KR20180123052A

KR20180123052A - 인간 간엽 줄기세포(hMSC)로부터 갭 연접을 통한 올리고의 전달을 기반으로 하는 암 치료

Info

Publication number: KR20180123052A
Application number: KR1020187027476A
Authority: KR
Inventors: 아이라 에스 코헨; 피터 알. 브링크; 마이클 알. 로젠
Original assignee: 더 트러스티스 오브 컬럼비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕; 더 리서치 파운데이션 포 더 스테이트 유니버시티 오브 뉴욕
Priority date: 2016-03-23
Filing date: 2017-03-23
Publication date: 2018-11-14
Also published as: WO2017165641A1; CN108882705A; AU2021290224A1; BR112018069090A2; SG11201807223UA; AU2017238505B2; EP3432714A1; CA3018150A1; EP3432714A4; AU2017238505A1; US20200171067A1; JP2019509297A

Abstract

생체 내에서 암을 치료하는 방법은 시험관 내에서 인간 간엽 줄기세포(hMSC) 내에 적어도 하나의 타입의 억제성 올리고뉴클레오타이드를 도입하는 단계, 및 생체 내에서 hMSC가 종양 조직의 제1 세포융합 암세포와 연접 채널을 형성하게 하는 조건 하에서, 세포융합 암세포의 종양 조직을 hMSC와 접촉시키는 단계를 포함한다. 결과적으로, 적어도 하나의 타입의 억제성 올리고뉴클레오타이드는 갭 연접 채널을 횡단함으로써 제1 세포융합 암세포 내로 전달되며, 적어도 하나의 타입의 억제성 올리고뉴클레오타이드는 제1 세포융합 암세포와 제2 세포융합 암세포 간의 갭 연접 채널을 횡단함으로써 종양 조직의 제2 세포융합 암세포 내로 전달된다.

Description

인간 간엽 줄기세포(hMSC)로부터 갭 연접을 통한 올리고의 전달을 기반으로 하는 암 치료

관련된 출원

본 출원은 35 U.S.C. §119(e)에 따라 2016년 3월 23일자로 출원된 가출원 제62/312,230호의 이익을 주장하며, 이러한 문헌의 전체 내용은 본 명세서에 전체가 기술된 것처럼 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 출원은 2010년 11월 30일자로 미국 특허 제7,842673호로서 발행된 PCT 출원 PCT/US2004/042504호로서 2004년 12월 17일자로 출원된 미국 출원 일련번호 제10/583,369호; 및 2012년 5월 29일자로 특허 제8,188,062호로서 발행된 2010년 10월 22일자로 출원된 미국 계속출원 일련번호 제12/910,346호와 관련이 있다.

EFS -웹을 통해 제출된 서열목록에 대한 참조

본 출원은 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출되고, 전자적으로 제출된 .txt 포맷의 서열목록을 포함한다. .txt 파일은 2017년 3월 23일자로 작성된 "20170323_15003087PC0_ST25.txt" 제목의 서열목록을 포함하고, 크기가 2 KB이다. 이러한 .txt 파일자로 포함된 서열목록은 본 명세서의 일부이고, 이의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.

정부 지분의 진술

본 발명은 미국국립보건원(National Institutes of Health)에 의해 부여된 GM055263호에 따른 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명의 특정 권리를 갖는다.

본 출원 전반에 걸쳐, 다양한 간행물은 각주 내에 또는 괄호 안의 텍스트에서 언급된다. 이러한 간행물 각각은 전문이 본 발명이 속하는 기술 수준을 더욱 충분히 기술하기 위해, 본 명세서에서 사용된 것과 모순되는 용어를 제외하고, 본 명세서에서 참고로 본 출원에 포함된다. 이러한 참고문헌에 대한 전체 서지 인용은 청구범위 앞의 명세서의 마지막 부분에서 확인될 수 있다.

2003년 1월 15일자로 출원된 공동 소유의 종래 출원 미국 일련번호 제10/342,506호, 및 문헌[Plotnikov et al., 2003, 및 Valiunas et al., 2002]에 기술된 바와 같이, 줄기세포는 표적 조직과 갭 연접(gap junction)을 형성하기 위해 사용되었다. 이러한 줄기세포는 유전자 산물 또는 소분자를 전달함으로써 표적 조직의 활성에 영향을 미칠 수 있다.

미국 특허 제7,842,673호 및 제8,188,062호에 기술된 바와 같이, 단일 가닥 또는 이중 가닥 중 어느 하나, 또는 둘 모두의 올리고뉴클레오타이드는 공여체 세포로의 형광-태그화된 올리고뉴클레오타이드(fluorescent-tagged oligonucleotide)의 단일 전자 전달에 의해, 그리고 갭 연접 매개 소통(gap junction mediated communication)을 통해 표적 세포로의 이의 전달을 결정함으로써 입증된 바와 같이, HeLa 세포 쌍에서 코넥신 단백질 Cx43 또는 코넥신 단백질 Cx40에 의해 형성된 갭 연접을 통해 진행될 수 있다. 이에 따라, 그러한 특허는 갭 연접을 형성하는 임의의 공여체 세포를 사용하여 표적 세포에 올리고뉴클레오타이드의 전달을 제시한다.

그러나, 안티센스 RNA, 또는 siRNA 형태의 뉴클레오타이드는 다양한 암의 종양 세포로 구성된 표적 조직에 인간 간엽 줄기세포(hMSC)에 의해 전달될 때 종양 성장을 감소시키는 데 효과적인 것으로 나타나지 않았다. 이에 대한 하나의 이유는 종양 세포와 함께 성장하는 hMSC가 종양 성장 속도를 증가시키는 맥관 구조를 증진시킨다는 관찰이다. 예를 들어, 문헌[Tian et al., 2011]에는 "우리는 종양 성장에 대한 hMSC의 증진 역할이 종양 혈관 형성의 증가와 관련이 있다는 것을 발견하였다. 우리의 제시된 연구는, hMSC가 시험관 내와 생체 내 간에 종양 세포에 대한 상반되는 효과를 가지고, 이에 따라, 새로운 치료 전략에서 hMSC의 개발이 악성 조건 하에서 신중해야 한다는 것을 시사한다"는 것이 기술되어 있다.

본 명세서에 기술되는 바와 같이, 억제성 올리고뉴클레오타이드는 놀랍게도, 생체 내에서 종양 성장을 지연시키는 데 효과적이고 이에 따라 치료를 위한 양으로 갭 연접을 통해 hMSC로부터 종양 조직으로 진행될 수 있다. hMSC는 종양 세포 내에 억제성 올리고뉴클레오타이드를 효과적으로 도입할뿐만 아니라, 억제성 올리고뉴클레오타이드가 전신으로 도입되는 것이 아니라 종양 내측의 접촉 부위에 국소적으로 도입되기 때문에, 억제성 올리고뉴클레오타이드에 대한 종양 외측의 세포의 노출을 감소시키는 역할을 한다.

제1 구현예 세트에 따르면, 생체 내에서 암을 치료하는 방법은 시험관 내에서 인간 간엽 줄기세포(hMSC) 내에 적어도 하나의 타입의 억제성 올리고뉴클레오타이드를 도입하는 단계, 및 생체 내에서 hMSC가 종양 조직의 제1 세포융합 암세포(syncytial cancer cell)와 갭 연접 채널(gap junction channel)을 형성시킬 수 있는 조건 하에서 세포융합 암세포를 포함하는 종양 조직을 hMSC와 접촉시키는 단계를 포함한다. 결과로서, 억제성 올리고뉴클레오타이드는 갭 연접 채널을 횡단함으로써 제1 세포융합 암세포 내로 전달되며, 억제성 올리고뉴클레오타이드는 제1 세포융합 암세포와 제2 세포융합 암세포 사이의 갭 연접 채널을 횡단함으로써 종양 조직의 제2 세포융합 암세포 내로 전달된다.

구현예는 특정의 억제성 올리고뉴클레오타이드에 의해 야기된 특정 종양에서 유전자 활성의 하향 조절이 hMSC의 존재 하에서 대개 관찰되는 가속화된 종양 성장을 극복하기에 충분한 유용한 치료를 제공한다.

표적 세포로의 RNA 또는 안티센스의 전달이 네이키드 플라스미드(naked plasmid)에 의해 또는 간질액(interstitial fluid)에 의해 이루어지는 종래 방법과 비교하여, 다양한 구현예에서, 전달은 갭 연접을 통해 표적 조직의 세포의 세포질 내로 직접적으로 hMSC를 통한 것이며, 형질도입 비율(transfection rate)은 훨씬 더 높을 것으로 예상된다. 또한, 표적 종양 세포에서, 하나의 종양 세포에 전달된 억제성 올리고뉴클레오타이드는 생체 내에서 종양의 성장을 지연시키는 데 충분한 속도로, 또한 갭 연접을 통해 이웃하는 종양 세포에 형질도입된다. 이에 따라, 다양한 구현예는 특정의 다양한 암에 대한 치료를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태, 특징, 및 장점은 본 발명을 수행하기 위해 고려되는 최상의 모드를 포함하는, 다수의 특정 구현예 및 실행예를 단순히 예시함으로써, 하기 상세한 설명으로부터 자명해진다. 본 발명은 또한, 다른 그리고 상이한 구현예도 가능하며, 모두 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서, 이의 여러 세부사항은 다양한 명백한 관점에서 변형될 수 있다. 이에 따라, 도면 및 설명은 본질적으로 예시적인 것으로 여겨지고, 제한적이지는 않다.

본 발명은 첨부된 도면의 도(figure)에서 일 예로서 예시된 것으로서, 제한적인 것은 아니며, 여기서, 유사한 참조 번호는 유사한 구성요소를 지칭한다:
도 1a는 일 구현예에 따른, 코넥신 43으로 이루어진 갭 연접 채널을 통해 진행하는 12량체의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 예를 도시한 도면;
도 1b는 일 구현예에 따른, 코넥신 43으로 이루어진 갭 연접 채널을 통해 진행하는 16량체의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 예를 도시한 도면;
도 1c는 일 구현예에 따른, 코넥신 43으로 이루어진 갭 연접 채널을 통해 진행하는 24량체의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 예를 도시한 도면;
도 1d는 일 구현예에 따른, 코넥신 43으로 이루어진 갭 연접 채널을 통해 진행하는 12량체(12mer)의 혼성화 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드의 예를 도시한 도면;
도 2a는 일 구현예에 따른, 데이터의 예의 요약을 예시한 그래프이며, 여기서, x-축은 올리고뉴클레오타이드의 길이이며, y-축은 소스 세포에 올리고뉴클레오타이드의 전달 후 12분에, 수용체 세포(도 1a 내지 도 1d의 예 모두에서 좌측의 세포)에서 형광 태그의 상대적 강도임;
도 2b는 일 구현예에 따른, y-축 상의 형광 태그의 상대적 강도에 대한 x-축 상의 연접 전도도(junctional conductance)의 예를 예시한 그래프;
도 3a 및 도 3b는 생체 내에서 인간 간엽 줄기세포(hMSC)로 치료될 때 종양 성장 속도의 증가의 예를 예시한 그래프;
도 4는 일 구현예에 따른, 다양한 세포 과정 경로를 간섭하는 마이크로RNA를 예시하고, 이에 따라, 종양 성장을 지연시키기 위한 잠재적인 제제(potential agent)를 나타내는 다이어그램;
도 5a 내지 도 5c는 일 구현예에 따른, 시험관 내에서 직접적으로 형질도입된 종양 성장을 지연시키기 위한 잠재적인 제제에 의한 다양한 세포융합 암의 종양 성장에 대한 상대적 효과를 예시하고, 이에 따라, hMSC를 통한 도입을 위한 후보 제제를 지시하는 플롯(plot);
도 6은 일 구현예에 따른, 시험관 내에서 직접적으로 형질도입된 종양 성장을 지연시키기 위한, miR-16을 포함하는, 잠재적인 제제에 의한 흑색종 종양 성장에 대한 상대적 효과를 예시하고, 이에 따라, hMSC를 통한 도입을 위한 후보 제제를 지시하는 플롯;
도 7a 내지 도 7c는 일 구현예에 따른, 생체 내에서 직접적으로 형질도입된 종양 성장을 지연시키기 위한, 마이크로RNA miR-16을 모방한 SiRNA를 포함하는, 잠재적인 제제에 의한 전립선 종양 성장에 대한 상대적 효과를 예시하고, hMSC를 통한 도입을 위한 후보 제제를 지시하는 플롯;
도 8a 내지 도 8d는 일 구현예에 따른, 시험관 내에서 직접적으로 형질도입된 종양 성장을 지연시키기 위한, miR-16 모방체 및 Kras^GAT SiRNA를 포함하는, 잠재적인 제제에 의한 췌장 종양 성장에 대한 상대적인 효과를 예시하고 이에 따라 hMSC를 통한 도입을 위한 후보 제제를 지시하는 이미지 및 플롯;
도 9a는 일 구현예에 따른, 시험관 내에서 직접적으로 형질도입된 종양 성장을 지연시키기 위한, miR-16 모방체을 포함하는, 잠재적인 제제에 의해 상이한 세포주의 췌장 종양 성장에 대한 상대적 효과를 예시하고, 이에 따라, hMSC를 통한 도입을 위한 후보 제제를 지시한, 이미지이며, 도 9b는 이의 플롯;
도 10a 내지 도 10f는 일 구현예에 따른, 시험관 내에서 hMSC 내로 직접적으로 형질도입된 종양 성장을 지연시키기 위한 잠재적인 제제의 로딩(loading)을 예시한 이미지 및 플롯;
도 11은 다양한 구현예에 따른, 시험관 내에서 hMSC 내로 직접적으로 형질도입된 종양 성장을 지연시키기 위한 잠재적인 제제의 로딩을 위한 다양한 방법을 예시한 한 세트의 플롯;
도 12a 및 도 12b는 일 구현예에 따른, 시험관 내에서 hMSC 내로 직접적으로 형질도입된 종양 성장을 지연시키기 위한 잠재적인 제제에 의한 로딩 후에 hMSC의 생존을 예시한 플롯;
도 13a 및 도 13b는 일 구현예에 따른, hMSC와 세포융합 암세포 간의 갭 연접의 형성을 예시한 플롯;
도 14a 및 도 14b는 일 구현예에 따른, 세포융합 암 종양의 여러 세포를 통해 억제성 올리고뉴클레오타이드를 전파시키는 데 사용하기 위한 2개의 세포융합 암세포들 사이에 갭 연접의 형성의 예를 예시한 도면;
도 14c 및 도 14d는 다양한 구현예에서 사용하기 위해, 다양한 대장암 세포주에서 갭 연접 코넥신이 발견됨을 예시하는 전기영동 겔의 이미지;
도 14e 및 도 14f는 다양한 구현예에서 사용하기 위한, 여러 구조적 또는 기능적 단백질의 생산을 간섭하는 RNA가 암세포들 간에 형질도입될 수 있음을 예시하는 전기영동 겔의 이미지;
도 15a 내지 도 15c는 일 구현예에 따른, 세포융합 암 종양의 다수 세포를 통해 siRNA의 전파를 예시하는 이미지 및 플롯;
도 16은 일 구현예에 따른, 시험관 내에서 hMSC와의 공동-배양에 의해 대장 종양 성장에 대한 상대적인 효과를 예시한 플롯;
도 17은 다양한 나머지 플롯을 비교하기 위해 종양 중량과 종양 용적 간의 직접적인 관계를 예시하는 플롯;
도 18a 및 도 18b는 일 구현예에 따른, miR-16 또는 miR-16을 모방한 siRNA가 로딩된 hMSC와 함께 시험관 내 공동 배양에 의해 전립선 종양 성장에 대한 상대적 효과를 예시하는 플롯; 및
도 19a 내지 도 19c는 일 구현예에 따른, miR-16을 모방하는 siRNA가 로딩된 hMSC로의 생체 내 치료에 의한 전립선 종양 성장에 대한 효과의 예를 예시하는 플롯.

1. 정의

하기 정의 및 설명은 하기 실시예에서 명확하게 그리고 명료하게 변형되지 않는 경우에 또는 의미의 적용이 의미없는 또는 본질적으로 의미없는 임의의 구성을 제공할 때, 임의의 미래의 구성을 조절하도록 의미를 가지고 의도된다. 이러한 용어의 구성이 의미가 없거나 본질적으로 의미가 없는 경우에, 이러한 정의는 웹스터 사전(Webster's Dictionary, 제3판) 또는 당업자에게 알려진 사전, 예를 들어, 사전(Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology (Ed. Anthony Smith, Oxford University Press, Oxford, 2004))으로부터 취해져야 한다.

본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 구현예를 기술하기 위한 것으로서, 제한하려는 것으로 의도되지는 않는다. 본 명세서에서 사용되는 단수 형태는 달리 문맥이 명확하게 지시하지 않는 한, 또한 복수 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 용어 "포함하는," "포함하다," "갖는," "갖는다," "~를 갖는(with)" 또는 이의 파생어가 상세한 설명 및/또는 청구범위 중 어느 하나에서 사용되는 정도까지, 이러한 용어는 용어 "포함하는(comprising)"과 유사한 방식으로 포괄적인 것으로 의도된다.

용어 "약" 또는 "대략"은 수치가 어떻게 측정되거나 결정되는 지에 부분적으로 의존하는 당업자에 의해 결정된 바와 같은 특정 수치에 대한 허용 가능한 오차 범위, 예를 들어, 측정 시스템의 한계 내를 의미한다. 예를 들어, "약"은 당해 분야에서 실행마다(per the practice), 1 또는 1이상 표준 편차 내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 언급된 값의 +/- 10%의 범위 또는 최소 0이 아닌 숫자에 의해 시사된 정밀도를 의미할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "DNA" 또는 "데옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid)"은 특정 핵산 염기로 구성된 분자를 의미한다. DNA는 공지된 모든 생물체 및 다수의 바이러스의 발달, 기능화 및 복제에서 사용되는 대부분의 유전적 정보(genetic instruction)를 지닐 수 있다. DNA는 핵산이며, 단백질 및 탄수화물과 함께, 핵산은 모든 공지된 삶의 형태를 위해 필수적인 3개의 주요 거대분자를 구성한다. 대부분의 DNA 분자는 이중 나선형을 형성하기 위해 서로 감겨진 2개의 생체폴리머 가닥으로 이루어진다. 2개의 DNA 가닥은 폴리뉴클레오타이드로서 알려져 있는데, 왜냐하면, 이러한 것이 핵산 염기, 또는 더욱 간단하게, 뉴클레오타이드로 지칭되는 더 단순한 단위로 구성되어 있기 때문이다. 각 뉴클레오타이드는 질소-함유 뉴클레오염기, 즉 시스테인(C), 구아닌(G), 아데닌(A), 또는 티민(T)뿐만 아니라, 데옥시리보오스로스 지칭되는 단당류 당 및 포스페이트 기로 이루어진다. 뉴클레오타이드는 하나의 뉴클레오타이드의 당과 다음의 포스페이트 간의 공유 결합에 의해 사슬에서 서로 결합되어, 교대하는 당-포스페이트 골격을 야기시킨다. 염기 쌍형성 규칙(A와 T, 및 C와 G)에 따르면, 수소 결합은 2개의 별개의 폴리뉴클레오타이드 가닥들의 질소함유 염기들을 결합시켜 이중-가닥 DNA를 제조한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "RNA" 또는 "리보핵산"은 종종 유전자의 코딩(coding), 디코딩(decoding), 조절(regulation) 및 발현에서의 다양한 생물학적 역할에 관여하는 폴리머 분자를 의미한다. DNA와 같이 RNA는 핵산이다. RNA는 리보뉴클레오타이드 염기로 지칭되는 4개 타입의 더 작은 분자, 즉, 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 및 DNA에서 발견된 티민(T) 대신에, 우라실(U)로 이루어진 선형 분자이다.

용어 "유전자"는 폴리펩타이드 사슬을 생산하는 데 관여하는 DNA의 세그먼트를 의미한다. 이는 유전자 산물의 전사/번역 및 전사/번역의 조절뿐만 아니라, 개개 코딩 세그먼트(엑손)들 사이의 개재 서열(인트론)에 관여된 코딩 영역 앞 및 뒤 영역(리더(leader) 및 트레일러(trailer))을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "안티센스(antisense)"는 코딩 서열에 대해 상보적이고 이에 따라, 코딩 서열에 결합할 수 있는 뉴클레오타이드의 서열을 의미하며, 이는 전사를 일으키는 DNA 이중 나선의 가닥의 서열 또는 메신저 RNA 분자의 서열 중 어느 하나일 수 있다. 안티센스 DNA는 이중-가닥 DNA에서 코딩 가닥에 대해 상보적인 비-코딩 가닥이다. 안티센스 가닥은 메신저 RNA(mRNA) 합성을 위한 주형으로서 역할을 한다.

용어 "핵산" 및 "핵산 분자"는 본 개시내용 전반에 걸쳐 교호적으로 사용될 수 있다. 이러한 용어들은 임의의 조성 형태의 핵산, 예를 들어, DNA(예를 들어, 상보적 DNA(cDNA), 게놈 DNA(gDNA), 등), RNA(예를 들어, 메시지 RNA(mRNA), 짧은 억제 RNA(siRNA), 리보솜 RNA(rRNA), tRNA, 마이크로RNA, 태아 또는 태반에 의해 고도로 발현된 RNA, 등), 및/또는 DNA 또는 RNA 유사체(예를 들어, 염기 유사체, 당 유사체 및/또는 비-고유 골격, 등을 함유함), RNA/DNA 하이브리드 및 폴리아미드 핵산(PNA)을 지칭하고, 이들 모두는 단일- 또는 이중-가닥 형태일 수 있고, 달리 한정되지 않는 한, 자연 발생 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 기능할 수 있는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 포함할 수 있다. 핵산은 특정 구현예에서, 플라스미드, 파지, 자율적으로 복제하는 서열(autonomously replicating sequence: ARS), 동원체, 인공 염색체, 염색체, 또는 시험관 내에서 또는 숙주 세포, 세포, 세포의 세포핵 또는 세포질에서 복제할 수 있거나 복제될 수 있는 다른 핵산일 수 있거나, 이로부터 유래될 수 있다. 달리 명시하지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한, 명백하게 명시된 서열뿐만 아니라, 내재적으로, 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 축퇴 코돈 치환), 대립 형질, 이종 상동, 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP), 및 상보적인 서열을 포함한다. 용어 핵산은 유전자에 의해 엔코딩된 유전자좌, 유전자, cDNA, 및 mRNA와 교호적으로 사용된다. 이러한 용어는 또한, 균등물로서, 뉴클레오타이드 유사체, 단일-가닥("센스(sense)" 또는 "안티센스," "플러스(plus)" 가닥 또는 "마이너스(minus)" 가닥, "순반향" 판독 프레임 또는 "역방향"판독 프레임) 및 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드로부터 합성된 RNA 또는 DNA의 유도체, 변형체 및 유사체를 포함할 수 있다.

용어 "혼성화(hybridization)"는 하나 이상의 뉴클레오타이드에서 상보적인 뉴클레오시드 또는 뉴클레오타이드 염기들 간에 왓슨-크릭, 후스틴 또는 역전된 후스틴 수소 결합일 수 있는 수소 결합을 의미한다.

용어 "합성 핵산"은 핵산이 자연 발생 핵산의 화학적 구조 또는 서열을 갖지 않는 것을 의미한다. 합성 뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA 분자와 같은 조작된 핵산을 포함한다. 그러나, 이의 구조 또는 서열이 성숙한 miRNA 서열과 같은 비-합성 또는 천연 발생 핵산과 동일하도록, 세포에 투여된 합성 핵산이 후속하여 세포에서 변형되거나 변경될 수 있다는 것이 고려된다. 예를 들어, 합성 핵산은 전구체 miRNA의 서열과는 상이한 서열을 가질 수 있지만, 그러한 서열은 내인성의 처리된 miRNA와 동일하도록 세포에서 1회 변경될 수 있다. 결과적으로, 용어 "합성 miRNA"가 세포에서 또는 생리학적 조건 하에서 천연 발생 miRNA로서 기능하는 "합성 핵산"을 지칭하는 것으로 이해될 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 짧은 DNA 또는 RNA 분자 올리고뉴클레오타이드가 서열-특이적 방식으로, 이의 개개의 상보적인 올리고뉴클레오타이드, DNA, 또는 RNA에 용이하게 결합하여 듀플렉스(duplex)를 형성하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "단리된 뉴클레오타이드"는 인간 개입을 통해 천연 상태로부터 변경되거나 제거된 뉴클레오타이드를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "mRNA" 또는 "메신저 RNA"는 번역을 통해 단백질 합성을 위한 주형을 의미하고, 유전자 정보를 DNA에서 리보솜으로 전달하는 RNA 분자의 큰 패밀리(family)이며, 여기서, 이러한 것은 유전자 발현의 단백질 산물의 아미노산 서열을 특정한다.

용어 작은 간섭 RNA(siRNA)는 때때로, 짧은 간섭 RNA 또는 사일런싱 RNA(silencing RNA)로서 알려진 것으로서, 이는 길이가 20 내지 25개의 염기쌍인 이중-가닥 RNA 분자의 부류이다. 다양한 siRNA는 여러 역할을 하지만, RNA 간섭(RNAi) 경로에서 가장 주목할 만하며, 여기서, 이는 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 특정 유전자의 발현을 간섭한다. siRNA는 mRNA를 전사 후에 분해시켜 단백질로 번역하지 않음으로써 기능한다. 특정 단백질로의 번역을 막는 siRNA는 용어 siRNA와 결합된 단백질 이름으로 나타낸다. 이에 따라, 중요한 키나아제 Akt로의 번역을 간섭하는 siRNA는 표현 "Akt siRNA"로 나타낸다. 통상적으로, 다양한 구현예에서 siRNA는 2개의 뉴클레오타이드 가닥을 포함하는 이중-가닥 핵산 분자이며, 각각의 가닥은 약 19 내지 약 28개의 뉴클레오타이드(즉, 약 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개의 뉴클레오타이드)를 갖는다.

용어 마이크로 RNA(miRNA로 약칭됨)는 RNA 사일런싱 및 유전자 발현의 전사후 조절에서 기능하는, 식물, 동물 및 일부 바이러스에서 발견되는 작은 비-코딩 RNA 분자(약 22개의 뉴클레오타이드를 함유함)이다. miRNA는, miRNA가 짧은 헤어핀을 형성하기 위해 자체적으로 뒤로 폴딩되는 RNA 전사체의 영역으로부터 유래되는 반면 siRNA가 이중-가닥 RNA의 더 긴 영역으로부터 유래되는 것을 제외하고, RNA 간섭(RNAi) 경로의 작은 간섭 RNA(siRNA)와 유사하다. 표준 명명 시스템 하에서, 이름은 실험적으로 확인된 miRNA으로 지정된다. 접두사 "miR" 뒤에 대시(dash)와 숫자가 이어지며, 후자는 종종 명명 순서를 지시한다. "MIR"은 상응하는 miRNA를 엔코딩하는 유전자를 지칭한다. 1 또는 2개의 뉴클레오타이드를 제외한 거의 동일한 서열을 갖는 상이한 miRNA는 추가 소문자로 주석을 달았다.

본 명세서에서 사용되는 용어 miRNA 모방체는 세포 내에 도입될 때, 내인성 성숙 miRNA 분자를 모방하도록 설계된, siRNA와 같은, 작은, 이중-가닥 RNA 분자를 지칭한다. 몇몇 도면에서, miR-16 모방체는 miR-16 모방체로 지정된다.

용어 "억제성 올리고뉴클레오타이드"는 예를 들어, 리보솜에서 단백질로 mRNA를 번역하는 것을 간섭함으로써 단백질의 생산 또는 발현을 감소시키거나 표적화된 단백질들 중 하나 이상을 엔코딩하는 유전자 또는 mRNA 중 어느 하나에 대해 충분히 상보적이고, 하나 이상의 표적화된 유전자 또는 mRNA에 특이적으로 결합(이와 혼성화)하여 표적 단백질의 발현 또는 생물학적 활성을 감소시키는 임의의 올리고뉴크레오타이드를 지칭한다. 억제성 올리고뉴클레오타이드는 다른 것들 중에서, 단리된 또는 합성 shRNA 또는 DNA, siRNA 또는 DNA, 안티센스 RNA 또는 DNA, 키메라 안티센스 DNA 또는 RNA, miRNA 및 miRNA 모방체를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "코넥신"은 이온 및 작은 신호전달 분자의 세포간 소통 및 전달을 가능하게 하고 어셈블링되어 갭 연접을 형성하는 막관통 단백질의 큰 패밀리를 의미한다. 코넥신은 C 및 N 세포질 말단 둘 모두, 세포질 루프(CL) 및 2개의 세포외 루프(EL-1) 및 (EL-2)를 갖는 4개 관통 투과막 단백질이다. 코넥신은 각 세포 상에 하나씩 헤미채널, 또는 콘넥손(connexon), 및 2개의 헤미채널을 형성하기 위해 6개의 그룹으로 어셈블링되고, 이후에, 2개의 세포들 사이에 갭 연접을 형성하기 위해 결합한다. 코넥신 유전자 패밀리는 다양한데, 서열화된 인간 게놈에서 21개의 구성원이 동정되었으며, 마우스에서 20개의 구성원이 동정되었다(이 중 19개는 이종상동성 쌍임). 이러한 것은 대개 26 내지 60 킬로달톤(kDa)의 중량을 가지고 380개의 아미노산의 평균 길이를 갖는다. 다양한 코넥신은 호모머 갭 연접(두 코넥신이 동일함) 및 헤테로머 갭 연접(두 개의 상이한 코넥신) 둘 모두로 결합된 것으로 관찰되었으며, 이들 각각은 공극 전도도(pore conductance), 크기 선택성, 전하 선택성, 전압 게이팅(voltage gating), 및 화학적 게이팅(chemical gating)을 포함하는 상이한 기능적 성질들을 나타낼 수 있다. 용어 코넥신은 Cx로서 약칭되고 CX를 엔코딩하는 유전자이다. 최근 문헌에서, 코넥신은 통상적으로, 다른 종에서 이종상동성 단백질의 넘버링(numbering)을 위한 인간 단백질의 중량을 이용하여, 이의 분자량에 따라 명명되며, 예를 들어, Cx26은 26 kDa의 코넥신 단백질이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "갭 연접(gap junction)"은 다양한 동물 세포-타입들 간의 특수 세포간 연결을 의미한다. 이러한 것은 2개의 세포의 세포질을 직접적으로 연결하는데, 이는 다양한 분자, 이온 및 전기적 충격이 세포들 사이의 조절된 게이트를 통해 직접적으로 진행할 수 있게 한다.

용어 세포융합(syncytial)은 활동 전위에서 전기적으로 동기화되는, 갭 연접으로 특별한 막에 의해 상호연결된 세포들로 구성된 세포융합 조직을 지칭한다. 세포융합 세포는 심장 근세포, 평활근 세포, 상피 세포, 결합조직 세포, 또는 세포융합 암세포를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "전달하는(delivering)" 또는 "전달된(delivered)"은 세포막 내측에 분자를 도입하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "공여체 세포"는 표적 세포로 지칭되는 상이한 세포로 전달되도록 분자가 로딩된 세포를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "표적 세포"는 공여체 세포 또는 공여체 세포에 의해 운반되는 함유물과 같은 특정 제제에 의해 선택적으로 영향을 받는 세포를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "인간 간엽 줄기세포"(hMSC로 약칭됨)는 인간 골아세포(뼈 세포), 인간 연골세포(연골 세포), 인간 근세포(근육 세포), 및 인간 지방세포(지방 세포)를 포함하는 다양한 세포 타입으로 분화할 수 있는 인간 다능성 간질 세포를 의미한다.

용어 "개체," "대상체," "숙주," 및 "환자"는 본 명세서에서 교호적으로 사용되고, 진단, 치료, 또는 치료법이 요망되는 임의의 포유류 대상체, 특히, 인간을 지칭한다.

용어 "치료(treatment)," "치료하는(treating)," 등은 일반적으로 요망되는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 이러한 효과는 질병 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 관점에서 예방적일 수 있고/거나 질병 및/또는 질병에 기인한 부작용에 대한 부분적 또는 완전한 치유의 관점에서 치료적일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "치료"는 포유동물에서 질병의 임의의 치료를 포함하고, (a) 질병에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 질병에 걸린 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질병이 발생하는 것을 예방하는 것; (b) 질병을 억제하는 것, 즉, 이의 발달을 막는 것; 또는 (c) 질병을 완화시키는 것, 즉, 질병의 퇴행을 야기시키는 것을 포함한다. 치료제는 질병 또는 상해의 발병 전, 동안, 또는 후에 투여될 수 있다. 치료가 환자의 요망되지 않는 임상적 증상을 안정화시키거나 감소시키는 경우에, 진행 중인 질병의 치료가 특히 고려된다. 이러한 치료는 바람직하지 않게 영향받은 조직에서 기능의 완전한 상실 이전에 수행된다. 대상 요법(subject therapy)은 바람직하게 질병의 증상 단계(symptomatic stage) 동안 투여될 것이고, 일부 경우에, 질병의 증상 단계 후에 투여될 것이다.

분자 및 세포 생화학에서의 일반적인 방법은 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed.(Sambrook et al., HaRBor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed.(Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods(Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy(Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual(I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); 및 Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology(Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998)]과 같은 이러한 표준 교과서에서 확인될 수 있다. 이러한 문헌의 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 개시내용에서 언급되는 유전자 조작을 위한 시약, 클로닝 벡터, 및 키트는 상업적 공급업체, 예를 들어, BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich, 및 ClonTech로부터 입수 가능하다.

2. 개요

본 발명자의 초기 연구에 따르면, 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 발현시키는 플라스미드를 표적 세포 내로 전달하는 방법은 공여체 세포 내에 올리고뉴클레오타이드를 도입하고, 공여체 세포가 표적 세포와 갭 연접을 형성할 수 있는 조건 하에서 표적 세포를 공여체 세포와 접촉시켜, 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 산물이 공여체 세포로부터 표적 세포 내로 전달되는 것을 포함한다.

몇몇 신규한 구현예에 따르면, 공여체 세포는 인간 간엽 줄기세포(hMSC)이며, 억제성 올리고뉴클레오타이드는 갭 연접을 통해 진행할 수 있는 억제성 올리고뉴클레오타이드이며, 표적 세포는 세포융합 암 조직의 세포이다. 세포융합 암 조직은 또한, 본 명세서에서 세포융합 암 종양으로 지칭된다. 표적 세포는 또한, 본 명세서에서 세포융합 암세포 또는 종양 세포로 지칭된다. 본 방법은 세포융합 암 종양의 성장을 지연시키는 데 효과적인 것으로 나타난다. 이는, 과거 연구에서 hMSC가 암 종양 성장을 향상시키는 것으로 나타났기 때문에, 놀라운 것이다. 이는 또한, 종래에 억제성 올리고뉴클레오타이드가 공여체 세포에 손상 없이 공여체 세포 내에 로딩될 수 있다는 것이 알려져 있지 않기 때문에 놀라운 것이며, 여기서, 이러한 손상은 공여체 세포가 억제성 올리고뉴클레오타이드의 효과적인 전달을 이루기에 충분히 오래 생존할 수 없게 할 수 있다.

다양한 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 갭 연접을 횡단할 수 있는 억제성 올리고뉴클레오타이드이다. 올리고뉴클레오타이드는 siRNA, 안티센스 RNA, miRNA 또는 miRNA 모방체를 코딩하는, DNA, 예를 들어, 플라스미드일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 갭 연접을 횡단할 수 있는 억제성 올리고뉴클레오타이드를 생성시키는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 cDNA일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 갭 연접을 횡단할 수 있는, siRNA 또는 miRNA, 또는 miRNA의 siRNA 모방체를 생성시키는 mRNA 또는 cDNA일 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 siRNA를 엔코딩하는 플라스미드이다. 올리고뉴클레오타이드는 12량체 내지 28머 또는 그 이상을 포함할 수 있다.

갭 연접 채널은 세포융합 암 조직에 존재하는 것들 중에서 코넥신 43(Cx43), 코넥신 40(Cx40), 코넥신 45(Cx45), 코넥신 32(Cx32) 및 코넥신 37(Cx37) 중 하나 이상으로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, Cx32는 siRNA를 진행시키는 데 사용되지 않는다.

다양한 구현예에서 치료되는 세포융합 종양은 자궁경부암, 대장암, 흑색종, 췌장암, 및 전립선암의 종양을 포함한다.

본 발명자의 초기 연구는 갭 연접 채널을 통해 올리고뉴클레오타이드(DNA 및/또는 RNA 단편)를 진행시키는 방법을 제공한다. 이는 코넥신43(Cx43)으로 이루어진 갭 연접 채널이 자궁경부암에 대한 HeLa 세포주에서 사용된 실험에서 입증되었다.

실험은 규정된 길이의 DNA 또는 RNA 서열과 같은 올리고 복합체가 갭 연접 채널을 통해 진행할 수 있음을 확인하였다. DNA 또는 RNA는 0.9 내지 1.0 nm의 최소 직경으로 용액 중에 알파 헬릭스를 형성한다. 12 내지 24개의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 쌍 크기 범위의 올리고뉴클레오타이드가 특히 고려된다. 다양한 실험에서, 모르폴리노(Morpholino)라 지칭되는, 더 작은 단편으로 분해될 수 없는 독특한 DNA 서열은 올리고 서열의 제조에서 특별한 GENE TOOLS, LLC^TM(Philomath, Oregon)로부터의 형광 프로브로 태그화되었다. Hek 293 부모 세포는 35㎜ 배양 접시 내에 배치된 18×18㎜ 멸균 커버슬립 상에서 성장되었다. 파종하고 대략 24시간 후에, 각 접시 상에 배양 배지는 2㎖의 새로운 완전 배지(10% FBS, 1% P/S)로 교체되었고, 여기에 24-머 모르폴리노(Gene Tools) 및 Endo-Porter(Gene Tools)가 첨가되었다. 모르폴리노 최종 농도는 1.25uM이었으며, Endo-Porter 최종 농도는 약 6uM이었다. 모르폴리노는 세척 없이 최대 전달을 위해 세포 상에 잔류하였다. 대조군 접시는 단지 Endo-Porter를 함유한 완전 배지를 수용하였다. 커버슬립은 3.7% 폼알데하이드와 함께 다양한 시점에 고정되었다. 커버슬립에 Vectashield(Vector Labs)가 장착되었고, 이미지는 63배 오일 대물렌즈를 이용한 Olympus Fluoview 1000 공초점 현미경 상에서 캡처되었다. 형광 강도 프로파일은 Olympus 라인 시리즈 분석 소프트웨어 툴을 이용함으로써 준비되었다.

제1 실험 세트는 12량체 올리고뉴클레오타이드, 16량체 올리고뉴클레오타이드, 및 24량체 올리고뉴클레오타이드로 수행되었다. 결과는, 3개의 단일 가닥 형태 모두가 Cx43으로 이루어진 갭 연접 채널을 통해 진행함을 입증하였다(도 1a, 도 1b, 및 도 1c). 또한, 2개의 12량체 컴플리먼트(compliment)는 혼성화되어 이중 가닥 형태를 생성시켰으며, 이의 통로(passage)가 측정되었다(도 1d). 이중 가닥 버젼은 이의 최소 직경의 단지 작은 증가를 갖는다. 도 2a는 X-축이 올리고뉴클레오타이드의 길이인 데이터의 요약을 도시한 것이다. 혼성화된 12량체 올리고뉴클레오타이드는 X-축 상에 순서대로 플롯팅된다. Y-축은 소스 세포로 올리고뉴클레오타이드를 전달하고 12분 후에 수용체 세포(도 1a 내지 도 1d의 모든 실시예에서 왼쪽의 세포)에서 형광 태그의 상대적 강도이다. 각 올리고뉴클레오타이드에 대하여, 개개 실험적으로 유도된 값은 각 올리고뉴클레오타이드에 대한 평균 및 표준 편차와 함께 나타낸다. 많은 실험에서, 형광 표지화된 올리고뉴클레오타이드의 연접 전도도 및 전달이 동시에 모니터링되었다. 도 2b는 Y-축 상의 형광 태그의 상대적 강도에 대한 X-축 상의 연접 전도도의 그래픽 도식이다. 비교를 위하여, Cx43 갭 연접 채널을 통한 Lucifer Yellow 통과에 대한 전도도-강도 관계가 나타난다(Valiunas et al., 2002)(2). 모든 경우에, 하나의 세포에서 다른 세포로의 전달 속도를 나타내는, 상대적 강도는 수용체 세포에서 Lucifer Yellow 형광 강도보다 5 내지 10배 낮다. 이러한 더 낮은 전달 속도는 올리고뉴클레오타이드의 로드-형 치수 및 분자량과 일치하며, 이의 최소 직경은 1.0 나노미터(nm)이며, 이는 Lucifer Yellow보다 용액 중에서 덜 이동성이다.

이러한 관찰은, 갭 연접 채널이 사일런싱 RNA(siRNA) 또는 유사한 치수의 임의의 다른 분자와 같은 분자에 대한 실현 가능한 전달 포트임을 입증한다. 본 발명자는 종래에, hMSC가 서로 및 표적 세포와 갭 연접을 만드는 것을 입증하였다. 본 발명자는 또한, 종래에 전기천공에 의해 줄기세포 내에 플라스미드를 로딩할 수 있음을 입증하였다. 본 결과는 다른 표적 세포 타입과 갭 연접을 형성하는 임의의 공여체 세포(이는 잠재적인 공여체 또는 표적 세포로서 hMSC를 포함함)이 RNA 또는 DNA를 전달하기 위해 비히클로서 사용될 수 있음을 입증한다.

하기 설명에서, 설명의 목적을 위하여, 본 발명의 완전한 이해를 제공하기 위해 여러 특정 세부사항이 기술된다. 그러나, 당업자에게 본 발명이 이러한 특정 세부사항 없이 실행될 수 있음이 명백할 것이다. 다른 경우에, 널리 공지된 구조 및 디바이스는 본 발명을 불필요하게 모호하게 하는 것을 피하기 위해 블록 다이어그램 형태로 나타낸다.

예시적인 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 종양 성장을 간섭하는, siRNA 또는 miRNA 또는 miRNA의 siRNA 모방체(편의를 위해 하기에서 "miRNA 모방체"로 지칭됨), 예를 들어, miR-16, miR-34a, miR-16 모방체, miR-34a 모방체, 코르탁틴 siRNA, 겔솔린 siRNA, Akt siRNA, α-튜불린 siRNA, GAPDH siRNA, Kras^GAT siRNA 또는 이러한 siRNA를 코딩하는 DNA 중 하나 이상이다. 이러한 억제성 올리고뉴클레오타이드는 본래 필수 세포 구조 또는 과정 또는 아폽토시스(세포 사멸)에 영향을 미치는 데 이의 공지된 성질들로 인하여 선택되었다. 이러한 것들 중에서, 특정 억제성 올리고뉴클레오타이드는 하기 실험 구현예에서 유리한 것으로 확인되었다.

예를 들어, 일부 구현예에서, miR-16은 유전자 번호: 406950 - MIR16-1 마이크로RNA 16-1이며, 이의 상응하는 miR-16 모방체는 CCAGUAUUAACUGUGCUGCUGA(hsa-mir-16-1, 서열번호: 1)이다. 다른 구현예에서, mirR-34a는 유전자 번호: 407040 - MIR34A 마이크로RNA 34a이며, 이의 상응하는 miR-34a 모방체는 UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU(hsa-mir-34a, 서열번호: 2)이다.

3. 실험 구현예

하기 실험은, 특정 억제성 올리고뉴클레오타이드가 시험관 내에서 세포융합 암 종양 성장을 지연시킬 수 있고, hMSC의 생존을 간섭하지 않으면서 시험관 내에서 hMSC 내에 로딩될 수 있고; 갭 연접을 통해 hMSC와 세포융합 암세포 사이로 통과될 수 있고; 종양 내에서 세포들 중에서 갭 연접을 통해 전파될 수 있고, hMSC 내에 로딩되고 이러한 종양에 접촉될 때, 생체 내에서 종양 성장을 효과적으로 및 치료학적으로 지연하거나 감소시킬 수 있음을 입증한다. 이러한 이유로, 다양한 구현예는 세포융합 암 종양에 대해 효과적인 치료를 제공할 것으로 예상된다.

하기에 기술된, 다양한 시험관 내 직접 형질도입 실험에서, hMSC 또는 다른 세포는 로딩된 세포를 생성하기 위해 siRNA와 직접적으로 형질도입된다. 달리 기술하지 않는 한, 이러한 실험은 당해 분야에 널리 공지된 멸균 조건 하에서 동일한 세포 배양 배지를 함유한 페트리 디시(petri dish)에서 수행되었다. 형질도입은 통상적으로 100 나노몰(nM) 용액으로서 억제성 올리고뉴클레오타이드의 용액 및 형질도입 제제(리포펙타민)로, 약 20% 내지 약 30%의 세포 밀도로, 24시간 형질도입 시간에 걸쳐 일어났다. 24시간의 기간 종료 시에, 세포는 배양 배지로 세정되며, hMSC 또는 다른 세포 집단은 하기에 기술된, 간접 형질도입 실험에 도입되거나, 시간에 따른 세포 증식을 수득하기 위해, 임의의 표지의 흡광도 또는 형광 강도를 포함하는, 임의의 세포 카운트 방법을 이용하여 시간에 따라 기록되었다.

다양한 시험관 내 형질도입 실험에서, 로딩되거나 로딩되지 않은 hMSC 또는 다른 세포는 표적 세포 집단과 함께 공동-배양되었다. 로딩될 때, hMSC는 상술된 바와 같이 직접적으로 형질도입되었다. 달리 기술하지 않는 한, 이러한 실험은 약 20% 내지 30% 컨플루언스에서 표적 세포를 갖는 페트리 디시 상에 로딩되거나 로딩되지 않은 hMSC를 플레이팅함으로써 수행되었다. 동시-플레이팅된 세포는 이후에 배양 배지로 세정되었다. 이후에, 표적 세포 집단은 임의의 표지의 흡광도 또는 형광 강도를 포함하는 임의의 세포 카운트 방법을 이용하여 시간에 따라 기록되어, 시간에 따른 표적 세포 집단을 수득하였다.

3.1 생체 내에서 hMSC로의 치료는 종양 성장을 향상시킬 수 있다

도 3a 및 도 3b는 생체 내에서 인간 간엽 줄기세포(hMSC)와 접촉될 때 종양 성장 속도의 증가 예를 예시한 그래프이다. 도 3a는 단독으로(대조군) 및 특정 억제성 올리고뉴클레오타이드가 로딩되지 않은 hMSC의 존재 하에서 성장된 마우스(생체 내)에서 종양 세포에 대한 종양 용적 성장을 예시한 그래프이다. 수평축은 일 단위의 경과 시간을 나타내는 것이며, 수직축은 정규화된 종양 용적을 나타내는 것이다. 종양은 전립선암 연구에서 사용된 인간 전립선암의 PC-3 세포주이다. 이러한 세포는 발달된 전립선암 세포의 생화학적 변화를 조사하고 치료에 대한 이의 반응을 평가하는 데 유용하다. 또한, 이러한 것은 유기체의 맥락에서 종양 환경의 생체 내 모델을 조사하기 위해 마우스에서 피하 종양을 생성시키기 위해 사용될 수 있다.

흰색 원(open circle)은 5마리의 상이한 마우스에 대해 평균화된 누드 마우스 내에 도입 후 20일 내지 50일의 다양한 시간에 대조군에 대한 PC-3 종양 용적을 나타낸 것이다. 검정색 원(solid circle)은 5마리의 상이한 마우스에 대해 평균화된 누드 마우스 내에 도입 후 20일 내지 50일의 다양한 시간에 hMSC와 함께 성장된 종양에 대한 PC-3 종양 용적을 나타낸 것이다. 이러한 실험에서, PC-3 세포에는 동일한 수의 hMSC가 주입되었다. 그래프는 48일자로 대조군 값에 대해 정규화된다. 대부분의 주입된 hMSC는 약 3 내지 4일 이상 동안 종양 부위에 머물지 않을 것이다. 결과의 표준 편차는 수직 막대(vertical bar)로 나타낸다. hMSC와 함께 성장된 종양은 대조군보다 지속적으로 더 큰 용적을 측정하였다.

실험의 종결 시에, 동물이 희생되었고, 종양이 칭량되었다. 도 3b는 단독으로(대조군) 및 특정의 억제성 올리고뉴클레오타이드가 로딩되지 않은 hMSC의 존재 하에서 성장된 종양 세포에 대한 종양 중량을 예시한 막대 그래프이다. 수평축은 군(group)을 나타낸 것이며, 수직축은 그램 단위의 중량을 나타낸 것이다. 도 3b에서 종양 중량은 종양 세포가 발현된 녹색 형광 단백질(GFP)의 이미징(imaging)에 의해 얻어진 종양 용적으로부터 추정된다. 흰색 막대(open bar)는 대조군의 평균 중량을 나타낸 것이며, 검정색 막대는 hMSC로 성장된 군의 평균 중량을 나타낸 것이며, 수직선은 표준 편차를 나타낸 것이다. 억제성 올리고뉴클레오타이드가 로딩되지 않은 hMSC에 의한 치료와 관련된 종양 성장의 현저한 증가가 존재한다.

3.2 특정 siRNA는 시험관 내에서 직접 노출에 의해 종양 성장을 지연시킬 수 있다

연구는 실험적 시험을 위한 후보 억제성 올리고뉴클레오타이드를 발견하기 위해 수행되었으며, 이후에 실험은 hMSC를 통해 생체 내에서 상응하는 종양 내로의 도입을 위해 적합한 가장 효과적인 억제성 올리고뉴클레오타이드를 발견하기 위해 시험관 내에서 수행되었다. 후보 억제성 올리고뉴클레오타이드는 세포 구조 및 주요 기능에 역할을 하는, 겔솔린, GAPDH, α-튜불린, 코르탁틴, 및 Akt에 대한 siRNA를 포함한다. 이러한 구조 단백질 또는 주요 기능이 표적 세포에서 제한된 경우에, 영향을 받는 세포가 적절하게 기능하지 못하고 더욱 천천히 성장할 것으로 예상되었다. 상기 단백질 표적이 예시된 구현예에서 동정되었지만, 다양한 다른 구현예에서, 다른 세포 단백질은 억제성 올리고뉴클레오타이드에 의해 표적화된다.

당해 분야에 공지된 바와 같이, 겔솔린은 중요한 액틴 조절인자이고, 세포 운동성에 영향을 미치고 침습성 암세포와 같은 많은 다른 분화 세포에서 나타나는 포도솜 형성(Arp3, 코르탁틴, 및 Rho GTPase와 함께)에서 역할을 한다. 겔솔린은 또한, 미토콘드리아를 안정화시킴으로써 아폽토시스(세포 사멸)를 억제한다. 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나아제(GAPDH로서 약칭됨)는 당분해의 여섯번째 단계를 촉매화하고 이에 따라 에너지 및 탄소 분자를 위해 글루코오스를 분해하는 역할을 하는 크기가 약 37 kDa인 효소이다. α-튜불린 및 β-튜불린 둘 모두는 진핵 세포골격의 주요 성분인 미세소관으로 중합한다. 미세소관은 유사분열을 포함하는, 많은 필수 세포 과정에서 기능한다. 코르탁틴은 모든 세포 타입으로 존재한다. 이는 액틴 세포골격, 특히, 세포 주변부 둘레의 액틴 피질의 중합 및 재배열을 촉진시키기 위해 외부 자극에 의해 활성화될 수 있는 세포의 세포질에 위치된 모노머 단백질이다. 단백질 키나아제 B(PKB)로도 알려진 Akt는 글루코오스 대사, 아폽토시스, 세포 증식, 전사 및 세포 이동과 같은 여러 세포 과정에서 중요한 역할을 하는 세린/트레오닌-특이적 단백질 키나아제이다.

다른 후보 억제성 올리고뉴클레오타이드는 다양한 중요한 세포 과정 경로에 영향을 미치는 것으로 알려진 마이크로RNA 중에서 선택되었다. 도 4는 일 구현예에 따른, 다양한 세포 과정 경로를 간섭하고 이에 따라 종양 성장을 지연시키기 위한 잠재적인 제제를 나타내는 마이크로RNA를 예시하는 다이어그램이다. 예를 들어, miR-16 및 miR-34a는 다양한 단백질의 번역을 간섭하는 것으로 알려져 있다. 상기 miRNA 및 이의 siRNA 모방체가 예시된 구현예에서 동정되었지만, 다양한 다른 구현예에서, 다른 miRNA 및 이의 siRNA 모방체는 억제성 올리고뉴클레오타이드로서 사용된다. 도 4에 도시된 바와 같이, miR-16은 단백질 CDK1, CDK2 및 CDC2의 번역을 간섭하며; miR-34a는 단백질 CDC2 및 CDK4의 번역을 간섭한다. 이러한 단백질은 세포 성장 및 분열 사이클에서 역할을 하며, 이에 따라, 이러한 간섭은 잠재적으로 세포 주기를 정지시킬 수 있다. 유사하게, miR-16은 단백질 FGF-2, CCND1 및 FGFR-1의 번역을 간섭하며; miR-34a는 단백질 CDK5, E2F3 및 E2F5의 번역을 간섭한다. 이러한 단백질은 세포 증식(수의 증가) 및 이동에서 역할을 하며, 이에 따라, 이러한 간섭은 이러한 증식 및 이동의 억제를 잠재적으로 야기시킬 수 있다. 또한, 도 4에 도시된 바와 같이, miR-16은 단백질 BCL2, PDC6IP, MCL1 및 WNT3A의 번역을 간섭하며; miR-34a는 단백질 CCND1, BCL2 및 SIRT1의 번역을 간섭한다. 이러한 단백질은 아폽토시스(세포 사멸) 및 노화(세포 노화)를 지연시키는 역할을 하며, 이에 따라, 이러한 간섭은 노화 또는 아폽토시스를 유도하고, 이에 의해, 종양 성장을 억제하는 것을 잠재적으로 야기시킬 수 있다.

도 5a 내지 도 5c는 일 구현예에 따른, 시험관 내에서 직접적으로 형질도입된 종양 성장을 지연시키기 위한 잠재적인 제제에 의한 다양한 세포융합 암 또는 세포의 종양 성장에 대한 상대적인 영향을 예시한 플롯으로서, 이에 따라, hMSC를 통한 도입을 위한 후보 제제를 나타내는 것이다. 도 5a는 본 명세서에서 HeK293으로도 지칭되는 정상 인간 배아 신장 293 세포의 성장에 대한 2가지 타입의 억제성 올리고뉴클레오타이드의 효과를 도시한 것이다. HeK293 세포는 조직 배양물에서 성장된 인간 배아 신장 세포로부터 본래 유래된 특정 비-암세포주이다. HEK293 세포는 매우 용이하게 성장하고 매우 용이하게 형질도입되고, 세포 생물학 연구에서 널리 사용되었다. 직접 형질도입 실험 프로토콜은 24시간 형질도입 기간과 함께 사용되었다. 수평축은 실험 개시 후 시간을 나타내는 것이다. 수직축은 1만개의 세포 단위의 세포를 나타내는 것이다. 수직선은 표지가 적용되는 n = 6 실험에 대한 표준 편차를 나타내는 것이다. 추적 표지화된 "대조군"은 정상 HeK293에 대한 성장 곡선이다. 추적 표지화된 "코르탁틴"은 코르탁틴을 간섭하는 siRNA, 즉, 코르탁틴 siRNA에 48시간 노출 후 성장된 세포를 지칭한다. 추적 표지화된 "mir-16"은 miR-16을 모방한 siRNA, 즉, miR-16 모방체에 48시간 노출 후 성장된 세포를 지칭한다. 명확하게, 코르탁틴 siRNA는 HeK293에서 세포 성장을 감소시키는 데 효과적인데, 이는 코르탁틴 siRNA가 암세포와 같은 다른 세포 타입 내에 형질도입될 때 성장을 조절하는 데 효과적일 수 있음을 나타낸다. 하기에 나타낸 바와 같이, 암세포 내로 형질도입될 때, miR-16 모방체는 도 5a에 도시된 정상 HeK 세포에 대한 것보다 더욱 효과적이다.

도 5b는 본 명세서에서 UACC62 세포로도 지칭되는, UACC-62 세포주에 의해 나타나는 인간 흑색종에 대한 성장에 대한 3가지 타입의 억제성 올리고뉴클레오타이드의 효과를 도시한 것이다. 각 추적에 대하여 n = 6 실험을 갖는 직접 형질도입 실험 프로토콜이 이용되었다. 수평축은 실험의 개시 후 시간을 나타내는 것이다. 수직축은 1만개 세포 단위의 세포 수를 나타내는 것이다. 추적 표지화된 "대조군(UACC62)"은 억제성 올리고뉴클레오타이드에 의한 로딩 없는 UACC-62 세포에 대한 성장 곡선이다. 추적 표지화된 "코르탁틴 siRNA, 겔솔린 siRNA, Akt siRNA"는 각각 코르탁틴, 겔솔린 및 Akt를 간섭하는 0시간에 출발하는 노출 후 성장된 세포를 지칭한다. 명확하게, 코르탁틴 siRNA, 겔솔린 siRNA, Akt siRN 모두는 증식 속도를 감소시키는데, 이는 모두가 흑색종 종양의 성장을 조절하는 데 효과적일 수 있음을 나타내는 것이다.

도 5c는 본 명세서에서 PC3으로도 지칭되는, PC-3 세포주에 의해 나타난 인간 전립선암에 대한 성장에 대한 3가지 타입의 억제성 올리고뉴클레오타이드의 효과를 도시한 것이다. 각 추적에 대해 n = 6 실험과 함께, 직접 형질도입 실험 프로토콜이 사용되었다. 수평축은 실험의 개시 후 시간을 나타내는 것이다. 수직축은 1만개 세포 단위의 세포 수를 나타내는 것이다. 수직선은 표지화된 타입의 6개의 상이한 실험의 표준 편차를 나타낸 것이다. 추적 표지화된 "대조군(PC3)"은 억제성 올리고뉴클레오타이드에 의한 로딩이 없는 PC-3 세포에 대한 성장 곡선이다. 추적 표지화된 "코르탁틴 siRNA, Akt siRNA 및 Mir-16 모방체"는 각각 0시간에 코르탁틴 및 Akt 및 miR-16을 모방하는 것을 간섭하는 siRNA에 노출 후에 성장된 세포를 지칭한다. 명확하게, 코르탁틴 siRNA 및 Akt siRN 둘 모두는 증식 속도를 감소시키는데, 이는 둘 모두가 전립선 종양의 성장을 조절하는 데 효과적일 수 있음을 나타내는 것이다. 또한, miR-16 모방체가 전립선암에 대해 더욱더 효과적이라는 것이 명백하며, 이는 miR-16 모방체가 흑색종을 포함하는 다른 암 타입에 대해 Akt siRNA 또는 코르탁틴 siRNA 중 어느 하나에 대해 더욱 효과적일 수 있음을 시사한다.

도 6은 시험관 내에서 직접적으로 형질도입된 종양 성장을 지연시키기 위한, miR-16을 포함하는, 잠재적인 제제에 의한 흑색종 종양 성장에 대한 상대적인 효과를 예시하는 플롯이고, 이에 따라, 일 구현예에 따른, hMSC를 통한 도입을 위한 후보 제제를 나타낸다. 각 추적에 대해 n = 6 실험과 함께, 직접 형질도입 실험 프로토콜이 사용되었다. 수평축은 실험의 개시 후 시간을 나타내는 것이다. 수직축은 세포 수에 관한, 광학 빔의 흡광도를 나타내는 것이다. 추적 표지화된 "NEG 대조군"은 억제성 올리고뉴클레오타이드에 의한 로딩 없이 UACC-62에 대한 성장 곡선을 나타낸다. 추적 표지화된 "코르탁틴, 겔솔린"은 각각 코르탁틴 및 겔솔린을 간섭하는 siRNA에 직접 노출 후 성장된 세포를 지칭한다. 추적 표지화된 "miR-16, miR-34"는 miR-16을 모방하는 siRNA 및 miR-34a를 모방하는 siRNA에 직접 노출 후 성장된 세포를 지칭한다. 각 추적의 각 포인트에서의 값은 평균을 나타내며, 각 포인트에서의 수직선은 각 표지화된 타입의 6개 실험에 대한 표준 편차를 나타낸다. 겔솔린 siRNA 및 miR-34a 모방체는 이러한 흑색종 세포주의 증식을 유용하게 감소시키는 것으로 보이지 않는다. 이는 코르탁틴 siRNA가 약 50%의 추정 속도 감소와 함께, 효과적임을 나타낸다는 도 5b의 결과를 뒷받침한다. 이는 또한, miR-16을 모방하는 siRNA가 실제로, 약 80%의 보다 양호한 추정된 속도 감소와 함께, 적어도 이러한 세포주에 대해 흑색종 증식 속도를 감소시키는 데 코르탁틴 siRNA보다 더욱 효과적임을 나타낸다.

도 7a 내지 도 7c는 시험관 내에서 직접적으로 형질도입된 종양 성장을 지연시키기 위한, miR-16 또는 이의 모방체를 포함하는, 잠재적인 제제에 의한 전립선 종양 성장에 대한 상대적인 효과를 예시한 플롯이고, 이에 따라, 일 구현예에 따른, hMSC를 통한 도입을 위한 후보 제제를 나타낸다. 직접 형질도입 실험 프로토콜이 각 추적에 대해 n = 6 실험과 함께, 사용되었다. 도 7a에서, 수평축은 실험의 개시 후 시간을 나타낸 것이다. 수직축은 세포 수와 관련된, 광학 빔의 흡광도를 나타낸 것이다. 추적 표지화된 "NEG CON"은 억제성 올리고뉴클레오타이드에 의한 로딩없이 PC-3 세포에 대한 성장 곡선을 나타낸다. 추적 표지화된 "코르탁틴, 겔솔린"은 각각 코르탁틴 및 겔솔린을 간섭하는 siRNA에 직접 노출 후 성장된 세포를 지칭한다. 추적 표지화된 "miR-16, miR-34"는 각각 miR-34를 모방하는 siRNA 및 miR-16을 모방하는 siRNA에 직접 노출 후 성장된 세포를 지칭한다. 각 추적의 각 포인트에서의 값은 평균을 지시하며, 각 포인트에서의 수직선은 각 표지화된 타입의 6회 실험에 걸친 표준 편차를 나타낸다. 모든 siRNA는 세포 증식을 감소시키는 데 약간 효과를 가지며, 겔솔린 siRNA가 가장 작은 효과를 갖는다. 코르탁틴 siRNA는 약 60%의 추정 속도 감소와 함께, 효과적인 것으로 나타나며, miR-34는 약간 덜 효과적이며, miR-16 모방체는 코르탁틴 siRNA보다 훨씬 더 효과적이다.

도 7b에서 수평축은 도 7a와 동일한 것이며; 수직축은 상대적 단위의 종양에서의 세포의 수를 나타낸 것이다. 추적 표지화된 "대조군"은 억제성 올리고뉴클레오타이드에 의한 로딩 없이 PC-3 세포에 대한 성장 곡선을 나타낸다. 추적 표지화된 "Akt siRNA"는 Akt를 간섭하는 siRNA에 직접 노출 후 성장된 세포를 지칭한다. 추적 표지화된 "SiRNA 모방체 mir-16, SiRNA 모방체 miR-34"는 각각 miR-34를 모방한 siRNA 및 miR-16을 모방하는 siRNA에 직접 노출 후 성장된 세포를 지칭한다. 각 트레이스의 각 포인트에서의 값은 평균을 나타내며, 각 포인트에서의 수직선은 각 표지화된 타입의 여러 실험에 대한 표준 편차를 나타낸다. 모든 siRNA는 세포 증식을 감소시키는 데 약간 효과를 갖는데, miR-16 모방체가 가장 효과적이다.

도 7c는 단독으로 성장된(대조군) 및 도 7b의 억제성 올리고뉴클레오타이드의 형질도입 후 PC-3 종양 세포에 대한 아폽토시스를 겪은 세포의 백분율을 예시하는 막대 그래프이다. 수평축은 Akt, miR-16 및 miR-34a를 표지화하는 군이 각각 Akt siRNA, miR-16에 대한 siRNA 모방체, 및 miR-34a에 대한 siRNA 모방체로 형질도입된 군을 나타내는 군을 나타낸다. 수직축은 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제 dUTP 닉 단부 표지화(TUNEL) 검정을 통해 결정된 바와 같이 세포의 아폽토시스 백분율을 나타낸다. TUNEL 검정은 핵산의 말단 단부를 표지화함으로써 DNA 단편화를 검출하는 방법이고, 아폽토시스성 신호전달 캐스케이드로부터 형성된 DNA 단편화를 검출하기 위한 일반적인 방법이다. miR-16 및 miR-34a에 대한 SiRNA 모방체의 직접 형질도입과 관련된 아폽토시스가 유의미하게 증가하며, miR-16에 대한 모방체가 가장 효과적이다. 샘플은 실험 종료 시에 120시간에 TUNEL 검정으로 처리하였다.

상기 모든 실험에서, miR-16의 모방체는 세포 증식을 감소시키는 데 가장 효과적임을 입증하였고, 이에 따라, 대부분의 남은 실험 및 이후 섹션에서 제시된 첫번째 생체 내 실험에 대해 사용되었다.

도 8a 내지 도 8d는 시험관 내에서 직접적으로 형질도입된 종양 성장을 지연시키기 위해, miR-16 및 Kras^GAT SiRNA를 포함하는, 잠재적인 제제에 의한 췌장 종양 성장에 대한 상대적 효과를 예시한 이미지 및 플롯이고, 이에 따라, 일 구현예에 따른, hMSC를 통한 도입을 위한 후보 제제를 나타낸다. 비-내분비 췌장암은 인간 췌장 유상피 암종에 대해 PANC-1 세포를 사용하여 모델링된다. 각 추적에 대해 n = 4 실험과 함께, 직접 형질도입 실험 프로토콜이 사용되었다. 도 8a는 4개의 이미지를 도시한다. 왼쪽 2개의 이미지는 실험 개시 후 24시간 및 96시간에 배양물 중 인간 PANC-1 세포의 세포의 현미경 사진을 도시한 것이다. 오른쪽 2개의 이미지는 miR-16을 모방하는 100 나노몰(nM) siRNA의 용액에서 직접 형질도입으로 처리된 실험 개시 후 24시간 및 96시간에 배양물 중 인간 PANC-1 세포의 세포의 현미경 사진을 도시한 것이다. 96시간에 2개의 이미지를 비교함으로써 알 수 있는 바와 같이, miR-16 모방체에 노출된 배양물에서 PANC-1 세포의 증식이 명확하게 감소된다.

이러한 결과는 시간에 따른 PANC-1 세포 집단 성장(증식)을 도시한 도 8b에서 정량화된다. 수평축은 시간 단위의 시간을 나타내는 것이며, 수직축은 24시간에 대조 집단에 의해 정규화된 집단을 나타내는 것이다. 대조 추적은 억제성 올리고뉴클레오타이드에 노출되지 않은 PANC-1 세포에 대한 집단 크기를 나타내는 것이다. miR-16 레이스(race)는 miR-16을 모방하는 siRNA의 100nM 용액에 노출된 PANC-1 세포에 대한 집단 크기를 나타낸다. 24시간 집단의 약 1.3배의 miR-16 모방체에 노출된 집단은 24시간 집단의 약 5.7배의 대조 집단으로부터 96시간에 거의 80%까지 감소된다. 이러한 동일한 감소는 훨씬 더 낮은 농도의 miR-16 모방체에 노출 시에 달성될 수 있다.

도 8c는 상이한 농도의 miR-16 모방체에 대한 96시간에 예시적인 PANC-1 세포주 집단 감소를 예시한 플롯이고, 이에 따라, miR-16에 노출에 대한 용량 반응을 플롯팅한 것이다. 로그 수평축은 나노몰(nM) 단위의 miR-16 모방체의 농도를 나타내는 것이며, 수직축은 도 8b에서와 동일한 것이다. 대조 추적은 흰색 원으로 플롯팅되며, miR-16 모방체 용액에 노출에 대한 추적은 검정색 원으로 플롯팅된다. 도 8b에서의 추적은 100nM의 miR-16 모방체 농도에 대해 플롯팅되었다. 도 8c에서 100nM에서, 동일한 결과가 나타날 수 있다. miR-16 모방체에 노출된 집단은 약 5.7의 대조 집단으로부터 거의 80% 감소된 약 1.3이었다. 이러한 차이는 100nM보다 약간 더 높은 것에서 그리고 약 20nM에서 대략 동일하다. 심지어, 단지 4nM의 농도에서도, miR-16 모방체에 노출된 세포의 집단은 약 50%의 감소를 위한, 약 5.5의 대조군 집단과 비교하여 약 2.7로 상당히 감소된다. 20nM 용액과 비교하여 더 높은 농도의 100nM 용액을 사용이 장점이 있는 것으로 보이지 않는다.

도 8d는 PANC-1 세포에 대한 다른 siRNA의 효과를 예시한 플롯이다. KRAS 및 BRAF는 세포 증식, 분화 및 아폽토시스를 조절하는 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 신호전달 경로에 관여된 종양유전자이다. KRAS 및 BRAF 종양유전자에서의 돌연변이는 흔히, 인간 세포융합 암, 예를 들어, 대장암 및 비-소세포 폐암에서 발견된다. 그러나, 비-소세포 폐암은 코넥신 발현을 감소시켰으며, 이에 따라, 이러한 것은 siRNA의 갭 연접 전달을 수반하는 제안된 치료를 위한 이상적인 후보물질은 아니다. 몇몇 암에서, 코돈 12에서의 유전자 돌연변이가 관찰되고, GAT 돌연변이로 지칭된다. 이에 따라, 이러한 돌연변이에 의해 코딩된 단백질(본 명세서에서 Kras^GAT로 지칭됨)의 번역을 간섭하는 siRNA(본 명세서에서 Kras^GAT siRNA로 지칭됨)는 이러한 암의 확산과 싸우는 데 유익한 효과를 가질 수 있다. 수평축은 시간 단위의 시간을 나타내는 것이며, 수지축은 24시간에 대조 집단에 의해 정규화된 집단을 나타내는 것이다. 대조 추적은 빈 원형을 사용하고, 억제성 올리고뉴클레오타이드에 노출되지 않은 PANC-1 세포에 대한 집단 크기를 나타낸다. Kras^GAT 추적은 검정색 원을 사용하고, Kras^GAT siRNA의 150nM 용액에 노출된 PANC-1 세포에 대한 집단 크기를 나타낸다. 대조 siRNA 추적은 대각선 해치(diagonal hatch)로 채워진 원을 사용하고, 임의의 주요 경로 또는 구조를 간섭하지 않는 siRNA의 150nM 용액에 노출된 PANC-1 세포에 대한 집단 크기를 나타낸다. 대조 siRNA는 Kras^GAT siRNA와 동일한 길이를 갖지만, 대조 siRNA는 임의의 유전자를 코딩하지 않고, 넌센스 siRNA(nonsense siRNA)로 지칭된다. 형질도입은 두 집단 모두에 대해 0시간에 개시되었다. 이러한 플롯은 넌센스 siRNA를 초과하는 Kras^GAT siRNA에 의한 중간 정도의 효과가 나타남을 보여준다.

도 9a는 이미지이고, 도 9b는 둘 모두가 시험괜 내에서 직접적으로 형질도입된 종양 성장을 지연시키기 위한, miR-16 모방체를 포함하는, 잠재적인 제제에 의한 상이한 세포주의 췌장 종양 성장에 대한 상대적 효과를 예시한 플롯이고, 이에 따라, 일 구현예에 따른, hMSC를 통한 도입을 위한 후보 제제를 나타낸다. 각 추적에 대해 n = 6 실험과 함께, 직접 형질도입 실험 프로토콜이 이용되었다. CFPAC-1로 명명된 세포주는 낭포성 섬유증을 갖는 환자로부터 인간 췌장 선암 세포주이다. 도 9a는 4개의 이미지를 도시한 것이다. 왼쪽의 2개의 이미지는 형질도입의 개시 후 24시간 및 96시간에 배양물 중에서의 인간 CFPAC-1 세포의 세포의 현미경 사진을 도시한 것이다. 오른쪽의 2개의 이미지는 miR-16을 모방하는 100nM siRNA의 용액 중에서 직접 형질도입의 개시 후에 24시간 및 96시간에 배양물 중의 인간 CFPAC-1 세포의 세포의 현미경 사진을 도시한 것이다. 96시간의 2개의 이미지를 비교함으로써 알 수 있는 바와 같이, miR-16 모방체에 노출된 배양물 중에서 CFPAC-1 세포의 증식이 명확하게 감소된다.

도 8a 및 도 8b와 유사하게, 도 9a의 결과는 시간에 대한 CFPAC-1 세포 집단 성장(증식)을 도시한 도 9b에서 정량화된다. 수평축은 시간 단위의 시간을 나타낸 것이며, 수직축은 24시간에 대조 집단에 의해 정규화된 집단을 나타낸 것이다. 대조 추적은 억제성 올리고뉴클레오타이드에 노출되지 않은 CFPAC-1 세포에 대한 집단 크기를 나타낸다. miR-16 추적은 miR-16을 모방하는 siRNA의 100nM 용액에 노출된 CFPAC-1 세포에 대한 집단 크기를 나타낸다. 24시간 집단의 약 1.5배의 miR-16 모방체에 노출된 집단은 24시간 집단의 약 8.3배의 대조 집단으로부터의 96시간에 80% 이상까지 감소된다.

이러한 실험에서 또한, miR-16의 siRNA 모방체는 세포 증식을 감소시키는 데 가장 효과적인 것임을 입증하였다.

3.3 hMSC 세포질에는 시험관 내에서 종양 성장을 지연시키는 siRNA가 로딩될 수 있다.

갭 연접이 공여체 세포에서 표적 세포로 억제성 올리고뉴클레오타이드와 같은 형질도입에서 효과적이게 하기 위하여, 제제는 공여체 세포의 세포질에서 풍부해야 하고, 이에 따라, 종종 갭 연접의 부근에서 풍부해야 한다. 일부 형질도입 과정 동안, 제제는 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해 주변 유체로부터 세포내로 로딩된다. 엔도사이토시스는 세포가 이러한 것을 빨아들여, 소낭을 형성함으로써 분자(예를 들어, 핵산 및 단백질)를 세포 내로 수송하는 능동 수송의 형태이다. 이는 에너지를 이용하여 과정이다. 엔도사이토시스 및 이의 대응부분, 엑소사이토시스는 모든 세포에 의해 사용되는데, 왜냐하면, 이러한 것에 중요한 대부분의 화학 물질이 수동적 수단에 의해 소수성 혈장 또는 세포막을 통과할 수 없는 큰 극성 분자이기 때문이다. 엔도사이토시스에 의해 로딩된 제제가 갭 연접을 통해 형질도입에 이용 가능하게 하기 위하여, 소낭벽은 분해되어 이러한 제제를 세포질 내로 방출해야 한다. 다음 실험은 hMSC의 세포질 내로 siRNA의 효과적인 이동을 입증한다.

도 10a 내지 도 10f는 일 구현예에 따른, 시험관 내에서 hMSC에 직접적으로 형질도입된 종양 성장을 지연시키기 위한 잠재적인 제제의 로딩을 예시한 이미지 및 플롯이다. 이러한 구현예에서, 형광체로 표지화된 siRNA는 배양물 중에서 hMSC에 로딩된다. 표지화된 siRNA는 약 500 마이크론(1 마이크론 = 1 마이크로미터, ㎛ = 10^-6 미터)의 긴 치수를 갖는다. Hek 293 부모 세포는 35㎜ 배양 접시 내에 배치된 18×18㎜ 멸균 커버슬립 상에서 성장되었다. 파종하고 대략 24시간 후에, 각각 상의 배양 배지는 24량체 모르폴리노(Gene Tools) 및 Endo-Porter(Gene Tools)가 첨가된 2㎖의 새로운 완전 배지(10% FBS, 1% P/S)로 교체되었다. 모르폴리노 최종 농도는 1.25μM이었으며, Endo-Porter 최종 농도는 약 6μM이었다. 모르폴리노는 세척 없이, 최대 전달을 위해 세포 상에 남아있었다. 대조 접시는 단지 Endo-Porter를 갖는 완전 배지를 수용하였다. 커버슬립은 다양한 시점에 3.7% 폼알데하이드로 고정되었다. 커버슬립에는 Vectashield(Vector Labs)로 장착되었고, 이미지는 63배 오일 대물렌즈를 이용하여 Olympus Fluoview 1000 공초점 현미경 상에서 캡처되었다. 형광 강도 프로파일은 Olympus 라인 시리즈 분석 소프트웨어 툴을 이용함으로써 준비되었다.

hMSC에서 자연 발생 백그라운드 형광으로부터 로딩된 siRNA에 의한 형광을 구별하기 위해, 형광은 먼저, 로딩되지 않은 대조 hMSC에 대해 측정된다. 도 10a는 대조 hMSC로부터 형광 강도의 예시적 현미경 사진을 예시한 이미지이다. 이미지의 타원 형상의 hMSC에서 다소 더 밝은 백그라운드 형광이 존재한다. 도 10a에서 대략 700 마이크론의 긴 백색 라인을 따르는 형광 강도의 프로파일은 도 10b에 플롯팅된다. 수평축은 백색 라인 세그먼트를 따르는 거리를 나타낸다. hMSC 세포 경계는 대략 100 마이크론 및 600 마이크론이며, 길이는 약 500 마이크론이다. 수직축은 임의 단위의 형광 강도를 나타내는 것이다. hMSC의 우측 경계 부근에 평균 구배보다 더 큰 형광 강도가 존재한다.

도 10c는 형광체 태그화된 siRNA로의 로딩에 대한 3시간의 노출 후에 상이한 hMSC로부터의 형광 강도의 예시적 현미경 사진을 예시한 이미지이다. 이미지의 타원 형상의 hMSC의 좌측 및 우측 에지에서 백그라운드보다 명확하게 더 밝은 형광이 존재한다. 두 에지 소낭 모두에서, 형광이 매우 밝은 가로지르는 몇 픽셀이 뚜렷하다. 도 10c에서 대략 700 마이크론 길이의 백색 라인 세그먼트를 따르는 형광 강도의 프로파일은 도 10d에 플롯팅된다. 수평축은 백색 라인 세그먼트를 따르는 거리를 나타내는 것이다. hMSC 세포 경계는 대략 100 마이크론 및 500 마이크론이며, 길이는 약 400 마이크론이다. 수직축은 임의 단위의 형광 강도를 나타내는 것이다. hMSC의 좌측 경계 및 우측 경계 부근에 형광 강도의 2개의 구별되는 피크가 존재한다. 형광은 여전히 세포 경계 부근의 소낭에 국한되고 세포질 전반에 걸쳐 밝지 않은 것으로 보인다.

스토리(story)는 48시간의 노출로 변경된다. 도 10e는 형광체 태그화된 siRNA 로딩에 대한 48시간의 노출 후에 상이한 hMSC로부터의 형광 강도의 예시적 현미경 사진을 예시한 이미지이다. 백그라운드 형광이 존재하지만, 삼각형 hMSC는 백그라운드보다 명확하게 훨씬 더 밝다. 형광이 너무 밝은 몇 픽셀을 가로지르는 소낭이 여전히 명백하다. 그러나, 형광은 세포질 전반에 걸쳐 밝다. 이러한 경우에 밝은 세포질 위에서 볼 수 있도록 검정색인, 도 10e에서 대략 800 마이크론 길이의 라인 세그먼트를 따르는 형광 강도의 프로파일은 도 10f에 플롯팅된다. 수평축은 검정색 라인 세그먼트를 따르는 거리를 나타내는 것이다. hMSC 세포 경계는 대략 200 마이크론 및 700 마이크론이며, 길이는 약 500 마이크론이다. 수직축은 임의 단위의 형광 강도를 나타내는 것이다. hMSC의 좌측 경계 및 우측 경계 부근에 형광 강도의 2개의 구별되는 피크가 존재하지만, 세포의 중간에 더 넓고 더 강력한 피크가 존재한다. 형광은 hMSC 전반에 걸쳐 밝다. 이는 갭 연접을 통한 형질도입을 위한 siRNA의 바람직한 분포이다.

도 11은 다양한 구현예에 따르면, 시험관 내에서 hMSC 및 다른 세포에 직접적으로 형질도입된 종양 성장을 지연시키기 위한 잠재적인 제제의 로딩을 위한 다양한 방법을 예시한 한 세트의 플롯이다. 2개의 형질도입 시약이 사용되었고, 형질도입 시약을 가지지 않은 대조군과 비교되었다. 형질도입을 위해 시험된 siRNA는 시아닌 3(하기에서 Cy3으로 지칭되고, 플롯 상에 Cy3 PE-A라고 명명함)을 사용하여 형광을 나타내는 미션(Mission) siRNA이다. 세포를 구별하는 것을 돕기 위하여, 이러한 것은 또한, 플루오레세인(플롯 상에서 6FAM FITC-A로 명명됨)로 염색되었다. 도 11에서 9개의 플롯 각각은 Cy3으로부터 형광 강도를 나타내는 로그 수직축, 및 플루오레세인으로부터 형광의 강도를 나타내는 로그 수평축을 갖는다. 하기에서 분명해지는 바와 같이, 이러한 축 상에 스케일을 판독할 필요는 없다. 각 플롯은 하나의 군의 세포 내측에서 Cy3 및 플루오레세인의 분포의 스캐터 플롯(scatter plot)이다.

3개의 세포 타입이 비교되었는데, hMSC는 도 11의 하부 열이며, 2개의 췌장 암 세포주, PANC-1는 중간 열이며, CFPAC-1은 상부 열이다. 좌측 칼럼은 3개의 세포 타입에 대한 대조군, 즉, 형질도입 시약이 없이 Cy3에 의해 태그화된 미션 siRNA의 100nM 용액에 잠겨진 Cy3 및 플루오레세인의 분포를 나타낸다. 대부분의 세포는 각 플롯에서 표시된 왼쪽 아래 사분면 Q3을 규정하는 Cy3 및 플루오레세인에 대해 낮은 값을 갖는다. 왼쪽 아래 사분면은 대조 경우를 위한 왼쪽 칼럼에서 3개의 플롯을 비교하여 분명한 바와 같이 각 세포 타입에 대해 상이하다.

중간 칼럼은, 리포펙타민 RNAiMAX 형질도입 시약이 사용될 때 Cy3에 의해 태그화된 미션 siRNA의 100nM 용액에 세포를 잠기는 효과를 예시한 것이다. 플루오레세인 강도는 낮게 유지되지만, 세포 내측의 Cy3 강도는 사분면 Q3에서 사분면 Q1으로 뛰어 오른다. 이는 하부 열에서 hMSC를 포함하는 모두 3가지 세포 타입으로 미션 siRNA의 효과적인 형질도입을 나타낸다. 오른쪽 칼럼 상에서 3가지 세포 타입 모두에 대해 예시된 바와 같이, X-tremeGene siRNA 형질도입 시약(Roche Molecular Systems Inc.로부터 입수 가능, 뉴욕주의 브랜치버그에 소재)이 사용될 때 유사한 결과가 나타난다.

도 11은 siRNA가 생체 내에서 공여체 세포로서 사용하기 위해 시험관 내에서 hMSC에 용이하게 로딩됨을 나타낸다. 24개 웰 플레이트의 단일 웰로부터의 평균 세포 수율은 1.9×10⁵개의 siRNA로 로딩된 hMSC 세포이다. 간섭성 siRNA가 로딩된 10⁵ hMSC 세포를 도입하는 것은 세포융합 암세포의 종양과 생체 내에서 접촉되었을 때 치료 효과가 있을 것으로 예상된다.

다른 구현예에서, 다른 메커니즘은 비제한적으로, 칼슘 포스페이트, 또는 전기영동, 또는 세포 압착을 이용하여, 또는 단독으로 또는 일부 조합으로, 세포막과 융합하고 내측에 이의 카고(cargo)를 증착시키는, 리포좀을 형성시키기 위해 물질과 양이온성 지질을 혼합함으로써, 시험관 내에서 hMSC에 siRNA를 형질도입시키기 위해 사용된다.

3.4 종양 성장을 지연시키는 특정의 siRNA를 로딩하는 hMSC는 생존할 수 있다

도 12a 및 도 12b는 일 구현예에 따라, 시험관 내에서 hMSC에 직접적으로 형질도입된 종양 성장을 지연시키기 위한 잠재적인 제제에 의한 로딩 후에 hMSC의 생존을 예시한 플롯이다. 각 추적에 대하여 n = 4 실험과 함께, 직접 형질도입 실험 프로토콜이 사용되었다. 도 12a는 적어도 일부의 암세포의 증식을 감소시키기 위해 상기에 나타낸 억제성 올리고뉴클레오타이드가 로딩될 때, hMSC의 생존의 예를 예시한 그래프이다. 수평축은 형질도입 후 시간 단위의 시간을 나타내는 것이며, 수직축은 각 추적에 대한 세포의 수십 내지 수천의 세포 수를 나타내는 것이며, 0시간에 초기 집단은 50,000개 세포이다. 추적 표지화된 "hMSC-대조군"은 48시간까지의 집단 변화를 나타내지만, 초기 집단으로부터 약 10% 이상 벗어나지 않는다. 추적은 각각 Akt siRNA, 겔솔린 siRNA, 및 코르탁틴 siRNA가 로딩된 hMSC에 대해 나타낸 것이다. 모두는 72시간에 걸쳐 약간 변하지만, 모든 것은 이웃하는 세포와 실질적인 수의 갭 연접을 형성시키는 데 충분한 양인, hMSC의 초기 집단의 약 40% 내에서 끝난다.

도 12b는 모든 시험된 암세포의 증식을 감소시키는 데 가장 효과적인 제제인 것으로 상기에 나타낸 miR-16에 대한 siRNA 모방체가 로딩될 때 hMSC의 예시적인 생존을 예시한 그래프이다. 수평축은 로딩 후 시간 단위의 시간을 나타내는 것이며, 수직축은 임의 단위의 세포 수를 나타내는 것이다. 추적 표지화된 "대조군"은 집단이 miR-16에 대한 SiRNA 모방체가 로딩되지 않은 hMSC에 대해 96시간까지 성장함을 나타낸다. 추적은 각각 100nM, 200nM 및 300nM의 상이한 농도 수준에서의 용액 중에서 miR-16에 대한 siRNA가 로딩된 hMSC에 대한 추적이 나타나고, 이에 따라 표지화된다. 각 포인트는 4회 실험의 평균이며, 수직선으로 표시된 표준 편차는 심볼 크기의 순서이므로 용이하게 관찰할 수 없다. miR-16 모방체가 로딩된 hMSC에 대한 모든 추적은 대조 추적보다 단지 약간 낮은 성장을 나타내며, 3개의 비-대조 추적 간에는 거의 차이가 없다.

이에 따라, miR-16 모방체가 로딩된 hMSC는 표적 세포와 갭 연접을 형성하고 표적 세포에 대한 이의 miR-16 모방체 로드를 전달하기에 충분히 오래 생존해야 한다.

3.5 hMSC는 세포융합 암세포와 기능적 갭 연접을 형성하고, 이에 따라, 세포융합 암세포로 종양 성장을 지연시키는 특정 siRNA를 갭 연접을 통해 형질도입 시킬 수 있다

도 13a 및 도 13b는 일 구현예에 따른, hMSC와 세포융합 암세포 간의 갭 연접의 형성을 예시한 플롯이다. 이러한 경우에, 세포융합 암세포는 LoVo(인간 결장 선암) 세포주의 구성원이다. 도 13a는 듀얼 전체 세포 패치 클램프로 인한 데이터를 도시한 것이다. 수평축은 시간이며, 2개의 수직 스케일이 존재하는데, 하부 스케일은 인가된 전압을 나타내며, 상부 스케일은 얻어진 전류를 도시한 것이다. 0시간에, 인간된 전압이 0이며, 전류가 0이다. 전압은 즉시 -110 밀리볼트(mV, 1 mV = 10^-3 볼트)로 낮아지며, 백색 추적에 의해 제공된 전류는 600 피코암페어(pA, 1 pA = 10^-12 암페어) 이상까지 뛰어오르고, 이후에 약간 감쇠된다. 5초 후에, 전압은 +110 mV로 스위칭되며, 전압은 -600 pA 미만으로 역전되고, 이후에 점차적으로 감소한다. 10초 후에, 전압은 0으로 변환되며, 전류가 또한 그러하다. 또한, 0 내지 110 mV의 전압이 다른 추적을 형성시키기 위해 10 mV 증가로 시험되었다. hMSC에 인가된 전류는 LoVo 세포에서 검출되었다. 이러한 반응은 갭 연접이 측정된 전류를 운반하기 위해 세포들 간에 이온을 진행시키는 갭 연접이 형성되었음을 나타낸다. 도 13b는 LoVO 암세포에 가해진 전압의 함수로서 hMSC 세포에서의 접합 전류를 나타내는 전압 전류 반응 곡선을 예시한 그래프이다. 전류 수준이 점선에서 떨어지는 경우에, 커플링은 또한 의존성을 검출하기에는 너무 높다. 검정색 추적은 측정된 값이며, 점선 추적은 세포들 간의 전도도가 낮은(즉, 전도도의 전압 의존성이 관찰될 수 있음) 경우에 예상될 것이다.

3.6 세포융합 암세포는 서로 기능적 갭 연접을 형성하고, 이에 따라, 종양 성장을 지연하는 특정 siRNA를 갭 연접을 통해 형질도입 할 수 있다

도 14a 및 도 14b는 일 구현예에 따른, 세포융합 암 종양의 다수의 세포를 통해 억제성 올리고뉴클레오타이드를 전파시키는 데 사용하기 위한 2개의 세포융합 암세포 간의 갭 연접의 형성의 예를 예시한 것이다. 도 14a는 적색 형광체로 외부 막의 액틴을 강조하고, 세포의 핵에서 청색 DAPI 형광체로 DNA를 강조하고, 세포질에서 녹색 형광체로 겔솔린을 강조하기 위해, 형광으로 표지화된 2개의 UACC-62 흑색종 세포의 현미경 사진이다. 도 14b는 듀얼 전체 세포 패치 클램프로부터 얻어진 데이터를 도시한 것이다. 하나의 세포에 적용된 전류는 다른 세포에서 검출되었다.

도 14c 및 도 14d는 다양한 구현예에서 사용하기 위한, 다양한 대장암 세포주에서 코넥신이 확인된 갭 연접을 전기영동 겔의 예의 이미지이다. 2가지 상이한 실험에서, Cx43은 대조군으로서 Hek293에서 그리고 LoVo, 인간 대장 암종 세포주 HCT116, 및 결장 선암 SW480을 포함하는 4개의 직장 세포주 중 3개에서 확인되었다. 단지 인간 대장 선암 세포주 HT29는 Cx43을 발현시키지 못한다. Cx43의 지배적인 존재는 세포주의 다른 구성원뿐만 아니라 hMSC와의 갭 연접을 형성하는 데 유용하다.

3.7 세포융합 암세포는 서로 특정 siRNA를 형질도입 한다

도 14e 및 도 14f는 일 구현예에 따라, 여러 구조적 또는 기능적 단백질의 생산을 간섭하는 RNA가 암세포들 사이에서 형질도입됨을 예시한 전기영동 겔(웨스턴 블롯)의 이미지이고, 이에 따라, 종양 성장을 지연시키기 위한 잠재적인 제제를 나타낸다. 도 14e는 겔의 5개의 칼럼을 도시한 것이다. 제1 칼럼은 55 kDa, 72 kDa, 95 kDa, 130 kDa, 및 170 kDa을 포함하는 공지된 크기의 마커 분자를 포함한다. 칼럼 2 내지 칼럼 5는 UACC-62(악성 흑색종), Hela CX43 H10(자궁경부암), 대조군으로서 HeK293, 및 C6(래트 신경교종) 세포주의 세포 내로 각각 성공적으로 형질도입된 이의 항체(90 kDa의 항-겔솔린, 및 36 kDa의 항-GAPDH)에 의해 검출된 단백질의 존재를 도시한 것이다. 도 14f는 도 14e의 이미지를 갖는 크기에 의해 정렬된 겔의 3개의 칼럼을 도시한 것이다. 도 14f에서, 제3 칼럼은 40 kDa, 50 kDa, 및 60 kDa을 포함하는, 공지된 크기의 마커 분자를 포함한다. 칼럼 1 및 칼럼 2는 UACC-62 세포 내에 성공적으로 형질도입된 siRNA에 의해 하향 조절된 이의 항체(90 kDa의 항-겔솔린, 및 55 kDa의 항-α-튜불린)에 의해 검출된 단백질의 존재를 나타낸다. 넉다운된 단백질은 우측(겔솔린) 상의 웨스턴 블롯에서 더 낮은 밀도를 갖는 것으로 나타난 것이다. 겔솔린에 대한 siRNA는 형질도입되었으며, 단백질의 수준이 감소되었다. 이러한 플롯은 이러한 siRNA가 커플링된 종양 세포들 중에서 형질도입될 수 있고, 이에 따라, 다양한 구현예에서 적어도, 이러한 세포주에 의해 나타낸 종양에 대해 사용될 수 있음을 나타낸다.

3.8 시험관 내에서 세포융합 암 조직은 세포융합 암세포의 다수의 세포 폭을 통해 siRNA를 전달한다

하나의 암세포에서 다른 암세포로 siRNA의 갭 연접 형질도입의 결정은 스크레이프 로딩(scrape loading)을 이용하여 이루어진다. 스크레이프 로딩에서, 접착 세포의 단일층은 갭 연접 침투성 트레이서의 존재 하에서 단일 라인을 따라 스크레이핑되거나 스크래칭되며, 이는 스크레이프를 따라 세포에 의해 도입되고, 아마도, 막의 일부 기계적 섭동의 결과로 나타날 수 있다. 정상적인 막 투과성이 다시 확립됨에 따라, 트레이서는 세포질 내에서 포집되고, 시간에 따라, 로딩된 세포에서 코넥신 채널로 제조된 기능성 갭 연접에 의해 연결된 인접한 세포로 이동할 수 있다. 특정 기간 동안 스크레이프 라인(scrape line)으로부터 형광 염료가 확산하는 거리는 갭 연접 세포간 소통을 나타낸다.

도 15a 내지 도 15c는 일 구현예에 따른, 세포융합 암 종양의 다수의 세포를 통한 siRNA의 전파를 예시하는 이미지 및 플롯이다. 도 15a에서, HeLa 자궁경부 암세포주 세포 내에 로딩된 형광체 태그화된 siRNA의 양은 각각 24시간의 형질도입 후에, 각각 0nM, 0.05nM, 5nM 및 150nM의 용액 중 4개의 농도의 태그화된 siRNA에 대한 4개의 이미지로 도시되어 있다. 더 높은 농도에서, 더 많은 세포가 형광 태그화된 siRNA의 밝은 도트와 함께 형질도입된다.

도 15b는 상단 중앙에서 하단 우측 모서리까지 대각선으로 절단된 스크레이프 로드 사건 후 22시간에 HeLa 자궁경부암 단일층의 이미지를 도시한 것이다. 상단 이미지는 배율이 2배인 하단 이미지의 일부이다. 스크레이프 라인을 따르는 세포는 태그화된 siRNA로 밝으며, 인접한 세포는 또한, 갭 연접 전달로 인해 일부 태그화된 siRNA를 나타낸다. 이중 화살표 라인 세그먼트는 스크레이프 방향에 대해 수직 방향을 도시한 것이며, 이러한 데이터는 도 15c에 플롯팅된다.

도 15c는 스크레이프 로드 라인으로부터의 거리에 따라 형광 강도 강하를 예시한 그래프이다. 수평축은 마이크론 단위의 거리이며; 수직축은 임의 단위의 형광 강도이다. 형광 염료는 각 세포의 핵에서 농축하여, 피크를 형성한다. 이러한 표지화된 siRNA가 운반되는 세포 폭의 수는 피크를 카운팅함으로써 결정될 수 있다. 형광 강도는 약 11개의 세포 폭에 해당하는, 약 175 마이크론의 범위에서 스크레이프 라인 값의 약 5%로 떨어진다. 이에 따라, 태그화된 siRNA는 태그화된 siRNA를 나타낸 마지막 세포에 도달하기 위해 10개의 개재 세포를 통한 갭 연접에 의해 전파되었다. 확산 곡선의 피트(fit)는 초당 약 5×10^-9 제곱 센티미터의 확산 상수(DC)를 생성한다.

이는, 억제성 올리고뉴클레오타이드가 로딩된 hMSC에 의한 도입 후에 하나의 암세포에서 다른 암세포로 갭 연접을 통해 전파할 것으로 예상될 수 있고, 암세포에 의해 대개 수적으로 우세한 hMSC의 효과를 증가시킴을 나타낸다.

3.9 시험관 내에서 로딩된 hMSC와의 공동-배양물은 종양 성장을 지연시킨다

적절한 억제성 올리고뉴클레오타이드로 로딩할 때, 시험관 내에서 암세포와 함께 공동-배양된 hMSC는 종양 성장의 감소를 야기시키는 것으로 발견되었다. 이는 억제성 올리고뉴클레오타이드가 hMSC 내에 로딩되지 않은 경우에 얻어진 결과(예를 들어, 도 3a 및 도 3b)와는 완전히 상반된다. 상기 실험을 기초로 하여, 이러한 결과가 hMSC에서 인접한 암세포로, 및 그러한 인접한 암세포에서 연속적으로 더 원위의 암세포로 갭 연접을 통해 억제성 올리고뉴클레오타이드의 형질도입에 기인한 것으로 사료된다.

도 16은 일 구현예에 따르면, 시험관 내에서 hMSC와 공동-배양에 의해 대장 종양 성장에 대한 상대적인 효과를 예시한 플롯이다. 이러한 실험은 LoVo 대장 세포주를 사용하였다. 각 추적에 대해 n = 15 실험과 함께, 간접 형질도입 실험 프로토콜이 사용되었다. 수평축은 일 단위의 시간을 나타내는 것이며, 수직축은 임의 단위의 세포 집단을 나타내는 것이다. 추적은 단독으로 배양된 LoVo 세포 및 억제성 올리고뉴클레오타이드가 로딩되지 않은 hMSC와 함께 배양된 LoVo 세포에 대해 나타난 것이다. 추적은 또한 Akt siRNA가 로딩된 hMSC와 공동-배양된 LoVo 세포("LoVo+hMSC+Akt"로 표지화됨)에 대해 나타낸 것이다. 추적은 Ehks 스크램블드 siRNA(scrambled siRNA)가 로딩된 hMSC와 함께 공동-배양된 LoVo 세포에 대해 나타낸 것이다("LoVo+hMSC+스크램블드"로 표지화됨). 스크램블드 siRNA는 서열이 임의의 공지된 유전자 서열에 대해 상보적이지 않고 이에 따라 넌센스 siRNA를 나타내는 siRNA이다. 각 추적은 수직선 세그먼트에 의해 나타낸 표준 편차와 함께 15개의 배양물의 평균을 플롯한다. 3일 째에, LoVo+hMSC+Akt는 세 개의 다른 군 모두에 비해 상당히 더 양호하였다(p<0.001). LoVo+hMSC+스크램블드는 LoVo 단독 및 LoVo+hMSC에 비해 상당히 더 양호하였다(p<0.05).

도 17은 다양한 나머지 플롯들과 비교하기 위한 종양 중량과 종양 용적 간의 직접 관계식을 예시한 플롯이다. 수평축은 그램 단위의 중량을 나타내는 것이며, 수직축은 입방 센티미터(cm³) 단위의 부피를 나타내는 것이다. 데이터는 대조 종양 및 칭량된 더 작은 종양에 대한 miR-16 모방체로 형질도입된 종양 둘 모두를 기초로 한 것이다. 관계식은 약 0.1 그램 내지 약 1.6 그램의 중량에 대해 선형이며, R2는 0.81이다.

도 18a 및 도 18b는 일 구현예에 따른, 시험관 내에서 miR-16 또는 miR-16에 대해 모방한 siRNA가 로딩된 hMSC와 함께 공동-배양에 의한 전립선 종양 성장에 대한 상대적 효과를 예시한 플롯이다. 각 추적에 대해 n = 4 실험과 함께, 간접 형질도입 실험 프로토콜이 사용되었다. 도 18a는 하나의 예시적 실험 세트로부터의 데이터를 예시한 그래프이다. 수평축은 시간 단위의 시간을 나타낸 것이며, 수직축은 수만의 세포에서의 세포 수를 나타내는 것이다. 대조 추적은 억제성 올리고뉴클레오타이드가 로딩되지 않은 hMSC와 함께 PC-3 전립선 세포주를 공동-배양하는 효과를 나타낸 것이다. 다른 추적은 miR-16 모방체가 로딩된 hMSC와 함께 PC-3 전립선 세포주를 공동-배양하는 효과를 나타낸 것이다. 각 추적은 4개의 배양물의 평균을 플롯팅하며, 표준 편차는 수직선 세그먼트에 의해 표시된다. 종양 성장 속도의 약 25% 감소가 존재하며, 이는 miR-16 모방체의 직접 형질도입 정도로 상당히 급격하지는 않다. 배양 시간이 길어질수록 갭 연접의 수가 증가하고 더 많은 miR-16 모방체가 PC-3 세포로 전달됨에 따라 더 많은 감소를 나타낼 것으로 예상된다.

도 18b는 하루보다 더 길게, 96시간까지 연장한 다른 예시적 실험 세트로부터의 데이터를 예시한 그래프이다. 수평축은 시간 단위의 시간을 나타낸 것이며, 수직축은 흡광도의 단위의 종야 세포 수를 나타낸 것이다. 대조 추적은 각 타입의 세포의 고른 혼합물(1:1)에서 억제성 올리고뉴클레오타이드가 로딩되지 않은 hMSC와 함께 PC-3 전립선 세포주를 공동-배양하는 효과를 나타낸 것이다. 다른 추적은 또한 1:1 혼합물에서 miR-16 모방체가 로딩된 hMSC와 함께 PC-3 전립선 세포주를 공동-배양하는 효과를 나타낸다. hMSC는 150nM miR-16 모방체의 용액 중에 로딩되었다. 각 추적은 6개의 배양물의 평균을 플롯팅한 것이며, 표준 편차는 수직선 세그먼트로 표현된다. 종양 성장 속도의 약 30% 내지 40% 감소가 존재하며, 이는 여기에서 72시간에 그리고 도 18a에서 72시간에 얻어진 것보다 다소 더 양호하다.

3.10 생체 내에서 로딩된 hMSC로의 치료는 종양 성장을 지연시킨다

본 섹션에서, 억제성 올리고뉴클레오타이드가 로딩되지 않은 hMSC에 대한 도 3a 및 도 3b에 도시된 결과와 아주 대조적으로, 억제성 올리고뉴클레오타이드가 로딩된 hMSC가 생체 내에서 종양 성장을 감소시킴을 입증한다.

도 19a 내지 도 19c는 일 구현예에 따른, miR-16 모방체가 로딩된 hMSC로의 생체내 치료에 의한 전립선 종양 성장에 대한 효과를 예시한 플롯이다. 도 19a는 miR-16 모방체가 로딩된 hMSC를 사용하여 생체 내에서 종양 성장의 감소 예를 예시한 그래프이다. 수평축은 40일까지의, 일 단위의 시간을 나타낸 것이며, 수직축은 입방 센티미터(cm³)의 종양 용적을 나타낸 것이다. 제0일에, 전립선암 PC-3 세포주의 1백만개의 세포가 각 군이 n=4 마우스인, 2개의 누드 마우스 군에서 각 누드 마우스에 주사되었다. 제10일에, 100nM 용액 중 miR-16 모방체가 로딩된 hMSC가 군들 중 하나에서 각 누드 마우스에 대한 종양에 주사되었다. 대조 추적은 miR-16 모방체가 로딩된 hMSC를 수용하지 않은 누드 마우스의 미치료군의 평균 종양 용적을 나타낸 것이며, 표준 편차는 수직선 세그먼트로 표현된다. 치료 추적은 miR-16 모방체가 로딩된 hMSC를 수용한 누드 마우스의 치료군의 평균 종양 용적을 나타낸 것이며, 여기서 표준 편차는 수직선 세그먼트로 표현된다. 제35일에, 치료군 종양 용적은 미치료 대조군의 종양 용적 약 50%이다. 차이는 통계학적으로 유의미하고, 치료학적으로 중요하다.

도 19b는 단독으로 성장된(대조군) 그리고 동물이 도 19a에 도시된 실험으로부터 희생되었을 때 제35일에 miR-16을 모방한 siRNA가 로딩된 hMSC의 존재 하에서 성장된 종양 세포에 대한 종양 중량을 예시한 막대 그래프이다. 수평축은 군을 나타낸 것이며, 수직축은 그램 단위의 중량을 나타낸 것이다. 첫번째 막대는 대조군에서 4개의 종양의 평균 중량을 나타낸 것이며, 검정색 막대는 hMSC로 성장된 군에서 4개의 종양의 평균 중량을 나타낸 것이며, 수직선 세그먼트는 평균의 표준 오차(SEM)를 나타낸 것이다. miR-16 모방체가 로딩된 hMSC에 의한 치료와 관련된 종양 성장이 유의미하게 감소한다. 이러한 결과는 도 3b에 도시된 결과와는 상반될 것이다.

도 19c는 종양 크기(폭 및 높이)의 측면에서 생체 내에서 miR-16 모방체가 로딩된 hMSC를 사용하여 종양 성장의 감소 예를 예시한 그래프이다. 수평축은 36일까지의, 일 단위의 시간을 나타낸 것이며, 수직축은 기준선 크기의 %로 종양 크기를 나타낸 것이다. 0일자로, 전립선암 PC-3 세포주의 1백만개의 세포가 각 군에서 6마리의 마우스를 갖는, 2 누드 마우스 군에서 각 누드 마우스에 주사되었다. 14일자로, miR-16 모방체로서 역할을 하는 siRNA가 로딩된 1백만개의 hMSC가 군들 중 하나에서 각 누드 마우스에 대한 종양에 주사되었다. 대조 추적은 miR-16 모방체가 로딩된 hMSC를 수용하지 않은 누드 마우스의 치료되지 않은 군의 평균 종양 크기를 나타내며, 평균의 표준 오차(SEM)는 수직선 세그먼트에 의해 표시된다. 처리된 추적은 miR-16 모방체가 로딩된 hMSC를 수용하지 않은 누드 마우스의 치료군의 평균 종양 크기를 나타낸 것이며, 다시, SEM은 수직선 세그먼트로 표현된다. 36일자로, 처리군 종양 크기는 미처리, 대조군의 종양 크기의 약 60%이다. 차이는 통계학적으로 유의미하고, 치료학적으로 중요하다.

하나의 암세포주에 대한 실험 결과, 및 코넥신 발생에서 관찰된 평행, 갭 연접 형성, 및 다른 세포융합 암세포주에 대한 miR-모방체에 대한 반응을 기초로 하여, 종양 성장에서 유사한 유의미한 그리고 치료학적 효과가 다른 것들 중에서 miR-16 모방체, 코르탁틴 siRNA, 겔솔린 siRNA, Akt siRNA, 및 miR-34a 모방체와 같은, 억제성 올리고뉴클레오타이드가 로딩된 hMSC을 종양에 주사하거나, 달리 이러한 hMSC를 종양과 접촉시킴으로써, 본 명세서에 예시된 암(자궁경부암, 대장암, 흑색종, 췌장암, 전립선, 비-소세포 폐암, 및 래트 신경교종)을 포함하는 다른 암에 대해 얻어질 수 있는 것으로 예상된다.

4. 대안예 , 및 변형예

상기 명세서에서, 본 발명은 이의 특정 구현예를 참조로 하여 기술되었다. 그러나, 본 발명의 더 넓은 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변형예 및 변경예가 이로 이루어질 수 있다는 것이 분명할 것이다. 이에 따라, 본 명세서 및 도면은 한정적인 의미보다는 예시적인 것으로 여겨질 것이다. 본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 문맥이 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함하다" 및 이의 변형예, 예를 들어, "포함하는"은 임의의 다른 항목, 구성요소 또는 단계 또는 항목들의 그룹을 배제하지 않으면서, 기술된 항목, 구성요소 또는 단계, 또는 항목들의 그룹의 포함을 시사하는 것으로 이해될 것이다. 또한, 단수 용어는 하나 이상의 항목, 구성요소 또는 단계를 지시하는 것을 의미한다.

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참고문헌

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Claims

생체 내 암의 치료 방법으로서,
a) 시험관 내에서 복수의 인간 간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cell: hMSC) 내에 적어도 하나의 타입의 억제성 올리고뉴클레오타이드(inhibitory oligonucleotide)를 도입하는 단계; 및
b) 생체 내에서 상기 복수의 hMSC 중 하나의 hMSC가 종양 조직의 제1 세포융합 암세포(synytial cancer cell)와 갭 연접 채널(gap junction channel)을 형성하게 하는 조건 하에서 복수의 세포융합 암세포를 포함하는 종양 조직을 복수의 hMSC와 접촉시키는 단계로서, 이에 의해, 상기 적어도 하나의 타입의 억제성 올리고뉴클레오타이드가 상기 갭 연접 채널을 횡단함으로써 상기 제1 세포융합 암세포 내로 전달되며, 상기 적어도 하나의 타입의 억제성 올리고뉴클레오타이드가 상기 제1 세포융합 암세포와 제2 세포융합 암세포 사이의 갭 연접 채널을 횡단함으로써 상기 종양 조직의 제2 세포융합 암세포 내로 전달되는, 상기 접촉시키는 단계를 포함하는, 생체 내 암의 치료 방법.
제1항에 있어서, 상기 hMSC가 상기 적어도 하나의 타입의 억제성 올리고뉴클레오타이드를 상기 제1 세포융합 암세포로 전달할 수 있기 전에, 상기 적어도 하나의 타입의 억제성 올리고뉴클레오타이드가 상기 hMSC를 사멸시키지 않는, 생체 내 암의 치료 방법.
제1항에 있어서, 상기 복수의 hMSC가 약 10⁵개의 hMSC를 포함하는, 생체 내 암의 치료 방법.
제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 타입의 억제성 올리고뉴클레오타이드가 miR-16, miR-34a, miR-16을 모방한 siRNA, miR-34a를 모방한 siRNA; 코르탁틴(Cortactin)의 번역을 간섭하는 siRNA, Akt의 번역을 간섭하는 siRNA, 겔솔린(Gelsolin)의 번역을 간섭하는 siRNA, a-튜불린(a-Tubulin)의 번역을 간섭하는 siRNA, GAPDH의 번역을 간섭하는 siRNA, 및 Kras^GAT의 번역을 간섭하는 siRNA를 포함하는 군으로부터 선택되는, 생체 내 암의 치료 방법.
제1항에 있어서, 상기 종양 조직이 자궁경부암 조직, 대장암 조직, 흑색종 조직, 췌장암 조직, 전립선암 조직, 비-소세포 폐암, 및 래트 신경교종(rat Glioma)을 포함하는 군의 구성원(member)인, 생체 내 암의 치료 방법.
제1항에 있어서, 상기 종양 조직이 전립선암 조직이며, 상기 적어도 하나의 타입의 억제성 올리고뉴클레오타이드가 miR-16을 모방한 siRNA인, 생체 내 암의 치료 방법.
제1항에 있어서, 시험관 내에서 복수의 인간 간엽 줄기세포(hMSC) 내에 적어도 하나의 타입의 억제성 올리고뉴클레오타이드를 도입하는 단계가 상기 적어도 하나의 타입의 억제성 올리고뉴클레오타이드를 코딩하는 적어도 하나의 타입의 억제성 올리고뉴클레오타이드의 20 나노몰 용액 중에서 상기 복수의 hMSC를 배양하는 것을 더 포함하는, 생체 내 암의 치료 방법.
제1항에 있어서, 시험관 내에서 복수의 인간 간엽 줄기세포(hMSC) 내에 적어도 하나의 타입의 억제성 올리고뉴클레오타이드를 도입하는 단계가 상기 적어도 하나의 타입의 억제성 올리고뉴클레오타이드를 코딩하는 상기 적어도 하나의 타입의 억제성 올리고뉴클레오타이드 및 형질도입 시약(transfection reagent)의 용액 중에서 상기 복수의 hMSC를 배양하는 것을 더 포함하는, 생체 내 암의 치료 방법.