NO324775B1 - Renset peptid, isolert nukleinsyresekvens og deres anvendelse. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører rensede polypeptider med en reseptoraktivitet som er spesifikk for interleukin-13 (IL-13) og deres biologisk aktive fragmenter. Oppfinnelsen vedrører også deres anvendelse.

Oppfinnelsen vedrører også isolerte nukleinsyresekvenser og deres anvendelse, samt klonings- og/eller ekspresjonsvektor, vertscelle, nukleotid probe og antisense-sekvens.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for å fremstille et rekombinant IL-13 reseptor polypeptid, samt et farmasøytisk preparat.

Endelig vedrører oppfinnelsen monoklonale eller polyklonale antistoffer, konjugerte antistoffer eller fragmenter derav. IL-13 er et nylig identifisert (1,2) cytokin med 112 aminosyrer utskilt ved de aktiverte T lymfocyttene, B lymfocyttene og mastocyttene etter aktivering.

I kraft av sine mange biologiske egenskaper som deles med IL-4, er IL-13 blitt beskrevet som et IL-4 lignende cytokin. Dets aktiviteter er faktisk tilsvarende dem til IL-4 på B cellene (3-5), monocyttene (6-10) og andre ikke-hematopoietiske celler (11-12). På den annen side, i motsetning til IL-4, vil det ikke utvise en spesifikk effekt på hvilende eller aktiverte T celler (13).

Forskjellige biologiske aktiviteter av IL-13 på monocytter/- makrofager, B lymfocytter og visse hematopoietiske forløpere er blitt beskrevet detaljert av A.,J. Minty, så vel som i oversiktsartikler på IL-13 (se for eksempel 14). En rekke data indikerer i tillegg at dette cytokin har en pleiotropisk effekt på andre celletyper. Disse ikke-hematopoietiske celler som direkte påvirkes ved IL-13 er endotel- og mikro-gliaceller, keratinocytter og nyre- og kolonkarsinomer.

De anti-inflammatoriske og immunoregulerende aktiviteter av IL-13 kan for eksempel anvendes i behandlingen av autoimmune, tumor og virale patologier.

En utnyttelse av disse biologiske egenskaper på et klinisk nivå krever imidlertid en inngående kunnskap om de signaler og mekanismer via hvilke disse effekter utvises, slik at man kan være i stand til å styre og modulere dem i de relevante patologier.

Ett av trinnene i analysen av signalet som transmitteres ved et biologisk molekyl i en celle omfatter identifikasjon av membranreseptoren derav. De studier som til nå er gjennom-ført på IL-13 reseptoren har vist at IL-13 og IL-4 hadde felles en reseptor, eller i det minste noen av komponentene av et reseptorkompleks, så vel som signal-transduksjonsele-menter (15-18). Denne reseptor er til stede på overflaten av en rekke celletyper, i et variabelt antall i henhold til den celletypen som man betrakter. En sammenlignbar fordeling av IL-13 og IL-14 reseptorene er blitt indikert av A.J. Minty (14) .

Kondo et al. (19) har beskrevet strukturen av en reseptor med en høy affinitet for IL-4. Denne reseptor er en dimer, dannet ved foreningen av et glykoprotein på 140 kDa (IL-4R) og y kjeden i IL-2 reseptoren (yc). IL-4 kan binde til glykoprotein-subenheten på 140 kDa (IL-4R eller gp 140) med en høy affinitet (Kd mellom 50 og 100 pM) (15). Denne affinitet økes imidlertid med en faktor på fra 2 til 3 når yc kjeden forenes med gp 140. Denne forening er i tillegg nødvendig for transmisjonen av visse signaler mediert ved IL-4 (19,20).

Kryss-konkurranseforsøk for binding av enten IL-13 eller IL-4 har vist at IL-4 normalt kan forhindre bindingen av IL-13, mens IL-13 kan generelt bare delvis forhindre bindingen av IL-4 til dets reseptor (17, 21) og binder seg ikke til noen av de to subenheter av IL-4 reseptoren eller til komplekset dannet ved foreningen derav. På grunnlag av disse observa- sjoner, har man antatt at reseptoren som er spesifikk for IL-13 besto av reseptorkomplekset IL-4 assosiert med en annen

IL-13 bindingskomponent (IL-13RP).

Forsøksstudier gjennomført på en erytro-leukemicellelinje i stand til proliferasjon som svar på IL-13 og IL-4 (TF-1 linje) har vist at disse to cytokiner ga lignende intra-cellulære virkninger etter binding til deres reseptor (18). Parallelt, har kryssbindingsforsøk gjort at man har kunnet vise at gp 140 kan danne heterodimerer med enten y kjeden eller med en ny subenhet med en molekylvekt på 55 til 70 kDa (17, 21).

Forsøksstudier som nylig er gjennomført på en embryonisk stamcellelinje fra mus har gjort det mulig å isolere genomisk DNA og cDNA som koder for et polypeptid med 424 aminosyre-rester (IL-13Ra), noe som foreslår at IL-13 reseptoren delte en felles kjede med IL-4 reseptoren til å utgjøre en høyaffinitetsreseptor (22, 23), dvs. som har en affinitet hvis konstante Kd ligger mellom verdier på mellom omtrent 10 pM og 100 pM (en lavaffinitetsreseptor har en konstant Kd som ligger mellom en verdi på 2 nM og 10 nM).

I og med viktigheten, på et medisinsk nivå, av en nærmere forståelse av fenomenet for regulering av IL-4 og av IL-13, og særlig muligheten av å kunne separere og kontrollere separat effektene som dannes ved begge disse to cytokiner, har man på den ene side vært interessert i karakteriseringen av et polypeptid som spesifikt binder IL-13 med en høy affinitet og på en annen side i karakteriseringen av et annet polypeptid som alene spesifikt binder IL-13 med en lav affinitet og som, dersom det er forenet med IL-4 reseptoren, utgjør en høyaffinitetsreseptor for IL-13.

Man har nå identifisert en human karsinomcellelinje som uttrykker den IL-13 spesifikke reseptor i en mengde som er større enn andre kjente humane renale karsinomlinjer (21), og man har nå gjennomført kloning av den primære subenhet som er ansvarlig for bindingen av IL-13 til IL-4/IL-13 reseptoren, betegnet IL-13RP, så vel som kloningen av den felles kjede som deles av IL-13 og IL-4 for å gi en høyaffinitetsreseptor som tillater kryss-konkurranse mellom de to cytokiner, betegnet IL-13Ra. Den foreliggende oppfinnelse vedrører således rensede polypeptider som spesifikt binder IL-13.

Mere spesielt vedrører den foreliggende oppfinnelse rensede polypeptider hvis aminosyresekvenser svarer til dem for en reseptor spesifikk for IL-13 (IL-13Rp og IL-13R<x) , eller biologisk aktive fragmenter derav.

Formålet med den foreliggende oppfinnelse er også isolerte DNA sekvenser som koder for de nevnte peptider eller deres biologisk aktive fragmenter.

I tillegg vedrører oppfinnelsen ekspresjonsvektorene som inneholder minst en av nukleotidsekvensene som definert i det foregående, og vertscellene som er transfektert med disse ekspresjonsvektorer under betingelser som tillater replikasjon og/eller ekspresjon av en av de nevnte nukleotidsekvenser.

Fremgangsmåter for fremstilling av rekombinant IL-13RP og IL-13Ra eller deres biologisk aktive fragmenter ved transfekterte vertsceller utgjør også en del av oppfinnelsen.

Oppfinnelsen vedrører også farmasøytiske preparater omfattende IL-13RP og/eller IL-13Ra eller biologisk aktive fragmenter derav for reguleringen av immunologiske og inflammatoriske mekanismer dannet ved IL-13. Den vedrører i tillegg anvendelse av IL-13Rp og/eller IL-13Ra eller fragmenter derav for å screene midler i stand til å modulere deres aktivitet så vel som for fremstilling av nye produkter i stand til å modulere aktivitetene av IL-13 reseptoren.

Oppfinnelsen vedrører også antistoffer eller derivater av antistoffer som er spesifikke for IL-13RP og/eller IL-13Rcc.

I den etterfølgende beskrivelse av oppfinnelsen anvendes følgende definisjoner: polypeptid som spesifikt binder IL-13 med en høy affinitet (IL-13RP): et polypeptid omfattende aminosyresekvensen SEQ ID No. 2 eller ethvert biologisk aktivt fragment eller derivat derav, - polypeptid som alene spesifikt binder IL-13 med en lav affinitet og som, dersom det er assosiert med IL-4 reseptoren, utgjør en høyaf f initetsreseptor (IL-13R<x) : et polypeptid omfattende aminosyresekvensen SEQ ID No. 4 eller ethvert biologisk aktivt fragment eller derivat derav, - biologisk aktivt: i stand til å binde spesifikt til IL-13 og/eller delta i transduksjonene av signalet spesifikt dannet ved IL-13 på cellemembrannivået, og/eller i stand til å

interagere reseptoren spesifikk for IL-4 (IL-4R/gp 140) for å danne et kompleks i stand til å binde IL-4 og IL-13, og/eller som gjenkjennes ved hjelp av antistoffer spesifikke for polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 2 og/eller med sekvens SEQ ID No. 4, og/eller indusere antistoffer som gjenkjenner polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 2 og/eller sekvens SEQ ID No. 4,

derivat: ethvert polypeptid som er en variant av polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 2 og/eller sekvens SEQ ID No. 4, eller ethvert molekyl resulterende fra en modifikasjon av en genetisk og/eller kjemisk natur av sekvensen SEQ ID No. 2 eller av sekvensen SEQ ID No. 4, dvs. som oppnås ved mutasjon, delesjon, addisjon, substitusjon og/eller ved kjemisk modifikasjon av et begrenset antall aminosyrer, så vel som enhver isoform sekvens, dvs. en sekvens som er identisk med sekvensen SEQ ID No. 2 eller med sekvensen SEQ ID No. 4, med ett av deres fragmenter eller en av deres modifiserte sekvenser, inneholdende en eller flere aminosyrer i D-enantiomer-formen, idet nevnte variant, modifiserte eller isoforme sekvenser har bibeholdt minst en av egenskapene som gjør dem biologisk aktive.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et renset polypeptid som omfatter en aminosyresekvens valgt blant:

a) sekvensen SEQ ID No. 2,

b) en hvilken som helst sekvens avledet fra SEQ ID No. 2 ved mutasjon, delesjon, addisjon, substitusjon og/eller

kjemisk modifikasjon av en eller av et begrenset antall aminosyrer, hvori nevnte polypeptid med sekvens avledet fra SEQ ID No. 2 har den samme biologiske aktivitet som polypeptidet omfattende aminosyresekvensen SEQ ID No. 2.

Oppfinnelsen vedrører også en isolert nukleinsyresekvens som koder for et polypeptid som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 5.

Oppfinnelsen vedrører også et renset polypeptid som omfatter sekvensen SEQ ID No. 4.

Oppfinnelsen vedrører også et renset polypeptid som er en oppløselig form av polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 4 som strekker seg opp til rest 343 og foretrukket opp til restene mellom 336 og 342.

Oppfinnelsen vedrører også en isolert nukleinsyresekvens som koder for et polypeptid som angitt i krav 9 eller 10.

Oppfinnelsen vedrører også en klonings- og/eller ekspresjonsvektor som inneholder en nukleinsyresekvens som angitt i ett eller flere av kravene 6 til 8 og 11 til 13.

Oppfinnelsen vedrører også en vertscelle som er transfektert med en vektor som angitt i krav 14 eller 15.

Oppfinnelsen vedrører også en nukleotid probe som hybridiserer spesifikt med hvilken som helst av sekvensene som angitt i krav 6 til 8, de komplementære sekvensene derav eller de tilsvarende budbringer RNA<1>er, som inkluderer hele sekvensen SEQ ID No. 1 eller den komplementære tråden derav.

Oppfinnelsen vedrører også en nukleotid probe som hybridiserer spesifikt med hvilken som helst av sekvensene som angitt i krav 11 til 13, de komplementære sekvensene derav eller tilsvarende budbringer RNA'er, som inkluderer hele sekvensen SEQ ID No. 3 eller den komplementære tråden derav.

Oppfinnelsen vedrører også en antisense-sekvens som er i stand til å i det minste delvis inhibere produksjon av polypeptidet som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 5 og9til 10, som er valgt fra sekvensene som utgjør leserammen som koder for et polypeptid som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 5 og 9 til 10 på transkripsjonsnivået.

Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av en nukleinsyresekvens som angitt i ett eller flere av kravene 6 til 8 og 11 til 13 for fremstilling av et rekombinant polypeptid som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 5 og 9 til 10.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for å fremstille et rekombinant IL-13 reseptor polypeptid, hvor transfekterte celler som angitt i krav 16 eller 17 dyrkes under betingelser som tillater ekspresjonen av et rekombinant polypeptid som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 5 og 9 til 10 og hvor nevnte rekombinante polypeptid utvinnes.

Oppfinnelsen vedrører også monoklonale eller polyklonale antistoffer, konjugerte antistoffer eller fragmenter derav, som er i stand til spesifikt å gjenkjenne et polypeptid som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 5 og 9 til 10.

Oppfinnelsen vedrører også monoklonale eller polyklonale antistoffer, konjugerte antistoffer eller fragmenter derav, som er merkede antistoffer, kimære antistoffer, humaniserte antistoffer, eller Fab eller F(ab')2fragmenter som er i stand til å spesifikt gjenkjenne et polypeptid som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 5 og9til 10.

Oppfinnelsen vedrører også et farmasøytisk preparat som omfatter, som aktivt prinsipp, et polypeptid som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 5 eller 9 til 10.

Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av et polypeptid som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 5 for å screene midler som er i stand til å modifisere aktiviteten av IL-13RP.

Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av et polypeptid som angitt i krav 9 eller 10 for å screene midler som er i stand til å modifisere aktiviteten av IL-13Rcc.

Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av et polypeptid som angitt i krav 4, 5 eller 10 for å syntetisere et IL-13 antagonistisk legemiddel som er egnet for å behandle tilstander som responderer på en IL-13 antagonistisk effekt.

Endelig vedrører oppfinnelsen anvendelse av et polypeptid som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 5 eller 9 til 10 for å fremstille et farmasøytisk preparat som kan anvendes for å regulere immunologiske og inflammatoriske mekanismer produsert ved IL-13.

Fremstillingen av derivater kan ha en rekke formål inkluderende spesielt økning av affiniteten av reseptoren for IL-13, modulering av kryss-konkurransen mellom IL-13 og IL-4, øking av produksjonsnivået, økning av deres resistens overfor proteaser, modifikasjon av deres biologisk aktivitet eller gi dem nye farmasøytiske og/eller biologiske egenskaper.

Blant biologisk aktive varianter av polypeptidene som definert over, er fragmenter dannet ved alternerende spleising av transkriptene (messenger RNAer) av genet som koder for en av aminosyresekvensene beskrevet over, foretrukne.

I en fordelaktig variant, blir de 8 C-terminale aminosyrer i polypeptiden med sekvens SEQ ID No. 2 substituert med følg-ende 6 aminosyrer: VRCVTL.

I henhold til et fordelaktig aspekt vedrører oppfinnelsen en oppløselig form av IL-13RP, betegnet IL-13Ps, omfattende særlig det ekstracellulære domenet av polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 2 som strekker seg opp til rest 343 og foretrukket opp til rest 337 så vel som en oppløselig form av IL-13Rcc, betegnet IL-13Ras, omfattende særlig det ekstracellulære domenet av polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 4 som strekker seg opp til rest 343 og foretrukket opp til restene mellom 336 og 342.

Polypeptidet som omfatter sekvensen SEQ ID No. 2 eller sekvensen SEQ ID No. 4 representerer en spesifikk utførelses-form av oppfinnelsen.

Som det vil fremgå fra eksemplene, kan polypeptidet som omfatter sekvensen SEQ ID No. 2 eller sekvensen SEQ ID No. 4 uttrykkes på overflaten av humane celler til å danne en funksjonell IL-13 reseptor og/eller kombinere med IL-4 reseptoren til å danne, med y kjeden av IL-2 reseptoren, reseptorkomplekset felles for IL-4 og IL-13.

Formålet med den foreliggende oppfinnelse er som nevnt også isolerte nukleinsyresekvenser.

I en utførelsesform av oppfinnelsen er den isolerte nukleinsyresekvens valgt fra:

a) sekvensen SEQ ID No. 1,

b) nukleinsyresekvensene i stand til å hybridisere til sekvensen SEQ ID No. 1 og som koder for et polypeptid med

en IL-13 reseptor aktivitet,

c) nukleinsyresekvensene avledet fra sekvenser a) og b)som et resultat av degenereringen av den genetiske kode.

I en ytterligere utførelsesform av oppfinnelsen er den isolerte nukleinsyresekvens valgt fra:

(a) sekvensen SEQ ID No. 3,

(b) nukleinsyresekvensene avledet fra sekvens a) som et resultat av degenereringen av den genetiske koden.

Mere spesielt vedrører den foreliggende oppfinnelse en sekvens som koder for den oppløselige del av IL-13RP eller av IL-13Ra og enhver variant dannet ved alternerende spleising av transkriptene av IL-13RP eller av IL-13Rcc, med konserv-ering av minst en av de biologiske egenskaper som er beskrevet.

En foretrukket utførelsesform er representert ved en nukleinsyresekvens som omfatter eller som utgjøres av en serie av nukleotider som strekker seg fra nukleotid nr. 1 opp til nukleotid 1081, og foretrukket opp til nukleotid 1063 på sekvensen SEQ ID No. 1.

En annen foretrukket utførelsesform er representert ved en nukleinsyresekvens som omfatter eller som utgjøres av en serie av nukleotider som strekker fra nukleotid nr. 1 opp til nukleotid nr. 1059, og foretrukket opp til nukleotidene mellom nr. 1041 og 1056 på sekvensen SEQ ID No. 3.

Nukleinsyresekvensen i henhold til oppfinnelsen er fordelaktig en sekvens som koder for et protein svarende til den modne form av IL-13RP eller av IL-13Ra, idet dette modne protein er resultatet av frigivelsen av signalpeptider.

De forskjellige nukleotidsekvenser i henhold til oppfinnelsen kan være av kunstig opprinnelse eller annet. De kan være DNA eller RNA sekvenser oppnådd ved screening av sekvensbiblio-teker ved hjelp av prober dannet på grunnlag av sekvensen SEQ ID No. 1 eller av sekvensen SEQ ID No. 3. Slike biblioteker kan fremstilles ved konvensjonelle biologiske molekylære teknikker som er kjent for fagkyndige på området.

Nukleotidsekvensene i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan også fremstilles ved kjemisk syntese eller alternativt ved en kombinasjon av metoder som omfatter kjemisk eller enzymatisk modifikasjon av sekvenser oppnådd ved å screene bibliotekene.

Disse nukleotidsekvenser tillater fremstillingen av nukleo-tidprober som koder for et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelse eller et biologisk aktivt fragment derav. De passende hybridiseringsbetingelser svarer til de temperatur- og ionestyrkebetingelser som vanlig anvendes av fagkyndige på området, foretrukket temperaturforhold mellom Tm - 5°C og Tm - 3 0°C og ytterligere fortrukket temperaturforhold mellom Tm - 5°C og Tm - 10°C (høy stringens) , idet Tm er smeltetemperaturen, definert som den temperatur hvorved 50% av de base-parede tråder separerer. Slike prober utgjør også en del av oppfinnelsen. De kan anvendes som et in vitro diagnostisk verktøy for deteksjonen, ved hybridiserings-forsøk, av transkripter som er spesifikke for polypeptidene i henhold til oppfinnelsen i biologiske prøver eller for deteksjon av variantsynteser eller av genetiske avvik resulterende fra en polymorfisme, fra mutasjoner eller fra en dårlig spleising.

Probene i henhold til oppfinnelsen omfatter minst 10 nukleotider og omfatter høyst hele nukleotidsekvensen SEQ ID No. 1 eller hele nukleotidsekvensen SEQ ID No. 3 eller deres komple-mentærtråd.

Blant de korteste prober, dvs. med fra omtrent 10 til 15 nukleotider, svarer de passende hybridiseringsbetingelser til de temperatur- og ionestyrkebetingelser som vanlig anvendes av fagkyndige på området.

Probene i henhold til oppfinnelsen merkes foretrukket før bruk. For dette er det for fagkyndige tilgjengelig en rekke teknikker, som for eksempel fluorescensmerking, radioaktiv merking, kjemiluminescensmerking eller enzymatisk merking.

Nukleotidsekvensene i henhold til oppfinnelsen kan også anvendes for fremstillingen av og anvendelsen av sense-og/eller antisense- og lionukleotidprimere for sekvenserings-reaksjoner eller for spesifikke amplifikasjonsreaksjoner i henhold til den såkalte PCR (polymerasekjedereaksjon) teknikken eller enhver annen variant derav. Nukleotidsekvensene i henhold til oppfinnelsen kan dessuten anvendes innen det terapeutiske området for fremstilling av antisense-sekvenser som er i stand til spesifikk hybridisering med en nukleinsyresekvens, inkluderende en messenger RNA, og kan anvendes innen genterapi.

De kan mere fordelaktig anvendes i behandling av allergier og av inflammasjon.

Nukleotidsekvensene i henhold til oppfinnelsen kan dessuten anvendes for fremstilling av de rekombinante polypeptider, som definert over, med en IL-13 reseptor aktivitet.

Disse polypeptider kan fremstilles fra nukleotidsekvensene som definert over i henhold til teknikker for fremstillingen av rekombinante produkter som er kjent for fagkyndige på området. I dette tilfellet anbringes den anvendte nukleotidsekvens under styring av signaler som tillater ekspresjon derav i en cellulær vert. Den cellulære vert som anvendes kan velges fra prokaryotiske systemer, slik som bakterier, eller fra eukaryotiske systemer, slik som gjær, insektceller, CHO celler (ovarieceller fra kinesisk hamster) eller fra ethvert annet system som fordelaktig er kommersielt tilgjengelig. En cellulær vert som er foretrukket for ekspresjonen av polypeptidene i henhold til oppfinnelsen utgjøres av fibroblastlinjen COS-7 eller COS-3.

Signalene som styrer ekspresjonen av polypeptidene, slik som promoterene, aktivatorene eller terminalsekvensene, velges i henhold til den vertscelle som anvendes. For dette formål kan nukleotidsekvensen i henhold til oppfinnelsen innføres i vektorer med autonom replikasjon i den valgte vert, eller integrerende vektorer av den valgte vert. Slike vektorer vil fremstilles i henhold til metoder som er vanlig anvendt av fagkyndige på området, og de oppnådde kloner kan innføres i en passende vert ved standardmetoder som for eksempel elektroporering.

I tilfellet av COS-7 eller COS-3 celler, kan transfeksjonen gjennomføres ved anvendelse av vektoren pSE-1, som beskrevet i (17) .

Vertscellene ifølge oppfinnelsen som er transfektert med disse ekspresjonsvektorer kan oppnås ved innføring, i vertscellene, av en nukleotidsekvens innført i en vektor som definert over, etterfulgt av dyrking av de nevnte celler under betingelser som tillater replikasjon og/eller ekspresjon av den transfekterte nukleotidsekvens.

Disse celler kan anvendes i en fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant polypeptid med sekvens SEQ ID No. 2 eller SEQ ID No. 4 eller et derivat, hvor de transfekterte celler dyrkes under betingelser som tillater ekspresjon av et rekombinant polypeptid med sekvens SEQ ID No. 2 eller SEQ ID No. 4, eller et derivat, og hvor det nevnte rekombinante polypeptid utvinnes.

Renseprosesser som anvendes er kjente for fagkyndige på området. Det rekombinante polypeptid kan renses fra celle-lysater og ekstrakter, fra kultursupernatanten, ved hjelp av fremgangsmåter som anvendes individuelt eller i kombinasjon, som fraksjonering, kromatografimetoder, immunaffinitets-teknikker ved anvendelse av spesifikke mono- eller polyklonale antistoffer.

De mono- eller polyklonale antistoffer som er i stand til spesifikt å gjenkjenne IL-13RP og/eller IL-13R0i henhold til den definisjon som er angitt over utgjør som nevnt også en del av oppfinnelsen. De polyklonale antistoffene kan oppnås fra serum fra et dyr som er immunisert mot IL-13RP og/eller IL-13Ra i henhold til vanlig anvendte prosedyrer.

De monoklonale antistoffene kan oppnås i henhold til den konvensjonelle hybridom-dyrkingsmetode som beskrevet av Kohler og Milstein (Nature, 1975, 256, 495-497). Fordelaktige antistoffer er antistoffer rettet mot det ekstracellulære domenet av IL-13RP og/eller IL-13Ra.

Antistoffene i henhold til oppfinnelsen er for eksempel kimære antistoffer, humaniserte antistoffer, Fab og F(ab')2 fragmenter. De kan også eksistere i form av merkede antistoffer eller immunokonjugater. De kan for eksempel være assosiert med toksin som difteritoksinet eller med et radioaktivt produkt. Disse immunotoksiner kan i dette tilfelle utgjøre terapeutiske midler som kan anvendes for behandling av visse patologier som involverer en overekspresjon av IL-13RP og/eller IL-13Ra.

Antistoffene i henhold til oppfinnelsen, særlig de monoklonale antistoffer, kan også anvendes for immunocytokjemisk analyse av IL-13 reseptorene på spesifikke vevssnitt, for eksempel ved immunofluorescens eller ved gullmerking eller peroksidasemerking.

De kan fordelaktig anvendes i enhver situasjon hvor ekspresjonen av IL-13Rp og/eller IL-13Ra skal observeres, som for eksempel en unormal overekspresjon eller måling av reguleringen av membranekspresjon.

Oppfinnelsen vedrører også som nevnt et farmasøytisk preparat omfattende, som aktivt prinsipp, et polypeptid svarende til de ovennevnte definisjoner, foretrukket i en oppløselig form, eventuelt kombinert med en farmasøytisk aksepterbar vehikkel.

Et slikt polypeptid kan faktisk virke i konkurranse med IL-13RP og/eller IL-13R0uttrykt på celleoverflaten, og derved utgjøre en antagonist som er spesifikk for bindingen av IL-13 til dens reseptor, som fordelaktig kan anvendes for syntese av et medisinsk produkt som er egnet for å modulere reaksjonene mediert ved IL-13 i patologiske situasjoner.

Tilstander som er forbundet med immunologiske reaksjoner mediert ved IL-13, kan behandles ved at det til en pasient administreres IL-13Rp og/eller IL-13Roc (eller ett av de biologiske aktive fragmenter derav), eller at det administreres en forbindelse i stand til spesifikt å modulere den biologiske aktivitet derav, i kombinasjon med en farmasøytisk aksepterbar vehikkel.

Andre egenskaper og fordeler med den foreliggende oppfinnelse vil fremgå fra den etterfølgende beskrivelse omfattende eksemplene og figurene, hvor forklaringene er gitt i det etter-følgende .

Forklaring til figurene

Fig. 1: karakterisering av den humane IL-13RP reseptor tilstede i Caki-1 celler.

a) Scatchard analyse (innføyd) av metningskurven av IL-13 merket med [125I] ; b) binding av [<125>I][Phe43]-IL-13-GlyTyrGlyTyr i nærvær av økende konsentrasjoner av umerket IL-13 (■ ) og av IL-4 (o); c) kryssbindingsforsøk ved anvendelse av radioaktiv IL-13 i fravær (spor a) og i nærvær av ett hundre ganger overskudd av umerket IL-13 (spor b) eller av IL-4 (spor c); d) inhibering av sekresjonen av IL-6 indusert ved IL-13 og IL-4 i nærvær av et monoklonalt antistoff spesifikt for IL-4R kjeden og IL-4 antagonisten Y124DIL-4. Fig. 2: Nukleotidsekvens av cDNA av IL-13RP, og sammenligning av proteinsekvenseii av IL-5R og IL-13RP. a) nukleotidsekvens av cDNA av IL-13RP. Aminosyrer svarende til signalpeptidet utledet av nukleinsyresekvensen er indikert i kursiv, og dem svarende til transmembrandomenet er indikert med uthevet skrift. De potensielle N-glykosyleringssteder (Asn-X-Ser/Thr) er understreket, b) oppstilling av aminosyrene av IL-13RP og IL-5R sekvensene. Proteinsekvensene av IL-13R og IL-5R er

oppstilt som beskrevet over (24). Cysteinrestene og WSXWS motivet som er karakteristisk for denne familie av reseptorer er angitt i bokser.

Fig. 3: ekspresejonsmønster for IL-13RP raRNA.

RNA ble fremstilt fra følgende celler: Caki-1 (spor

a), A431 (spor b), TF-1 (spor c), U937 (spor d), Jurkat (spor e) og IM9 (spor f). Fig. 4: karakterisering av den rekombinante IL-13RP reseptoren for IL-13. COS-7 cellene er transfektert med IL-13RP cDNA og anvendt for: a) studier for bindingen av radioaktivt merket IL-13 (innføyd) ved Scatchard analyse av metningskurven; b) kryssbindingsforsøk ved anvendelse av radioaktivt merket IL-13 i fravær (spor a) og i nærvær av ett

hundre ganger overskudd av umerket IL-13 (spor b);

c-d) kotransfeksjonsforsøk ved anvendelse av klonet IL-13RP, IL-4R (gpl40) og yc kjeden etterfulgt av bindingen av radioaktivt merket IL-13 (c) eller av IL-4 (d). De mørke og lyse kolonner representerer den spesifikke binding av henholdsvis IL-13 og av IL-4.

Fig. 5: inhibering av bindingen av IL-13 til IL-13RP ved den oppløselige form av reseptoren (IL-13Rps) i transient ekspresjon.

Ekspresjonen av IL-13RPs i supernatanten av cellene transfektert med 2 034 testes ved inhibering av bindingen av IL-13 på celler transfektert med IL-13RP

(2036). Supernatantene testes i den urene tilstand

ved at de fortynnes 1/2 i den joderte ligand.

2036 NSB: ikke-spesifikk binding i nærvær av et overskudd av umerket IL-13.

2 036 BT: total binding på celler transfektert med

2036

2036 + sgt 2034: binding til celler transfektert med 2 036 i nærvær av supernatant av celler transfektert

med 2034.

2 036 + sgt pSEl: kontroll.

Fig. 6: inhibering av bindingen av IL-13 til IL-13RP ved den oppløselige form av reseptoren (IL-13Rps) på stabile linjer.

T2036-22: Total binding på klonet IL-13RP (2036-22)

i fravær av supernatant av klon som utskiller IL-13RPs (referanse 100%)

2034-4

2034-6

2034-19 4 kloner IL-13RpS

2034-21

1274-20: i nærvær av supernatant av CHO celler som ikke uttrykker IL-13RPs (kontroll).

Fig. 7: nukleotidsekvens av IL-13Rcc cDNA og sammenligning av proteinsekvensene av human IL-13R0og murin IL-13R<x. a) Nukleotidsekvens av IL-13Rcc cDNA. Aminosyrene svarende til signalpeptidet utledet fra nukleinsyresekvensen er understreket med en prikket linje og dem svarende til transmembrandomenet er understreket med en dobbel linje. De potensielle N-glykosyleringssteder (Asn-X-Ser/Thr) er angitt i bokser. b) Oppstilling av aminosyrene av human IL-13R<x og av murin IL-13Ra. Proteinsekvensene av human IL-13R0

og av murin IL-13R0er oppstilt som beskrevet over (24). Cysteinrestene og motivet WSXWS som er karakteristisk for denne familie av reseptorer er angitt i bokser.

Fig. 8: karakterisering av den rekombinante IL-13Rcc reseptoren for IL-13.

CHO eller COS-3 cellene transfektert med IL-13Roc og/eller IL-4R cDNA og anvendt for: a) studier av bindingen av jod-125 merket IL-13 ved Scatchard analyse av metningskurven med CHO celler transfektert med IL-13RP cDNA (fig. A), transfektert med IL-13RP cDNA og IL-4R cDNA (fig. B), transfektert med IL-13Ra cDNA (fig. C) og transfektert med IL-13Rcc cDNA og IL-4R cDNA (fig.

D) ,

b) konkurranseforsøk av binding av [125I]-IL-13 på CHO celler transfektert med IL-13RP cDNA (fig. E), transfektert med IL-13RP cDNA og IL-4R cDNA (fig. F), transfektert med IL-13Ra cDNA (fig. G) og transfektert med IL-13Ra cDNA og IL-4R cDNA (fig. H). De klare og skraverte kolonner representerer henholdsvis den spesifikke binding av radioaktivt merket IL-13 i nærvær av et overskudd (1.000 ganger mere) av IL-13 eller IL-4, de sorte kolonner representerer total binding.

Fig. 9: sammenligning av elektroforesemobiliteten i EMSA for cellulære ekstrakter som uttrykker IL-4 reseptoren alene (CHO-4), IL-13Ra reseptoren alene (CHO-13) eller de kombinerte reseptorer IL-13Ra og IL-4R (CHO-4-13) etter aktivering av CHO cellene i nærvær av IL-4 eller IL-13 (4 eller 13), idet c representerer den ikke-aktiverte kontroll.

Materialer og metoder

Bindings- og kryssbindingsforsøk:

Bindings- og kryssbindingsforsøkene gjennomføres som beskrevet for[12<5>I][Phe43]-IL-13-GlyTyrGlyTyr (17).

Induksjon av sekresjon av IL- 6:

Caki-1 celler (ATCC HTB46) anbringes i 24 brønns plater i en densitet på 5xl0<4>celler/brønn og etter 3 døgns dyrking blir konfluente monolag vasket tre ganger med DMEM medium uten føtalt kalveserum. Stimuleringen av Caki-1 cellene gjennom-føres med 3 0 ng/ml IL-4 eller IL-13 i fravær eller i nærvær av Y124DIL-4 eller av et anti-gpl40 monoklonalt antistoff. Mengden av IL-6 frigitt inn i kulturmediumet etter inkubasjon i 24 timer måles ved en ELISA teknikk (Innotest, Frankrike).

Isoler ing og analyse av det hu mane IL- 13RP cDNA:

Total RNA ble ekstrahert fra Caki-1 cellene som beskrevet over (25). Poly(A) RNA isoleres fra de totale RNAer med magnetiske kuler belagt med oligo(dT)25(Dynal). Et cDNA bibliotek inneholdende 2xl0<5>kloner ble konstruert ved anvendelse av en primer-adaptorprosedyre (26) og vektoren pSE-l (27) . Kloningsstrategien for ekspresjonen som ble anvendt er beskrevet tidligere (17).

Fremstilling av human IL- 13Rp cDNA:

RNA prøvene kopieres med revers transkriptase underkastet PCR (polymerasekjedereaksjon) ved anvendelse av en sense primer svarende til sekvensen + 52 til + 71 og en antisense primer svarende til + 489 til 470 (nummereringen er gjort på grunnlag av den cDNA sekvens som er vist i fig. 2). De PCR-ampli-fiserte produkter hybridiseres med en probe som er komple-mentær til sekvensene + 445 til + 461 av cDNA. Størrelses-markørene er indikert på venstre side av figuren.

Isolering og analyse av det humane IL- 13Ra cDNA:

1) Fremstilling av den murine IL-13Roc probe.

a) Dyrking av B9 cellene (28).

B9 cellene dyrkes i RPMI medium (Gibco) supplert med 10%

føtalt kalveserum og 50fig/ml gentamycin.

b) Fremstilling av RNA av B9 cellene.

Cellene vaskes to ganger med PBS buffer (fosfatbufret salt-oppløsning, referanse 04104040-GIBCO-BRL). Etter sentri-fugering i 10 minutter ved 1.000 rpm suspenderes celle-pelleten i lysisbuffer med følgende sammensetning: 4M guanidin-tiocyanat, 25 mM natriumcitrat pH 7, 0,5% sarkosyl, 0,1 M P2-merkaptoetanol.

Suspensjonen ultralydbehandles ved anvendelse av en Ultra-turax sonikator nr. 231256 (JANKE og KUNDEL) ved maksimal kraft i ett minutt. Natriumacetat pH 4 tilsettes til 0,2 M. Oppløsningen ektraheres med en volumdel av en fenol/kloro-formblanding (volum/volum: 5/1).

RNA inneholdt i den vandige fase presipiteres ved -2 0°C ved hjelp av en volumdel isopropanol. Pelleten resuspenderes i lysisbuffer. Oppløsningen ekstraheres igjen med en fenol/- kloroformblanding og RNA presipiteres med isopropanol Etter vasking av pelleten med 70% og deretter med 100% etanol resuspenderes RNA i vann.

c) Fremstilling av det kompléntære DNA.

cDNA fremstilles fra 5/xg total RNA ved anvendelse av en poly

T12 primer. Det totale RNA inkuberes i en volumdel på 30/xl buffer: 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 40 mM KC1, inneholdende 0,5 mM av hver av deoksynukleotid-trifos-fatene og 30 enheter Rnasin (Promega), i en time ved 37°C, og deretter i 10 minutter ved 50°C, og deretter i ytterligere 10 minutter ved 37°C, med 200 enheter av det reverse transkrip-taseenzym Rnase H (Gibco-BRL referanse 8064A). Reaksjonen stanses ved oppvarming i 10 minutter ved 65°C. d) Spesifikk amplifikasjon av et IL-13Ra cDNA fragment fra mus ved PCR teknikken.

Polymeriseringen gjennomføres med 6/il cDNA i 50/il sluttvolum med bufferen med følgende sammensetning: 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 2,5 mM MgCl2, 50 mM KC1, 4 dNTP 0,2 mM, 2/xg/ml av hver av de to nukleinsyreprimere og 2,5 U TAQ DNA polymerase (Beckman). Primerparene velges på sekvensen publisert av Hilton (22).

Reaksjonen gjennomføres i 30 sykluser av 1 minutt ved 94°C, 1 minutt ved 58°C, 4 minutter ved 72°C, etterfulgt av en endelig syklus på 10 minutter ved 72°C.

e) Rensing av PCR amplifikasjonsproduktet.

Etter kjøring på en 1% agarosegel (Sigma) i TAE buffer

(40 mM, Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,9) il time ved 100 volt, farges gelen i nærvær av 1/ig/ml etidiumbromid i den samme buffer. Båndet svarende til amplifikasjonsproduktet (cDNA fragment på 1027 basepar (bp) av IL-13Ro) ekstraheres ved anvendelse av et Glass Max kit (Gibco).

f) Fremstilling av proben.

25 ng av det rensede cDNA fragment på 1027 bp svarende til

IL-13Ro musereseptoren merkes med fosfor-32 med BRL random primere DNA merkesystemkit ved en spesifikk aktivitet på2,4xl0<9>dpm//ig og alternativt merkes 100 ng ved nicktranslasjon ved anvendelse av Boeringher kitet ved en spesifikk aktivitet på 4xl0<8>dpm//zg.

2) Isolering og analyse av det humane IL-13Ra cDNA.

a) Fremstilling av total RNA.

Det totale RNA ble ekstrahert fra Caki-1 celler som beskrevet

over i avsnitt lb.

b) Rensing av messenger RNA (polyA+ fraksjon).

Rensingen av polyA+ fraksjonen av RNA gjennomføres ved

anvendelse av DYNAL oligo (dT)25Dynabeads kitet (referanse 610.05) idet man følger prosedyren som er anbefalt av produsenten. Prinsippet er basert på bruk av superparamagnetiske polystyrenkuler på hvilke et poly(dT)25oligonukleotid er festet. PolyA+ fraksjonen hybridiseres med oligo(dT)25oligo-nukleotidet koblet til kulene som er fanget på en magnetisk bærer.

c) Northern blott.

5 ( ig av polyA+ messenger RNA anbringes på en 1% agarose, 8%

formaldehyd-denatureringsgel i MOPS buffer (10 mM pH 7,4,

0,5 mM EDTA). Etter migrering og overføring på en N+ Hybond membran (Amersham) i en 2 0X SSC buffer, fikseres RNAet ved oppvarming i en ovn ved 80°C under vakuum. Membranen prehybridiseres deretter i 2 timer ved 42°C i følgende buffer: 1 M NaCl, 30% formamid, 1% SDS, 5X Denharfs, 100 ug/ ml laksesperma DNA. Etter 2 timers prehybridisering hybridiseres membranen i den samme buffer med en konsentrasjon av IL-13RO museprobe fremstilt ved random priming på 2,5xl0<6>dpm/ml i 16 timer. Membranen vaskes deretter to ganger i 3 0 minutter i 2X SSC 0,1% SDS buffer ved romtemperatur og deretter i 2 timer ved 50°C i den samme buffer. Etter 4 døgns eksponering i en kassett (Molecular Dynamics), analyseres Northern blottet med et Instant Imager (Molecular Dynamics). Et dominerende transkript på 4.200 bp og en dublett på 1.500 bp og 2.000 bp detekteres i Caki-1 cellene, U3 73 og U93 7.

Karakterisering av egenskapene av det humane IL-13R0og IL-13Rp: COS-7 eller CHO cellene transfekteres i Petri skåler som beskrevet over (17). 24 timer senere trypsinbehandles cellene og dyrkes i 24 brønns plater ved en densitet på8xl0<4>celler/brønn. Etter dyrking i 48 timer ved 37°C, anvendes cellene for bindingsforsøk (analyser gjennomført in triplo viser en variasjon på mindre enn 10%) med jodert IL-13 som beskrevet (17). For transfeksjon, ble denne bevirket på COS-7 eller CHO cellene i 25 cm<2>plater ved anvendelse av 0,6 mg av forskjellige plasmider. Etter 24 timer trypsinbehandles cellemonolagene og dyrkes i 12 brønns plater ved 8xl0<4>celler/brønn. Tre døgn senere ble bindings- og konkurranseforsøk gjennomført med merket IL-13 og med umerket IL-13 og/eller IL-4. Resultatene er representative for minst tre forsøk gjennomført uavhengig av hverandre.

Sammenligning av elektroforetiske mobiliteter i EMSA for nukleærekstraktene av celler som uttrykker human IL-13Rcc og/eller IL-4R:2xl0<6>CHO celler ble platet ut på 10 cm Petri skåler. 24 timer senere transfekteres cellene med 6 ug plasmid DNA (34). Etter 48 timer inkuberes cellene ved 3 7°C i 3 0 minutter i 3 ml medium med eller uten IL-13 eller IL-4 i en konsentrasjon på 100 ng pr. ml. Cellene blir deretter vasket to ganger med en PBS-0,5 mM EDTA buffer og deretter høstet i 1,2 ml PBS. Cellene sentrifugeres deretter og celleekstraktene fremstilles som beskrevet i (35). EMSA gjennomføres deretter som beskrevet i (3 6) med 10 til 2 0/tg celleekstrakter og med en oligonukleotidprobe radioaktivt merket med<32>P (50.000-100.000cpm), en probe svarende til Ce elementet av den humane Ce promoter (37). Oligonukleotidproben som syntetiseres har følgende sekvens:

5'-GATCCACTTCCCAAGAACAGA-3'.

EKSEMPLER

Eksempel 1

Analyse av ekspresjonen av human IL- 13RP på overflaten av Caki-1 celler

Man har nylig funnet at humane renale karsinomceller uttrykte, i tillegg til reseptorene delt med IL-4 og IL-13, et stort overskudd av spesifikke IL-13 reseptorer (21). På grunnlag av disse resultater, ble en prøve av humane karsi-nomcellelinjer studert for bindingen av IL-13 som beskrevet over (17) . En spesifikk linje, Caki-1 (ATCC HTB46), som uttrykker et særlig høyt antall bindingsseter for IL-13, ble analysert i større detalj. Scatchard kurvene oppnådd fra metningsforsøk viste tilstedeværelsen av bindingsseter med en Kd på 446+50 pM og en kapasitet på 7,2xl0<4>reseptorer/celle (fig. la). I konkurrerende forsøk deplasserer umerket IL-13 fullstendig merket IL-13 på en doseavhengig måte, mens IL-4 deplasserer, med en høy affinitet, omtrent 10% av merket IL-13. Høyere konsentrasjoner av IL-4 (mere enn 100 nM) deplasserer ikke de resterende 90% av bundet IL-13 (fig. lb).

Disse resultater er i overensstemmelse med eksistensen av to seter, ett som deles av de to cytokiner, det andre spesifikt for IL-13. Forsøkene på kryssbinding med affinitet for IL-13 viste et kompleks på omtrent 70 kDa, som stemmer overens med komplekset observert i lignende kryssbindingsforsøk med IL-13 i forskjellige celletyper (17, 21). Merket IL-13 deplasseres fullstendig fra komplekset ved IL-13 men ikke ved IL-4, som er i overensstemmelse med de konkurrerende forsøk (fig. lc).

Eksempel 2

Analyse av sekresjon av IL- 6 indusert ved IL- 4 eller IL- 13 De foreliggende oppfinnere har også analysert sekresjonen indusert ved IL-4 eller IL-13 på Caki-1 celler. De to cytokiner induserer sekresjonen av tilsvarende nivåer av IL-6, og sekresjonen inhiberes ved antistoffer som er spesifikke for a kjeden av IL-4R og ved antagonisten Y124DIL-4 (fig. Id). Dette foreslår at reseptorene som deles av de to cytokiner i Caki-1 cellene er ansvarlig for induksjonen av sekresjonen av IL-6. Tilsvarende resultater observeres når fosforyleringen av proteinkomplekset IRS1/4PS (18) indusert ved IL-4 og IL-13 analyseres i nærvær eller i fravær av anti-IL-4R antistoffer og av IL-4 antagonist.

Disse resultater, sett under ett, foreslår at reseptorkomplekset IL-4/IL-13 uttrykt i Caki cellene er identisk med det som er beskrevet tidligere og at proteinet som binder IL-13 (IL-13RP) som er over-uttrykt, er en komponent av reseptoren ansvarlig for gjenkjennelsen av IL-13 i et funk-sjonelt kompleks som inkluderer IL-4R. Disse celler blir derfor anvendt som en messenger RNA kilde for kloningen av denne IL-13 bindingsentitet.

Eksempel 3

Kloning av den primære subenhet av IL- 13 reseptoren ( IL- 13RP) Strategien for kloningen og ekspresjonen som ble anvendt er beskrevet tidligere (17). Et cDNA bibliotek inneholdende 2xl0<5>rekombinante kloner ble konstruert (26) ved anvendelse av Caki-1 celler. Biblioteket ble oppdelt i batcher på 1.0 00 cDNAer hvor DNA i hver batch, i plasmidform, ble innført i COS-7 celler (29). Bindingen av merket IL-13 til de trans-ferkterte COS-7 celler gjør det mulig å identifisere batchene av kloner som koder for en IL-13 reseptor. De positive batcher ble fordelt på nytt og rescreenet inntil et enkelt klon i stand til å gjennomføre syntesen av et celleover-flateprotein i stand til binding av IL-13 er identifisert. To uavhengige IL-13RP cDNAer ble til slutt isolert. Den fullstendige nukleotidsekvens for IL-13RP cDNA og aminosyresekvensen utledet derfra er vist i fig. 2a. cDNA har en lengde på 1298 baser som utelukker poly-A halen og har en kort 3' ikke-translatert region på 106 baser. Et kanonisk AATAAA polyadenyleringssignal er på forventet sted. Den åpne leseramme mellom nukleotider 53 og 1192 definerer et polypeptid på 380 aminosyrer. Sekvensen koder for et membranprotein med et potensielt signalpeptid, et enkelt transmembrandomene og en kort intracytoplasmatisk hale.

Fire potensielle N-glykosyleringssteder er lokalisert i den ekstracellulære region. Det er viktig å merke seg at to konsensusmotiver som er betraktet som signaturer for type II familien av cytokinreseptorer (3 0) også er til stede, hvor det første er avledet fra en N-terminal disulfidbro-sløyfe-struktur, og det andre er WSXWS type motivet lokalisert i den C-terminale ende av den ekstracellulære region. Den svært korte cytoplasmatiske sekvens vil kunne forklare hvorfor det kun er reseptorkomplekset som deles av IL-4 og av IL-13 i Caki cellene som transduserer et signal i cellen.

Oppstillingsstudier viser homologier med den humane IL-5R a kjeden (51% likhet og 27% identitet, fig.2b) og, i mindre grad, med prolaktinreseptoren. Det er interessant å merke seg at IL-5R komplekset utgjøres av en a kjede som binder IL-5 men som behøver et annet protein, p kjeden delt med IL-3 og GM-CSF reseptorene, for å danne en høyaffinitetsreseptor som er i stand til å transdusere et signal (31).

Eksempel 4

Deteks jon av humane IL- 13Rp messenger RNAer i forskjellige cellelinjer

I Caki-1 cellene ble tilsvarende mengder messenger RNAer for IL-13RP og IL-4R overraskende detektert ved hjelp av Northern analyser skjønt et stort overskudd av IL-13Rp er uttrykt. Denne observasjon foreslår at det er en større translasjon av dette mRNA sammenlignet med IL-4R transkriptet og forklarer mangelen på deteksjon av IL-13RP mRNA i cellelinjene som uttrykte et lite antall IL-13R bindingssteder. RT-PCR analyser (fig. 3) viser at transkriptet funnet i Caki-1 cellene også er til stede i mindre mengder i den keratinocytiske linje A431, premyeloidcellene TF-1, de premocytiske celler U93 7 og cellelinjen B IM9. Intet transkript ble detektert i Jurkat T cellelinjen eller i pre-B NALM6 cellelinjen. Disse resultatene er i overensstemmelse med IL-13 bindingsstudiene utført på de samme linjer som beskrevet tidligere av forfåt-terene av den foreliggende oppfinnelse (17), og med de kjente biologiske IL-13 targeter.

Eksempel 5

Bindingsanalyser gjennomført på COS- 7 celler transfektert med human IL- 13Rp cDNA

COS-7 cellene transfektert med det isolerte cDNA som koder for IL-13RP binder spesifikt merket IL-13. Scatchard analysen av metningskurven viser et enkelt komponentsete med en Kd verdi på 250+3 0 pM og en maksimal bindingskapasitet på5,6xl0<5>reseptorer/celle (fig. 4a).

Affiniteten av den rekombinante reseptor er i god overensstemmelse med Kd verdien på 446 pM for IL-13RP i Caki-1 cellene og det som er blitt beskrevet for en rekke andre celler (17). Følgelig, til tross for en sekvenshomologi med a kjeden av IL-5R, opptrer den klonede reseptor annerledes da den ikke behøver en andre kjede for å rekonstituere et høy-af f initets-bindingssete .

Det er interessant å merke seg at proteinet som binder IL-15 og som nylig er blitt beskrevet likeledes har egenskapen med binding av IL-15 med en høy affinitet i fravær av de to andre komponenter av IL-15R komplekset (32).

I konkurrerende forsøke er IL-13 i stand til å inhibere bindingen av merket IL-13 til den klonede reseptor, med en inhi-beringskonstant (Ki) på 1,5+0,5 nM, mens IL-4 ikke inhiberer bindingen. Farmakologien for den klonede reseptor er derfor lik den for IL-13RP til stede i Caki-1 celler. Kryssbind-ingsforsøk viser et radioaktivt merket bånd på 70kDa. Dette bånd har den samme mobilitet som det som observeres i Caki celler så vel som i andre celler (17). Dette kompleks svarer mest sannsynlig til 60-70 kDa båndet observert i tillegg til IL-4R 140 kDa båndet i kryssbindingsforsøk gjennomført med merket IL-4. Dette vil også kunne foreslå at der eksisterer en sterk interaksjon mellom de to proteiner i det funksjon-elle reseptorkompleks. Forfatterne av den foreliggende oppfinnelse undersøkte derfor om IL-13Rp og IL-4R interagerer i cellemembranen for å rekonstituere en reseptor som tillater kryss-konkurrering mellom de to cytokiner. Resultatene av et koekspresjonsforsøk er vist i fig. 4 c og d.

Det fremgår klart at ekspresjonen av de to reseptorer, enten separat eller samtidig, resulterer i et stort antall reseptorer som spesifikt gjenkjenner den ene eller den andre av de to cytokiner. Når de uttrykkes sammen, er imidlertid et lite antall reseptorer (5 til 10%) i stand til å gjenkjenne de to cytokinene. Kotransfeksjonen av yc kjeden med IL-4R og IL-13RP bevirker ikke en økning i antallet delte bindingsseter. Disse resultater foreslår at IL-13RP og IL-4R kjeden kan interagere med hverandre i cellemembranen for å rekonstituere en reseptor for hvilken IL-13 og IL-4 kan være i konkurranse. Den lave prosentandel rekonstituerte reseptorer er et argument som favoriserer tilstedeværelsen av et annet protein (IL-13Ra) i begrensede mengder i COS cellene som er nødvendig for rekonstitueringen av reseptorkomplekset hvortil IL-13 og IL-4 binder på konkurrerende måte.

De resultater som oppnås i transfeksjonsforsøkene med yc kjeden viser at dette protein ikke er den begrensende faktor som foreslått tidligere (15). Denne konklusjon er også understøttet av fraværet av yc messenger RNA i Caki-1 cellene (21) .

En annen mulig grunn som forklarer det lave antallet rekonstituerte reseptorer er forekomsten av en ukorrekt støkio-metri av de to proteiner i cellemembranen. Kotransfeksjoner ved anvendelse av forskjellige relative mengder av IL-4R og IL-13RP viser imidlertid ikke en stor forskjell i antallet rekonstituerte reseptorer. Muligheten av at en annen IL-13R med en større kapasitet til å interagere med IL-4R eksisterer ble bekreftet i mus (22) og i menneske ved isolering av IL-13Ra cDNA (konf. eksempel 7). Det skal bemerkes at ekspresjonen av yc øker bindingen av IL-4 som beskrevet tidligere (19) men reduserer bindingen av IL-13, noe som foreslår en kompleks interaksjon mellom de forskjellige kjeder.

Eksempel 6

Studium av inhiberingen av bindingen av IL-13 til dens membranreseptor ved en reseptor i oppløselig form

Resultatene i transient ekspresjon (fig. 5) eller på stabile linjer (fig. 6) er beskrevet.

De to cDNA sekvenser som koder for IL-13RP og IL-13RPs inn-føres i vektoren p7055 i stedet for IL-2 cDNA (33) . De oppnådde plasmider betegnes henholdsvis 2036 og 2034.

a) Transient ekspresjon.

CHO cellene inokuleres i 12 brønns plater ved 3xl0<5>celler/-

brønn og transfekteres den neste dag ved hjelp av DEAE-Dextran metoden som for COS cellene, enten med plasmid 2 03 6 eller 2 034, eller med det tomme plasmid pSE-1 som kontroll.

Cellene dyrkes i tre døgn for å tillate akkumulering av IL-13Rps i supernatanten til cellene transfektert med plasmidet 2 034 og god ekspresjon av IL-13RP i membranen til cellene transfektert med plasmidet 2036.

Supernatanten til cellene transfektert med IL-13Rps (2034) eller den negative kontroll (tom pSE-1) samles deretter og cellene transfektert med IL-13RP anvendes til å studere inhiberingen av bindingen av IL-13.

Bindingen av IL-13 til overflaten av CHO cellene som uttrykker IL-13RP (2036) måles i nærvær eller fravær av disse urene supernatanter fortynnet en til to med radioliganden eller i nærvær av overskudd av ikke-radioaktivt IL-13 (NSB). Bindingen gjennomføres på hele celler i et sluttvolum på

500 ml med 3 00 pM radioligand, in triplo.

b) Stabile linjer.

To stabile transformerte CHO linjer oppnås ved transfeksjon

med kodesekvensene av den komplette IL-13Rp (polypeptid på 380 rester) eller av IL-13RP i oppløselig form (IL-13RPs, trunkert polypeptid svarende til rester 1 til 337 i IL-13RP). Disse sekvenser innføres i vektoren p7055.

CHO-DHFR" cellene transfekteres med plasmidene 2036 (IL-13RP) og 2034 (IL-13RPs) og de rekombinante kloner velges som beskrevet tidligere (33).

Ett av klonene CHO-IL-13RP (CHO 2036) som oppnås med 2 til5xl0<5>seter pr. celle, inokuleres i en 12 brønns plate med en densitet på IO<5>celler pr. brønn og cellene anvendes to døgn senere for bindingsforsøk i nærvær eller fravær av IL-13RPs.

For dette inokuleres CHO-IL-13Rps (CHO 2034) kloner i 6 cm skåler, in triplo, ved 5xl0<5>celler pr. skål. Etter 3 døgns akkumulering i dyrkingsmediet, samles mediet (5 ml pr. skål) for IL-13 bindingsinhiberingstudier på IL-13RP av CHO 2036 klonet. På samme måte blir supernatanten fra CHO celler som ikke uttrykker det oppløselige IL-13RP samlet.

Bindingen av IL-13 på overflaten av CHO 2 036-22 klonet måles i nærvær eller fravær av disse urene supernatanter fortynnet en til to med radioliganden, eller i nærvær av et overskudd av ikke-radioaktivt merket IL-13 (NSB). Bindingen gjennom-føres in triplo, på hele celler, i et volum på 500 ml med 3 00 pM radioligand.

Histogrammene i figurene 5 og 6 representerer inhiberingen av bindingen av IL-13 på IL-13RP ved IL-13RPs. Inhibering av bindingen av IL-13 til dets reseptor kan observeres på en rekke kloner.

Eksempel 7

Kloning av den humane IL- 13Ra reseptor

a) Fremstilling av cDNA biblioteket fra polyA+ messenger RNAer av Caki-1 celler.

Med utgangspunkt i 0,5/xg polyA+ messenger RNA, fremstilles enkelttrådet komplementært DNA merket med [<32>P]dCTP (det komplementære DNA som oppnås har en spesifikk aktivitet på 3.000 dpm/ng) med den syntetiske primer som har følgende sekvens (omfattende et BamHI sete):

i et volum på 30/il av følgende buffer: 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 40 mM KC1, inneholdende 0,5 mM av hver av deoksynukleinsyretrifosfåtene,30/iCi [a<32>P]dCTP og 30 U Rnasin (Promega). Etter inkubasjon i en time ved 37°C og deretter 10 minutter ved 50°C og deretter i ytterligere 10 minutter ved 37°C med 200 enheter av det reverse transkrip-taseenzym Rnase H (Gibco -BRL) , tilsettes 4/il EDTA. RNA templatet nedbrytes deretter ved tilsetning av 6/il av en 2 N NaOH oppløsning og man inkuberer i 5 minutter ved 65°C. For å fjerne den syntetiske primer, blir det komplementære DNA renset på en 1 ml Sephacryl S400 kolonne (Pharmacia), ekvilibrert i TE buffer. De første to radioaktive fraksjoner kombineres og presipiteres med en 1/10 volumdel av en 10 M ammoniumacetatoppløsning og 2,5 volumdeler etanol, dette etter ekstraksjon med kloroform. cDNA utvides deretter i 5' retningen ved tilsetning av en dG homopolymer hale med 2 0 enheter av enzymet terminal transferase (Pharmacia 27073001). Deretter gjennomføres inkubasjon i 20/il buffer med følgende sammensetning: 3 0 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM koboltklorid, 140 mM kakodylsyre, 0,1 mM DTT, 1 mM dGTP, i 15 minutter ved 37°C, og deretter tilsettes 2/il 0,5 M EDTA. En videre behandling med natriumhydroksyd gjennomføres uten oppvarming, etterfulgt av en ny rensing på en S400 kolonne, ekstraksjon med kloroform og presipitering med etanol. Pelleten oppløses i 33/il TE buffer. Det neste trinn omfatter paring av kloningsvektoren pT7T3-18 gjennom hvilken en homopolymer dC hale er blitt addert på forhånd etter kutting med Pstl, cDNA og adaptoren. cDNA (33/il) bringes i kontakt med 75 ng av vektoren pT7/T3-18 (5/il), 120 ng adaptor (1/il) med følgende sekvens (omfattende et Apal sete), 10/il av en 200 mM NaCl oppløsning og blandingen inkuberes deretter i 5 minutter ved 65°C og deretter avkjøles reak-sjonsblandingen til romtemperatur. Det neste trinn omfatter ligeringen av kloningsvektoren og den enkelttrådede cDNA i et reaksjonsvolum på 100/il med 32,5 enheter av enzymet T4 fag DNA ligase (Pharmacia) over natten ved 15°C i en buffer med sammensetning: 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP.

Proteinene fjernes deretter ved ekstraksjon med fenol etterfulgt av ekstraksjon med kloroform og deretter tilsettes en 1/10 volumdel av 10 mM ammoniumacetatoppløsning og 2,5 volumdeler etanol. Blandingen sentrifugeres, pelleten tas opp i bufferen med sammensetningen: 33 mM Tris-acetat pH 7,9,

62,5 mM kaliumacetat, 1 mM magnesiumacetat og 1 mM DTT, den andre cDNA tråd syntetiseres i et volum på 3 0 fil med 3 0 enheter av enzymet T4 fag DNA polymerase (Pharmacia) og en blanding av1mM av de fire deoksynukleotidtrifosfater så vel som to enheter av proteinet av T4 fag genet 32 (Pharmacia) i en time ved 3 7°C. Blandingen ekstraheres med fenol og spor fjernes ved avsetning på en P10 kolonne (Biogel P10-200-400 mesh - referanse 15011050 - Biorad).

Det siste trinn omfatter transformering av E. Coli MC 1061 celler ved elektroporering av det rekombinante DNA ved anvendelse av et Biorad Gene Pulser apparat anvendt ved 2,5 kV under de betingelser som anbefales av produsenten, og deretter dyrkes bakteriene i en time i LB medium med sammensetningen: baktotrypton 10 g/l, gjærekstrakt 5 g/l, NaCl 10 g/l.

Antallet oppnådde uavhengige kloner bestemmes ved utplating av en 1/1.000 fortynning fra transformasjonen etter en times inkubasjon på en plate av LB medium supplert med 1,5% agar (vekt/volum) og med 100 ug/ ml ampicillin i det etterfølgende betegnet LB agarmedium.

Antallet oppnådde uavhengige kloner er 1 million,

b) Screening av cDNA biblioteket.

Hele biblioteket ble utplatet på agarmedium (Petri skåler med

diameter 150 mm) belagt med Biodyne A membraner (PALL referanse BNNG 132). Etter henstand over natten ved 37°C over-føres klonene ved kontakt på de nye membraner. De sistnevnte behandles ved at de anbringes på et Wathman 3 MM papir som er impregnert med følgende oppløsninger: 0,5 N NaOH, 1,5 M NaCl i 5 minutter og deretter 0,5 Tris-HCl pH 8, 1,5 M NaCl i 5

minutter. Etter behandling med proteinase K i den følgende

buffer, 10 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,1% SDS, 100/jg/ml proteinase K i 30 minutter ved 37°C, vaskes membranene inngående i 2X SSC buffer (natriumcitrat-NaCl), og tørkes deretter i en ovn under vakuum ved 80°C i 20 minutter.

c) Prehybridisering og hybridisering av membranene. Membranene prehybridiseres i 2 timer ved 42°C i følgende

buffer: 1 mM NaCl, 3 0% formamid, 1% SDS, 5X Denhart's 100/xg/ml laksesperma DNA. Etter 2 timers prehybridisering, hybridiseres membranene i den samme buffer med en konsentrasjon av IL-13Ra probe fra mus fremstilt ved nicktranslasjon av 2,5xl0<6>dpm/ml, i 16 timer. Membranene vaskes to ganger i 30 minutter i 2X SSC, 0,1% SDS buffer ved romtemperatur og deretter i to timer ved 50°C i den samme buffer. Etter eksponering ved -8°C i nærvær av en Kodak X-OMAT film over natten, detekteres en rekke positive kloner. d) Sekvensering av et humant IL-13Ro klon og analyse av sekvensen.

Sekvensen oppnås ved anvendelse av et kit fra Applied Bio-system (referanse 401628). Den komplette nukleinsyresekvens av IL-13Rcc cDNA og aminosyresekvensen utledet derfra er vist i fig. 7. cDNA har 3999 baser med utelukkelse av poly-A halen og har en lang ikke-translatert 3' region på 2145 baser.

Et kanonisk polyadenyleringssignal eksisterer på det for-ventede sted. Den åpne leseramme mellom nukleotidet 34 og1851definerer et polypeptid på 427 aminosyrer. Sekvensen koder for et membranprotein med et potensielt signalpeptid og et enkelt transmembrandomene og en kort intracytoplasmatisk region.

10 potensielle glykosyleringssteder er lokalisert i den ekstracellulære region. Det er viktig å merke seg at to konsensusmotiver betraktet som signaturer av type II familien av cytokinreseptorer også er til stede, idet det første er avledet fra en N-terminal disulfidbro-sløyfestruktur, og den andre er WSXWS type motivet lokalisert i den C-terminale ende av den ekstracellulære region.

Eksempel 8

Bindin gsanalyse gjennomført på COS- 3 eller CHO celler transfektert med human IL- 13Rg cDNA

CHO cellene transfektert med det isolerte cDNA som koder for IL-13Ra binder spesifikt merket IL-13. Scatchard analyse av metningskurven viser et enkelkompbnentsete med en Kd verdi på 4,5+0,4 nM og en maksimum bindingskapasitet på 26.000 reseptorer/celle (figurene 8C og 8G).

Resultatene av koekspresjonsforsøkene er vist i figurene 8D og 8H.

Analyse av resultatene i fig. 8C viser at IL-13Ra er godt uttrykt i klonet 2036 av CHO cellene. Det skal bemerkes at IL-4R deplasserer 60% av bindingen av IL-13 i CHO cellene kotransfektert med IL-4R og IL-13Roc cDNA (fig. 8H) men under hensyntagen til en Kd på 7,5 nM for IL-13Rcc vil der være 10 ganger så mange IL-13Ra seter som IL-4R seter.

CHO-hIL4R cellene (human IL-4R) som uttrykkes hIL-4R som er transfektert med det cDNA som koder for hIL-13Ra binder spesifikt merket IL-13.

Scatchard analysen av metningskurven viser klart 2 komponent-seter, ett med høy affinitet med en Kd verdi på 23+8,9 pM og en maksimal bindingskapasitet på 28.000 seter/celle og den andre med lav affinitet med en Kd verdi på 4,2+1,4 nM og en maksimal bindingskapasitet på 150.000 seter/celle (fig. 8D).

Det andre sete som erkarakteriserthar den samme affinitet som hIL-13Rcc (human IL-13Ra) uttrykt alene og svarer til de ikke-assosierte IL-13Rcc kjeder fordi de er uttrykt i en større mengde enn hIL-4R.

Disse høyaffinitetsreseptorer som er rekonstituert i nærvær av 2 hIL-l3Rct og hIL-4R kjedene er i stand til å gjenkjenne de 2 cytokiner (figurer 8D og 8H). Dette er enda klarere på COS/pSEl cellene som ko-uttrykker 2 hIL-13Ra og hIL-4R kjedene i en sammenlignbar mengde hvor IL-4 deplasserer all IL-13 bindingen.

Affiniteten av den rekombinante humane IL-13Ra er sammenlignbar med den som er beskrevet for IL-13Ra musereseptoren (2-10 nM) (ref. 22).

I motsetning til hIL-13RP som er beskrevet tidligere, utgjør human IL-13Rcc ikke alene et høyaf f initets-bindingssete. IL-13RO og IL-4R interagerer derfor i cellemembranen for å rekonstituere en høyaffinitetsreseptor.

Eksempel 9

Aktivering av STAT proteinene ved IL- 13 og IL- 4 i CHO cellene som ko- uttrykker hIL- 13Ra og hIL- 4R

I humane PBMC celler aktiverer hIL-4 og IL-13 2 tryosin-kinaser av janusfamilien, Jakl og Jak2 som fosforylerer en latent transkripsjonsfaktor, STAT6. Denne aktiverte faktor går inn i kjernen og binder til spesifikke elementer i promotorene til gener regulert ved IL-4.

Man velger Ce elementet av den humane Ce promotoren som probe i en elektroforese-mobilitets-svitsj-analyse (EMSA) for å demonstrere aktiveringen, ved IL-13, av en bindningsfaktor som er lik STAT6.

Kjerneekstraktene fra CHO cellene som uttrykker IL-13R alene, IL-4R alene eller de 2 kjedene sammen, stimulert med

100 ng/ml IL-13 eller IL-4 i 30 min. ved 37°C, inkuberes med det radioaktivt merkede Ce elementet.

Kjerneekstraktene av cellene som ko-uttrykker hIL-13Rcc og hIL-4R danner et kompleks med den samme mobilitet i EMSA enten cellene er indusert med IL-4 eller IL-13 (se fig. 9). På den annen side, med de cellene som uttrykker den ene eller den andre kjede alene, detekteres intet kompleks.

I CHO cellene som uttrykker hIL-13Ra og hIL-4Ro, initierer derfor IL-13 og IL-4 den samme signalkaskade.

Kloningen av IL-13RP og IL-13Ra som beskrevet her gjør det mulig å forbedre kunnskapen vedrørende de faktorer som er involvert i responsene spesifikt indusert ved IL-13 sammenlignet med responsene indusert ved IL-4. Den gjør det i tillegg mulig å ha et verktøy for å studere reguleringen av ekspresjonen av reseptoren under normale og patologiske forhold hvor IL-13 spiller en nøkkelrolle.

Dessuten gjør tilgjengeligheten av cDNA det mulig å forenkle kloningen av andre proteiner som er nødvendige for rekonstitueringen av et IL-4/IL-13 reseptorkompleks og er også anvendbar for fremstillingen eller den rasjonelle utforming av nye medisinske produkter i stand til å være spesifikke antagonister av aktivitetene av IL-13.

REFERANSER:

1. Minty, A. et al., Nature, 1993, 362, 248-250. 2. McKenzie, A.N. et al.,Proe. Nati. Ac ad. Sei. U.S. A, 1993, 90, 3735-3739. 3. Defrance, T. et al., J. Exp. Med., 1994, 179, 135--143. 4. Punnonen, J. et al.. Proe. Nati. Acad.Sci. (USA), 1993, 90, 3730-3734. 5. Fior, R. et al., Eur. Cytokina Network, 1994, 5, 593-600. 6. Huzio, M. R. F. et al., Blood, 1994, 83, 1738-1743. 7. De Waal Malefyt, R. et al., J. immunol, 1993, 151, 6370-6381. 8. Doyle, A. et al., Eur. J. Inaminol. 1994, 24, 1441-1445. 9 i Mont aner, L.J. et al., J. Exp. Med., 1993, 178, 743-747. 10. Sozzani, F. et al., J. Biol. Chem., 1995, 270, 5084-5088. 11. Herbert, J.M. et al., Febs Lett., 1993, 122, 268-270. 12. Derocq, J.M. et al.:, Febs Lett. 1994, 343, 32-36. 13. Zurawski, O. et al., Immunol. Today, 1994, 15, 19-26. 14. Interlaukin-13 for Cytokinea in Health and Diaeaae. Eds D.G. Remick and J.S. Frie, Marcel Decker, N.Y. 1996. 15. Zurawski S.M. et al., Embo Journal, 1993, 12, 2663-2670. 16. Aversa, G. et al., J. Exp. Med., 1993, 178, 2213-2218. 17. Vita, N. et al., Biol. Chem., 1995, 270, 3512-3517. 18. Lefort, S. et al.,Faba Lett., 1995, 366, 122-126. 19. Kondo, M. et al., Science, 1993, 262, 1874-1883. 20. Russell, S.M. et al., Science, 1993, 262, 1880-1883. 21. Obiri, N. et al., J. Biol. Cnea., 1995, 270, 8797-8804. 22. Hilton,' D.J. et al., Proe. Nati. Acad; Sei. USA, 1996,' 93, 497-501. 23. Callard, R.E. et al;, Ianminplogy Today, 1996, 17, 3 108-110. 24. Deveraux, J. et al., Nucleic Acida Res., 1984, 12, 387-395. 25. Chomczynski, P. et al., N. Anal. Biochem., 1987, 162, 156-159. 26. Caput, D. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 1986, 83, 1670-1674. .27. Minty, A. et al., Eur. Cytokine Network, 1993, 4, 99-110 28. Labit Le Bouteiller, C. et al., J. of Immunol.

Methods, 1995, 181, 1, 29-36. 29. Seed, B. et al.. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 1987,. 84, 3365-3369. 30.Bazan, J.F. et al.,. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 1990, 87, 6934-6938. 31. Honjo, T. et ai., Current Opinion in.Cali Biology, 1991, 1, 201-203. 32. Giri, J.G. et . al., Embo Journal, 1993, 14, 3654-3663.

33. Miloux, B. et al., Gene, 1994, 149, 341-344.

34. Sampayrac, L.M. etr. al. , PNAS USA, 1981, 78, 7575-7578. 35. "Jiansr, S-W et al., Nucleic Acid Rea., 1995, 23, 3607-3608. 36. KShler, I. et al., FEBS Letters, 1994, 345, 187-192. 37. Seidel, H.M. et al., PNAS USA, 1995, 92, 3041-3045.

Claims (30)

1. Renset polypeptid, karakterisert vedat det omfatter en aminosyresekvens valgt blant: a) sekvensen SEQ ID No. 2, b) en hvilken som helst sekvens avledet fra SEQ ID No. 2 ved mutasjon, delesjon, addisjon, substitusjon og/eller kjemisk modifikasjon av en eller av et begrenset antall aminosyrer, hvori nevnte polypeptid med sekvens avledet fra SEQ ID No. 2 har den samme biologiske aktivitet som polypeptidet omfattende aminosyresekvensen SEQ ID No. 2.

2. Polypeptid som angitt i krav 1,karakterisert vedat det omfatter aminosyresekvensen SEQ ID No. 2.

3. Polypeptid som angitt i krav 1,karakterisert vedat det er polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 2 hvori de 8 C-terminale restene er substituert med de etterfølgende 6 rester: VRCVTL.

4. Polypeptid som angitt i krav 1,karakterisert vedat det er en oppløselig form som strekker seg opp til rest 343.

5. Polypeptid som angitt i krav 1,karakterisert vedat det er en oppløselig form som strekker seg opp til rest 337.

6. Isolert nukleinsyresekvens, karakterisert vedat den koder for et polypeptid som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 5.

7. Isolert nukleinsyresekvens som angitt i krav 6,karakterisert vedat den er valgt fra: (a) sekvensen SEQ ID No. 1, (b) nukleinsyresekvensene som er i stand til å hybridisere med sekvensen SEQ ID No. 1 og som koder for et polypeptid med en IL-13 p-reseptor aktivitet, (c) nukleinsyresekvensene avledet fra sekvenser a) og b) som et resultat av degenereringen av den genetiske koden.

8. Nukleinsyresekvens som angitt i krav 7,karakterisert vedat den omfatter eller består av en serie av nukleotider som strekker seg fra nukleotid nr. 1 til nukleotid 1081, og foretrukket til nukleotid 1063 på sekvensen SEQ ID No. 1.

9. Renset polypeptid, karakterisert vedat det omfatter sekvensen SEQ ID No. 4.

10. Renset polypeptid, karakterisert vedat det er en oppløselig form av polypeptidet med sekvens SEQ ID No. 4 som strekker seg opp til rest 343 og foretrukket opp til restene mellom 336 og 342.

11. Isolert nukleinsyresekvens, karakterisert vedat den koder for et polypeptid som angitt i krav 9 eller 10.

12. Isolert nukleinsyresekvens som angitt i krav 11,karakterisert vedat den valgt fra: (a) sekvensen SEQ ID No. 3, (b) nukleinsyresekvensene avledet fra sekvens a) som et resultat av degenereringen av den genetiske koden.

13. Nukleinsyresekvens som angitt i krav 11,karakterisert vedat den omfatter eller består av en serie av nukleotider som strekker seg fra nukleotid 1 til nukleotid 1059, og foretrukket til nukleotidene mellom nr. 1041 og 1056 på sekvensen SEQ ID No. 3.

14. Klonings- og/eller ekspresjonsvektor, karakterisert vedat den inneholder en nukleinsyresekvens som angitt i ett eller flere av kravene 6 til 8 og 11 til 13.

15. vektor som angitt i krav 14,karakterisert vedat den er plasmidet PSE-1.

16. Vertscelle, karakterisert vedat den er transfektert med en vektor som angitt i krav 14 eller 15.

17.Transfektert vertscelle som angitt i krav 16,karakterisert vedat den er en celle fra cellelinjen COS-7, COS-3 eller CHO.

18. Nukleotid probe som hybridiserer spesifikt med hvilken som helst av sekvensene som angitt i krav 6 til 8, de komplementære sekvensene derav eller de tilsvarende budbringer RNA'er, karakterisert vedat den inkluderer hele sekvensen SEQ ID No. 1 eller den komplementære tråden derav.

19.Nukleotid probe som hybridiserer spesifikt med hvilken som helst av sekvensene som angitt i krav 11 til 13, de komplementære sekvensene derav eller tilsvarende budbringer RNA'er, karakterisert vedat den inkluderer hele sekvensen SEQ ID No. 3 eller den komplementære tråden derav.

20. Antisense-sekvens som er i stand til å i det minste delvis inhibere produksjon av polypeptidet som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 5 og 9 til 10,karakterisert vedat den er valgt fra sekvensene som utgjør leserammen som koder for et polypeptid som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 5 og 9 til 10 på transkripsjonsnivået.

21. Anvendelse av en nukleinsyresekvens som angitt i ett eller flere av kravene 6 til 8 og 11 til 13 for fremstilling av et rekombinant polypeptid som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 5 og 9 til 10.

22. Fremgangsmåte for å fremstille et rekombinant IL-13 reseptor polypeptid, karakterisert vedat transfekterte celler som angitt i krav 16 eller 17 dyrkes under betingelser som tillater ekspresjonen av et rekombinant polypeptid som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 5 eller 9 til 10 og hvor nevnte rekombinante polypeptid utvinnes.

23. Monoklonale eller polyklonale antistoffer, konjugerte antistoffer eller fragmenter derav,karakterisert vedat de er i stand til spesifikt å gjenkjenne et polypeptid som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 5 og 9 til 10.

24. Monoklonale eller polyklonale antistoffer, konjugerte antistoffer eller fragmenter derav,karakterisert vedat de nevnte antistoffer er merkede antistoffer, kimære antistoffer, humaniserte antistoffer, eller Fab eller F(ab')2fragmenter som er i stand til å spesifikt gjenkjenne et polypeptid som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 5 og 9 til10.

25. Farmasøytisk preparat, karakterisert vedat det som aktivt prinsipp omfatter et polypeptid som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 5 eller 9 til 10.

26. Farmasøytisk preparat som angitt i det foregående krav,karakterisert vedat det omfatter et polypeptid som angitt i ett eller flere av kravene 4, 5 eller 10.

27. Anvendelse av et polypeptid som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 5 for å screene midler som er i stand til å modifisere aktiviteten av IL-13RP.

28. Anvendelse av et polypeptid som angitt i krav 9 eller 10 for å screene midler som er i stand til å modifisere aktiviteten av IL-l3Ra.

29. Anvendelse av et polypeptid som angitt i krav 4, 5 eller10for å syntetisere et IL-13 antagonistisk legemiddel som er egnet for å behandle tilstander som responderer på en IL-13 antagonistisk effekt.

30. Anvendelse av et polypeptid som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 5 eller 9 til 10 for å fremstille et farma-søytisk preparat som kan anvendes for å regulere immunologiske og inflammatoriske mekanismer produsert ved IL-13 .