能力的结果。
图7为实施例3中抗间皮素抗体共聚焦免疫荧光检测的结果(OVCAR-3细胞)。
图8为实施例3中抗间皮素抗体共聚焦免疫荧光检测的结果(SKOV3细胞)。
图9为实施例3中小鼠活体成像监测抗体靶向肿瘤能力的结果(OVCAR-3细胞)。
图10为实施例3中小鼠活体成像监测抗体靶向肿瘤能力的结果(AsPC-1细胞)。
图11为实施例3中小鼠活体成像监测抗体靶向肿瘤能力的结果(SKOV3细胞)。
图12为实施例3中3B单抗与人肿瘤组织芯片结合能力测定的结果。
图13为实施例5中重组质粒pIZDHL-MSLN-IgG-LDP的结构示意图。
图14为实施例5中Anti-MSLN-LDP蛋白与力达霉素发色团AE组装示意图。
图15为实施例5中抗体力达霉素偶联物对肿瘤细胞的杀伤活性的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。如无特殊说明,以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。如无特殊说明,实施例中的PBS缓冲液均为pH7.4、0.01M的PBS缓冲液。PBST溶液:1000ml PBS缓冲液中加入500μl吐温20。人间皮素蛋白:北京义翘神州科技有限公司,货号13128-H08H1。SKOV3细胞:人卵巢癌细胞。AsPC-1细胞:人胰腺癌细胞。OVCAR-3细胞:人卵巢癌细胞。SW1990细胞:人胰腺癌细胞。H460细胞:人大细胞肺癌细胞。
实施例中,通过ELISA检测抗体效价以及抗体浓度,具体方法如下:
①用PBS缓冲液稀释人间皮素蛋白至2μg/mL,然后加入96孔板中(每孔100μL),4℃孵育过夜,然后用PBST溶液洗3次(每次每孔加入200μL,然后震荡3min,然后弃除上清)。
②完成步骤①后,加入2% BSA封闭液(每孔200μL),37℃孵育2h,然后用PBST溶液洗3次(每次每孔加入200μL,然后震荡3min,然后弃除上清)。2% BSA封闭液:2g BSA溶于100ml PBS缓冲液。
③完成步骤②后,加入供试样本(每孔100μL),37℃孵育2h,然后用PBST溶液洗3次(每次每孔加入200μL,然后震荡3min,然后弃除上清)。
④完成步骤③后,加入二抗工作液(每孔100μL),37℃孵育1h,然后用PBST溶液洗3次(每次每孔加入200μL,然后震荡3min,然后弃除上清)。二抗工作液:将辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG(Fc特异性)用PBS缓冲液稀释至1000倍体积。辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG:北京中杉金桥生物科技有限公司,货号ZB-2305。
⑤完成步骤④后,加入TMB显色液,常温孵育30min。
⑥完成步骤⑤后,加入2M H2SO4溶液以终止反应,然后用酶标仪检测450nm处吸光度值。
供试样本即供试抗体或供试抗体的稀释液(采用PBS缓冲液作为稀释用溶剂)。供试样本设置2个复孔。
用标准品溶液代替供试样本,按照上述方法进行操作,制作以吸光值和抗体浓度为变量的标准曲线。标准品溶液设置三个复孔。标准品溶液:SANTA间皮素单抗200μg/mL,先用超滤管浓缩,然后用PBS缓冲液稀释至1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.13μg/mL、0.06μg/mL或0.03μg/mL。SANTA间皮素单抗(间皮素鼠源嵌合抗体):Santa Cruz生物技术公司,货号sc-271540。
根据吸光值,可以得到供试抗体的效价。
通过将吸光值代入标准曲线,计算可以得到供试抗体的浓度。
实施例1、杂交瘤细胞的获得和保藏
一、杂交瘤细胞的获得
1、动物免疫
间皮素抗原即人间皮素蛋白。间皮素抗原溶液是将人间皮素蛋白溶于PBS缓冲液得到的。
0周,第一次免疫,间皮素抗原溶液与完全弗氏佐剂等体积混合,冰浴条件下超声乳化完全(时间3min,超声波频率小于30%,每超声2s停2s)。每只小鼠腹腔注射200μL,相当于抗原总量50μg/只。
3周,第二次免疫,间皮素抗原溶液与不完全弗氏佐剂等体积混合,冰浴条件下超声乳化完全。每只小鼠腹腔注射200μL,相当于抗原总量25μg/只。
6周,第三次免疫,操作同第二次免疫。
7周,通过ELISA法检测小鼠血清抗体效价,血清效价达百万。
示例性结果见表1。
表1
9周,加强免疫。每只小鼠腹腔注射200μl间皮素抗原溶液(含50μg抗原),三天后进行细胞融合。
2、骨髓瘤细胞活化
SP2/0细胞接种于BALB/c小鼠背部,待瘤块长至500mm3左右剥离瘤块研磨制成细胞悬液,用细胞计数仪进行细胞计数及活力测定,存活率大于90%的骨髓瘤细胞可进行融合。
3、B淋巴细胞的准备
取血清抗体效价达到融合指标的BALB/c小鼠,摘眼球取血,分离血清,-20℃保存备用。将小鼠脱颈处死,在75%酒精中浸泡5min进行消毒处理。于超净台内解剖盘中用无菌剪刀和镊子剪开小鼠左腹部皮肤,更换无菌剪刀和镊子,打开腹腔,脾脏位于左腹后侧部,长为3-4cm深红色舌形组织,即为脾脏。取出脾脏置于盛有10ml无血清培养基的平皿中,轻轻洗涤,并小心剥去周围结缔组织(注意,要保持脾脏外层粘膜的完整性)。在脾脏圆弧状的一头用5mL注射器针向内戳两三个洞,吸取无血清培养液,在脾脏尖的一头用注射器把培养液打入脾脏,每针管液体约注射8s左右,以保证一定的压力和流速将脾脏内的B淋巴细胞充分吹洗出来。冲洗3-5次,待脾脏变白即可。收集B细胞悬液,1000rpm离心5min。用无血清培养基重悬进行细胞计数,通常一只小鼠可取108个B淋巴细胞。
4、细胞融合
取1×108个脾细胞与2×107-5×107个骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14(通常比例为10:1—10:5)混合于一支50ml离心管中,1000rpm离心5min,吸净上清,轻击离心管管底使沉淀细胞松散均匀,置40℃水浴中预热备用。用时45s均匀而缓慢的加入1ml预热至40℃的50% PEG-1450溶液(pH8.0),边加边轻轻旋转离心管,使PEG溶液充分且均匀接触松散的细胞。吸取1ml预热至40℃无血清培养基在60s内缓慢而均匀的加入离心管底,边加边旋转离心管;吸取5ml预热至40℃无血清培养基在60s内缓慢而均匀的加入离心管底,边加边旋转离心管;吸取10ml预热至40℃无血清培养基在90s内缓慢而均匀的加入离心管底,边加边旋转离心管;重复一次;1000rpm离心5min弃去上清。加入添加HAT培养液的1640完全培养基,轻轻吹吸成细胞悬浮,加入到96孔板中,5% CO2培养箱内培养,5天后用HAT培养基换出1/2培养基,7-10天后用HT培养基换出HAT培养基,第14天后可用普通完全培养基。观察杂交瘤细胞生长情况,待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测,并间隔相同时间进行第二次抗体检测,比较两次阳性值结果,挑出阳性值提高或持平的孔,初步断定为阳性孔,并进一步阳性孔筛选克隆化。
5、阳性杂交瘤筛选及亚克隆
利用稀释培养法进行杂交瘤细胞复筛及亚克隆。制备小鼠腹腔细胞。挑取阳性孔的杂交瘤细胞悬液,用含20%血清的HT培养基稀释杂交瘤细胞至每毫升含2.5、15和50个细胞的不同稀释度细胞悬液,铺板于96孔板,0.2ml/孔,每孔杂交瘤细胞数分别为0.5、3和10,37℃、5% CO2培养7-10天,出现肉眼可见的克隆,在显微镜下观察,挑出只有单个克隆生长的孔(克隆呈现圆形,且边缘细胞生长轨迹弧线圆润即为单克隆),并进行抗体检测。取抗体检测阳性孔的细胞进行2-3次同上的稀释培养亚克隆筛选后扩大培养,并冻存。
共筛选出8株可高表达抗间皮素抗体的单克隆杂交瘤细胞株,相应抗体的450nm处吸光度值见表2,将吸光值代入标准曲线计算抗体浓度,相应抗体的浓度见图1。细胞株3B7生产抗体的能力最高。
表2
6、杂交瘤细胞3B7稳定性鉴定
连续培养杂交瘤细胞3B7,检测细胞培养上清中抗体效价。
传代过程中细胞培养上清检测抗体效价时450nm处吸光度值见表3。G1代表传代1代,依此类推。结果显示,在传代过程中以及重新复苏后的抗体效价无明显变化,证明杂交瘤细胞3B7可以稳定分泌抗间皮素单克隆抗体。
表3
二、杂交瘤细胞的保藏
杂交瘤细胞3B7,其全称为杂交瘤细胞QJW-520-3B7。
杂交瘤细胞QJW-520-3B7,已于2019年06月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所),保藏登记号为CGMCC No.18168。
实施例2、抗间皮素单克隆抗体的制备
一、单克隆抗体的制备
1、7-8周龄雌性BALB/c小鼠,腹腔注射弗氏不完全佐剂(500μl/只),正常饲养7-10天。
2、完成步骤1后,腹腔注射杂交瘤细胞悬液(200μl/只),正常饲养7-10天。
杂交瘤细胞悬液:将杂交瘤细胞3B7重悬于PBS缓冲液,使细胞浓度为1×107个/ml。
3、完成步骤2后,采集腹水,10000rpm离心30min,收集上清液。
4、取步骤3获得的上清液,采用0.45μm滤膜过滤,收集滤液。
5、取步骤4获得的滤液,进行硫酸铵沉淀,然后用ProteinG(1ml)亲和层析柱纯化,获得单克隆抗体,称为3B7单抗。
二、对照样品的制备
用SP2/0细胞代替杂交瘤细胞株3B7,其他同步骤一,得到对照样品。
三、检测抗体效价
分别通过ELISA检测步骤一制备的3B7单抗和步骤二制备的对照样品的效价。
结果见图2。
四、抗体纯度鉴定
1、HPLC法检测抗体纯度
供试抗体:步骤一制备的3B7单抗。
凝胶柱:SEC S3000;流速:1ml/min;上样量:20μl;检测器:280nm;
洗脱过程:0-16min流动相中乙腈比例为5-95%梯度增加,总时长为20min;
通过单抗特征吸收280nm的积分峰面积,计算单抗纯度。
结果见图3。纯度为95%以上。
2、电泳检测抗体纯度
供试抗体:步骤一制备的3B7单抗。
取供试抗体,分别进行非还原蛋白电泳以及还原蛋白电泳。
电泳凝胶:12%分离胶,5%浓缩胶。
考马斯亮蓝染色后凝胶成像系统拍照。
结果见图4。
五、抗体类及亚类鉴定
供试抗体:步骤一制备的3B7单抗。
取供试抗体,采用SBA Clonotyping System-HRP小鼠单克隆抗体分型试剂盒鉴定。
结果见表4。3B7单抗的重链亚型为IgG1,轻链亚型为Kappa。
表4
亚型 | OD450nm值 | P/N | 反应 |
IgA | 0.1166 | 1.7613 | - |
IgG1 | 1.7524 | 26.4713 | + |
IgG2a | 0.1004 | 1.5196 | - |
IgG2b | 0.1038 | 1.5680 | - |
IgG3 | 0.1091 | 1.6480 | - |
IgM | 0.0757 | 1.1435 | - |
Kappa | 0.7811 | 11.7991 | + |
Lambda | 0.0965 | 1.4577 | - |
control | 0.0662 | 1.0000 |
六、3B7单抗的氨基酸序列测定
提取杂交瘤细胞3B7的RNA,逆转录获得cDNA库,通过PCR和测序获得编码抗体重链和抗体轻链的核苷酸序列,进而获得重链和轻链的氨基酸序列。
3B7单抗的重链可变区如序列表的序列1所示(由序列表的序列2所示的DNA分子编码),3B7单抗的轻链可变区如序列表的序列3所示(由序列表的序列4所示的DNA分子编码)。
实施例3、鼠源单克隆抗体的性能
一、检测供试细胞表达间皮素的情况
供试细胞:SKOV3细胞、AsPC-1细胞或OVCAR-3细胞。
取供试细胞,提取总蛋白,通过westernblot检测间皮素。
westernblot采用的一抗为实施例2的步骤一制备的3B7单抗或小鼠抗β-actin抗体(中杉金桥,TA-09)。
结果见图5。
二、流式细胞术检测抗体与肿瘤细胞结合能力
供试细胞:SKOV3细胞、AsPC-1细胞或OVCAR-3细胞。
1、取5×106个供试细胞于EP管中,用含2% FBS的PBS缓冲液洗涤,然后用100μl含2%FBS的PBS缓冲液重悬,即为一份细胞悬液。
2、取细胞悬液,加入实施例2的步骤一制备的3B7单抗,使抗体浓度分别为10、1、0.1、0.01或0.001μg/ml。取细胞悬液,加入实施例2的步骤二制备的对照样品,作为0浓度对照。
3、完成步骤2后,4℃孵育1.5h,用含2% FBS的PBS缓冲液洗涤,然后加入200μlFITC标记羊抗鼠IgG二抗(1:200倍稀释),4℃避光孵育1h,然后用PBS缓冲液洗涤3次,然后采用流式细胞仪检测。
结果见图6。3B7单抗与高表达间皮素的OVCAR3细胞和中表达间皮素的AsPC-1细胞均有较强的结合能力,并且其结合强度与抗体浓度呈剂量依赖性。3B7单抗与低表达间皮素的SKOV3细胞结合程度很弱。结果表明,3B7单抗能够与肿瘤细胞表面天然的间皮素特异性结合。
三、抗间皮素抗体共聚焦免疫荧光检测
供试细胞:SKOV3细胞或OVCAR-3细胞。
本步骤用于检测3B7单抗是否能与肿瘤细胞结合并通过内吞作用被转运至溶酶体。
1、将处于对数生长期的供试细胞制成单细胞悬液,细胞浓度为1×104个/200μl。
2、将单细胞悬液接种于八孔小室(200μl/孔),37℃培养24h,然后加入实施例2的步骤一制备的3B7单抗(10μg/mL,200μL/孔),4℃孵育30min或者37℃孵育2h。4℃孵育0.5h是为了检测单抗与细胞表面的结合情况。37℃孵育2h是为了检测单抗被细胞内吞的情况。
3、收集细胞,用PBS缓冲液洗3次,然后加入4%多聚甲醛(200μL/孔)固定15min,然后用PBST溶液洗3次,然后加入0.2% Triton-X100(200μl Triton-X100+100ml PBS缓冲液)200μL/孔,透化10min,然后用PBST溶液洗3次,然后加入5% BSA溶液,37℃封闭30min。
4、加入兔抗人溶酶体蛋白LAMP-1的抗体,4℃孵育过夜,用PBST溶液洗3次,然后加入AF555(红色荧光)标记驴抗兔二抗(200μL/孔),37℃孵育2h,同时加入AF488(绿色荧光)标记的山羊抗小鼠二抗(200μL/孔),37℃孵育30min,用PBST溶液洗5次,加DAPI核染15min,用PBST溶液洗3次,滴加抗荧光猝灭剂,然后在共聚焦显微镜下观察。
3B7单抗标记为绿色荧光。LAMP-1抗体标记为红色荧光。DAPI染核,标记为蓝色荧光。
结果见图7和图8。3B7单抗可与高表达间皮素的OVCAR-3细胞结合并被内吞转运至溶酶体呈现黄色荧光。在低表达间皮素的SKOV3细胞中未观察到3B7单抗与细胞膜的结合及其内吞现象。结果表明,3B7单抗可特异性靶向高表达间皮素的肿瘤细胞并能通过受体介导的内吞作用被转运至溶酶体。
四、小鼠活体成像监测抗体靶向肿瘤能力
供试细胞:OVCAR-3细胞、AsPC-1细胞或SKOV3细胞。
利用Dylight 680抗体试剂盒标记3B7单抗,获得标记后单抗。
供试细胞接种BALB/c裸鼠腋窝(6×104个细胞/只),饲养小鼠至瘤体积达200-300cm2,然后尾静脉注射标记后单抗(20mg/kg),分别于30min、1h、2h、3h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、24h、30h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h、132h、144h、156h、168h、192h、216h、240h、264h、288h、312h、336h、360h进行活体成像拍照。
OVCAR-3细胞的结果见图9。AsPC-1细胞的结果见图10。SKOV3细胞的结果见图11。
在卵巢癌OVCAR-3移植瘤模型中,在给药6h后,DyLight 680标记的3B7单抗开始在肿瘤部位富集,60-180h荧光富集程度最强,且肿瘤部位的荧光富集可持续15天以上。在胰腺癌细胞AsPC-1移植瘤模型中,在给药3h后,DyLight 680标记的3B7单抗开始在肿瘤部位富集,60-156h荧光富集程度最强,且肿瘤部位的荧光富集可持续15天以上。在卵巢癌细胞SKOV3移植瘤模型中,由于SKOV3细胞表达间皮素抗原水平较低,DyLight 680标记的3B7单抗在给药36h才开始在肿瘤部位富集,且荧光强度相对较弱。
在给药15天时,处死BALB/c裸鼠模型,剥离瘤块,取其心、肝、脾、肺、肾、胰腺、大肠、小肠、股骨和胃置于荧光成像仪下检测,结果显示离体肿瘤仍具有较强的荧光信号,其他组织脏器没有明显的荧光强度,说明3B单抗可特异并持久的富集于肿瘤部位。
五、3B单抗与人肿瘤组织芯片结合能力测定
卵巢癌组织芯片(产品编号:HOvaC151Su01)和胰腺癌组织芯片(产品编号:OD-CT-DgPan03-002)均购于上海芯超生物科技有限公司。
免疫组化染色主要步骤包括:烘片、脱蜡、抗原修复、内源性过氧化物酶阻断、一抗孵育、二抗孵育、DAB显色、苏木素复染、封片。
结果见图12。3B单抗与人卵巢癌及胰腺癌肿瘤组织的结合活性显著区别于相应的癌旁组织,与肿瘤组织结合呈阳性,与癌旁组织结合呈阴性。表明3B7单抗能够与人卵巢癌及胰腺癌组织特异性结合。
实施例4、人源化单克隆抗体的制备
一、鼠源单克隆抗体的人源化改造
以3B7单抗的序列为基础,进行人源化设计,获得人源化单克隆抗体序列。
将人源化单克隆抗体命名为h3B7单抗。h3B7单抗,重链如序列表的序列5所示(由序列表的序列6所示的DNA分子编码),轻链如序列表的序列7所示(由序列表的序列8所示的DNA分子编码)。
二、人源化单克隆抗体的制备
制备h3B7单抗(北京安必奇生物科技有限公司)。h3B7单抗,重链如序列表的序列5所示(由序列表的序列6所示的DNA分子编码),轻链如序列表的序列7所示(由序列表的序列8所示的DNA分子编码)。
制备h3B7单抗的方法简述如下:将外源DNA分子插入至pcDNA3.1-IgG1Fc表达载体,得到重链表达载体(其中具有序列表的序列6所示的DNA分子,表达序列表的序列5所示重链);将外源DNA分子插入至pcDNA3.1-IgKc表达载体,得到轻链表达载体(其中具有序列表的序列8所示的DNA分子,表达序列表的序列7所示轻链);将重链表达载体和轻链表达载体共转染293F-SVP16细胞,采用FreeStyleTM293表达培养基(赛默飞世尔科技(中国)有限公司,CAT#12338018)培养,收集培养基上清,用0.45μm的滤膜过滤,滤液使用ProteinA磁珠纯化,得到单克隆抗体溶液,即为h3B7单抗溶液。pcDNA3.1-IgG1Fc表达载体、pcDNA3.1-IgKc表达载体、293F-SVP16细胞均为安必奇公司产品。
三、Biacore法检测抗体抗原亲和作用
供试抗体:实施例2的步骤二制备的3B7单抗或本实施例的步骤二制备的h3B7单抗。
采用BiaCoreT200,检测供试抗体与目标蛋白(即人间皮素蛋白)的亲和力。
3B7单抗浓度:10/5/2.5/1.25/0.625/0.3125μg/ml。
h3B7单抗浓度:10/5/2.5/1.25/0.625/0.3125μg/ml。
流速:30μl/min。
结合时间:300s。
解离时间:300s。
再生试剂:Glycine 2.0。
结果见表5。
表5
3B7单抗 | h3B7单抗 | |
Ka(M-1s-1) | 2746 | 1.231×105 |
kd(s-1) | 4.181×10-5 | 3.394×10-4 |
KD(M) | 1.552×10-8 | 2.757×10-9 |
实施例5、融合蛋白anti-MSLN-LDP的构建和表达纯化
一、重组质粒的构建
质粒pIZDHL记载于如下文献:Xiao-Yun Liu,et al.Chimetric,divalent andtetravalent anti-CD19 monoclonal antibodies with potent in vitro and in vivoantitumor activity against human B-cell lymphoma and pre-B acutelymphoblastic leukemia cell lines.Int J Cancer,2011,129(2):497-506.。质粒pIZDHL中具有抗体重链恒定区的编码基因和抗体轻链恒定区的编码基因。
将质粒pIZDHL的NheI和XhoI酶切识别序列间的小片段替换为序列表的序列10所示的DNA分子,并且将MluI和BsiWI酶切识别序列间的小片段替换为序列表的序列12所示的DNA分子,保持其它序列不变,得到重组质粒pIZDHL-MSLN-IgG-LDP。结构示意图见图13。
序列表的序列10所示的DNA分子编码序列表的序列9所示的蛋白质。序列表的序列9所示的蛋白质即VH蛋白(人源化全长重链的重链可变区)。
序列表的序列12所示的DNA分子编码序列表的序列11所示的蛋白质。序列表的序列11所示的蛋白质(LDP-VL蛋白)中,第1-21位氨基酸残基组成信号肽,第22-131位氨基酸残基组成力达霉素辅基蛋白LDP,第140-243位氨基酸残基组成VL蛋白(人源化全长轻链的轻链可变区)。
重组质粒pIZDHL-MSLN-IgG-LDP表达重链(具有VH蛋白和重链恒定区)和LDP融合轻链(具有LDP、VL蛋白和轻链恒定区),二者自组装为抗体蛋白,命名为Anti-MSLN-LDP蛋白。
二、融合蛋白Anti-MSLN-LDP的表达
1、重组质粒pIZDHL-MSLN-IgG-LDP进行pvuI酶切,收获线性化质粒。
2、将步骤1获得的线性化质粒转染CHO细胞(前一天已铺入6孔板中),培养48h,然后收集细胞并用胰酶消化。
3、将步骤2获得的消化后细胞接种至96孔板(约103个细胞/孔),培养24h,然后采用含2μg/ml博莱霉素和10%透析胎牛血清的IMDM培养基进行筛选,得到表达Anti-MSLN-LDP蛋白的细胞株,命名为CHO-Anti-MSLN-LDP细胞株。
三、融合蛋白Anti-MSLN-LDP的纯化
将CHO-Anti-MSLN-LDP细胞株接种至T75细胞培养瓶中,采用含10%透析胎牛血清的IMDM培养基培养至密度达到90%以上,然后换成无血清培养基(CD Opti CHOTMMedium,Gibco)持续培养10天,然后将培养瓶中的液相转移至50ml离心管中,4℃、8000rpm离心15min,收集上清液,用0.45μm膜过滤并收集滤液,然后采用30000MW的超滤管离心浓缩,然后采用Protein G亲和层析柱纯化,然后采用脱盐柱进行脱盐,然后再次采用30000MW的超滤管离心浓缩,得到蛋白溶液,命名为Anti-MSLN-LDP蛋白溶液。
四、抗体力达霉素偶联物的制备
1、取力达霉素,经C4柱分离活性发色团AE(流动相为水:乙腈:三氟乙酸=77.9%:22%:0.1%,体积比,检测350nm处的吸收值),收集发色团AE。
2、将步骤三制备的Anti-MSLN-LDP蛋白与发色团AE按照1:3的分子比混合,置于摇床上缓慢摇动,4℃避光反应12h-16h。
3、完成步骤2后,将二者的混合液4℃、3500rpm超滤离心4-6次(当超滤出的溶液中检测不到发色团的吸收值时停止超滤),收集滤液。滤液中含有抗体力达霉素偶联物(即借助力达霉素的辅基蛋白LDP和力达霉素的发色团AE的结合作用,Anti-MSLN-LDP蛋白与力达霉素的发色团AE形成偶联物),因此滤液又名命名为抗体力达霉素偶联物溶液。Anti-MSLN-LDP蛋白与力达霉素发色团AE组装示意图见图14。
五、抗体力达霉素偶联物对肿瘤细胞的杀伤活性
供试细胞:OVCAR-3细胞、AsPC-1细胞、SW1990细胞、H460细胞。
取对数生长期的供试细胞,计数后接种于96孔板(3000/孔),次日加入步骤四制备的抗体力达霉素偶联物(设置不同的偶联物浓度)或者力达霉素(设置不同的力达霉素浓度),培养48h后,加入CCK-8试剂,在酶标仪450nm处测其吸光值,检测抗体力达霉素偶联物或力达霉素对肿瘤细胞的杀伤活性。
结果见图15。在一致的浓度下(摩尔质量相等),抗体力达霉素偶联物对肿瘤细胞的增殖抑制率与力达霉素接近,两者对MSLN阳性肿瘤细胞的杀伤作用基本一致,表明通过柔性连接肽构建的ADC并不影响力达霉素辅基蛋白LDP与AE的组装以及AE的活性。因此,抗体力达霉素偶联物不仅具有Anti-MSLN-IgG对MSLN抗原的亲和活性和靶向性,还兼有LDM对肿瘤细胞高效的杀伤活性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明的宗旨和范围,以及无需进行不必要的实验情况下,可在等同参数、浓度和条件下,在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例,应该理解为,可以对本发明作进一步的改进。总之,按本发明的原理,本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进,包括脱离了本申请中已公开范围,而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围,可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.抗人间皮素的单克隆抗体或其抗原结合部分,其特征在于:所述单克隆抗体或其抗原结合部分含有名称为VH的重链可变区和名称为VL的轻链可变区,所述VH和VL均由决定簇互补区和框架区组成;所述VH和所述VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成;
所述VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:5的第31-35位所示;
所述VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:5的第50-66位所示;
所述VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:5的第99-109位所示;
所述VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:7的第24-34位所示;
所述VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:7的第50-56位所示;
所述VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:7的第89-97位所示。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分,其特征在于:其重链可变区如SEQ ID No:5的第1-120位所示,其轻链可变区如SEQ ID No:7的第1-104位所示。
3.如权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分,其特征在于:其重链可变区如SEQ ID No:1的第20-139位所示,其轻链可变区如SEQ ID No:3的第21-127位所示。
4.杂交瘤细胞或所述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体;
所述杂交瘤细胞为杂交瘤细胞QJW-520-3B7,其保藏登记号为CGMCC No.18168。
5.生物材料,为如下(a)、(b)、(c)、(d)或(e):
(a)编码权利要求1至3中任一所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的核酸分子;
(b)具有(a)所述核酸分子的表达盒;
(c)具有(a)所述核酸分子的重组载体;
(d)具有(a)所述核酸分子的重组微生物;
(e)具有(a)所述核酸分子的转基因细胞系。
6.权利要求1至3中任一所述的单克隆抗体或其抗原结合部分或者权利要求4所述杂交瘤细胞或者权利要求4所述单克隆抗体或者权利要求5所述生物材料的应用,为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)或(Ⅳ):
(Ⅰ)在制备用于靶向肿瘤或肿瘤细胞的载体中的应用;
(Ⅱ)在制备用于检测间皮素的产品中的应用;
(Ⅲ)在制备用于检测肿瘤组织或肿瘤细胞的产品中的应用;
(Ⅳ)在制备用于抑制肿瘤或抑制肿瘤细胞的产品中的应用。
7.一种产品,其活性成分包括权利要求1至3中任一所述的单克隆抗体或其抗原结合部分或者权利要求4所述单克隆抗体;
所述产品为如下(ⅰ)或(ⅱ)或(ⅲ):
(ⅰ)用于靶向肿瘤或肿瘤细胞的载体;
(ⅱ)用于检测间皮素的产品;
(ⅲ)用于检测肿瘤组织或肿瘤细胞的产品。
8.抗体和药物的偶联物;所述抗体为权利要求1至3中任一所述的单克隆抗体或其抗原结合部分或者权利要求4所述单克隆抗体。
9.权利要求8所述偶联物在制备药物中的应用。
10.一种药物,其活性成分包括权利要求8所述偶联物。
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