JP2003513623A

JP2003513623A - 細胞培養物においてウイルスベクター力価を改善するための方法および細胞死を減少するための方法

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Publication number: JP2003513623A
Application number: JP2001535520A
Authority: JP
Inventors: マニッシュシン，
Original assignee: カイロンコーポレイション
Priority date: 1999-10-29
Filing date: 2000-10-27
Publication date: 2003-04-15
Also published as: WO2001032838A2; CA2389057A1; EP1224260A2; WO2001032838A3; AU1346501A

Abstract

(57)【要約】細胞培養物において組換えウイルスベクターの産生を増加するための組成物および方法が開示される。この組成物および方法は、組換えウイルスベクター産生細胞株を基本培地中に培養する工程を含み、この基本培地は、組換えウイルスベクターが産生されるように、（ａ）１．５ｇ／Ｌより多いアミノ酸（または、ＤＭＥＭのような基本培地中に存在するよりも多い数量および量の選択されたアミノ酸）、ならびに（ｂ）０．５％と４％との間の血清を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、一般に、細胞培養においてウイルスベクターの産生を改善するため
の方法および組成物に関する。

【０００２】（発明の背景）動物細胞を用いる産物の製造は、近年、バイオテクノロジー産業の主要な構成
要素である。このような細胞は、近年、ウイルス、ワクチン、モノクローナル抗
体、タンパク質、および組換えウイルスベクターの生産のために使用されている
。産物発現の最適化およびコストの削減は、これらの産物の経済的かつ商業的実
行のために重要である。

【０００３】不運にも、長期にわたる大量の産物の発現可能性は、培養における細胞の死に
起因して制限される。培養の間の細胞死の防止は、生物薬剤の生産のために優先
順位が高いが、しかし、特に商業的製品の製造のために、この方向ではあまりほ
とんど進行していない。

【０００４】現在の商業的生産戦略の主要な制限の１つは、特に懸濁液中であまり増殖しな
い（すなわち、足場依存性である）培養にとって、アポトーシスを遅延させる能
力が制限されていることである。この問題は、用いられる細胞株が足場依存性培
養物である多数のワクチンおよびウイルスベクター適用について特に明らかであ
る。

【０００５】ほとんどの培養培地の主要成分の１つは、これが製造コストを顕著に増大させ
るが、血清である。しかし、５〜１０％の標準から血清を除去または減少するこ
とは、通常、産物形成の減少を生じる。無血清繁殖のために多数の培地が開発さ
れているが、しかし、少数の細胞型（例えば、ＣＨＯ細胞および２９３細胞）が
、無血清／血清減少条件下で確実に増殖するのみである。生物学的製品のほとん
どの商業的生産は、血清の使用をなお必要とし、そしてウイルスおよびウイルス
ベクターの生産は、より高い血清濃度の使用を慣用的に必要とする。産物収量ま
たは産物力価を犠牲にすることなく血清濃度を減少させることは、これまで完全
に取り組んでこられなかった挑戦である。

【０００６】本発明は、ベクター力価を増大させるため、および細胞死を減少させるための
組成物および方法を開示し、そして他の関連した利点をさらに提供する。

【０００７】（発明の要旨）簡単に述べれば、本発明は、細胞培養において組換えウイルスベクターの産生
を増大するための組成物および方法を提供し、この方法は、基本培地において組
換えウイルスベクター産生細胞株を培養する工程を包含し、この基本培地は、
（ａ）１．５ｇ／Ｌより多いアミノ酸（または、基本培地（例えば、ＤＭＥＭ）
に存在するより多い数量および量の選択されたアミノ酸）、および（ｂ）０．５
％と４％との間の血清をさらに含み、これにより組換えウイルスベクターが産生
される。このような方法は、細胞株によるウイルスベクターの産生（またはウイ
ルス力価）を増大するため、および／または産生の間の細胞死を減少させるため
に利用され得る。さらに、このような培養条件の効果は、細胞培養中に細胞に対
して抗アポトーシス効果を生じるために利用され得る。

【０００８】適切な基本培地の代表的な例としては、ＲＰＭＩまたはＤＭＥＭが挙げられる
。このような培地に、アミノ酸（１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１
．７、１．８、１．９、２．０、２．２５、または２．５ｇ／Ｌより多い最終濃
度）および血清（約０．５％と４％との間、好ましくは、約１または２％と３％
との間）が添加される。特定の実施形態においては、基本培地に添加されるアミ
ノ酸の数量およびタイプは、培養される細胞株の利用プロフィールに基づく。例
えば、１．５、２、２．５またはより多いｇ／Ｌのアミノ酸を細胞培養物に添加
するというよりむしろ、選択されたアミノ酸が所定の細胞株の利用プロフィール
を補充するように添加され得る。

【０００９】同様に、種々のタイプの血清が、本発明の背景において使用され得る。このよ
うな血清としては、例えば、胎児ウシ血清およびヒト血清が挙げられる。さらな
る成分もまた、この培地に添加され得る。このような成分としては、例えば、金
属（例えば、セレニウムおよび亜鉛）、および塩（例えば、塩化マグネシウム）
が挙げられる。

【００１０】本明細書中に記載の方法は、広範な種々の組換えウイルスベクター産生細胞株
（例えば、組換えレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随
伴ウイルスベクター、およびアルファウイルスベクターを産生するように構築さ
れた細胞株が含まれる）のために利用され得る。このようなベクターは、種々の
目的（例えば、タンパク質のインビボもしくはエクスビボ産生、またはワクチン
目的を包含する）のために利用され得る。特定の実施形態においては、組換えウ
イルスベクター産生細胞株は、足場依存性細胞株である。さらなる実施形態にお
いては、細胞株は、バッチ形態、または還流培養系で培養される。

【００１１】本発明に従う方法は、第一の金属塩（コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、マンガ
ン（Ｍｎ）、モリブデン（Ｍｏ）、およびセレニウム（Ｓｅ）からなる群から選
択される金属を含む）および第二の金属塩（鉄（Ｆｅ）、カルシウム（Ｃａ）、
マグネシウム（Ｍｇ）、および亜鉛（Ｚｎ）からなる群から選択される金属を含
む）をさらに含み得る。特定の実施形態においては、第一の金属塩は、ＣｏＣｌ ₂ ．６Ｈ₂Ｏ、ＣｕＣｌ₂．２Ｈ₂Ｏ、ＣｕＳＯ₄、ＭｎＣｌ₂．４Ｈ₂Ｏ、（ＮＨ₄） ₆ Ｍｏ₇Ｏ₂．４Ｈ₂Ｏ、およびＮａ₂ＳｅＯ₃からなる群から選択され得る。さらに
、またはあるいは、第二の金属塩は、ＦｅＣｌ₃、ＦｅＳＯ₄、ＣａＣｌ₂、Ｃａ
ＮＯ₃、ＭｇＣｌ₂、ＭｇＳＯ₄、ＺｎＣｌ₂、ＺｎＳＯ₄、ＦｅＮＯ₃．９Ｈ₂Ｏか
らなる群から選択され得る。

【００１２】本発明はまた、組換えウイルスベクターの産生を増大させるため、および／ま
たは細胞培養において細胞死を減少させるための組成物を提供する。例示的な組
成物は、基本培地；１．５ｇ／Ｌより多いアミノ酸；０．５％と４％との間の血
清；第一の金属塩、ここで当該第一の金属塩は、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）
、マンガン（Ｍｎ）、モリブデン（Ｍｏ）、およびセレニウム（Ｓｅ）からなる
群から選択される金属を含む；および第二の金属塩、ここで当該第二の金属塩は
、鉄（Ｆｅ）、カルシウム（Ｃａ）、マグネシウム（Ｍｇ）、および亜鉛（Ｚｎ
）からなる群から選択される金属を含む、を含む。

【００１３】基本培地が、ＢＭＥ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ−Ｆ−１２、ＩＭＤＭ、Ｍ
ｃＣｏｙ’ｓ５Ａ、Ｍｅｄｉａ１９９、Ｈａｍ’ｓＦ−１０、Ｈａｍ’ｓ
Ｆ−１２、ＭＳ−１６２、ＭＳ−１７４、およびＲＰＭＩからなる群から選択
される組成物が、さらに提供される。特定の実施形態においては、この基本培地
は、ＤＭＥＭ、ＭＳ１６２、およびＭＳ−１７４からなる群から選択される。本発明の代替の実施形態は、１．７ｇ／Ｌより多いアミノ酸、２．０ｇ／Ｌよ
り多いアミノ酸、または２．５ｇ／Ｌより多いアミノ酸を含む組成物を提供する
。特定の実施形態により、アミノ酸の１つは、Ｌ−シスチンであり得、これは、
７５ｍｇ／Ｌと３００ｍｇ／Ｌとの間の濃度、またはより好ましくは１００ｍｇ
／Ｌと２００ｍｇ／Ｌとの間の濃度で存在し得る。なおさらなる実施形態により
、当該アミノ酸の１つは、Ｌ−セリンであり、これは、７５ｍｇ／Ｌと１０００
ｍｇ／Ｌとの間の濃度、またはより好ましくは２００ｍｇ／Ｌと７００ｍｇ／Ｌ
との間の濃度で存在し得る。他の実施形態は、アミノ酸の１つが、７５ｍｇ／Ｌ
と３００ｍｇ／Ｌとの間の濃度、またはより好ましくは１００ｍｇ／Ｌと２００
ｍｇ／Ｌとの間の濃度のＬ−メチオニンであり得ることを提供する。

【００１４】本発明のなおさらなる実施形態は、１％と３％との間の血清、またはあるいは
、２％と３％との間の血清を含む組成物を提供する。特定の実施形態により、血
清は、胎児ウシ血清またはヒト血清である。

【００１５】特定の実施形態により、本発明に従う組成物は、ＣｏＣｌ₂．６Ｈ₂Ｏ、ＣｕＣ
ｌ₂．２Ｈ₂Ｏ、ＣｕＳＯ₄、ＭｎＣｌ₂．４Ｈ₂Ｏ、（ＮＨ₄）₆Ｍｏ₇Ｏ₂．４Ｈ₂Ｏ
、およびＮａ₂ＳｅＯ₃からなる群から選択される第一の金属塩を含み得る。好ま
しい実施形態により、この第一の金属塩は、０．００３ｍｇ／Ｌと１．０ｍｇ／
Ｌとの間の濃度、またはより好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌと０．１ｍｇ／Ｌとの
間の濃度で存在し得る。

【００１６】さらなる実施形態は、ＦｅＣｌ₃、ＦｅＳＯ₄、ＣａＣｌ₂、ＣａＮＯ₃、ＭｇＣ
１₂、ＭｇＳＯ₄、ＺｎＣｌ₂、ＺｎＳＯ₄、ＦｅＮＯ₃．９Ｈ₂Ｏからなる群から選
択される第二の金属塩を含み得る組成物を提供する。好ましい実施形態により、
第二の金属塩は、５０ｍｇ／Ｌと５００ｍｇ／Ｌとの間の濃度、またはより好ま
しくは、１２５ｍｇ／Ｌと１７５ｍｇ／Ｌとの間の濃度のＭｇＣｌ₂であり得る
。あるいは、第二の金属塩は、１ｍｇ／Ｌと５ｍｇ／Ｌとの間の濃度、またはよ
り好ましくは、２ｍｇ／Ｌと４ｍｇ／Ｌとの間の濃度のＺｎＣｌ₂であり得る。

【００１７】本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面
を参照することにより明らかになる。さらに、より詳細に特定の手順または組成
物（例えば、プラスミドなど）を記載する種々の文献を本明細書中に記載し、そ
れによってこれらの全体を参考として援用する。

【００１８】（発明の詳細な説明）（定義）本発明を記載する前に、本明細書において以降で用いる特定の用語の定義をま
ず記載することが本発明の理解のために有用であり得る。

【００１９】「組換えウイルスベクター」は、宿主細胞において目的の１つ以上の遺伝子ま
たは配列を送達し得る、そして好ましい実施形態においては発現し得る構築物を
いう。このような組換えウイルスベクターは、種々のウイルス（例えば、レトロ
ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、アルファウイルスなどのよう
な）から構築され得るか、またはこれに由来し得る。

【００２０】「組換えアデノ随伴ウイルスベクター」または「ｒＡＡＶベクター」は、アデ
ノ随伴ウイルスに基づく遺伝子送達ベクターをいう。ｒＡＡＶベクターは、５’
および３’アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）、および標的細胞にお
いてその発現を調節する配列に作動可能に連結された導入遺伝子または目的の遺
伝子を含むべきである。特定の実施形態においては、この導入遺伝子は、異種プ
ロモーター（例えば、ＣＭＶ）、または誘導性プロモーター（例えば、（ｔｅｔ
））に作動可能に連結され得る。さらに、ｒＡＡＶベクターは、ポリアデニル化
配列を有し得る。

【００２１】「組換えウイルスベクター産生細胞株」は、組換えウイルス粒子を産生するた
めに使用される細胞株をいう。このような細胞株の代表的な例としては、レトロ
ウイルスパッケージングまたは産生細胞株、およびアルファウイルスパッケージ
ングまたは産生細胞株が挙げられる。

【００２２】「基本培地」は、血清に補充された場合、所望の細胞株の増殖（ｇｒｏｗｔｈ
）および／または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を支持するのに十分であ
る最小培地をいう。このような培地の代表的な例としては、ＢＭＥ、ＭＥＭ、Ｄ
ＭＥＭ、ＤＭＥＭ−Ｆ−１２、ＩＭＤＭ、ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ、Ｍｅｄｉａ
１９９、Ｈａｍ’ｓＦ−１０、Ｈａｍ’ｓＦ−１２、およびＲＰＭＩが挙げ
られる。このような培地は、代表的には、糖（例えば、グルコース）、ビタミン
類（例えば、Ｂ１２など）、および１つ以上の塩もしくは緩衝液の混合物を提供
し、そして種々の商業的供給源（例えば、Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．（Ｌｏｇａ
ｎ，ＵＴ）、ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）、Ｂ
ｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、Ｇｉｂｃｏ−Ｌ
ＴＩ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、およびＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａ
ｌＣｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む）から得られ得る。上述のように、本発明は、細胞培養における組換えウイルスベクターの産生の
ための組成物および方法を提供し、これは、基本培地において組換えウイルスベ
クター産生細胞株を培養する工程を包含し、この基本培地は、（ａ）１．５ｇ／
Ｌより多いアミノ酸および（ｂ）０．５％と４％との間の血清をさらに含み、こ
れにより組換えウイルスベクターが産生される。

【００２３】このような方法は、細胞株によるウイルスベクターの産生（またはウイルス力
価）を増大させるため、および／または産生の間の細胞死を減少させるために利
用され得、そして種々の利点を生じ得る。例えば、細胞生存能および産物力価の
増大は、他の標準培地に比較して、（ａ）血清の必要性の減少に起因する組換え
ウイルス粒子の生じるコストの減少；（ｂ）純度の増大（夾雑する死細胞産物の
減少に起因する）；（ｃ）足場依存性細胞株の使用容易性；および（ｄ）細胞密
度の増大を生じ得、それによりより高い産物濃度および／またはより高い比活性
を生じる。

【００２４】本発明のさらなる理解のために、以下のことを、以下により詳細に記載する：
（Ａ）組換えウイルスベクター産生細胞株の構築（組換えウイルスベクター産生
細胞株を生成するための方法を含む）；および（Ｂ）組換えウイルスベクター産
生細胞株を培養するための方法（適切な培地を選択するための方法を含む）。

【００２５】（Ａ．組換えウイルスベクター産生細胞株）（１．レトロウイルスベクター産生細胞株の構築）本発明の１つの局面においては、目的の選択された遺伝子または配列を保有ま
たは発現するように構築されるレトロウイルスベクターが提供される。簡潔には
、本発明のレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルは、広範な種々のレトロウイルス
（例えば、Ｂ、Ｃ、およびＤ型レトロウイルス、ならびにスプマウイルスおよび
レンチウイルス（ＲＮＡＴｕｍｏｒＶｉｒｕｓｅｓ，第二版、ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８５を参照のこと）を
含む）から容易に構築され得る。このようなレトロウイルスは、寄託機関または
収集機関（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（「ＡＴＣＣ」；
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）から容易に入手され得るか、または市
販の技術を用いて公知の供給源から単離され得る。

【００２６】上記のレトロウイルスのいずれかが、本明細書中に提供される開示、および標
準的な組換え技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏ
ｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第二版、ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９；Ｋｕ
ｎｋｌｅ，ＰＮＡＳ８２：４８８，１９８５）が与えられれば、レトロウイル
ス遺伝子送達ビヒクルを組み立てるまたは構築するために容易に利用され得る。
さらに、本発明の特定の実施形態においては、レトロウイルス遺伝子送達ビヒク
ルの部分が、異なるレトロウイルスに由来し得る。例えば、本発明の１つの実施
形態においては、レトロウイルスＬＴＲは、マウス肉腫ウイルスに由来し得、ｔ
ＲＮＡ結合部位は、ラウス肉腫ウイルスに由来し得、パッケージングシグナルは
、マウス白血病ウイルスに由来し得、そして第二鎖合成起点は、トリ白血症ウイ
ルスに由来し得る。

【００２７】本発明の１つの局面においては、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージ
ングシグナル、１つ以上の異種配列、第二鎖ＤＮＡ合成起点、および３’ＬＴＲ
を含むレトロウイルスベクターが提供され、ここで、このベクター構築物は、ｇ
ａｇ／ｐｏｌまたはｅｎｖコード配列を欠く。

【００２８】他のレトロウイルスベクターは、本発明の背景において同様に利用され得る。
例えば、ＥＰ０，４１５，７３１；ＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９１／０２８
５，ＷＯ９４０３６２２；ＷＯ９３２５６９８；ＷＯ９３２５２３４；米国特許
第５，２１９，７４０号；ＷＯ９３１１２３０；ＷＯ９３１０２１８；Ｖｉｌｅ
およびＨａｒｔ、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５３：３８６０−３８６４，１９９３
；ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５３：９６２−９６７、１
９９３；Ｒａｍら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５３：８３−８８，１９９３；Ｔａ
ｋａｍｉｙａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３３：４９３−５０３，１９
９２；Ｂａｂａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７９：７２９−７３５，１９９３
（米国特許第４，７７７，１２７号、ＧＢ２，２００，６５１、ＥＰ０，３４５
，２４２およびＷ０９１／０２８０５）が挙げられる。

【００２９】上記のレトロウイルスベクターとともに使用するために適したパッケージング
細胞株は、容易に調製され得（米国出願番号第０８／２４０，０３０号（１９９
４年５月９日に出願）を参照のこと；米国出願番号第０７／８００，９２１号（
１９９１年１１月２７日に出願）もまた参照のこと）、そして組換えベクター粒
子の産生のために産生細胞株（ベクター細胞株または「ＶＣＬ」とも称する）を
作製するために利用され得る。

【００３０】２つの特に好ましいパッケージング細胞株（ＨＡ−ＩＩおよびＨＡ−ＬＢ）が
、ＨＴ−１０８０（ヒト線維肉腫）細胞株において、ＭＬＶｇａｇ／ｐｏｌお
よび両栄養性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）ｅｎｖ配列の発現に基づいて開発され
た。これらのパッケージング細胞株は、レトロウイルスゲノムの分割、長末端反
復（ＬＴＲ）配列の除去、およびそれらとサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初
期プロモーターとの置換により複製許容レトロウイルス（ＲＣＲ）の生成の可能
性を減少させるという原理を用いて開発された。ＨＡ−ＩＩおよびＨＡ−ＬＢは
、重複配列の数が異なった。ベクター産生細胞株は、適切なパッケージング細胞
株に適切な遺伝子をコードするＶＳＶ−Ｇ偽型（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）プロ
ベクターを形質導入することによって生成された。

【００３１】（２．組換えアデノ随伴ウイルスベクター）上述のように、種々のｒＡＡＶベクターが、目的の１つ以上の所望の配列の発
現を指向するために利用され得る。簡潔には、ｒＡＡＶは、順に、５’アデノ随
伴ウイルス逆方向末端反復、標的細胞においてその発現を制御する配列に作動可
能に連結された導入遺伝子または目的の遺伝子、および３’アデノ随伴ウイルス
逆方向末端反復で構成される。さらに、ｒＡＡＶベクターは、好ましくは、ポリ
アデニル化配列を有し得る。

【００３２】一般に、ｒＡＡＶベクターは、複製、パッケージング、および細胞染色体への
効率的な組み込みを可能にするために、導入遺伝子または目的の遺伝子の各末端
に１コピーのＡＡＶＩＴＲを有するべきである。ＩＴＲは、ＡＡＶＤＮＡゲ
ノムの５’末端のヌクレオチド１から１４５、およびＡＡＶＤＮＡゲノムの３
’末端のヌクレオチド４６８１から４５３６（すなわち、同じ配列）からなる。
好ましくは、ｒＡＶＶベクターはまた、ＩＴＲの末端の後に少なくとも１０ヌク
レオチド（すなわち、「Ｄ領域」の一部分）を含み得る。

【００３３】本発明の好ましい実施形態においては、導入遺伝子配列は、約２〜５ｋｂの長
さである（または、あるいは、導入遺伝子は、２つのＩＴＲの間の核酸配列の全
サイズを２ｋｂと５ｋｂとの間にするように「スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）
」または「フィラー（ｆｉｌｌｅｒ）」配列をさらに含み得る）。あるいは、導
入遺伝子は、数回の同じ異種配列（例えば、リボソーム読み通し、または代替的
に内部リボソーム侵入部位（ＩｎｔｅｒｎａｌＲｉｂｏｓｏｍｅＥｎｔｒｙ
Ｓｉｔｅ）もしくは「ＩＲＥＳ」によって分離された、ＦＧＦ−２をコードす
る２つの核酸分子）、またはいくつかの異なる異種配列（例えば、ＦＧＦ−２お
よびＦＧＦ−５、リボソーム読み通しもしくはＩＲＥＳによって分離された）で
構成され得る。

【００３４】本発明の組換えＡＡＶベクターは、例えば、血清型１〜６を含む種々のアデノ
随伴ウイルスより作製され得る。例えば、任意のＡＡＶ血清型由来のＩＴＲは、
複製、組込み、除去および転写機能に関して同様の構造および機能を有すること
が期待される。

【００３５】本発明の特定の実施形態において、導入遺伝子の発現は、別々のプロモーター
（例えば、ウイルスプロモーター）によって達成され得る。この点に関して適切
なプロモーターの代表的な例は、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、Ｓ
Ｖ４０プロモーター、またはＭｏＭＬＶプロモーターを含む。本発明の内容にお
いて同様に利用され得る他のプロモーターは、細胞特異的プロモーターまたは組
織特異的プロモーター（例えば、桿状体、網膜錐体、神経節由来のプロモーター
）あるいは誘導性プロモーターを含む。適切な誘導性プロモーターの代表的な例
は、テトラサイクリン応答性プロモーター（「Ｔｅｔ」、例えば、Ｇｏｓｓｅｎ
およびＢｕｊａｒｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：
５５４７−５５５１，１９９２；Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８：１
７６６−１７６９，１９９５：Ｂａｒｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．
２５：２７２３−２７２９，１９９７；ＢｌａｕおよびＲｏｓｓｉ，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９６：７９７−７９９，１９９９；Ｂｏ
ｈｌら、Ｂｌｏｏｄ９２：１５１２−１５１７，１９９８；ならびにＨａｂｅ
ｒｍａｎら、ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ５：１６０４−１６１１，１９９８を
参照のこと）、エクジソン系（例えば、Ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３：３３４６−３３５１，１９９６を参照のこと）、なら
びに他の調節プロモーターまたはプロモーター系（例えば、Ｒｉｖｅｒａら、Ｎ
ａｔ．Ｍｅｄ．２：１０２８−１０３２，１９９６を参照のこと）を含む。

【００３６】ｒＡＡＶベクターはまた、特定のさらなる配列（例えば、ベクターについての
所望の機能をもたらす際に援助するアデノウイルス由来）であり得る。このよう
な配列は、例えば、アデノウイルス粒子にｒＡＡＶベクターをパッケージングす
る際に援助する配列を含む。

【００３７】アデノ随伴ウイルスベクターを作製するために適切なパッケージング細胞株は
、容易に利用可能な技術を与えられる場合、容易に調製され得る（例えば、米国
特許第５，８７２，００５号を参照のこと）。

【００３８】（３．組換えアルファウイルスベクター）本発明はまた、遺伝子送達ビヒクルとして機能し得る種々のアルファウイルス
ベクターを提供する。例えば、シンドビスウイルスは、トガウイルス科のアルフ
ァウイルス属の原形メンバーである。シンドビスウイルスのセグメント化されて
いないゲノムＲＮＡ（４９ＳＲＮＡ）は、約１１７０３ヌクレオチド長であり
、５’キャップおよび３’ポリアデニル化テールを含み、そして陽性な極性を示
す。感染性エンベロープのシンドビスウイルスは、細胞質のウイルスゲノムＲＮ
Ａ上へのウイルスヌクレオカプシドタンパク質のアセンブリによって産生され、
ウイルスのコードする糖タンパク質を埋め込まれた細胞膜を通じて発芽する。ウ
イルスの細胞内への侵入は、クラスタリン被膜小胞を介するエンドサイトーシス
、ウイルス膜のエンドソームへの融合、ヌクレオカプシドの放出、およびウイル
スゲノムの脱被膜による。ウイルス複製の間、ゲノム４９ＳＲＮＡは、相補的
なネガティブ鎖の合成についての鋳型として働く。このネガティブ鎖は順々に、
ゲノムＲＮＡおよび内部で開始する２６ＳサブゲノムＲＮＡについての鋳型と
して働く。シンドビスウイルスの非構造タンパク質は、ゲノムＲＮＡから翻訳さ
れるが、構造タンパク質は、サブゲノム２６ＳＲＮＡから翻訳される。全ての
ウイルスゲノムは、ポリタンパク質として発現され、そして翻訳後修飾の蛋白質
分解的切断によって個々のタンパク質にプロセスされる。非構造コード領域内の
パッケージング配列残基、従って、ゲノム４９ＳＲＮＡのみが、ビリオン中に
パッケージされる。

【００３９】本明細書中に提供される開示を与えられる場合、種々の異なるアルファウイル
スベクター系およびパッケージング細胞株が、容易に作製され得る。このような
系の代表的な例は、米国特許第５，８４３，７２３号および同５，７８９，２４
５号、ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／０７９９４に記載されるものを含む。

【００４０】（４．他のウイルス遺伝子送達ベクター）レトロウイルスベクターおよびアルファウイルスベクターに加えて、多くの他の
ウイルスベクター系はまた、遺伝子送達ビヒクルとして利用され得る。このよう
な遺伝子送達ビヒクルの代表的な例は、例えば、ポックスウイルス（カナリアポ
ックスウイルス）またはワクシニアウイルス（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、ＰＮ
ＡＳ８６：３１７−３２１，１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６−１０３，１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ｖａ
ｃｃｉｎｅ８：１７−２１，１９９０；米国特許第４，６０３，１１２号、同
４，７６９，３３０号および同５，１０７，４８７号；ＷＯ８９／０１９７３）
；ＳＶ４０（Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ２７７：１０８−１１４、１
９７９）；インフルエンザウイルス（Ｌａｙｔｊｅｓら、Ｃｅｌｌ５９：１１
０７−１１１３、１９８９；ＭｃＭｉｃｈｅａｌら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．
３０９：１３−１７，１９８３；およびＹａｐら、Ｎａｔｕｒｅ２７３：２３
８−２３９，１９７８）；ヘルペスウイルス（Ｋｉｔ、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ
．Ｂｉｏｌ．２１５：２１９−２３６，１９８９；米国特許第５，２８８，６４
１号）；ＨＩＶウイルス（Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：５３２
−５３６，１９９１）；麻疹ウイルス（欧州特許第０４４０，２１９号）；セ
ミリキフォレストウイルス、ならびにコロナウイルス、そして他のウイルス系（
例えば、欧州特許第０，４４０，２１９号；ＷＯ９２／０６６９３；米国特許第
５，１６６，０５７号）が含まれる。さらに、ウイルスキャリアは、相同で、非
病原性で（欠損の）、複製適合性であるウイルスであり（例えば、Ｏｖｅｒｂａ
ｕｇｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：９０６−９１０、１９８８）、にもかかわ
らず細胞性免疫応答（ＣＴＬを含む）を誘導する。

【００４１】（Ｂ．組換えウイルスベクター産生細胞株を培養するための方法）細胞株によるウイルスベクター（またはウイルス力価）の産生を増加するため
に、および／または産生の間の細胞死を減少するために、ウイルスベクター産生
細胞株は、（ａ）１．５ｇ／Ｌより多いアミノ酸（または、特定の量の選択され
たアミノ酸）、および（ｂ）０．５％と４％との間の血清、とを添加される基本
培地中で培養されるかまたはインキュベートされる。

【００４２】簡単には、上記されたような基本培地は、血清を補充された最小限の培地をい
い、これは、所望の細胞株の増殖（ｇｒｏｗｔｈａｎｄ／ｏｒｐｒｏｌｉｆ
ｅｒａｔｉｏｎ）を支持するために十分である。基本培地は、代表的には糖（例
えば、グルコース）、ビタミン（例えば、Ｂ１２など）および１以上の塩もしく
は緩衝液の混合物を含む。このような培地の代表的な例としては、ＢＭＥ、ＭＥ
Ｍ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ−Ｆ−１２、ＩＭＤＭ、ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ、培地１
９９、Ｈａｍ’ｓＦ−１０、Ｈａｍ’ｓＦ−１２、およびＲＰＭＩが挙げら
れ、そして種々の商業的供給源（例えば、Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．（Ｌｏｇａ
ｎ，ＵＴ）、ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）、Ｂ
ｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、Ｇｉｂｃｏ−Ｌ
ＴＩ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、およびＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａ
ｌＣｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む）より得られ得る。

【００４３】このような基本培地に対して、選択された量の好ましいモノマー性アミノ酸が
添加される。本発明の特定の局面において、特定のアミノ酸は、他のアミノ酸よ
り高い割合で基本培地に添加され得、そしてさらに、特定のアミノ酸のみが基本
培地に特に添加され得る。どのアミノ酸が好ましいかを評価するために、所望の
ウイルスベクター産生細胞株は、そのアミノ酸利用、および、この必要性に適す
るように基本培地に添加されたある量のアミノ酸に依存して分析され得る。

【００４４】代表的な例として、産生（ｐｒｏｄｕｃｅｒ）細胞株（ＨＡ−ＬＢ／ＣＦ８ま
たはＨＡ−ＩＩ／ＣＦ−８）は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳにおいて、３７℃の
１０％ＣＯ２インキュベーター中で、Ｔフラスコ中でコンフルエントになるま
で増殖され、そして培養培地は、新鮮培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）によっ
て６日目に置換される。培地は、新鮮培地によって毎日基本的に置換され、そし
て使用後の培地は、さらなるアミノ酸分析にために−８０℃で貯蔵される。細胞
はまた、６、７、および８日目にトリプシン−ＥＤＴＡを使用してこれらのフラ
スコからトリパン青抽出を使用する細胞計数のために回収される。基準線として
、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（未使用）サンプルはまた、アミノ酸分析のために
貯蔵される。

【００４５】アミノ酸分析は、例えば、ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｎ
ｓｏｒｔｉｕｍ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）を含む種々の商業的組織に
よって実施され得る。簡単には、アミノ酸分析は、アミノ酸分析機専用のＢｅｃ
ｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｄｅｌ６３００および７
３００上で実施され得る。これは、１０ｃｍの陽イオン交換カラム、４つの連続
的リチウムベースの溶出剤、およびカラム再生のための水酸化リチウムを組み込
む。吸光度は、１３１℃でのニンヒドリン試薬によるカラム後の色素発色に続い
て４４０ｎｍおよび５７０ｎｍで測定される。データ取得および管理は、Ｂｅｃ
ｋｍａｎＳｙｓｔｅｍＧｏｌｄ８．１０クロマトグラフィーソフトウェア
を作動させるコンピューターで達成される。Ｂｅｃｋｍａｎ参照解決は、標準化
要求を実行する。（Ｓ）−２−アミノエチル−１−システイン（Ｓ２ＡＥＣ）ま
たはグルコサミン酸は、好ましい内部標準としてサンプルに添加される。

【００４６】アミノ酸分析に基づいて、使用された培地中に存在する量を未使用の培地に存
在する量から差し引き、そして再給餌の間に消費した時間で割ることにより各ア
ミノ酸の消費率が算出される。特異的消費率は、アミノ酸消費率を生存可能な細
胞数で割ることによって算出される。陽性値は、正味の消費を示し、そして陰性
値は、特定のアミノ酸の正味の蓄積を示す。意図された培地利用に基づいて、培
地中のアミノ酸濃度は、所望の細胞濃度と特定のアミノ酸消費率とをかけること
によって算出される。培養によって産生される全てのアミノ酸は、培地組成物よ
り消去され得る。

【００４７】この方法を使用して、ビタミン、緩衝液、金属塩および他の塩の代表的な基本
培地組成物と組み合わせた栄養選択法に基づくアミノ酸濃度を使用して、高密度
の培養培地を設計する。例のように、ＭＳ−１６２およびＭＳ−１７４の基本培
地ＤＭＥＭのアミノ酸プロファイル（ｍｇ／Ｌ）に対する比較は、以下に提供さ
れる。生じた培地ＭＳ−１６２およびＭＳ０１７４は、ＤＭＥＭと比較して総ア
ミノ酸含量において約２．９または３倍の増加を有し、そしてＬ−アラニンまた
はＬ−グルタミンのような特定のアミノ酸を含まなかった。

【００４８】

【化１】さらに、特定の金属塩はまた、ベクター力価産生の増強および細胞死の減少の
ために培養培地に添加され得る。このような金属塩の代表的な例としては、Ｃｏ
Ｃｌ₂・６Ｈ₂Ｏ、ＣｕＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、ＣｕＳＯ₄、ＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ、（Ｎ
Ｈ₄）₆Ｍｏ₇Ｏ₂・４Ｈ₂Ｏ、およびＮａ₂ＳｅＯ₃が挙げられる。

【００４９】

【化２】他の金属としてはまた、例えば、鉄（Ｆｅ）、カルシウム（Ｃａ）、マグネシ
ウム（ｍｇ）、および亜鉛（Ｚｎ）が挙げられる。代表的な金属塩は以下の表に
示される：

【００５０】

【化３】ＭＳ−１６２培地は、１．７×１０⁷細胞／ｍｌのＨＡ−ＩＩ／ＣＦ８ベクタ
ー産生細胞株を支持するように設計され、そしてＭＳ−１７４は、１．７×１０ ⁷ 細胞／ｍｌのＬＢ／ＣＦ８ＶＰＣＬを支持するように設計された。

【００５１】ＭＳ−１７４培地はまた、合理的な培地の発達原理に基づいて設計された。Ｈ
Ａ−ＬＢ／ＣＦ８細胞株についてのアミノ酸消費率は算出され、そして培地は、
１．７×１０⁷細胞／ｍｌのＨＡ−ＩＩ／ＣＦ８細胞株を支持するように設計さ
れた。この細胞密度は、ＤＭＥＭがその栄養素のいずれかを使い切ることなく支
持し得る細胞密度の１０倍高い。より多いアミノ酸に加えて、この培地は、低血
清での増殖を支持するための金属塩、およびレトロウイルスベクター安定性を増
強するためのＭｇＣｌ₂を含む。

【００５２】このような培地を利用して、ウイルスベクター産生細胞株は、種々の条件下で
培養され得る。例えば、ＨＡ−ＬＢ／ＣＦ８細胞は、ＣｅｌｌＣｕｂｅ中にて２
１，５００ｃｍ²〜８５，０００ｃｍ²の表面積で接種された。接種密度は、対数
期での増殖を提供するために２〜６×１０⁴細胞／ｃｍ²の間で維持された。１１
％ＦＢＳおよび２〜４ｍＭＬ−グルタミンで補充した適切な基本培地は、接
種に使用された。灌流は、代謝物質の浪費を除去するために１日目に開始され、
ウイルス産物、および新鮮な栄養素を有する補充細胞培養物は回収された。灌流
率は、７〜８日後に１日あたり５〜７容量交換まで徐々に増加された。灌流培地
は、通常４日目に低血清を有する適切な培地に交換された。溶解した酸素および
培養物のｐＨのレベルは、空気、酸素およびＣＯ₂の適切な混合物を使用するこ
とによって調節された。ＤＯは、通常５０〜８０％の空気飽和度で維持され、そ
してｐＨは、生理学的レベルで調節された。ＤＯおよびｐＨの勾配ならびにこれ
らの振幅は、ＣｅｌｌＣｕｂｅでの再循環率を増加することによって最小化され
た。サンプルは、ＫｏｄａｋＥｋｔａｃｈｅｍ機械を使用するグルコース、乳
酸、アンモニアおよび乳酸デヒドロゲナーゼの分析のために毎日回収された。サ
ンプルは、力価分析のために毎日回収された。サンプルは、レトロウイルス活性
を測定する力価分析のために毎日回収された。

【００５３】ベクター産生細胞株の力価は、種々の方法によって容易に決定され得る。例え
ば、力価アッセイは、発現の変換（ＴＯＥ）原理を利用して実施され得る。簡単
には、ＨＴ−１０８０細胞は、１日目に６ウェルプレートにプレートされ、そし
て２日目にレトロウイルスベクターで変換される。変換は、レトロウイルスベク
ターサンプルの数段階の希釈を使用して実施された。既知の量のレトロウイルス
ベクター力価を有する標準は、標準曲線を作製するために使用される。上清液体
における第８因子活性は、５日目に製造業者の供給した指導書を用いて、Ｃｈｒ
ｏｍｏｇｅｎｉｘからの第８因子アッセイキットを使用して測定された。上清中
に測定された第８因子レベルは、標準曲線を使用してレトロウイルスベクター力
価に直接相関される。

【００５４】以下の実施例は、例示の目的によって示され、そして限定の目的によって示さ
れない。

【００５５】（実施例）（実施例１：ＭＳ−１６２培地を使用することによるベクター力価の増加およ
び細胞死の減少）レトロウイルスベクターの産生を、Ｔフラスコで実施した。特に、ＨＡ−ＩＩ
またはＨＡ−ＬＢベースのベクター産生細胞株を、２〜４×１０⁴細胞／ｃｍ²で
Ｔ−７５フラスコにて１０％ＦＢＳおよび４ｍＭＬ−グルタミンを補充した
１５ｍｌのＤＭＥＭ中で接種した。４または５日目に、細胞がコンフルエントに
なった場合、培地を、種々の血清量を補充した適切な培地と置換した。培地を、
新鮮な培地によって基本的に毎日置換し、そして使用した培地をレトロウイルス
ベクター濃度について分析した。

【００５６】細胞を、６日目まで１０％ＤＭＥＭ中で増殖し、そして培地を、６日目にＭ
Ｓ−１６２＋１０％ＦＢＳと交換した。コントロールの比較について、ＤＭＥ
Ｍ＋１０％ＦＢＳをまた使用した。図１は、これらの異なる２つの条件下にお
ける７および８日目のレトロウイルスベクター力価を示す。ＭＳ−１６２＋１０
％ＦＢＳにおける力価は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地よりも３５〜６５％
高かった。細胞死をまた、上清中のＬＤＨレベルを比較することによって分析し
た。ＬＤＨは、細胞が溶解する場合に放出される酵素の１つであり、そして細胞
死に相関する生物プロセス発達環境において伝統的に使用されてきた。図２は、
ＤＭＥＭと比較して顕著に減少した、ＭＳ−１６２培地についてのＬＤＨレベル
を示す。これは、ＭＳ−１６２培地が細胞のアポトーシスを阻止し得、持続した
時間にわたる生存細胞の持続したレベルを提供し得ることを示す。

【００５７】（実施例２：減少した血清と組合わせたＭＳ−１７４培地を使用することによ
る連続灌流培養におけるベクター力価の増加）ＨＡ−ＬＢ／ＣＦ８ＶＰＣＬを使用するレトロウイルスベクターの産生を、
２１，２５０ｃｍ² ＣｅｌｌＣｕｂｅｓ（ＰｉｌｏｔＳｃａｌｅｓ）で実施
した。実行平均数を、ベクター力価について比較する。１１％血清を伴うＤＭＥ
Ｍ培地は、通常７〜８日目に安定期を生じ、続いてベクター力価が減少する（図
３）。１１％または２％の血清を補充したＤＭＥＭについてのベクター力価は、
産生期全体（４〜１３日目）についてほぼ０．５〜１．５×１０⁸ｅｑ．ｃｆｕ
／ｍｌである。２％または１１％の血清を補充したＭＳ−１７４は、１〜３×１
０⁸ｅｑ．ｃｆｕ／ｍｌの範囲のベクターレベルを生じる。ＭＳ−１７４＋１１
％は、１０日目に安定し、次いで、ＤＭＥＭ＋１１％ＦＢＳレベルと同様に下
がった。対照的に、ＭＳ−１７４＋２％ＦＢＳは、さらに最後の３日間にベク
ター産生を増加した。これは、ＭＳ−１７４＋２％ＦＢＳがＤＭＥＭ＋２％
ＦＢＳ、ＤＭＥＭ＋１１％ＦＢＳおよびＭＳ−１７４＋１１％ＦＢＳと比較
してより優れた力価能を有することを示す。

【００５８】（実施例３：減少した血清と組合わせたＭＳ−１７４培地を使用することによ
る連続灌流培養における総ベクター産生の増加）ＨＡ−ＬＢ／ＣＦ８ＶＰＣＬを使用するレトロウイルスベクターの産生を、
２１，２５０ｃｍ² ＣｅｌｌＣｕｂｅｓで実施し、そして実行平均数を、１日
あたりの総ベクター産生について比較する。この測定は、種々の培養系の収量お
よび能力の正しい指数である。図４は、種々の培養系についての１日あたりの総
ベクター産生を示す。総ベクター産生はまた、以下の表１に従う：（表１）

【００５９】

【表１】簡単には、１１％の血清を伴うＤＭＥＭ培地は、９日目に２．０×１０¹²ｅｑ
．ｃｆｕ／日のピークを示し、続いて１２日目には７×１０¹¹ｅｑ．ｃｆｕ／日
に近いレベルまで１／３に減少した。２％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭは、５〜
８×１０¹¹ｅｑ．ｃｆｕ／日の範囲の減少したレベルのベクター産生を生じた。
ＭＳ−１７４＋２％ＦＢＳまたは１１％ＦＢＳは、５〜１０日目の間の培養
の１．０〜２．０×１０¹²ｅｑ．ｃｆｕ／日の範囲のレベルに関して２〜３倍高
い総ベクター産生を生じた。これは、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳまたは１１％Ｆ
ＢＳでの培養より顕著な改善である。最後の３日間、ＭＳ−１７４＋１１％は、
ベクター産生レベルにおいて１／３に落ちたが、ＭＳ−１７４＋２％は、ベクタ
ー産生率においてさらなる増加を示した。これは、本発明者らはＤＭＥＭの結果
に基づいてＭＳ−１７４＋１１％ＦＢＳがＭＳ−１７４＋２％ＦＢＳより優
れていることを予期したので、予期せぬ結果であった。

【００６０】（実施例４：ＭＳ−１７４培地と減少した血清条件との組合わせは、アポトー
シスを減少し得る）ＨＡ−ＬＢ／ＣＦ８細胞の増殖を、２１，２５０ｃｍ² ＣｅｌｌＣｕｂｅで
実施し、そしてこれらの培養物における細胞死を、１日当たり産生したＬＤＨを
プレートすることによって比較する。細胞が溶解する場合、周囲の培地にＬＤＨ
を放出する。これは、死細胞の数に直接比例する。多量の細胞死は、不純物のレ
ベルを増加しかつ製造する実行の持続を減少するように、非常に所望されない。
図５は、１日あたりのＬＤＨを示し、これは、ＣｅｌｌＣｕｂｅ培養の間の１日
当たりの細胞死の指数である。全てのデータ点は、多様な実行の平均を示す。標
準培地条件（ＤＭＥＭ＋１１％ＦＢＳ）は、ＭＳ−１７４＋２％ＦＢＳと比
較して４〜６倍高い細胞死を示す。このグラフはまた、ＭＳ−１７４＋２％Ｆ
ＢＳがＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ培養と比較して１／２〜１／３に低い細胞死を有
することを示す。より重要には、ＭＳ−１７４＋２％ＦＢＳ培養の間の細胞死
レベルは、２％かまたは１１％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培養の９日目より低
く、このことは、細胞死が顕著に遅延したことを示す。これは、この方法を使用
する場合にベクター産生期の持続の顕著な増加が可能であることを示す。

【００６１】このグラフはまた、推定の培地の限定効果はアポトーシスの遅延に対して設計
することを示す。ＤＭＥＭ培養とＭＳ−１７４培養との比較（どちらも１１％Ｆ
ＢＳを補充した）は、ＭＳ−１７４培地培養における細胞アポトーシスにおける
３日の遅延を示す。しかし、培養の最後の２日間に死亡する細胞の数は、両方の
培養において類似する。これらの培養における血清レベルの減少は、かなり優れ
た培養条件を提供し、ＭＳ−１７４＋２％ＦＢＳ培養を使用する７日目の遅延
を示す。

【００６２】（実施例５：減少した血清と組合わせたＭＳ−１７４培地を使用する製造スケ
ールでのより高い力価）ＨＡ−ＬＢ／ＣＦ８細胞の増殖を、８５，０００ｃｍ² ＣｅｌｌＣｕｂｅに
て実施し、そして２つの製造スケール実行を、ベクター力価に関して比較する。
結果を、図６および図７に示す。簡単には、これらのグラフは、ＤＭＥＭ＋２％
ＦＢＳ培地と比較してＭＳ−１７４＋２％ＦＢＳ培地において３〜１０倍高
い力価を示す。ＤＭＥＭにおける力価は、３〜６×１０⁷ｅｑ．ｃｆｕ／ｍｌの
範囲であるが、ＭＳ−１７４は、１．５〜４．０×１０⁷ｅｑ．ｃｆｕ／ｍｌの
範囲の力価を示す。これは、ベクター品質における顕著な改善を提供し、そして
製造コストをかなり減少する。

【００６３】（実施例６：減少した血清と組合わせたＭＳ−１７４培地を使用する製造スケ
ールでのより高い総ベクター産生率）ＨＡ−ＬＢ／ＣＦ８細胞の増殖を、８５，０００ｃｍ² ＣｅｌｌＣｕｂｅに
て実施し、そして２つの製造スケール実行を、ベクター産生率に関して比較する
。このグラフはまた、最初のＭＳ−１７４培地における２〜３倍高いベクター産
生レベル、および１０日後の５〜１０倍高いレベルを示す。これは、製造のコス
トをかなり減少するが、産生収量における非常に顕著な改善を示す。

【００６４】（実施例７：減少した血清を伴うＭＳ−１７４を使用する製造スケール培養に
おける細胞アポトーシスの減少）ＨＡ−ＬＢ／ＣＦ８細胞の増殖を、８５，０００ｃｍ² ＣｅｌｌＣｕｂｅに
て実施し、そして２つの製造スケール実行を、細胞死に関して比較する。結果を
、図８に示す。簡単には、このグラフは、１１％ＦＢＳ培養の間（１日目〜４
日目）に類似する細胞死のレベル、引き続く２％ＦＢＳを補充したＭＳ−１７
４培地についてのアポトーシスにおける顕著な遅延を示す。産生期全体の間（５
日目〜１３日目）のＭＳ−１７４培地における細胞死のレベルは、ＤＭＥＭより
低い。これは、生物産生スケールにおける細胞環境条件を変化させることによる
アポトーシスの遅延が可能であることを示す。

【００６５】（実施例８：バッチ培養におけるＨＡ−ＬＢ／ＥＰＯベクターについてのベク
ター産生の増加）レトロウイルスベクターについてのＨＡ−ＬＢ／ＥＰＯ産生細胞株を、材料お
よび方法の説に示したもののように増殖した。図９は、Ｔフラスコにおける多様
なＤＭＥＭおよびＭＳ−１６２実行（両方とも１０％ＦＢＳを補充した）につ
いての平均力価値を示す。１０％ＦＢＳを伴うＭＳ−１６２培地は、培養物上
清中のウイルスベクター力価における６０％増加を生じる。

【００６６】前述より、本発明の特定の実施形態は本明細書中において例示の目的で記載さ
れるが、種々の改変が本発明の精神および範囲を逸脱することなくなされ得るこ
とは、明らかである。さらに、本発明は、添付の特許請求の範囲によって限定さ
れることは期待されない。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、７日培養および８日培養のＤＭＥＭ１０％（ＦＢＳ）対ＭＳ−１６
２１０％（ＦＢＳ）から産生されたベクター産物を示す棒グラフである。

【図２】図２は、７日培養および８日培養のＤＭＥＭ１０％（ＦＢＳ）対ＭＳ−１６
２１０％（ＦＢＳ）の培養中の細胞死を示す棒グラフである。

【図３】図３は、ＤＭＥＭ１１％（ＦＢＳ）、ＤＭＥＭ２％（ＦＢＳ）、ＭＳ−１
７４２％（ＦＢＳ）、およびＭＳ−１７４１１％（ＦＢＳ）において増殖し
た細胞の力価を比較するグラフである。

【図４】図４は、ＤＭＥＭ１１％（ＦＢＳ）、ＤＭＥＭ２％（ＦＢＳ）、ＭＳ−１
７４２％（ＦＢＳ）、およびＭＳ−１７４１１％（ＦＢＳ）において増殖し
た細胞のベクター産生率を比較するグラフである。

【図５】図５は、ＤＭＥＭ１１％（ＦＢＳ）、ＤＭＥＭ２％（ＦＢＳ）、ＭＳ−１
７４２％（ＦＢＳ）、およびＭＳ−１７４１１％（ＦＢＳ）において増殖し
た細胞の１日当たりのＬＤＨ生産を比較するグラフである。

【図６】図６は、ＤＭＥＭ２％（ＦＢＳ）およびＭＳ−１７４２％（ＦＢＳ）にお
いて増殖した細胞の全ベクター産生（製造スケールにおける）を比較するグラフ
である。

【図７】図７は、ＤＭＥＭ２％（ＦＢＳ）およびＭＳ−１７４２％（ＦＢＳ）にお
いて増殖した細胞の細胞死（製造スケールにおける）を比較するグラフである。

【図８】図８は、ＤＭＥＭ１０％（ＦＢＳ）対ＭＳ−１６２１０％（ＦＢＳ）にお
いて増殖した細胞からのベクター力価を示す棒グラフである。

【図９】図９は、ＤＭＥＭ１０％（ＦＢＳ）対ＭＳ−１６２１０％（ＦＢＳ）にお
いて増殖した細胞からのベクター産生を示す棒グラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞培養物において組換えウイルスベクターの産生を増加す
るための方法であって、該方法は、基本培地中に組換えウイルスベクターを産生
する細胞株を培養する工程を包含し、該培地は、該組換えウイルスベクターが産
生されるように（ａ）１．５ｇ／Ｌより多いアミノ酸、および（ｂ）０．５％と
４％との間の血清、を含む、方法。
【請求項２】細胞培養物において組換えウイルスベクターを産生する間の
細胞死を減少するための方法であって、該方法は、基本培地中に組換えウイルス
ベクターを産生する細胞株を培養する工程を包含し、該培地は、該組換えウイル
スベクターが産生されるように（ａ）１．５ｇ／Ｌより多いアミノ酸、および（
ｂ）０．５％と４％との間の血清、を含む、方法。
【請求項３】前記基本培地が、ＲＰＭＩまたはＤＭＥＭである、請求項１
または２に記載の方法。
【請求項４】前記基本培地が、１．２ｇ／Ｌより多いアミノ酸を含む、請
求項１または２に記載の方法。
【請求項５】前記基本培地が、２ｇ／Ｌより多いアミノ酸を含む、請求項
１または２に記載の方法。
【請求項６】前記基本培地が、約２％と３％との間の血清を含む、請求項
１または２に記載の方法。
【請求項７】前記血清が、胎児ウシ血清である、請求項１または２に記載
の方法。
【請求項８】前記ウイルスベクターが、組換えレトロウイルスベクターで
ある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】前記ウイルスベクターが、組換えアデノウイルスベクターで
ある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】前記ウイルスベクターが、組換えアルファウイルスベクタ
ーである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】前記ウイルスベクターが、組換えアデノ随伴ウイルスベク
ターである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】前記組換えウイルスベクター産生細胞株が、接着依存的細
胞株である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】前記組換えウイルスベクター産生細胞株が、連続還流の条
件下で培養される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】請求項１または２に記載の方法であって、コバルト（Ｃｏ
）、銅（Ｃｕ）、マンガン（Ｍｎ）、モリブデン（Ｍｏ）、およびセレニウム（
Ｓｅ）からなる群より選択される金属を含む第一金属塩、ならびに鉄（Ｆｅ）、
カルシウム（Ｃａ）、マグネシウム（Ｍｇ）、および亜鉛（Ｚｎ）からなる群よ
り選択される金属を含む第二金属塩をさらに含む、方法。
【請求項１５】前記第一金属塩が、ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ、ＣｕＣｌ₂・２
Ｈ₂Ｏ、ＣｕＳＯ₄、ＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ、（ＮＨ₄）₆Ｍｏ₇Ｏ₂・４Ｈ₂Ｏ、およ
びＮａ₂ＳｅＯ₃からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】前記第二金属塩が、ＦｅＣｌ₃、ＦｅＳＯ₄、ＣａＣｌ₂、
ＣａＮＯ₃、ＭｇＣｌ₂、ＭｇＳＯ₄、ＺｎＣｌ₂、ＺｎＳＯ₄、ＦｅＮＯ₃・９Ｈ₂
Ｏからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】細胞培養物において組換えウイルスベクターの産生を増加
するおよび／または細胞死を減少するための組成物であって、該組成物は、以下
：（ａ）基本培地；（ｂ）１．５ｇ／Ｌより多いアミノ酸；（ｃ）０．５％と４％との間の血清；（ｄ）コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、マンガン（Ｍｎ）、モリブデン（Ｍｏ
）、およびセレニウム（Ｓｅ）からなる群より選択される金属を含む第一金属塩
；および（ｅ）鉄（Ｆｅ）、カルシウム（Ｃａ）、マグネシウム（Ｍｇ）、および亜鉛
（Ｚｎ）からなる群より選択される金属を含む第二金属塩、を含む、組成物。
【請求項１８】前記基本培地が、ＢＭＥ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ−
Ｆ−１２、ＩＭＤＭ、ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ、培地１９９、Ｈａｍ’ｓＦ−１
０、Ｈａｍ’ｓＦ−１２、ＭＳ−１６２、ＭＳ−１７４、およびＲＰＭＩから
なる群より選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】前記基本培地が、ＤＭＥＭ、ＭＳ−１６２、およびＭＳ−
１７４からなる群より選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】１．７ｇ／Ｌより多いアミノ酸を含む、請求項１７に記載
の組成物。
【請求項２１】２．０ｇ／Ｌより多いアミノ酸を含む、請求項１７に記載
の組成物。
【請求項２２】２．５ｇ／Ｌより多いアミノ酸を含む、請求項１７に記載
の組成物。
【請求項２３】請求項１７に記載の組成物であって、ここで、前記アミノ
酸の１つがＬ−シスチンであり、そして該Ｌ−シスチンが、７５ｍｇ／Ｌと３０
０ｍｇ／Ｌとの間の濃度で存在する、組成物。
【請求項２４】請求項１７に記載の組成物であって、ここで、前記アミノ
酸の１つがＬ−シスチンであり、そして該Ｌ−シスチンが、１００ｍｇ／Ｌと２
００ｍｇ／Ｌとの間の濃度で存在する、組成物。
【請求項２５】請求項１７に記載の組成物であって、ここで、前記アミノ
酸の１つがＬ−セリンであり、そして該Ｌ−セリンが、７５ｍｇ／Ｌと１０００
ｍｇ／Ｌとの間の濃度で存在する、組成物。
【請求項２６】請求項１７に記載の組成物であって、ここで、前記アミノ
酸の１つがＬ−セリンであり、そして該Ｌ−セリンが、２００ｍｇ／Ｌと７００
ｍｇ／Ｌとの間の濃度で存在する、組成物。
【請求項２７】請求項１７に記載の組成物であって、ここで、前記アミノ
酸の１つがＬ−メチオニンであり、そして該Ｌ−メチオニンが、７５ｍｇ／Ｌと
３００ｍｇ／Ｌとの間の濃度で存在する、組成物。
【請求項２８】請求項１７に記載の組成物であって、ここで、前記アミノ
酸の１つがＬ−メチオニンであり、そして該Ｌ−メチオニンが、１００ｍｇ／Ｌ
と２００ｍｇ／Ｌとの間の濃度で存在する、組成物。
【請求項２９】１％と３％との間の血清を含む、請求項１７に記載の組成
物。
【請求項３０】２％と３％との間の血清を含む、請求項１７に記載の組成
物。
【請求項３１】前記血清が、胎児ウシ血清である、請求項１７に記載の組
成物。
【請求項３２】前記血清が、ヒト血清である、請求項１７に記載の組成物
。
【請求項３３】前記第一金属塩が、ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ、ＣｕＣｌ₂・２
Ｈ₂Ｏ、ＣｕＳＯ₄、ＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ、（ＮＨ₄）₆Ｍｏ₇Ｏ₂・４Ｈ₂Ｏ、およ
びＮａ₂ＳｅＯ₃からなる群より選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項３４】前記第一金属塩が、０．００３ｍｇ／Ｌと１．０ｍｇ／Ｌ
との間の濃度で存在する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項３５】前記第一金属塩が、０．０１ｍｇ／Ｌと０．１ｍｇ／Ｌと
の間の濃度で存在する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項３６】前記第二金属塩が、ＦｅＣｌ₃、ＦｅＳＯ₄、ＣａＣｌ₂、
ＣａＮＯ₃、ＭｇＣｌ₂、ＭｇＳＯ₄、ＺｎＣｌ₂、ＺｎＳＯ₄、ＦｅＮＯ₃・９Ｈ₂
Ｏからなる群より選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項３７】請求項３６に記載の組成物であって、ここで、前記第二金
属塩がＭｇＣｌ₂であり、そして該ＭｇＣｌ₂が、５０ｍｇ／Ｌと５００ｍｇ／Ｌ
との間の濃度で存在する、組成物。
【請求項３８】請求項３６に記載の組成物であって、ここで、前記第二金
属塩がＭｇＣｌ₂であり、そして該ＭｇＣｌ₂が、１２５ｍｇ／Ｌと１７５ｍｇ／
Ｌとの間の濃度で存在する、組成物。
【請求項３９】請求項３６に記載の組成物であって、ここで、前記金属が
ＺｎＣｌ₂であり、そして該ＺｎＣｌ₂が、１ｍｇ／Ｌと５ｍｇ／Ｌとの間の濃度
で存在する、組成物。
【請求項４０】請求項３６に記載の組成物であって、ここで、前記金属が
ＺｎＣｌ₂であり、そして該ＺｎＣｌ₂が、２ｍｇ／Ｌと４ｍｇ／Ｌとの間の濃度
で存在する、組成物。