JP2000512492A

JP2000512492A - 造血サイトカイン受容体

Info

Publication number: JP2000512492A
Application number: JP09542641A
Authority: JP
Inventors: ダブリュバーンガートナー，ジェームズ; シー．フォスター，ドナルド; ジェイ．グラント，フランシス; エー．スプレッシャー，シンディ
Original assignee: ザイモジェネティクス，インコーポレイティド
Priority date: 1996-05-23
Filing date: 1997-05-19
Publication date: 2000-09-26
Also published as: US5925735A; US6080406A; EP1555318A2; EP1555318A3; DE69738066D1; AU3009397A; EP0910635B1; ATE371735T1; EP0910635A1; WO1997044455A1; US5792850A; DE69738066T2

Abstract

(57)【要約】新規な受容体ポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド並びに関連する組成物及び方法が開示されている。前記ポリペプチドは、Ｂ−細胞及びＴ−細胞を含むリンパ組織中に高レベルで発現される細胞−表面受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む。前記ポリペプチドは、インビトロ及びインビボで、リンパ球及び骨髄細胞の増殖及び／または生長を刺激するリガンドを検出するための方法において用いることができる。リガンド結合受容体ポリペプチドもインビトロ及びインビボでリガンド活性を阻止するのにも用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】造血サイトカイン受容体発明の背景多細胞生物の細胞の増殖及び分化は、ホルモン及びポリペプチド成長因子により制御される。それらの拡散可能分子は、細胞及び器官を形成し、そして損傷された組織を修復するために細胞のお互いとの伝達及び協調しての作用を可能にする。ホルモン及び成長因子の例は、ステロイドホルモン（たとえばエストロゲン、テストステロン）、副甲状腺ホルモン、卵胞刺激ホルモン、インターロイキン、血小板由来成長因子（PDGF）、上皮成長因子(EGF)、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、エクトロポエチン(EPO)及びカルシトニンを包含する。ホルモン及び成長因子は、受容体に結合することによって細胞代謝に影響を及ぼす。受容体は、細胞内のシグナル経路、たとえば第２メッセンジャーシステムに結合される膜内在性タンパク質であり得る。他の種類の受容体は、可溶性分子、たとえば転写因子である。サイトカイン、すなわち細胞の増殖及び／又は分化を促進する分子のための受容体が特に興味あるものである。サイトカインの例は、赤血球細胞の発育を刺激するエリトロポエチン(EPO)；巨核球系統の細胞の発育を刺激するトロンボポエチン(TPO)；及び好中球の発育を刺激する顆粒球−コロニー刺激因子(G-CSF)を包含する。それらのサイトカインは、貧血症を有するか又は癌のための化学療法を受ける患者における正常な血液細胞レベルを回復することにおい４て有用である。それらのサイトカインの明らかにされたインビボ活性は、他のサイトカイン、サイトカインアゴニスト、及びサイトカインアンタゴニストの莫大な臨床学的可能性、及びそれらの必要性を示す。本発明は、新規の造血サイトカイン受容体、及び関連する組成物及び方法を提供することによってそれらの必要性を取り組んでいる。発明の要約本発明は、新規受容体ポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び関連する組成物及び方法を提供する。１つの観点においては、（ａ）配列番号３の残基33〜235、（ｂ）（ａ）の対立遺伝子変異体、及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に対して少なくとも60％の同一性を有する配列から成る群から選択されたアミノ酸の配列を含んで成るリガンド− 結合受容体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを供給する。１つの態様においては、前記ポリペプチドはさらに、フィブロネクチン型IIIドメインを含んで成る。関連する態様においては、前記ポリペプチドは、配列番号３の残基33〜514、配列番号７の残基25〜508、又はそれらの配列の１つの対立遺伝子変異体を含んで成る。もう１つの態様においては、前記ポリペプチドはさらに、トランスメンブランドメイン、たとえば配列番号３の残基515〜540、配列番号７の残基509〜533、又はそれらの配列の１つの対立遺伝子変異体を含んで成る。前記ポリペプチドはさらに、細胞内ドメインを包含することができる。好ましい細胞内ドメインは、配列番号３の残基541〜578、配列番号５の残基541〜636、配列番号７の残基534〜623、及びそれらの配列の対立遺伝子変異体を包含する。さらなる態様においては、前記ポリペプチドは、（ａ）配列番号３の残基33〜57 8、（ｂ）配列番号５の残基33〜636、（ｃ）配列番号７の残基25〜 623、又は（ｄ）（ａ），（ｂ）又は（ｃ）の対立遺伝子変異体を含んで成る。さらなる態様においては、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２のヌクレオチド23からヌクレオチド1756に示される、配列番号４のヌクレオチド139からヌクレオチド2046に示される、又は配列番号６のヌクレオチド11からヌクレオチド1879に示されるようなヌクレオチドの配列を含んで成るDNAである。上記に開示される単離されたポリヌクレオチドによりコードされるポリヌクレオチドはさらに、親和性標識を含んで成る。本発明の一定の態様においては、親和性標識は、ポリヒスチジン、プロテインＡ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、サブスタンスＰ、マルトース結合タンパク質、又は免疫グロブリンＨ鎖不変領域である。本発明の第２の観点においては、転写プロモーター、上記に開示されるような分泌ペプチド及びリガンド−結合受容体ポリペプチドをコードするDNAセグメント、及び転写ターミネーターを含んで成る発現ベクターが供給され、ここで前記プロモーター、DNAセグメント及びターミネーターは操作可能的に連結されている。１つの態様において、リガンド−結合受容体ポリペプチドはキメラポリペプチドであり、ここで前記キメラポリペプチドはペプチド結合により連結される第１部分及び第２部分から実質的に成る。キメラポリペプチドの第１部分は、（ａ）配列番号３に示されるような受容体ポリペプチド、（ｂ）（ａ）の対立遺伝子変異体、及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に対して少なくとも60％の同一性を有する受容体ポリペプチドから成る群から選択された受容体ポリペプチドのリガンド結合ドメインであり、そしてトランスメンブラン及び細胞内ポリペプチドセグメントを実質的に有さず；そして第２部分は上記に開示されるような親和性標識から実質的に成る。本発明の第３の観点においては、上記に開示されるような発現ベクターを導入されている、DNAセグメントによりコードされる受容体ポリペプチドを発現する培養された細胞が提供される。本発明の１つの態様においては、前記細胞はさらに、gp130又は白血病阻害因子(LIF)受容体を発現することができる。本発明のもう１つの態様においては、前記細胞は、外因的に供給される増殖のための造血成長因子に依存する。第４の観点においては、本発明は、（ａ）配列番号３の残基33〜235、（ｂ）（ａ）の対立遺伝子変異体、及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に対して少なくとも60 ％の同一性を有する配列から成る群から選択されたセグメントを含んで成る単離されたポリペプチドを供給し、ここで前記ポリペプチドは、造血受容体に通常関連するトランスメンブラン及び細胞内ドメインを実質的に有さない。１つの態様においては、前記ポリペプチドはさらに、親和性標識、たとえばポリヒスチジン、プロテインＡ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、サブスタンスＰ、マルトース結合タンパク質、又は免疫グロブリンFcポリペプチドを含んで成る。もう１つの態様においては、前記ポリペプチドは固体支持体上に固定される。さらなる態様においては、前記ポリペプチドは、ペプチド結合により連結される第１部分及び第２部分から実質的に成るキメラポリペプチドであり、ここで前記第１部分は（ａ）配列番号３に示されるような受容体ポリペプチド、（ｂ）（ａ）の対立遺伝子変異体、及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に対して少なくとも60％の同一性を有する受容体ポリペプチドから成る群から選択された受容体ポリペプチドのリガンド結合ドメインから実質的に成り、そして前記第２部分は親和性標識から実質的に成る。本発明の第４の観点においては、試験サンプルと上記で開示されたようなポリペプチドとを接触せしめ、そして前記サンプルにおけるリガンドに対する前記ポリペプチドの結合を検出することを含んで成る、試験サンプル内のリガンドを検出するための方法が提供される。１つの態様においては、前記ポリペプチドは、培養された細胞内で膜結合され、そして前記検出段階は培養された細胞における生物学的応答を測定することを含んで成る。関連する態様においては、前記生物学的応答は、細胞増殖、又はレポーター遺伝子の転写の活性化である。代りの態様においては、前記ポリペプチドは固体支持体上に固定されている。本発明はさらに、上記に開示されるようなポリペプチドに対して特異的に結合する抗体を提供する。本発明のそれらの及び他の観点は、次の発明の詳細な説明及び添付図面から明らかになるであろう。図面の簡単な説明図面は、サイトカイン受容体における保存された構造特徴を示す。発明の詳細な説明用語“対立遺伝子変異体”とは、同じ染色体遺伝子座を占有する遺伝子の複数の二者択一形のいづれかを示すために本明細書において使用される。対立遺伝子変異は、突然変異を通して天然において生じ、そして集団内での表現型多型現象をもたらす。遺伝子突然変異はサイレントであり（コードされたポリペプチドにおける変化は存在しない）、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語対立遺伝子変異体はまた、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を示すためにも使用され得る。用語“発現ベクター”とは、その転写を供給する追加のセグメントに対して操作可能的に連結される興味あるポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る、線状又は環状DNA分子を示すために使用される。そのような追加のセグメントは、プロモーター及びターミネーター配列を包含し、そしてまた、複製の１又は複数の起点、１又は複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、等も包含することができる。発現ベクターは一般的に、プラスミド又はウィルスDNAに起因し、又は両者の要素を含むことができる。用語“単離された”とは、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドがその天然の遺伝子的環境から除去されており、そして従って、他の外来又は所望しないコード配列を有さず、そして遺伝子的に構築されたタンパク質生成システム内での使用のために適切な形で存在することを示す。 “操作可能的に連結された”とは、DNAセグメントを言及する場合、それらのセグメントがそれらの意図された目的のために協調して機能し、たとえば転写がプロモーターにおいて開始し、そしてコードセグメントを通してターミネーターに進行するよう前記セグメントが配列されることを示唆する。 “ポリヌクレオチド”は、５’末端から３’末端に読取られるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーである。ポリヌクレオチドはRNA及びDNAを包含し、そして天然源から単離され、インビトロで合成され、又は天然及び合成分子の組合せから調製され得る。用語“プロモーター”は、RNAポリメラーゼの結合及び転写の開始を提供するD NA配列を含む遺伝子の部分を示すために、その技術４−認識された意味のために本明細書において使用される。プロモーター配列は通常、遺伝子の５’非コード領域に見出されるが、しかし必ずしもそうではない。用語“受容体”とは、生物活性分子（“リガンド”）に結合し、そして細胞上のリガンドの効果を仲介する、細胞関連タンパク質又はそのようなタンパク質のポリペプチドサブユニットを示すために本明細書において使用される。受容体へのリガンドの結合は、細胞におけるエフェクタードメインと他の分子との間での相互作用を引き起こす受容体の形状変化（及び多くの場合、受容体多重結合化、すなわち同一の又は異なった受容体サブユニットの会合）をもたらす。それらの相互作用は、細胞の代謝の変更を導びく。受容体−リガンド相互作用に連結される代謝現象は、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、細胞増殖、環状AMP生成の上昇、細胞カルシウムの移動、膜脂肪の移動、細胞付着、イノシトール脂質の加水分解、及びリン酸質の加水分解を包含する。細胞−表面サイトカイン受容体は、下記でより詳細に論ぜられるように多ドメイン構造により特徴づけられる。それらの受容体は、陽性に荷電された残基(Lys又はArg)を通常、端に有する、疎水性アミノ酸残基の配列（典型的には、約21〜25個の残基）により特徴づけられるトランスメンブランドメインにより細胞膜に固定される。用語“受容体ポリペプチド”は、単離された機能的ドメイン（たとえば、リガンド−結合ドメイン）を包含する、完全な受容体ポリペプチド鎖及びその一部を示すために使用される。 “分泌シグナル配列”は、大きなポリペプチドの成分として、それが合成される細胞の分泌路を通してその大きなポリペプチドを方向づけるポリペプチド（“ 分泌ペプチド”）をコードするDNA配列である。前記大きなぺプチドは、分泌路を通して、通過の間、分泌ペプチドを除去するために通常切断される。 “可溶性受容体”は、細胞膜に結合されない受容体ペプチドである。可溶性受容体は、最も普通には、トランスメンブラン及び細胞質ドメインを欠いているリガンド−結合受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は、追加のアミノ酸残基、たとえばポリペプチドの精製を提供し、又は基質へのポリペプチドの結合のための部位、又は免疫グロブリン不変領域配列を供給する親和性標識を含み得る。多くの細胞−表面受容体は、タンパク質加水分解により生成される天然に存在する可溶性相対物を有する。受容体ポリペプチドは、それらが、それぞれ、膜固定又はシグナルトランスダクションを供給するためにトランスメンブラン及び細胞内ポリペプチドセグメントの十分な部分を欠いている場合、それらのセグメントを実質的に有さないと言われる。本発明は、保存されたWSXWS型（配列番号１）を包含するサイトカイン受容体の構造を有するタンパク質をコードする新規なDNA配列の発見に一部、基づいている。この受容体をコードする単離されたヒトcDNA（配列番号２に示される代表的配列）は、578個のアミノ酸をコードするオープン読取り枠を含んでいた。その推定されるアミノ酸配列は、コードされた受容体がG-CSF，IL-6，CNTF，IL-11 ，OSM，LIF，CT-1及びgp130受容体を包含する受容体サブファミリーに属することを示唆した。配列番号３の残基217〜221でのWSXWS型の他に、受容体は約200個のアミノ酸残基のサイトカイン−結合領域(配列番号３の残基33〜235)、３種のフィブロネクチン型IIIドメイン(配列番号３の残基236〜514)、トランスメンブランドメイン(配列番号３の残基515〜540)及び細胞内又はシグナルドメイン(配列番号３の残基541〜578)を含んで成る。当業者は、それらのドメイン境界がおおよそであって、そして既知のタンパク質との整合及びタンパク質折りたたみの予測に基づかれていることを認識するであろう。それらのドメインの他に、コードされた受容体における保存された受容体特徴は、（配列番号３に関して）残基52〜54で保存されたCys-X-Trp、位置41でCys残基、位置151でTrp残基及び位置207でArg残基を包含する。この領域は、“ZCytor 1”と命名されている。当業者は、配列番号２及び配列番号３に示される配列がヒト受容体遺伝子の単一の対立遺伝子を表わし、そして対立遺伝子変異及び他のスプライシングが生じることが予測されることを認識するであろう。配列番号３に関してカルボキシル末端近くに58個のアミノ酸残基挿入物を有するタンパク質をコードする第２の、明らかに代わりにスプライスされたヒトcDNAも単離された。このより長いクローンのヌクレオチド配列及び推定されるアミノ酸配列は、配列番号４及び配列番号５に示されている。対立遺伝子変異体は、標準の方法に従って、異なった個体からのcDNA又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。本発明はさらに、他の種(“種オルソログ(orthologs)”)からの相対受容体及びポリヌクレオチドを供給する。他の哺乳類種からのZCytor 1受容体、たとえばネズミ、ブタ、羊、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ及び非ヒト霊長類受容体が特に興味の対象である。ヒトZCytor 1受容体の種オルソログは、従来のクローニング技法と組合して本発明により提供される情報及び組成物を用いてクローン化され得る。たとえば、cDNAは、受容体を発現する組織又は細胞型から得られるmRNAを用いてクローン化され得る。mRNAの適切な源は、本明細書に開示される配列から企画されたプローブによりノザンブロットをプローブすることによって同定され得る。次に、ライブラリーが、陽性組織又は細胞系のmRNAから調製される。次に、受容体をコードするcDNAが、種々の方法、たとえば完全又は部分ヒトcDNAにより、又は開示される配列に基づいての１又は複数組の分解プローブによりプローブすることによって単離され得る。cDNAはまた、本明細書に開示される配列から企画されたプライマーを用いてのポリメラーゼ鎖反応又はPCRを用いてクローン化され得る（Mullis、アメリカ特許第4,683,202号）。追加の方法においては、cDNA ライブラリーが、宿主細胞を形質転換し、又はトランスフェクトするために使用され得、そして興味あるcDNAの発現が受容体に対する抗体により検出され得る。類似する技法はまた、ゲノムクローンの単離にも適用され得る。代表的なマウス ZCytor 1クローンのDNA及び推定されるアミノ酸配列が、それぞれ配列番号６及び配列番号７に示される。ヒト（配列番号３及び５）及びマウス（配列番号７）ZCytor 1受容体のおおよそのドメイン境界（アミノ酸残基）が表１に示される。表１ドメインヒトマウスリガンド−結合 33-514 25-508 ヘマトポイエチン 33-235 25-229 フィブロネクチン型III 236-514 230-508 トランスメンブラン 515-540 509-533 細胞内 541-578(配列番号３) 534-623 541-636(配列番号５) この新規DNAに対応するmRNAの組織分布の分析は、発現が広がり、そして高レベルの発現がリンパ球組織、たとえば胸腺、脾臓、リンパ節及び末梢血液白血球に観察されることを示した。受容体がＢ−及びＴ−細胞の両者上に存在し、そしてＴ−細胞レベルが一般的に高い。それらのデータは、免疫細胞の増殖、分化及び／又は活性化におけるZCytor 1受容体のための役割を示し、そして／又は免疫応答の進行及び調節における役割を示す。前記データはまた、ZCytor 1とそのリガンドとの相互作用が骨髄細胞の増殖及び生長を刺激することができ、そしてIL -6，LIF，IL-11及びOSM(Baumannなど.,J.Biol.Chem. 268:8414-8417，1993)のように、肝細胞における急性相タンパク質合成を誘発することができることも示唆する。サイトカイン受容体サブユニットは、細胞外ドメイン、細胞膜にポリペプチドを固定するトランスメンブランドメイン、及び細胞内ドメインを含んで成る多ドメイン構造により特徴づけられる。細胞外ドメインは、リガンド−結合ドメインであり得、そして細胞内ドメインはシグナルトランスダクションに関与するエフェクタードメインであり得るが、但しリガンド−結合及びエフェクター機能はマルチマー受容体の別々のサブユニット上に存在する。リガンド−結合ドメインは、それ自体、多ドメイン構造体であり得る。マルチマー受容体は、ホモダイマー（たとえば、PDGF受容体αα及びββイソフォーム、エリトロポイエチン受容体、MPL及びG-CSF受容体）、そのサブユニットがそれぞれリガンド−結合及びエフェクタードメインを有するヘテロダイマー（たとえばPDGF受容体αβイソフォーム）、及び異なった機能を有するサブユニット成分を有するマルチマー（たとえばIL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7及びGM-CSF受容体）を包含する。いくつかの受容体サブユニットは、多くの受容体に共通している。たとえば、それ自体、リガンドを結合できないが、しかし細胞内シグナルトランスダクションドメインを包含するAIC2Bサブユニットは、IL-3及びGM-CSF受容体の成分である。多くのサイトカイン受容体は、その構造（添付図面に示されるような）及び機能に基づいて、４種の関連するファミリーの１つに配置され得る。造血受容体は、保存されたシステイン残基及びWSXWS型（配列番号１）を含むドメインの存在により特徴づけられる。追加のドメイン、たとえばタンパク質キナーゼドメイン；フィブロネクチン型IIIドメイン；ジスルフィド−結合ループにより特徴づけられる免疫グロブリンドメイン；及びTNFドメインが、一定の造血受容体に存在する。サイトカイン受容体構造は、Urdal，Ann ．Reports Med.Chem．26：221-228，1991及びCosman，Cytokine ５：95-106，1993により再考されている。新規の生物学的機能を獲得する生物のための選択的圧力下で、新規の受容体ファミリーメンバーが多重遺伝子族の存在を導びく存在する受容体遺伝子の重複から生じたと一般的に思われる。従って、族メンバーは起源遺伝子の痕跡を含み、そしてそれらの特徴は追加のファミリーメンバーの単離及び同定に利用され得る。サイトカイン受容体スーパーファミリーは、表２に示されるように再分される。表２サイトカイン受容体スーパーファミリー免疫グロブリンファミリー CSF-1受容体 MGF受容体 IL-1受容体 PDGF受容体ヘマトポイエチンファミリーエリトロポイエン受容体 G-CSF受容体 IL-2受容体ｂ−サブユニット IL-3受容体 IL-4受容体 IL-5受容体 IL-6受容体 IL-7受容体 IL-9受容体 GM-CSF受容体ａ−サブユニット GM-CSF受容体ｂ−サブユニットプロラクチン受容体 CNTF受容体オンコスタチンＭ受容体白血病阻害因子受容体 TNF受容体 TNF(p80)受容体 TNF(p60)受容体 TNFR-RP CD27 CD30 CD40 4-1BB OX-40 Fas NGF受容体他 IL-2受容体α−サブユニット IL-15受容体α−サブユニット IFN-γ受容体 ZCytor 1配列の分析は、それがLI-6，IL-11，G-CSF，CNTF，OSM，CT-1及び白血病阻害因子(LIF)受容体と同じ受容体サブファミリーのメンバーであることを示唆する。このサブファミリーにおける特定の受容体（たとえばG-CSF)は、シグナルをトランスダクトするホモダイマーの形成に関与している。前記サブファミリーの他のメンバー（たとえばIL-6，IL-11及びLIF受容体）は、リガンドを結合し、そしてシグナルをトランスダクトするために、第２サブユニット（β−サブユニットと称する）と結合する。特定のβ−サブユニットが、多くの特定のサイトカイン受容体レセプターサブユニットと結合する。たとえば、β−サブユニットgp130(Hibiなど.,Cell 6 3：1149-1157，1990)は、IL-6，IL-11及びLIFに対して特異的な受容体サブユニットと結合する（Gearingなど.,EMBO J ．10：2839-2848，1991；Gearingなど., アメリカ特許第5,284,755号）。オンコスタチンＭは、LIF受容体及びgp130のヘテロダイマーに結合する。CNTFは、CNTF受容体、LIF受容体及びgp130サブユニットを含んで成るトリマー受容体に結合する。配列番号５に示されるヒトZCytor 1 のより長い形は、延長された細胞内ドメインを含んで成る。本発明の好ましい態様においては、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２、配列番号４又は配列番号６の類似する大きさの領域、又はそれに対して相補的な配列に緊縮条件下でハイブリダイズするであろう。一般的に、緊縮条件は、定義されたイオン強度及びpHで特定の配列のための熱融点（Tm）よりも約５℃低く選択される。Tmは、標的配列の50％が好ましく適合されたプローブにハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度及びpH下で）である。典型的な緊縮条件は、塩濃度がpH７で少なくとも約0.02Ｍであり、そして温度が少なくとも約60℃ である条件である。前で示されたように、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、DNA及びRNAを包含する。DNA及びRNAを単離するための方法は、当業界において良く知られている。脾臓又は胸腺からRNAを単離することが一般的には好ましいが、但しDNAはまた、他の組織からのRNAを用いて調製され、又はゲノムDNAとしても単離され得る。完全なRNAは、グアニジンHCl抽出、その後のCsClグラジエントでの遠心分離による単離を用いて調製され得る（Chirgw inなど.,Biochemistry 18：52-94，1979）。ポリ(A)⁺RNAは、Aviv and Leder(P roc ．Natl．Acad．Sci．USA 69:1408-1412，1972)の方法を用いて、完全なRNA から調製される。相補的DNA(cDNA)は、既知の方法を用いてポリ(A)⁺RNAから調製される。次に、ZCytor 1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、、たとえばハイブリダイゼーション又はPCRにより同定され、そして単離される。本発明はまた、配列番号３，５，７及びそれらの種オルソログの受容体ポリペプチドに対して実質的に相同である単離された受容体ポリペプチドを供給する。 “単離された”とは、たとえば血液及び動物組織は別として、その生来の環境以外の条件下で見出されるタンパク質又はポリペプチドを意味する。好ましい形においては、単離されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起原の他のポリペプチドを実質的に有さない。高く精製された形、すなわち95％以上の純度、より好ましくは99％以上の純度のポリペプチドを供給することが好ましい。用語“実質的に相同である”とは、配列番号３，５，７又はそれらの種オルソログに示される配列に対して50％、好ましくは60％、より好ましくは少なくとも80％の配列同一性を有するポリペプチドを示すために本明細書において使用される。そのようなポリペプチドは、配列番号３，５，７又はそれらの種オルソログに対して好ましくは少なくとも90％、及び最も好ましくは95％又はそれ以上同一であろう。配列同一性％は、従来の方法により決定される。たとえば、Altschulなど .,Bull．Math ．Bio．48：603-616，1986及びHenikoff and Henikoff．Proc ．Nat l．Acad．Sci．USA 89 ：10915-10919，1992を参照のこと。手短に言及すれば、２種のアミノ酸配列が、表３（アミノ酸が標準の１文字コードにより示される）に示されるように、10のギャップ開始ペナルティー、１のギャップ延長ペナルティー及びHenikoff and Henikoff（前記）の“blosum 62”評点マトリックスを用いて整合評点を最適化するために整合される。次に、同一性％が次のようにして計算される：ポリヌクレオチド分子の配列同一性は、上記に開示されるような割合を用いて類似する方法により決定される。実質的に相同のタンパク質は、１又は複数のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するものとして特徴づけられる。それらの変更は好ましくは、マイナーな性質のもの、すなわち保存性アミノ酸置換（表４を参照のこと）及びタンパク質の折たたみ又は活性に対して有意に影響を及ぼさない他の置換；典型的には１〜約30個のアミノ酸の小さな欠失；及び小さなアミノ−又はカルボキシル−末端の延長、たとえばアミノ末端メチオニン残基の延長、約20〜25個までの残基の小さなリンカーペプチドの延長、又は精製を促進する小さな延長（親和性標識）、ポリ−ヒスチジン域、プロテインＡ（Nilssonなど.,EMBO J ．4：1075，1985；Nilssonなど.,Methods Enzymol ．198：3，1991）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（S mith and Johnson，Gene 67：31，1988）、マルトース結合タンパク質（Keller man and Ferenci，Methods Enzymol．90：459-463，1982；Guanなど.,Gene 67： 21-30，1987)、又は他の抗原性エピトープ又は結合ドメインの延長である。一般的には、引用により本明細書に組込まれる、Fordなど.,Protein Expression and Purification 2：95-107，1991を参照のこと。親和性標識をコードするDNAは、商業的供給者（たとえば、Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ；New England B iolabs，Beverly，MA）から市販されている。表４保存性アミノ酸置換塩基性：アルギニンリシンヒスチジン酸性：グルタミン酸アスパラギン酸極性：グルタミンアスパラギン疎水性：ロイシンイソロイシンバリン芳香族：フェニルアラニントリプトファンチロシン小さい：グリシンアラニンセリントレオニンメチオニン本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において知られている方法、たとえば特定部位の突然変異誘発又はアラニンー走査突然変異誘発(Cunni ngham and Wells，Science 244；1081-1085，1989)に従って同定され得る。後者の技法においては、単一のアラニン突然変異が分子におけるあらゆる残基で導入され、そして得られる変異体分子は生物学的活性（たとえば、リガンド結合及びシグナルトランスダクション）について試験され、分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基が同定される。また、Hiltonなど.,J ．Biol．Chem．271：4699 -4708，1996を参照のこと。リガンド−受容体相互作用の部位はまた、核磁気共鳴、結晶学又は光親和性ラベリングのような技法により決定されるような結晶構造の分析により決定され得る。たとえば、de Vosなど.,Science 255：306-312， 1992；Smithなど.,J ．Mol．Biol．224：899-904，1992；Wl odaverなど.,FEBS Lett ．309：59-64，1992を参照のこと。必須アミノ酸の本体はまた、関連する受容体との相同性の分析から推定され得る。複数のアミノ酸置換が、突然変異誘発及びスクリーニングの既知方法、たとえばReidhaar-Olson及びSauer（Science 241：53-57，1988）又はBowie及びSauer （Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 86：2152-2156，1989）により開示される方法を用いて実施され、そして試験され得る。手短に言及すれば、それらの著者は、ポリペプチドにおける複数の位置を同時ランダムダイズし、機能的ポリペプチドを選択し、そして次に、個々の位置での可能な置換の範囲を決定するために突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定するための方法を開示する。使用され得る他の方法は、ファージ表示（たとえばLaumanなど.,Biochemistry 30：10832-10 837，1991；Ladnerなど.,アメリカ特許第5,223,409号；Huse，WIPO公開WO 92／0 62045）及び領域指図された突然変異誘発(Derbyshireなど.,Gene 46；145，1986 ；Nerなど.,DNA 7：127，1988)を包含する。上記に開示されるような突然変異誘発方法は、宿主細胞におけるクローン化され、突然変異誘発された受容体の活性を検出するために高い処理量のスクリーニング方法と組合され得る。これに関しての好ましいアッセイは、下記に記載される、細胞増殖アッセイ及びバイオセンサーに基づくリガンド結合アッセイを包含する。活性受容体又はその一部（たとえばリガンド結合フラグメント）をコードする突然変異誘発されたDNA分子は、宿主細胞から回収され、そして近代的な装置を用いて急速に配列決定され得る。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の急速な決定を可能にし、そして未知の構造のポリペプチドに適用され得る。上記で論じられた方法を用いて、当業者は、配列番号３の残基33〜235に対して実質的に相同である種々のポリペプチド又はその対立遺伝子変異体もしくは種オルソログを調製し、そしてリガンド結合活性を保持することができる。そのようなポリペプチドは、ZCytor 1受容体の細胞外リガンド結合ドメイン（たとえば、１又は複数のフィブロネクチン型IIIドメイン）、及びトランスメンブラン並びに細胞内ドメインの一部又はすべてからの追加のアミノ酸を含むことができる。そのようなポリペプチドは、一般的に上記に開示されるような追加のポリペプチドセグメントも含むことができる。十分な長さの受容体、受容体フラグメント（たとえば、リガンド結合フラグメント）及び融合タンパク質を包含する本発明の受容体ポリペプチドは、従来の技法に従って、遺伝子的に構築された宿主細胞において生成され得る。適切な宿主細胞は、外因性DNAにより形質転換され、又はトランスフェクトされ、そして培養物において増殖され得るそれらの細胞型であり、そして細菌、菌類、及び培養された高等真核細胞を包含する。クローン化されたDNA分子を操作し、そして種々の宿主細胞中に外因性DNAを導入するための技法は、Sambrookなど.,Molecular Cloning ：A Laboratory Manual， 2nded.，Cold Spring Harbor Laboratory Pre ss，Cold Spring Harbor，NY，1989及びAusubelなど.,前記（それらは引用により本明細書中に組込まれる）により開示される。一般的に、本発明の受容体ポリペプチドをコードするDNA配列は、発現ベクター内の転写プロモーター及びターミネーターに操作可能的に連結される。ベクターは通常、１又は複数の選択マーカー、及び１又は複数の複製起点を含むが、但し、当業者は、特定のシステムにおいて、選択マーカーは別々のベクター上に供給され、そして外因性DNAの複製が宿主細胞ゲノム中への組込みにより提供され得ることを認識するであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター及び他の要素の選択は、当業者のレベル内の通常の設計上の問題である。多くのそのような要素は、文献に記載されており、そして商業的供給者を通して入手できる。宿主細胞の分泌路に本発明の受容体ポリペプチドを方向付けるためには、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）は、発現ベクターに供給される。その分泌シグナル配列は、受容体の分泌シグナル配列であり、又はもう１つの分泌されたタンパク質（たとえばt-PA）に由来し、又は新たに合成され得る。分泌シグナル配列は、本発明のタンパク質をコードするDNA配列に、正しい読取り枠で連結される。分泌シグナル配列は、通常、興味あるポリペプチドをコードするDNA配列の５’側に位置するが、但し特定のシグナル配列は興味あるDNA配列における他の場所にも位置することができる（たとえば、Welchなど.,アメリカ特許第5,037,743号；Hollandなど.,アメリカ特許第5,143,830号を参照のこと）。培養された哺乳類細胞は、本発明内の好ましい宿主である。哺乳類宿主細胞中に外因性DNAを導入するための方法は、リン酸カルシウム介在トランスフェクション(Wiglerなど.,Cell 14：725，1978；Carsaru and Pearson，Somatic Cell G enetics 7 ：603，1981；Graham and Van der Eb，Virology 52：456，1973)、エレクトロポレーション(Neumannなど.,EMBO J ．1：841-845，1982)、DEAE−デキストラン介在トランスフェクション(Ausubelなど.,eds.，Current Protocols in Molecular Biology ，John Wiley and Sons，Inc.，NY，1987)、及びリポソーム介在トランスフェクション（Hawley-Nelsonなど.,Focus 15：73，1993；Ciccaro neなど.,Focus 15：80，1993）（それらの文献は引用により本明細書中に組込まれる）を包含する。培養された哺乳類細胞における組換えタンパク質の生成は、たとえば、Levinsonなど.,アメリカ特許第4,713,339号；Hagenなど.,アメリカ特許第4,784,950号；Palmiterなど.,アメリカ特許第4,579,821号；及びRingold 、アメリカ特許第4,656,134号（それらは、引用により本明細書中に組込まれる）により開示される。好ましい培養された哺乳類細胞は、COS-1（ATCC No.CRL 1 650)，COS-7(ATCC No．CRL 1651)，BHK(ATCC No．CRL 1632)，BHK 570(ATCC No ．CRL 10314)，293(ATCC No．CRL 1573；Grahamなど.,J ．Gen．Virol．36：59-7 2，1977)、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞系（たとえばCHO-K1；ATCC No ．CCL 61）を包含する。追加の適切な細胞系は、当業界において知られており、そして公共の寄託機関、たとえばAmerican Type Culture Collection，Rockvill e，Marylandから入手できる。一般的に、強い転写プロモーター、たとえばSV-40 又はサイトメガロウィルスからのプロモーターが好ましい。たとえば、アメリカ特許第4,956,288号を参照のこと。他の適切なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子からのプロモーター（アメリカ特許第4,579,821号及び第4,601,978号；それらは引用により本明細書に組込まれる）及びアデノウィルス主要後期プロモーターを包含する。薬物選択は一般的に、外来性DNAが挿入されている培養された哺乳類細胞について選択するために使用される。そのような細胞は、通常、“トランスフェクタント”と称される。選択剤の存在下で培養されており、そしてそれらの子孫に対して興味ある遺伝子を通過することができる細胞は、“安定したトランスフェクタント”と称される。好ましい適切な選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。選択は、ネオマイシン型薬物、たとえば G-418及び同様のものの存在下で実施される。選択システム、すなわち“増幅”と称される工程がまた、興味ある遺伝子の発現レベルを高めるために使用され得る。増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトランスフェクタントを培養し、そして次に、導入された遺伝子の生成物を高レベルで生成する細胞を選択するために選択剤の量を高めることによって実施される。好ましい増幅可能な選択マーカーは、メトトセキセートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼである。他の薬物耐性遺伝子（たとえばヒグロマイシン耐性、複数薬物耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）がまた使用され得る。他の高等真核細胞、たとえば昆虫細胞、植物細胞及び鳥類細胞がまた、宿主として使用され得る。昆虫細胞の形質転換及び外来性タンパク質の生成は、Guarin oなど.,アメリカ特許第5,162,222号；Bangなど.,アメリカ特許第4,775,624号；及びWIPO公開WO 94／06463号（それらは引用により本明細書に組込まれる）により開示される。植物細胞において遺伝子を発現するためのベクターとしてのアグロバクテリウムリゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）の使用は、Sinkarなど.,J ．Biosci．(Bangalore)11：47-58，1987により再考されている。菌類細胞、たとえば酵母細胞及び特に、サッカロミセス属の細胞はまた、たとえば受容体フラグメント又はポリペプチド融合を生成するために本発明内で使用され得る。外来性DNAにより酵母細胞を形質転換し、そしてそれから組換えタンパク質を生成するための方法は、たとえばKawasaki、アメリカ特許第4,599,311 号；Kawasakiなど.,アメリカ特許第4,931,373号；Brake、アメリカ特許第4,870, 008号；Welchなど.,アメリカ特許第5,037,743号；及びMurrayなど.,アメリカ特許第4,845,075号（それらは引用により本明細書中に組込まれる）により開示される。形質転換された細胞は、選択マーカー、通常耐薬物性又は特定の栄養物（たとえばロイシン）の不在下で増殖する能力により決定される表現型により選択される。酵母への使用のための好ましいベクターシステムは、グルコース含有培地における増殖による、形質転換された細胞の選択を可能にする、Kawasakiなど、（アメリカ特許第4,931,373号）により開示されるPOT1ベクターシステムである。酵母細胞への使用のための適切なプロモータ−及びターミネーターは、解糖酵素遺伝子（たとえば、Kawasaki、アメリカ特許第4,599,311号：Kingsmanなど.,アメリカ特許第4,615,974号；及び Bitter、アメリカ特許第4,977,092号；それらは引用により本明細書に組込まれる）、及びアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子からのそれらを包含する。また、アメリカ特許第4,990,446号；第5,063,154号；第5,139,936号及び第4,661,454号（それらは引用により本明細書中に組込まれる）を参照のこと。他の酵母、たとえばハンセヌラポリモルファ（Hansenula polymorpha）、シゾサッカロミセスポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クレイベロミセスラクチス（Kluyver omyces lactis）、クルイベロミセスフラギリス（Kluyveromyces fragilis）、ウスチラゴマイディス(Ustilago maydis)、ピチアパストリス(Pichia pas toris)、ピチアメタノリカ（Pichia methanolica）、ピチアグイレルモンジ（Pichia guillermondii）及びカンジダマルトサ(Candida maltosa)のための形質転換システムは、当業界において知られている。たとえば、Gleeronなど.,J ．Gen．Microbiol．132 ：3459-3465，1986及びCregy、アメリカ特許第4,882,279 号も参照のこと。アスペルギラス細胞は、McKnightなど.,アメリカ特許第4,935, 349号（引用により本明細書に組込まれる）の方法に従って利用され得る。アクレモニウムクリソゲナム（Acremonium chrysogenum）を形質転換するための方法は、Suminoなど.,アメリカ特許第5,162,228号（引用により本明細書に組込まれる）により開示される。ニューロスポラ（Neurospora）を形質転換するための方法は、Lambowitz、アメリカ特許第4,486,533号（引用により本明細書に組込まれる）により開示される。形質転換された又はトランスフェクトされた宿主細胞は、選択された宿主細胞の増殖のために必要とされる栄養物及び他の成分を含む培養培地において、従来の方法に従って培養される。定義された培地及び複合培地を包含する種々の適切な培地は、当業界において知られており、そして一般的に、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン及び無機質を含む。培地はまた、必要とされる場合、成長因子又は血清のような成分を含むことができる。増殖培地は、一般的に、たとえば発現ベクター上に担持され、又は宿主細胞中に同時−トランスフェクトされる選択マーカーにより補充される必須栄養物における薬物選択又は欠失により、外因的に付加されたDNAを含む細胞について選択するであろう。本発明の１つの観点においては、サイトカイン受容体（トランスメンブラン及び細胞内ドメインを包含する）は、培養された細胞により生成され、そして前記細胞が受容体のためのリガンド、たとえば天然のリガンド、、並びにその天然のリガンドのアゴニスト及びアンタゴニストについてスクリーンするために使用される。このアプローチを要約すると、前記受容体をコードするcDNA又は遺伝子がその発現のために必要とされる他の遺伝子要素（たとえば転写プロモーター）と共に組合され、そして得られる発現ベクターが宿主細胞中に挿入される。DNAを発現し、そして機能的受容体を生成する細胞が、選択され、そして種々のスクリーニングシステム内で使用される。本発明の新規受容体の発現及び受容体介在シグナルのトランスダクションへの使用のために適切な哺乳類細胞は、β−サブユニット、たとえばgp 130を発現する細胞、及びgp130及びLIF受容体を同時発現する細胞を包含する（G earingなど.,EMBO J ．10：2839-2848，1991；Gearingなど.,アメリカ特許第5,28 4,755号）。これに関しては、同じサブファミリーにおける受容体、たとえばIL- 6又はLIFに結合する他のサイトカインに対して反応性である細胞を、そのような細胞が必要なシグナルトランスダクション路を含むので、使用することが好ましい。このタイプの好ましい細胞は、ヒトTF-1細胞系(ATCC No．CRL-2003)及びDA- 1細胞系（Branchなど.,Blood 69：1782，1987；Broudyなど.,Blood 75：1622-16 26，1990）を包含する。他に、適切な宿主細胞は、所望する細胞応答のために必要とされるβ−サブユニット又は他の細胞成分を生成するために構築され得る。たとえば、ネズミ細胞系BaF3（Palacios and Steinmetz，Cell 41：727-734，1 985；Mathey Prevotなど.,Mol ．Cell.Biol．6：4133-4135，1986）、子供ハムスター腎臓(BHK)細胞系、又はCTLL-2細胞系（ATCC No．TIB-214）は、ZCytor 1の他に、マウスgp130サブユニット、又はマウスgp130及びLIF受容体を発現するためにトランスフェクトされ得る。一般的には、同じ種からの宿主細胞及び受容体を用いることが好ましいが、しかしながら、このアプローチは、いづれかの種からの複数の受容体サブユニットを発現するためへの細胞系の構築を可能にし、それにより種特異性から生じる潜在的な制限を克服する。他方では、ヒト受容体cD NAの種相同体が、同じ種からの細胞系、たとえばBaF3細胞系におけるマウスcDNA 内にクローン化され、そして使用され得る。従って、１つの造血成長因子、たとえばIL-3に依存する細胞系が、ZCytor 1リガンドに依存するようになるよう構築され得る。機能的ZCytor 1を発現する細胞が、スクリーニングアッセイに使用される。それらのアッセイは、標的細胞における生物学的応答の検出に基づかれている。１つのそのようなアッセイは、細胞増殖アッセイである。細胞は試験化合物の存在又は不在下で培養され、そして細胞増殖が、たとえば、トリチウム化されたチミジンの組込みを測定することによって、又は３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT ）の代謝的分解に基づく比色アッセイにより検出される（Mosman，J.Immunol ．M eth ．65：55-63，1983）。他のアッセイ型式は、レポーター遺伝子を発現するようさらに構築される細胞を用いる。レポーター遺伝子は、受容体−結合された経路に応答するプロモーター要素に連結され、そしてアッセイがレポーター遺伝子の転写の活性化を検出する。これに関する好ましいプロモーター要素は、血清応答要素又はSREである（たとえば、Shawなど.,Cell 56：563-572，1989を参照のこと）。好ましいそのようなレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子である（de Wetなど.,Mol ．Cell．Biol．7：725，1987）。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、当業界において知られている方法を用いて、発光により検出される（たとえば、Baumgartnerなど.,J ．Biol．Chem．269：19094-29101，1994；Schenborn and Goiffin，Promega Notes 41：11，1993を参照のこと）。ルシフェラーゼアッセイキットは、たとえばPromega Corp.，Madison，WIから市販されている。このタイプの標的細胞系は、化学物質、細胞−ならし培養培地、菌類ブイヨン、土壌サンプル、水サンプル、及び同様のもののライブラリーをスクリーンするために使用され得る。たとえば、一群の細胞−又は組織−ならし培地サンプルが、リガンドを生成する細胞を同定するために標的細胞に基づいてアッセイされ得る。次に、陽性細胞が、プールに分けられ、宿主細胞中にトランスフェクトされ、そして発現される、哺乳類細胞発現ベクターによりcDNAライブラリーを生成するために使用される。次に、トランスフェクトされた細胞からの培地サンプルが、アッセイされ、そして続いてリガンドを発現するクローン細胞系を単離するために、陽性細胞のプールの分割、再トランスフェクション、継代培養、及び再アッセイを伴なう。腎臓、肝臓、脾臓、胸腺、他のリンパ組織又はＴ−細胞によりならされた培地サンプルは、スクリーニング工程への使用のためのリガンドの好ましい源である。 ZCytor 1のための天然のリガンドはまた、ZCytor 1を発現するサイトカイン− 依存性細胞系を突然変異誘発し、そしてそれをオートクライン増殖について選択する条件下で培養することによって同定され得る。WIPO公開WO 95／21930号を参照のこと。典型的な方法においては、ZCytor 1を発現する細胞が、たとえばEMS によ突然変異誘発される。次に、細胞が必要とされるサイトカインの存在下での回収を可能にされ、次にサイトカインを欠いている培養培地に移される。生存細胞が、たとえば可溶性（リガンド−結合の）受容体ポリペプチドを培養培地に添加することによって、又は野生型細胞及びZCytor 1を発現するトランスフェクトされた細胞に基づいてならし培地をアッセイすることによって、ZCytor 1のためのリガンドの生成についてスクリーンされる。この方法に使用するための好ましい細胞系は、gp130又はLIF受容体と組合してgp130を発現するためにトランスフェクトされる細胞を包含する。好ましいそのような宿主細胞系は、トランスフェクトされたCTLI-2細胞（Gillis and Smith，Nature 268：154-156，1977）及びトランスフェクトされたBaF3細胞を包含する。本発明により提供されるさらなるアッセイは、ハイブリッド受容体ポリペプチドの使用を包含する。それらのハイブリッドポリペプ４チドは２つの一般的な種類に分けられる。第１の種類においては、配列番号５のおおよその残基5541〜636を含んで成るZCytor 1の細胞内ドメインが、第２受容体のリガンド結合ドメインに連結される。好ましくは、第２受容体は、造血サイトカイン受容体、たとえばmpl受容体である(Souyriなど.,Cell 63 ：1137-1147，1990)。ハイブリッド受容体はさらに、いづれかの受容体に由来するトランスメンブランドメインを含んで成る。次に、ハイブリッド受容体をコードするDNA構造体が宿主細胞中に挿入される。ハイブリッド受容体を発現する細胞が、結合ドメインのためのリガンドの存在下で培養され、そして応答についてアッセイされる。このシステムは、容易に入手できるリガンドを用いて、ZCytor 1により介在されるシグナルトランスダクションを分析するための手段を提供する。このシステムはまた、特定の細胞系がZCytor 1によりトランスダクトされるシグナルに対して応答することができるかどうかを決定するためにも使用され得る。第２の種類のハイブリッド受容体ポリペプチドは、ZCytor 1の細胞外（リガンド結合の）ドメイン(配列番号３のおおよその残基33〜514)、及び第２受容体、好ましくは造血サイトカイン受容体の細胞質ドメイン、並びにトランスメンブランドメインを含んで成る。この第２の種類のハイブリッド受容体は、第２受容体によりトランスダクトされるシグナルに対して応答できることが知られている細胞において発現される。共に、それらの２種のハイブリッド受容体は、受容体に基づくアッセイシステムにおける広範囲の細胞型の使用を可能にする。次に、ZCytor 1のためのリガンドを発現することが見出された細胞が、上記に開示されるようにしてリガンドをコードするcDNAを単離することができるcDNAライブラリーを調製するために使用される。従って、本発明は、新規の受容体ポリペプチドの他に、受容体のためのポリペプチドリガンドをクローニングするための方法を提供する。 ZCytor 1発現の組織特異性は、初期胸腺細胞の増殖、及び免疫応答調節における役割を示す。それらの方法は、１又は複数のサイトカインのそれらの同種起源の受容体への結合に応答しての細胞増殖及び分化の刺激を包含する。この受容体のために観察される組織分布の観点においては、アゴニスト（天然のリガンドを包含する）及びアンタゴニストは、インビトロ及びインビボの両適用において莫大な可能性を有する。受容体アゴニストとして同定される化合物は、インビトロ及びインビボでの標的細胞の増殖及び成長を刺激するために有用である。たとえば、アゴニスト化合物は、定義された細胞培養物培地の成分として有用であり、そして細胞培養において通常使用される血清を置換するために、単独で、又は他のサイトカイン及びホルモンと組合して使用され得る。従って、アゴニストは、培養におけるリンパ及び骨髄系統のＴ−細胞、Ｂ−細胞及び他の細胞の増殖及び／又は成長を特異的に促進することにおいて有用である。 ZCytor 1のためのアゴニストリガンドは、たとえば免疫抑制、たとえば特定のウィルス感染を包含する感染の処理において、細胞介在免疫性を刺激することにおいて、及びリンパ球増殖を刺激するために有用である。さらなる使用は、悪性形質転換が抗原性である腫瘍細胞をもたらす腫瘍抑制を包含する。アゴニストリガンドは、エフェクター細胞、たとえばＴ−細胞、NK（ナチュラルキラー）細胞、又はLAK(リンパ球活性化キラー)細胞の活性化を通して介在され得る細胞毒性を誘発するために使用され得る。アゴニストリガンドはまた、影響される細胞型のレベルを高めることによって白血球減少症を処理することに、及び骨髄移植の後、Ｔ−細胞レパートリーの再生を増強するためにも有用であり得る。アンタゴニストリガンドは、免疫系の抑制に、たとえばリウマチ様関節炎、多発性硬化症、糖尿病、等を包含する自己免疫疾患の処理に利用され得る。免疫抑制はまた、影響される細胞型の増殖を阻害することによって、組織又は器官移植及び移植片の拒絶を減じるために、及びリンパ腫のＴ−細胞特異的白血病を処理するためにも使用され得る。 ZCytor 1はまた、循環レベルのリガンドを検出するための診断システムにも使用され得る。関連する態様においては、ZCytor 1に特異的に結合する抗体又は他の剤が、循環する受容体ポリペプチドを検出するために使用され得る。高められた又は低められたレベルのリガンド又は受容体ポリペプチドは、癌を包含する病理学的状態の表示であり得る。可溶性受容体ポリペプチドは、病理学的工程に寄与することができ、そして根元的な病気の間接的マーカーであり得る。たとえば、ヒト血清における高められたレベルの可溶性IL-2受容体は、広範囲の種類の炎症及び新生形成状態、たとえば心筋梗塞、喘息、重症筋無力症、リウマチ様関節炎、急性Ｔ−細胞白血病、慢性リンパ球白血病、大腸癌、乳癌、及び卵巣癌に関係している(Heaneyなど.,Blood 87：847-857，1996)。 ZCytor 1受容体のリガンド結合ポリペプチドは、ヒト受容体の残基33〜235(配列番号３)、又は非ヒト受容体のその対応する領域をコードする切断されたDNAを発現することによって調製され得る。受容体の追加の残基がまた、配列番号３の残基236〜514までの特定のカルボキシル末端残基に含まれ得る。好ましくは、細胞外ドメインは、トランスメンブラン及び細胞内ポリペプチドセグメントを実質的に有さない形で調製される。宿主細胞からの受容体ポリペプチドの輸送を方向づけるために、受容体DNAが、分泌ペプチド、たとえばt-PA分泌ペプチド又はZCy tor 1分泌ペプチドをコードする第 2 DNAセグメントに連結される。分泌された受容体ポリペプチドの精製を促進するために、Ｃ−末端延長、たとえばポリ−ヒスチジン標識、サブスタンスＰ、Fl ag^TMペプチド（Hoppなど.,Bio/Technology 6：1204-1210，1988；Eastman Kodak Co.，New Haven，CTから入手できる）、又は抗体又は他の特異的結合剤が利用できる他のポリペプチド又はタンパク質が、受容体ポリペプチドに融合され得る。他のアプローチにおいては、受容体細胞外ドメインが、免疫グロブリンＨ鎖不変領域、典型的には、２種の不変領域ドメインを含み、そして可変領域を欠いているFcフラグメントとの融合体として発現され得る。そのような融合体は典型的には、Fc部分が互いにジスルフィド結合されており、そして２種の受容体ポリペプチドが互いにきわめて接近して配列されているマルチマー分子として分泌される。このタイプの融合体は、リガンドを特異的に滴定することによってシグナルをインビトロで阻止するためにインビトロアッセイ手段として、及び循環リガンドを結合し、そしてその循環からそれを清浄するためにそれらを非経口投与することによってインビボでのアンタゴニストとして、溶液から同種起源のリガンドを親和性精製するために使用され得る。リガンドを精製するために、ZCytor 1-I gキメラが、受容体−リガンド結合を促進する条件（典型的には、ほぼ生理学的温度、、pH及びイオン強度）下で、リガンドを含むサンプル（たとえば細胞−ならし培養物培地又は組織抽出物）に添加される。次に、キメラ−リガンド複合体が、固体支持体（たとえば不溶性樹脂ビーズ）上に固定されるプロテインＡを用いて、混合物から分離される。次に、リガンドが、従来の化学的技法、たとえば塩又はpHグラジエントにより溶出される。他方では、キメラ自体が固体支持体に結合され得、そして結合及び溶出が上記のようにして実施される。集められた画分は、所望するレベルの純度が達成されるまで、再分別され得る。受容体−Igキメラはまた、ZCytor 1リガンドを特異的に結合し、そして中和するためにアッセイシステムで使用され得る。アッセイへの使用のために、キメラは、Fc領域を通して支持体に結合され、そしてELISA型に使用される。リガンド結合受容体フラグメントを用いる好ましいアッセイシステムは、市販のバイオセンサー装置(BIAcore^TM，Pharmacia Biosensor，Piscataway，NJ)を使用し、ここで受容体ポリペプチドが受容体チップの表面上に固定されている。この装置の使用は、Karlsson，J ．Immunol．Methods 145:229-240，1991及びCunni ngham and Wells，J ．Mol．Biol．234：554-563，1993により開示される。受容体ポリペプチドは、流動細胞内の金フィルムに結合されるデキストラン繊維に、アミン又はスルフヒドリル化学を用いて直接的に共有結合され得る。他方では、受容体ポリペプチドは、抗体を通してチップに結合され得る。１つの態様においては、免疫グロブリンFcフラグメントに融合されるリガンド結合ドメインを含んで成る受容体ポリペプチドが、、チップに結合される第２(抗−IgG)抗体を通して結合される。試験サンプルが細胞に通される。リガンドがサンプルに存在する場合、それは固定された受容体ポリペプチドに結合し、金フィルムの表面プラスモン共鳴の変化として検出される、媒体の屈折率の変化を引き起こす。このシステムは、結合親和性が計算され得るオン−及びオフ−速度の決定、及び結合の化学量論の評価を可能にする。リガンド結合受容体ポリペプチドはまた、当業界において知られている他のアッセイシステム内にも使用され得る。そのようなシステムは、結合親和性の決定のためのScatchard分析（Scatchard，Ann ．NY Acad．Sci．51：660-672，1949）及び測熱アッセイ(Cunn inghamなど.,Science 253：545-548，1991；Cunninghamなど.,Science 245：821 -825，1991)を包含する。 ZCytor 1リガンド結合ポリペプチドはまた、リガンドの精製のためにも使用され得る。ポリペプチドは、固体支持体、たとえばアガロース、架橋されたアガロース、ガラス、セルロース樹脂、シリカ基材の樹脂、ポリスチレン、架橋されたポリアクリルアミド、又は使用条件下で安定している同様の材料のビーズ上に固定される。固体支持体にポリペプチドを結合するための方法は、当業界において知られており、そしてアミン化学、臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化及びヒドラジド活性化を包含する。得られる培地は一般的に、カラムの形で形状化され、そしてリガンドを含む流体が１又はそれ以上の回数、カラムに通され、受容体ポリペプチドへのリガンドの結合を可能にされる。次に、リガンドが、リガンド−受容体結合を破壊するために塩濃度又はpHの変化を用いて溶出される。 ZCytor 1ポリペプチドはまた、ZCytor 1ポリペプチドに特異的に結合する抗体を調製するためにも使用され得る。これに関して有用なポリペプチドは、融合ポリペプチド、たとえばZCytor 1又はその一部と免疫グロブリンポリペプチド又はマルトース結合タンパク質との融合体を包含する。本明細書で使用される場合、用語“抗体”とは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメント、たと.えばF(ab’)₂及びFabフラグメント、及び同様のもの、たとえば遺伝子的に構築された抗体を包含する。抗体は、それらが他のタンパク質に結合するKaよりも少なくとも２対数大きなKaを伴って、ZCytor 1ポリペプチドに結合する場合、特異的に結合するものとして定義される。モノクローナル抗体の親和性は、当業者により容易に決定され得る（たとえば、Scatchard、前記を参照のこと）。ポリクローナル及びモノクローナル抗体を調製するための方法は、当業界において良く知られている（たとえば、Sambrookなど.,Molecular Cloning ：A Labor atory Manual ，2nd edition，Cold Spring Harbor，NY，1989；及びHurrell，J ．G．R.，Ed.，Monoclonal Hybridoma Antibadies ：Techniques and Applicatio ns ，CRC Press，Inc.，Boca Raton，FL，1982を参照のこと；それらは引用により本明細書に組込まれる）。当業者に明らかなように、ポリクローナル抗体は、種々の温血動物、たとえば馬、牛、ヤギ、羊、犬、鶏、ウサギ、マウス、及びラットから生成され得る。ZCytor 1ポリペプチドの免疫原性は、アジュバント、たとえばフロイント完全又は不完全アジュバントの使用により高められ得る。当業者に知られている種々のアッセイは、ZCytor 1ポリペプチドに対して特異的に結合する抗体を検出するために利用され得る。典型的なアッセイは、Antibadies ： A Laboratory Manual ，Harlow and Lane (Eds.)，Cold Spring Harbor Laborato ry Press，1988に詳細に記載されている。そのようなアッセイの代表的な例は次のものを包含する：同時免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、ラジオ−免疫沈殿、酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)、ドットブロットアッセイ、ウエスターンブロット（Towbin，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 76：4350，1979）、阻害又は競争アッセイ、及びサンドイッチアッセイ。 ZCytor 1に対する抗体は、受容体を発現する細胞を標識し、そしてZCytor 1発現レベルをアッセイするために、親和性精製のために、診断アッセイ内では、循環レベルの可溶性受容体ポリペプチドを決定するために、螢光活性化された細胞分類を用いる分析方法のために有用である。二価の抗体が、ZCytor 1リガンドの効果を模倣するためにアゴニストとして使用され得る。本発明は、次の非制限的な例によりさらに示される。例１ cDNAライブラリーを、製造業者により提供されるプロトコールを用いて、Mara thon^TM cDNA増幅キット（Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA）において、対照として供給されるヒト胎盤ポリA⁺ RNAから調製した。このcDNAを、ポリメラーゼ鎖反応において鋳型として使用した。プライマーを、ヒトgp130に対する相同性により同定される発現された配列標識(EST)の配列から設計した。プライマーを、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)を用いて、胎盤ライブラリーからのESTに対応するcDNAを増幅するために使用した。PCRを、鋳型としてのヒト胎盤cDNAの１：50希釈溶液５μｌ、５μｌの10×PCR緩衝液( Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)、５μｌの10×dNTPs（Perkin Elmer ，Norwalk，CN）、0.5μｌ(2.5単位)のTaqポリメラーゼ(Boehringer Mannheim) 、50ｐモルの個々のオリゴヌクレオチドプライマー9670（配列番号８）及び9671 （配列番号９）を用いて、50μｌの反応体積で実施した。前記混合物を、95℃で１分間、続いて55℃で20秒間；72℃で１分間；95℃で15秒間、25サイクル、インキュベートした。次に、前記混合物を、72℃で７分間インキュベートした。次に、最初のPCRに起因するDNAを、同じプライマーを用いて再増幅した。１μ ｌの鋳型DNAを、50ｐモルの個々のプライマー、５μｌの10×PCR緩衝液(Boehrin ger Mannheim)、５μｌの２mMのdNTPs(Perkin-Elmer)、0.5μｌ(2.5単位)のTaq ポリメラーゼ(Boehringer Mannheim)と共に、50μｌの反応体積において組合した。反応を、94℃で１分間、60℃で１分間、次に72℃で2.5分間、30サイクル実施し；次に72℃で７分間インキュベートした。13-13と称する増幅された生成物を、アガロースゲル上での電気泳動により精製した。例２受容体DNAをまた、Marathon^TM Ready cDNA（Clontech Laboratories）からのP CRにより調製した。５μｌの胎児脳cDNAを、50ｐモルのプライマー9670（配列番号８）、５μｌの10×dNTPs(Perkin-Elmer Corporation)、５μｌのTakara 10× 緩衝液(Pan Vera Corp.，Madison，WI)、１μｌの１：１ ExTaqポリメラーゼ（T akara，Otsu，Shiga，Japan）／Taq Start^TM抗体（Clontech Laboratories，Inc .)を含む反応混合物50μｌにおいてPCR(３’RACE反応)により増幅した。前記混合物を、95℃で１分間、次に60℃で30秒間；72℃で２分間；95℃で30秒間、10サイクル、インキュベートし、次に60℃で維持した。10μモルのプライマーAP1(配列番号10；Clontech Laboratoriesから得られた)を添加し、そしてその反応をさらに25サイクル、続け、続いて72℃で７分間インキュベートした。５’RACE反応を同じ態様で行なった。但し、プライマー9671（配列番号９）を使用した。次に、５’及び３’反応生成物を、一群のプライマーを用いて増幅した。５μ ｌの３’RACE反応混合物を、50ｐモルのプライマー9673（配列番号11）、50ｐモルのプライマー9719（配列番号12）、５μｌの10×dNTPs（Takara Shuzo Co.，L td）、５μｌのTakara 10×緩衝液、１μｌの１：１ ExTaq／Taqstart抗体を含む50μｌの反応混合物において増幅した。その混合物を、95℃で１時間；60℃で 30秒；72℃で２分間；95℃で30秒間、30サイクル；続いて72℃で７分間インキュベートした。類似する反応を、鋳型として５’RACE反応生成物５μｌ、及びオリゴヌクレオチドプライマー9672（配列番号13）及び9719（配列番号12）を用いて行なった。約1750bpの３’反応生成物及び約600bpの５’反応生成物を、低溶融アガロースゲル上での電気泳動によりPCR反応混合物から単離 adison，WI）中に連結した。サブクローン化されたフラグメントを配列決定した。代表的なヒトZCytor 1 DNA配列は、配列番号２に示されている。この配列を、サブクローン＃９（５’RACE生成物）、＃28（３’RACE生成物）、フラグメント 13−13（例１）及び元のESTから得られたデータから生成した。例３全RNAを、グアニジンイソチオシアネート、続いてCsCl遠心分離（Chirgwinなど.,前記）を用いて、約2.7×10⁸個のK-562細胞（ATCC CCL 243）から調製した。ポリ(A)⁺ RNAを、OLIGOTEX-dT-mRNA単離キット(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA )を用いて、製造業者の説明書に従って単離した。 K-562細胞からの第１鎖cDNAを、0.5μｇ／μｌの濃度でのポリd(T)−選択されたポリ(A)⁺ RNA 28μｌ、及びXhoＩ制限部位を含む、20ｐモル／μｌの第１鎖プライマー6172（配列番号14）2.5μｌを含む反応混合物において合成した。前記混合物を65℃で４分間加熱し、そして氷上で急冷することによって冷却した。第１鎖cDNA合成を、RNA−プライマー混合物に、16μｌの第１鎖緩衝液(５×SUPERS CRIPT^TM緩衝液；GIBCO BRL)、８μｌの100mMジチオトレイトール、及びそれぞれ 10mMのdATP，dGTP，dTTP及び５−メチル−dCTPを含むデオキシヌクレオチド三リン酸溶液（Pharmacia LKB Biotechnology Inc.）４μｌを添加することによって開始した。前記反応混合物を45℃で４分間インキュベートし、続いて、10μｌの 200Ｕ／μｌ RNase H^-逆転写酵素(GIBCO BRL)を添加した。第１鎖合成の効率を、分析のための反応をラベルするために反応混合物の１つからの10μｌアリコートに10μCiの³²P-αdCTPを添加することによって同様の反応において分析した。反応物を45℃で１時間インキュベートし、続いて50℃で15分間インキュベートした。ラベルされた反応における組込まれなかった³²P-αdCTPを、400孔サイズのゲル濾過カラム(Clontech Laboratories)上でのクロマトグラフィー処理により除去した。ラベルされなかった第１鎖反応における組込まれなかったヌクレオチドを、４μｇのグリコーゲンキャリヤー、2.5Ｍの酢酸アンモニウム、及び2.5体積のエタノールの存在下でcDNAを沈殿せしめることによって除去した。ラベルされなかったcDNAを、第２鎖合成への使用のために48μｌの水に再懸濁した。ラベルされた第１鎖cDNAの長さを、アガロースゲル電気泳動により決定した。第２鎖合成を、第２鎖合成の促進された第１鎖プライミングがDNAヘアーピン形成をもたらす条件下で第１鎖cDNAに基づいて実施した。３回の別々の平行した第２鎖反応を実施した。個々の第２鎖反応は、48μｌのラベルされていない第１鎖cDNA、16.5μｌの水、20μｌの５×ポリメラーゼＩ緩衝液(100mMのトリス−HC l，pH7.4，500mMのKCl，25mMのMgCl₂，50mMの(NH₄)₂SO₄)，１μｌの100mMジチオトレイトール、それぞれ10mMのデオキシヌクレオチド三リン酸を含む溶液１μｌ、３μｌの５mM B-NAD，１μｌの３Ｕ／μｌＥ．コリDNAリガーゼ（New England Biolabs Inc.）及び５μｌの10Ｕ／μｌＥ．コリDNAポリメラーゼＩ（Amersham Corp.）を含んだ。反応を室温でアセンブルし、そして室温で５分間インキュベートし、続いて、1.5μｌの２Ｕ／μｌ RNase H(GIBCO BRL)を添加した。第２鎖合成反応の１つからの10μｌアリコートを、10μCi³²P-αdCTPの添加によりラベルし、第２鎖合成の効率をモニターした。反応物を15℃で２時間、続いて室温で15分間インキュベートした。ラベルされた反応における組込まれなかった³²P-αdCTPを、アガロースゲル電気泳動による分析の前、400孔サイズのゲル濾過カラム(Clontech Laboratories)を通してのクロマトグラフィー処理により除去した。ラベルされていない反応をプールし、そしてフェノール／クロロホルム及びクロロホルムにより抽出し、続いて、2.5Ｍの酢酸アンモニウムの存在下でエタノール沈殿せしめた。ヘアーピン構造の一本鎖DNAを、ヤエナリのヌクレアーゼを用いて切断した。その反応混合物は、100μｌの第２鎖cDNA、20μｌの10×ヤエナリヌクレアーゼ緩衝液（Stratagene Cloning Systems）、16μｌの100mMジチオトレイトール、4 8μｌの水、10μｌのヤエナリヌクレアーゼ希釈緩衝液（Stratagene Cloning Sy stems）、及び６μｌの50Ｕ／μｌヤエナリヌクレアーゼ(Promega Corp.)を含んだ。その反応物を37℃で30分間インキュベートした。反応を１Ｍのトリス−HCl （pH8.0）20μｌの添加により停止し、続いて上記のようにして、フェノール／クロロホルム、及びクロロホルムの連続抽出を行なった。抽出に続いて、DNAをエタノール中で沈殿せしめ、そして水に再懸濁した。再懸濁されたcDNAをT4 DNAポリメラーゼによりブラント末端化した。水188μ ｌに再懸濁されたcDNAを、50μｌの５×T4 DNAポリメラーゼ緩衝液(25.0mMのトリス−HCl，pH8.0，250mMのKCl，25mMのMgCl₂)、３μｌの0.1Ｍジチオトレイトール、10mMの個々のデオキシヌクレオチド三リン酸を含む溶液４μｌ、及び５μ ｌの１Ｕ／μｌ T4 DNAポリメラーゼ(Boehringer Mannheim Corp.)と共に混合した。15℃で30分間のインキュベーションの後、反応を0.5ＭのEDTA 10μｌの添加により停止し、続いて、上記のようにして、フェノール／クロロホルム及びクロロホルムにより一連の抽出を行なった。DNAを400孔サイズのゲル濾過カラム（Clontech Laboratories Inc.）を通してクロマトグラフィー処理し、微量レベルのタンパク質を除去し、そして約40 0bp以下の長さの短いcDNAを除去した。DNAを、10μｇのグリコーゲンキャリヤー及び2.5Ｍの酢酸アンモニウムの存在下でエタノール沈殿せしめ、そして水15μ ｌに再懸濁した。³²P-αdCTPの組込みに基づいて、cDNAの収量は、40μｇの出発 mRNA鋳型から約８μｇであることが評価された。 EcoRＩアダプターを、上記cDNAの５’末端上に連結し、発現ベクター中へのクローニングを可能にした。cDNA（約５μｇ）の10μｌのアリコート及び21μｌの 65ｐモル／μｌEcoRＩアダプター（Pharmacia LKB Biotechnology Inc.）を、４ μｌの10×リガーゼ緩衝液(Promega Corp.)、３μｌの10mM ATP及び３μｌの15 Ｕ／μｌ T4DNAリガーゼ(Promega Corp.)と共に混合した。その反応物を９℃で一晩（約48時間）インキュベートした。反応を水140μｌ、20μｌの10×Ｈ緩衝液(Boehringer Mannheim Corp.)の添加により停止し、そして65℃で110分間インキュベートした。インキュベーションの後、上記のようにしてフェノール／クロロホルム及びクロロホルムにより抽出し、そして2.5Ｍの酢酸アンモニウム及び1 .2体積のイソプロパノールの存在下で沈殿せしめた。遠心分離に続いて、cDNAペレットを、70％エタノールにより洗浄し、空気乾燥し、そして水89μｌに再懸濁した。発現ベクターへのcDNAの方向的クローニングを促進するために、cDNAをXhoＩにより消化し、５’EcoRＩ付着端及び３’XhoＩ付着端を有するcDNAをらたらした。6172プライマー（配列番号14）を用いて、cDNAの３’末端でのXhoＩ制限部位を前もって導入した。制限酵素消化を、上記cDNA 89μｌ，10μｌの10×Ｈ緩衝液(Promega Corp.)及び1.5μｌの40Ｕ／μｌ XhoＩ(Boehringer Mannheim Corp.)を含む反応混合物において実施した。消化を37℃で１時間実施した。反応を一連のフェノール／クロロホルム及びクロロホルム抽出により停止し、、そして400孔サイズのゲル濾過カラム（Clontech Laboratories Inc.）を通してクロマトグラフィー処理した。 cDNAをエタノール沈殿せしめ、70％エタノールにより洗浄し、空気乾燥せしめ、そして20μｌの１×ゲル負荷緩衝液（10mMのトリス−HCl，pH8.0，１mMのEDTA ，５％のグリセロール及び0.125％のブロムフェノールブルー）に再懸濁した。その再懸濁されたcDNAを65℃に５分間、加熱し、氷上で冷却し、そして0.8％低溶融アガロースゲル(SEA PLAQUE GTG^TM低溶融アガロース；FMC Corp.)上で電気泳動した。汚染アダプター及び長さ0.5kb以下のcDNAをゲルから切り出した。電極を逆にし、そしてcDNAを、レーン起点近くに濃縮されるまで、電気泳動した。濃縮されたcDNAを含むゲルの領域を切り出し、そして微小遠心管に配置し、そしてゲルスライスのおおよその体積を決定した。ゲルスライスの体積(300μｌ)の約３倍の水のアリコートを前記管に添加し、そしてアガロースを、65℃に15分間、加熱することによって溶融した。45℃へのサンプルの平衡化に続いて、５μｌの１Ｕ／μｌβ−アガロースＩ(New England Biolabs，Inc.)を添加し、そしてその混合物を45℃で90分間インキュベートし、アガロースを消化した。インキュベーションの後、40μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムをサンプルに添加し、そしてその混合物を氷上で15分間、インキ.ュベートした。サンプルを14,000×ｇで15分間、室温で遠心分離し、消化されていないアガロースを除去し、続いて、400孔サイズのゲル濾過カラム(Clontech Laboratories)を通してクロマトグラフィー処理した。cDNAをエタノール沈殿せしめ、70％エタノールで洗浄し、空気乾燥せしめ、そして連結されたEcoRＩアダプターをリン酸化するためのキナーゼ反応のために70μｌの水に再懸濁した。 70μｌのcDNA溶液に、10μｌの10×リガーゼ緩衝液（stratagene Cloning Sys tems）を添加し、そしてその混合物を65℃に５分間加熱した。その混合物を氷上で冷却し、そして16μｌの10mM ATP及び４μｌの10Ｕ／μｌ T4ポリヌクレオチドキナーゼ（Stratagene Cloning Systems）を添加した。その反応混合物を37℃ で１時間インキュベートし、そして65℃に10分間、加熱することによって停止し、続いて、フェノール／クロロホルム及びクロロホルムによる一連の抽出を行なった。リン酸化されたcDNAを、2.5Ｍの酢酸アンモニウムの存在下でエタノール沈殿せしめ、70％エタノールにより洗浄し、空気乾燥せしめ、そして10μｌの水に再懸濁した。リン酸化されたcDNAの濃度を、約40ｆモル／μｌであると推定した。ム(Stratagene Cloning Systems)中にEcoRＩ-XhoＩ cDNAを、供給者の説明書に従って連結することによって調製した。サブクローンを用いてPCRにより生成した。その反応混合物（50μ１の合計体積）は、１μｌの鋳型DNA、20ｐモルのプライマーAP2（Clontech Laboratories）、20ｐモルのプライマー9672（配列番号13）、５μｌの10×PCR緩衝液(Boehring er Mannheim)、５μｌの10mM dNTPs（Perkin-Elmer Corporation）、及び2.5μ ｌのTaqポリメラーゼ(Boehringer Mannheim)を含んだ。混合物を、94℃で１分間；50℃で１分間；72℃で1.5分間、30サイクル、次に72℃で７分間インキュベートした。得られる620bpの生成物をNarＩにより消化し、545bpのサイズに減じ、そして存在するあらゆる非コード配列を除去した。545bpのフラグメントを、アガロースゲル上での電気泳動により精製し、そしてプローブ73457と命名した。 K562ライブラリーを、26のNZYプレート上に37,000pfu／プレートでプレートした。フィルターリフトをHybond N(Amersham Corp．，Arlington Heights，IL)を用いて調製し、そして962,000pfuを、プローブ73457に対するハイブリダイゼーションによりスクリーンした。フィルターを３×SSC，0.1％SDSにより60℃で１時間、洗浄した。次に、フィルターを６×SSC，0.1％SDS，５×Denhardt's(5’t o 3’Inc.，Boulder，CO)、100μｇ／mlのニシン精子DNA(Research Genetics，H untsville，Alabama)において65℃で一晩、プレハイブリダイズした。前記プレハイブリダイゼーション溶液を除去し、そして1.7×10⁶cpm／mlのランダム−ラベルされた73457プローブを含む同じ溶液により交換し、そしてフィルターを65 ℃で一晩ハイブリダイズした。フィルターを65℃で0.2×SSC，0.1％SDSにより洗浄し、次にＸ−線フィルムに一晩、感光した。26の陽性体を、プラグとしてプレートから採取した。DNAをプラグから溶離し、そしてPCRにより増幅し、興味ある配列の存在を確認した。溶離されたファージ２μｌを、40ｐモルの個々のプライマー9672（配列番号13）及び9780（配列番号15）、５μｌの10×緩衝液(Boehrin ger Mannheim)、５μｌのdNTP（Perkin-Elmer Corporation）及び0.5μｌのTaq ポリメラーゼ(Boehringer Mannheim)を用いて増幅した。反応物を、94℃で１分間；50℃で１分間；72℃で１分間、35サイクル、次に72℃で７分間インキュベートした。５個の陽性体をさらに、単一プラークに精製した。cDNA挿入体を ing Systems，La Jolla，CA)を用いて除去した。DNAを、その得らる１つのクローンを、完全に配列決定し、そして配列番号２に示される十分なcD NA及び細胞質ドメインにおける追加の58のコドンを含むことが見出された。このクローンの配列は、配列番号４に示されている。例４ Human Multiple Tissue Northern Blots（Clontech Laboratories，Inc．からのHumanＩ,HumanII,HumanIII及びHuman Fetal II）を、プローブし、ZCytor 1発現の組織分布を決定した。160bpの13-13 PCRフラグメント（例１）を、ランダムプライミングにより、³²Ｐによりラベルした。ブロットを65℃で１〜６時間、Ex press Hybハイブリダイゼーション溶液(Clontech Laboratories，Inc.)においてプレハイブリダイズし、次に、２×10⁶cpm／mlの13-13プローブを含むExpress H ybにおいて65℃で1.5時間〜一晩ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションの後、ブロットを0.1×SSC，0.1％SDSにおいて50℃で洗浄した。約３kbの転写体をプローブされたすべての組織について見出し、そして脾臓、胸腺、末梢血液リンパ球及びリンパ節においてはひじょうに高レベルであった。胎盤においては、わずか1.0kbの転写体が検出された。この小さな転写体は、いづれか他の組織においては見出されなかった。例５メッセンジャーRNAを、マウス腎臓、肝臓、脾臓及び骨髄組織から、CsCl方法( Chirgwinなど.,Biochemistry 18：52-94，1979)により調製した。ポリ(A)⁺ RNA を、全RNAから、オリゴ（dT）セルロースクロマトグラフィー（Aviv and Leder ，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 69：1408-1412，1972)により調製した。二本鎖D NAを、市販のキット（RT-PCRキット；Stratagene Cloning Systems，La Jolla， CA）を用いて、１mgのmRNAから調製した。そのDNAを、オリゴヌクレオチドプライマー9736（配列番号16）及び9740（配列番号17）を用いてPCRによりZCytor 1 配列についてスクリーンした。PC R条件は、５μｌの10×緩衝液(Clontech Laboratories，Inc.)、10ngの一本鎖DN A鋳型、20ｐモルのプライマー、200μモルのdNTP及び１μｌのKlentaq DNAポリメラーゼ(Clontech Laboratories，Inc.)を、50μｌの合計体積で含んだ。反応混合物を、95℃で１分間、次に、94℃で30秒間；40℃で30秒間；72℃で45秒間、 30サイクル、続いて72℃で７分間インキュベートした。サンプルを、トリス−硼酸塩−EDTA緩衝液において100Ｖで１％アガロースゲル上で電気泳動した。予測されるサイズ(約200bp)のバンドを個々のサンプルにおいて観察し、そして最強のバンドは脾臓サンプルにおいて観察された。このバンドの続いての配列決定は、それがマウスZCytor 1であることを示した。脾臓、cDNA（例３に開示されるようにして実質的に調製された）を、哺乳類発現ベクターpHZ-1中にクローン化した。pHZ-1発現単位は、マウスメタロチオネイン−１プロモーター、コード配列の挿入のためのユニーク制限部位を含む複数のクローニングバンクを端に有するバクテリオファージＴ７プロモーター、ヒト成長ホルモンターミネーター及びバクテリオファージＴ７ターミネーターを含んで成る。さらに、pHZ-1は、複製のＥ．コリ起点；細菌βラクタマーゼ遺伝子；SV4 0プロモーター及び起点を含んで成る哺乳類選択マーカー発現単位；耐ネオマイシン性遺伝子、及びSV40転写ターミネーターを含む。100,000クローンから成るライブラリーを、それぞれ2500クローンの29プールに分け、そしてPCRにより試験した。PCRを、５μｌの10×緩衝液(Boehringer Mannheim)、0.5μｌのTaq DNA ポリメラーゼ(Boehringer Mannheim)、20ｐモルの個々のプライマー9826（配列番号18）及び9827（配列番号19）、200μモルのdNTP（Perkin Elmer）、及び0.5 μｌのアセチル化されたBSA(10mg／mlの原液、New England Biolabs，Beverly， MA）を、50μｌの合計体積で用いて実施した。反応を、94℃で30秒間；65℃で30秒間；72℃で１分間、３サイクル；次に94℃で30秒間；60℃で30秒間；72℃で１分間、３サイクル；次に94℃で30秒間；55℃で30秒間；72℃で１分間、４サイクル；次に94℃で30 秒間；50℃で30秒間；72℃で１分間、30サイクル；続いて72℃で10分間インキュベートした。試験されたプールの２つが陽性であった。２種の陽性プールの１つを、マウスZCytor 1 DNAを単離するために、プレート化及びスクリーニングのために選択した。１μｌのプールを用いて、エレクトロポレーションによりＥ．コリElectroMax DH1OB^TM細胞(Life Technologies，Inc. ，Gaithersburg，MD)を形質転換した。細胞を高い密度でLB AMPプレート上に広げた。コロニーを、荷電されたナイロン膜(Amersham Corp.，Arlington Heights ，IL)にプロービングのために移した。オリゴヌクレオチド9559（配列番号20）及び9560（配列番号21）を、Sambrookなど.,Molecular Cloning ：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989により開示されるようにしてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてラベルした。組込まれなかったヌクレオチドを、プッシュカラム（Stratagene Cloning Systems）を用いて精製することにより除去した。膜上のDNAを、標準の方法（Sambrookなど.,前記）に従って変性し、そして中和し、UVクロスリンカー（Strata に６×SSC，0.1％SDSにより洗浄し、細菌残骸を除去した。次に、フィルターを、３Ｍのトリメチルアンモニウムクロリド、0.1ＭのNaPO₄，pH6.8，１mMのEDTA ，５×Denhardt's,100μｇ／mlの一本鎖DNAにおいて53℃で１時間、プレハイブリダイズした。次に、フィルターを、2,000,000cpm／mlのプローブにより、上記条件を用いて53℃で一晩ハイブリダイズした。フィルターを、18時間後、６×SS C，0.1％SDS，0.05％ピロリン酸ナトリウムにおいて60℃までの温度で洗浄し、次にＸ−線フィルム上に配置した。陽性物を照射により同定し、そしてコロニーを採取した。DNAの正体を配列決定及び診断PCR反応により確証した。 7.2及び11.2と称する２種の陽性クローンは、同一であることが見出され、そしてマウスZCytor 1をコードすることが決定された。その挿入体は、ヒトZCytor 1（配列番号３）のＮ−末端側の５個のアミノ酸に対応するコドンを欠いていたが、しかし十分な長さのクローンの連続する単離のために必要とされる必須配列情報を示した。例６十分な長さのマウスZCytor 1 DNAを、BaF3細胞DNAからPCRにより単離した。突然変異誘発されたBaF3細胞系（24-11細胞系；WIPO公開WO 95／21930号に開示される）のノザンブロット分析は、ZCytor 1の発現を示した。ベクターpDXES(EcoR Ｉ-XhoＩ末端により合成されたcDNAの方向的クローニングを促進するためのポリリンカーを含む哺乳類細胞発現ベクター；WIPO公開WO 95／21930号に開示される）中にクローン化された24-11 DNAを含んで成るプラスミドプールを、Magic min iprepキット（Promega Corp.，Madison，WI）により調製した。それぞれ10,000 個のコロニーを表わす51のプールを調製した。プールを、PCR反応及び２対のプライマーを用いてスクリーンした。反応混合物は、４μｌのプールDNA；２μｌ（40pモル）の個々のプライマー9745（配列番号22）及び9757（配列番号23）、又はプライマー9996（配列番号24）及び10002( 配列番号25)；５μｌのdNTP(Perkin Elmer);５μｌの10×Taqポリメラーゼ緩衝液；0.5μｌのTaq DNAポリメラーゼ(Boehringer Mannheim)；及び31.5μ ｌのdH₂Oを含んだ。反応を、94℃で１分間；55℃で１分間；72℃で１分間、35サイクル、続いて72℃で７分間、インキュベーションを行なった。２種のプール、すなわちTa34及びTa43はそれぞれ、プライマー9745及び9757を有する448bpの生成物、及びプライマー9996及び10002を有する425bpの生成物を示した。次に、Ta34及びTa43からの小さなプールをスクリーンした。反応を上記のようにして実施した。但し、１μｌのプールDNA及び34.5μｌのH₂O及びプライマー97 45（配列番号22）及び9757（配列番号23）を用いた。Ta34からの小さなプールの１つは、448bpのバンドを示した。プライマー9996（配列番号24）及び10002(配列番号25)によるスクリーニングは、プールTa43からの小さなプールの１つからの425bpのバンドを生成した。追加のスクリーニングは、それらのプールにおけるZCytor 1 DNAの存在を確かめた。２種の陽性の小さなプールからのDNAを、応答能のあるＥ．コリ細胞(FJ P 101 細胞；Life Technologies，Inc.)中にエレクトロポレーションにより形質転換した。40μｌの応答能のある細胞及び１μｌのDNAを氷上で組み合せた。細胞を、1 .8kV，200Ω，25μＦでエレクトロポレーションした。前記混合物を１mlの室温のSOC(20％のBacto^TM、トリプトン（Difco，Detroit，MI）、0.5％のBacto^TM酵母抽出物(Difco)、10mMのNaCl，2.5mMのKCl，10mMのMgCl₂，10mMのMgSO₄，20mM のグルコース）に添加した。細胞懸濁液の10^-1，10^-2及び10^-3希釈溶液10μｌを、LB⁺アンピシリンプレート上に配置した。コロニーを、37℃で一晩増殖した。 ZCytor 1 DNAの存在をスクリーンするために、コロニーをフィルターに移し、 1.5ＭのNaClを含む0.5ＮのNaOHにおいて変性し、そして１Ｍのトリス、pH7.5，1 .5ＭのNaClにおいて中和した。DNAを、UV架橋剤を用いてフィルターに架橋した。フィルターを、65℃で、２×SSC，0.1％SDSにより洗浄し、次に、６×SSC，0.1％SDS，５×Denhardt's ,0.1mg／mlのニシン精子DNAにおいて65℃で３時間、プレハイブリダイズした。フィルターを、市販のキット（Maltiprime^TM DNAラベリングシステム；Amersham Corp.）を用いて³²PαdATPによりラベルされている、上記に開示される448bpの PCR生成物によりプローブした。プローブを、プッシュカラム（Stratagene Clon ing Systemsから得られる）上で精製した。フィルターを、65℃で３時間、プローブ（プレハイブリダイゼーション溶液１ml当たり1.7×10⁶cpm）にハイブリダイズせしめた。次に、フィルターを、0.2×SSC，0.1％SDSにより室温で４度（手短なすすぎ）、室温で20分間、次に65℃で２×20分間、洗浄した。フィルターをＸ−線フィルムに、−80℃で３時間、露光した。個々の組のエレクトロポレーションからの１つの陽性コロニーを採取した。液体及び固体培養物を、LB＋アンピシリンを用いて調製した。 DNAを、mniprep方法により培養物から調製し、そして制限エンドヌクレアーゼ消化、及びベクター及び内部プライマーを用いてのPCRにより分析した。10個のコロニーを個々の組から採取し、そして内部プライマー9745（配列番号22）及び 9757（配列番号23）を用いてのPCRによりスクリーンした。２μｌの個々のプライマー；５μｌのdNTP（Perkin-Elmer Corporation）；５μｌの10×Taqポリメラーゼ緩衝液(Boehringer Mannheim)；0.5μｌのTaq DNAポリメラーゼ(Boehring er Mannheim);及び35.5μｌのdH₂Oを含む反応混合物を管に配置し、そして個々のコロニーを添加した。反応を、94℃で１分間；55℃で１分間；72℃で１分間、 35サイクル、続いて72℃で７分間インキュベーションを実施した。個々の組からの１つの正しいコロニーを、LB＋アンピシリンプレート上に画線培養した。２種の陽性コロニーを配列決定し、そして両者は十分な長さのZCytor 1をコードすることが見出された。１つのクローンである、T1323Dを、発現ベクター構成のために選択した。T1323D挿入体のヌクレオチド配列及び准定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号６及び７に示されている。マウス及びそれより長いヒト（配列番号５）配列の整合は、約62％のアミノ酸配列同一性を示す。例７ポリヒスチジン−標識された可溶性マウスZCytor 1をコードする発現ベクターを構成した。その一次翻訳生成物は、分泌ペプチド、及びZCytor 1の細胞外ドメイン、続いてスペーサーペプチド（Gly-Gly-Ser-Gly；配列番号26）及び６個のヒスチジン残基を含んだ。十分な長さのマウスZCytor 1クローンである、T1323Dを、EcoRＩ及びApaＩにより消化し、そして1500bpのフラグメントを回収した。第２ DNAフラグメントを、鋳型としてT1323を用いてPCRにより生成した。100 ngのプラスミドDNAを、20ｐモルの個々のプライマー10302（配列番号27）及び10 305(配列番号28)、５μｌの10×緩衝液(Clontech Laboratories，Inc.)、５μｌの10mM dNTP(Perkin-Elmer Corporation)及び１μｌのKlentaqポリメラーゼ(Clo ntech Laboratories，Inc.)と共に、50μｌの合計体積で組み合せた。反応を、9 4℃で１分間；450℃で１分間；72℃で１分間、15サイクル、続いて72℃で７分間インキュベーションを実施した。得られる440pbの生成物を、ApaＩ及びXhoＩにより消化し、そして１％アガロースゲル上で電気泳動した。65bpのフラグメントをゲルから溶出し、そして回収した。次に、1500bp及び65bpのフラグメントを、EcoRＩ及びXhoＩにより切断されたプラスミドpHZ200 HIS TAGに連結した。このプラスミドは、マウスメタロチオネイン−１プロモーター；コード配列の挿入のためのユニーク制限部位を含む複数のクローニングバンクを端に有するバクテリオファージＴ７プロモーター；ヒト成長ホルモンターミネーター；バクテリオファージＴ７ターミネーター；複製のＥ．コリ起点；細菌βラクタマーゼ遺伝子；SV40プロモーター及び起点；DHFR遺伝子、及びSV40転写ターミネーターを含んで成る哺乳類選択マーカー発現単位；及びMT-1プロモーターの下流のＣ−末端ポリヒスチジン標識をコードする配列を含んで成る哺乳類細胞発現ベクターである。Ｅ．コリ DH10B細胞を、得られる構造体により形質転換し、そしてプラスミドDNAを、４種のコロニーから、アルカリ溶解方法(Sambrookなど.,Molecular Cloning ：A Labo ratory Manual ，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)により調製した。プラスミドDNAの一部を配列決定し、その正体を確かめ、次に、リポソーム−介在トランスフェクション(Lipofectamine^TM試薬、Life Tcichnologies ，Inc.)によりBHK 570細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、１μＭのメトトレキセートにおいて選択した。ならされた血清フリーの培地を集め、そして可溶性受容体ポリペプチドをニッケル−アガロース樹脂（Gi agen，Inc.，Chatsworth，CA）上で単離した。単離されたタンパク質を、7.5％ SDS−ポリアクリルアミドゲル(Integrated Separation Systems，Natick，MA)上で電気泳動した。約75kDのバンドが観察された。例８ヒト及びマウスZCytorl 1-IgG融合タンパク質をコードする発現ベクターを構成した。前記融合体は、IgGg1（Ellisonなど.,Nuc ．Acids Res．10：4071-4079 ，1982）のFc部分のヒンジ部分に、そのＣ−末端（ヒトZCytor 1の残基514、配列番号３；マウスZCytor 1の残基508、配列番号７）で融合される個々のZCytor 1の細胞外ドメインを含んでいた。ヒンジ部分を変性し、融合タンパク質の二量体化に基づいて、対合されていないシステインを回避するためにセリンによりシステイン残基を置換した。ヒトZCytor 1 DNAフラグメントを、K7-1-1 P1(例３)鋳型から調製した。0.177 kbのApaLＩ-BalIIフラグメントを、１μｌのオリゴヌクレオチドプライマーZG10 381(配列番号29)及び4.9μｌのZG10390(配列番号30)を用いてPCRにより調製した。プライマーを、１μｌの鋳型DNA、10μｌの2.5mM dNTP (Perkin-Elmer Corp.) 、10μｌの10×緩衝液(Klentaq PCR緩衝液、Clontech Laboratories，Inc.)、２ μｌのKlentaq DNAポリメラーゼ(Clontech Laboratories，Inc.)、及び71.1μｌの水と共に組み合せた。反応を、94℃で１分間；55℃で１分間、及び72℃で２分間、35サイクル；続いて72℃で７分間、インキュベーションを行なった。反応生成物を、フェノール／CHCl₃により抽出し、エタノールにより沈殿せしめ、そしてBglIIにより消化した。DNAをアガロースゲル上で電気泳動し、そして177bpのフラグメントをゲルスライスから電気泳動的に溶離し、フェノール／CHCl₃抽出により精製し、そしてエタノールにより沈殿せしめた。第２フラグメント(1.512 kb)を、EcoRＩ及びApaLＩによる消化によりcDNAから単離した。ヒトIgGg1クローンを、オリゴヌクレオチドプライマーZG10314(配列番号31)及びZG10315(配列番号32)を用いてPCRにより、ヒト胎児肝臓cDNAライブラリー(Clo ntech Laboratories，Inc.)から単離した。前者のプライマーを、ヒンジ部分(Ly sからArgにヒンジ部分の第３残基を変更している)中にBglII部位を導入し、そしてヒンジ部分の第５残基(Cys)をSerにより置換した。PCRを、ZCytor 1反応について上記に記載されるようにして実質的に実施した。DN AをEcoRＩ及びXbaＩにより消化し、そして0.7kbのフラグメントを、アガロースゲル電気泳動、電気溶離、フェノール／CHCl₃抽出及びフェノール沈殿により回収した。IgGをコードするフラグメント及びXhaＩ−EcoRＩリンカーを、EcoRＩにより消化され；そしてウシ腸ホスファターゼにより処理されているZem229R(ATCC 寄託番号第69447)中に連結した。得られるプラスミドを、Zem229R IgGr1 ＃488 と命名した。ヒトZCytor 1-IgG融合体のための発現ベクターを構成するために、Zem229R Ig Gr1 ＃488をEcoRＩ及びBglIIにより消化した。線状化されたベクターを、２種のヒトZCytor 1フラグメントに連結した。得られる構造体を、hZYCTOR-1／IgG ＃6 41と命名した。マウスZCytor 1 DNAフラグメントを、T1323D（例６）鋳型から調製した。0.37 9kbのKpnＩ-BglIIフラグメントを、オリゴヌクレオチドプライマー10382(配列番号33)及び10388(配列番号34)を用いて、本質的に上記のようにしてPCRにより調製した。PCR生成物をApaＩにより消化し、そしてゲル精製し、46bpのApaＩ-BglI Iフラグメントを生成した。1.5kbのフラグメントを、EcoRＩ及びApaＩによる消化によりmZCYTOR-1 T1323から調製した。２種のマウスDNAフラグメントを、EcoRＩ及びBglIIにより消化されているZem2 29R IgGr1 ＃488に連結した。得られる構造体を、mZYCTOR-1／1gG ♯632と命名した。マウス及びヒトZCytor 1／IgG融合構造体をそれぞれ、リポソーム介在トランスフェクションによりBHK-570細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクタントを、１μＭのメトトレキセートを含む培地において10日間、培養した。融合タンパク質を、プロテインＡ−セファロースを用いて細胞−ならし培地から精製した。精製されたタンパク質を用いて動物（マウス又はウサギ）を免疫化し、抗−受容体抗体を生成した。アッセイへの使用のためにBIAcore^TMバイオセンサーに結合された融合タンパク質をまた使用した。例９ヒト及びマウスZCytor 1タンパク質を、Ｅ．コリマルトース結合タンパク質(M BP)の後に、インフレーム融合体としてＥ．コリにおいて発現した。得られるMBP -ZCytor 1融合タンパク質を、アミロース−セファロースマトリックス上での親和性クロマトグラフィーにより精製した。精製されたタンパク質を続いて、ラット及びウサギにポリクローナル抗体応答を誘発するために使用した。ヒトZCytor 1 cDNAのリガンド結合ドメインコード配列を、十分な長さの配列を含むプラスミド(K7-1-1 P1)から増幅した。PCR増幅を、Taqポリメラーゼ及び緩衝液（両者とも、Boehringer Mannheimから得られた）、及び20ｐモルの個々のプライマー10123(配列番号35)及び10116(配列番号36)を用いて、従来の反応条件下で実施した。反応を、94℃で30秒間；50℃で30秒間；及び72℃で１分間、30 サイクル；続いて72℃で６分間、インキュベートした。反応生成物を、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（24：24：１）による抽出により精製し、エタノールにより沈殿せしめ、そしてBamHＩ及びEcoRＩにより消化した。二本鎖リンカーを、オリゴヌクレオチド10124(配列番号37)及び10122(配列番号38)を用いて調製した。オリゴヌクレオチドをアニーリングし、そしてキナーゼ処理した。得られるリンカーは、zCytor 1コード配列の５’末端、並びにXmn Ｉ及びBamHＩ切断部位を供給した。発現ベクターを構成するために、プラスミドpMAL^TM-C2（New England Biolabs ）を、XmnＩ及びEcoRＩにより消化し、そしてウシ腸ホスファターゼにより処理した。線状化されたベクター及び精製されたPCR生成物をゲル電気泳動により精製した。ベクター、挿入体及びリンカーを連結し、そして得られる構造体を用いて、Ｅ．コリMC1061(Clontech Laboratories，Inc.) を形質転換した。個々のコロニーを、さらなる研究のために選択した。所望する融合構造体を有するコロニーを、プラスミドDNAの制限分析により同定した。正しい構造体を、配列決定により確証し、そしてpSDH38と命名した。マウスZCytor 1リガンド結合ドメインをコードするDNAを、鋳型として十分な長さの配列を含むプラスミド、及びオリゴヌクレオチドプライマー10182(配列番号39)及び10200(配列番号40)を含むプラスミドを用いてPCRにより増幅した。反応を、ヒト配列のために上記のようにして実施した。精製されたPCR生成物を、B amHＩ及びXhoＩにより消化した。二本鎖リンカーを、オリゴヌクレオチド10184(配列番号41)及び10183(配列番号42)を用いて調製した。オリゴヌクレオチドをアニールし、そしてキナーゼ処理した。得られるリンカーは、ZCytor 1コード配列の５’末端、並びにXmnＩ及びBamHＩ切断部位を供給した。発現ベクターを構成するために、プラスミドpMAL^TM-C2をXmnＩ及びSalＩにより消化し、そしてウシ腸ホスファターゼにより処理した。線状化されたベクター及び精製されたPCR生成物を、ゲル電気泳動により精製1した。ベクター、挿入体及びリンカーを連結し、そしてその得られる構造体を用いて、Ｅ．コリMC1061(C lontech Laboratories，Inc.)を形質転換した。個々のコロニーをさらなる研究のために選択した。所望する融合構造体を有するコロニーを、プラスミドDNAの制限分析により同定した。正しい構造体を、配列決定により確証し、そしてpCZR 154と命名した。 MBP::ZCytor 1融合構造体を担持するＥ．コリMC1061株を、100μｇ／mlのアンピシリンを含む５mlのTerrificブイヨン（１ｌ当たり、12ｇのBacto^TMトリプトン(Difco Laboratories，Detroit，MI)、24ｇのBacto^TM酵母抽出物（Difco Labo ratories）、9.2ｇのリン酸カリウム二塩基、2.2ｇのリン酸カリウム−塩基、及び４mlのグリセロールを含む）中に、新鮮なLB＋Ampプレートから、10⁷個の細胞／ml(OD⁶⁰⁰＝0.1)のおおよその密度に接種した。37℃での２時間の増殖の後、融合タンパク質の発現を、IPTGを添加し、１mMの最終濃度にすることによって誘発した。培養物を、さらに３時間インキュベートした。タンパク質抽出物を、SDS-PAGE及びウェスターンブロットによる続く分析のためにIPTG−誘発された及び誘発されていない対照培養物から調製した。１mlの培養物を、遠心分離により収穫し、そして細胞ペレットを、0.01％のブロムフェノールブルー及び２％のβ−メルカプトエタノールを含む400μｌのThorner緩衝液（８Ｍの尿素、５％のSDS、10％のグリセロール、100mMのトリス、pH7.0、２mM のEDTA）において、100μｌのガラスビーズと共に激しくかきまげ、そして65℃ に加熱することによって粉砕した。次に、サンプルを煮沸し、そして遠心分離により澄ました。その澄まされたサンプルの２μｌアリコートを、８〜16％のSDS −ポリアクリルアミドグリシンゲル（Novex，San Diego，(A)上での電気泳動により分析した。クーマシーブルーによる染色は、誘発されていない細胞に存在しない、誘発されたサンプルにおける66kDバンドの存在を示した。抗−MBP血清(Ne w England Biolabs)によるウェスターンブロットは、誘発されたバンドが所望するヒト及びマウスMBP::ZCytor 1融合タンパク質であったことを示した。マウス(pCZR154)又はヒト（pSDH38）ZCytor 1発現ベクターを含むIPTG−誘発されたＥ．コリ細胞の大きな（１ｌ）培養物を調製した。細胞を10 0μ／mlのアンピシリンを含むTerrificブイヨン中で増殖させた。MBPベクターにより供給される発現及び精製プロトコールに従った。精製されたタンパク質のSD S-PAGE分析は、融合物が合計タンパク質の70％以上を示したことを示唆した。個々の融合タンパク質の十分な量を調製し、ラット及びウサギの免疫化及び得られる抗体の親和性精製を可能にした。前述から、本発明の特定の態様が例示目的のために本明細書に記載されて来たが、種々の修飾が本発明の範囲内で行なわれ得ることが理解されるであろう。従って、本発明は、付随する請求の範囲を除いて、制限されない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者フォスター，ドナルドシー. アメリカ合衆国，ワシントン 98155，シアトル，ノースイーストワンハンドレットエイティファーストストリート 3002 (72)発明者グラント，フランシスジェイ. アメリカ合衆国，ワシントン 98115，シアトル，サーティセブンスアベニュノースイースト 7714 (72)発明者スプレッシャー，シンディエー. アメリカ合衆国，ワシントン 98115，シアトル，サーティナインスアベニュノースイースト 8207

Claims

【特許請求の範囲】 1. （ａ）配列番号３の残基33〜235；（ｂ）（ａ）の対立遺伝子変異体：及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に対して少なくとも60％の同一性を有する配列、から成る群から選択されたアミノ酸の配列を含んで成るリガンド−結合受容体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。 2. 前記ポリペプチドがさらに、フィブロネクチン型IIIドメインを含んで成る請求の範囲第１項記載の単離されたポリヌクレオチド。 3. 前記ポリペプチドが、（ａ）配列番号３の残基33〜514；（ｂ）配列番号７の残基25〜508；及び（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の対立遺伝子変異体、から成る群から選択されたアミノ酸の配列を含んで成る請求の範囲第２項記載の単離されたポリヌクレオチド。 4. 前記ポリペプチドがさらに、トランスメンブランドメインを含んで成る請求の範囲第１項記載の単離されたポリヌクレオチド。 5. 前記トランスメンブランドメインが、（ａ）配列番号３の残基515〜540；（ｂ）配列番号７の残基509〜533；又は（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の対立遺伝子変異体、を含んで成る請求の範囲第４項記載の単離されたポリヌクレオチド。 6. 前記ポリペプチドがさらに、細胞内ドメインを含んで成る請求の範囲第４項記載の単離されたポリヌクレオチド。 7. 前記細胞内ドメインが、（ａ）配列番号３の残基541〜578；（ｂ）配列番号５の残基541〜636；（ｃ）配列番号７の残基534〜623；又は（ｄ）（ａ），（ｂ）又は（ｃ）の対立遺伝子変異体、を含んで成る請求の範囲第６項記載の単離されたポリヌクレオチド。 8. 前記ポリペプチドが、（ａ）配列番号３の残基33〜235；（ｂ）配列番号７の残基25〜229；又は（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の対立遺伝子変異体、を含んで成る請求の範囲第１項記載の単離されたポリヌクレオチド。 9. 前記ポリペプチドが、（ａ）配列番号３の残基33〜578；（ｂ）配列番号５の残基33〜636；（ｃ）配列番号７の残基25〜623；又は（ｄ）（ａ），（ｂ）又は（ｃ）の対立遺伝子変異体、を含んで成る請求の範囲第１項記載の単離されたポリヌクレオチド。 10．前記ポリペプチドがさらに親和性標識を含んで成る請求の範囲第１項記載の単離されたポリヌクレオチド。 11．前記親和性標識が、ポリヒスチジン、プロテインＡ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、サブスタンスＰ、マルトース結合タンパク質、又は免疫グロブリンＨ鎖不変領域である請求の範囲第10項記載の単離されたポリヌクレオチド。 12．前記ポリヌクレオチドがDNAである請求の範囲第１項記載の単離されたポリヌクレオチド。 13．（ａ）配列番号２のヌクレオチド23〜ヌクレオチド1756に示されるヌクレオチドの配列；（ｂ）配列番号４のヌクレオチド139〜ヌクレオチド2046に示されるヌクレオチドの配列；又は（ｃ）配列番号６のヌクレオチド11〜ヌクレオチド1879に示されるヌクレオチドの配列、を含んで成る請求の範囲第12項記載の単離されたポリヌクレオチド。 14．転写プロモーター；分泌ペプチド及びリガンド−結合受容体ポリペプチドをコードするDNAセグメント、ここで前記ポリペプチドは、（ａ）配列番号３の残基33〜235；（ｂ）（ａ）の対立遺伝子変異体；及び（ｃ）（ａ）及び（ｂ）に対して少なくとも60％の同一性を有する配列から成る群から選択されたアミノ酸の配列を含んで成り；及び転写ターミネーターを含んで成り、ここで前記プロモーター、DNAセグメント及びターミネーターが操作可能的に連結されている発現ベクター。 15．前記ポリペプチドがさらに、フィブロネクチン型IIIドメインを含んで成る請求の範囲第14項記載の発現ベクター。 16．前記ポリペプチドが、（ａ）配列番号３の残基33〜514；（ｂ）配列番号７の残基25〜508；及び（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の対立遺伝子変異体、から成る群から選択されたアミノ酸の配列を含んで成る請求の範囲第15項記載の発現ベクター。 17．前記ポリペプチドがさらに、トランスメンブランドメインを含んで成る請求の範囲第14項記載の発現ベクター。 18．前記トランスメンブランドメインが、（ａ）配列番号３の残基515〜540；（ｂ）配列番号７の残基509〜533；又は（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の対立遺伝子変異体、を含んで成る請求の範囲第17項記載の発現ベクター。 19．前記ポリペプチドがさらに、細胞内ドメインを含んで成る請求の範囲第14 項記載の発現ベクター。 20．前記細胞内ドメインが、（ａ）配列番号３の残基541〜578；（ｂ）配列番号５の残基541〜636；（ｃ）配列番号７の残基534〜623；又は（ｄ）（ａ），（ｂ）又は（ｃ）の対立遺伝子変異体、を含んで成る請求の範囲第19項記載の発現ベクター。 21．前記ポリペプチドが、（ａ）配列番号３の残基33〜235；（ｂ）配列番号７の残基25〜229；又は（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の対立遺伝子変異体、を含んで成る請求の範囲第14項記載の発現ベクター。 22．前記ポリペプチドが、（ａ）配列番号３の残基33〜578；（ｂ）配列番号５の残基33〜636；（ｃ）配列番号７の残基25〜623；又は（ｄ）（ａ），（ｂ）又は（ｃ）の対立遺伝子変異体、を含んで成る請求の範囲第14項記載の発現ベクター。 23．次の操作可能的に連結された要素：（ａ）転写プロモーター；（ｂ）分泌ペプチド及びキメラポリペプチドをコードするDNAセグメント、ここで前記キメラポリペプチドは、ペプチド結合により連結される、第１部分及び第２部分から実質的に成り、前記第１部分は、（ｉ）配列番号３に示される受容体ポリペプチド；（ii）（ｉ）の対立遺伝子変異体；及び（iii）（ｉ）又は（ii）に対して少なくとも60％の同一性を有する受容体ポリペプチドから成る群から選択された受容体ポリペプチドのリガンド結合ドメインから実質的に成り、そして前記第２部分が親和性標識から実質的に成り；及び（ｃ）転写ターミネーター、を含んで成る発現ベクター。 24．前記親和性標識が、免疫グロブリンFcポリペプチド、ポリヒスチジン、プロテインＡ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、又はサブスタンスＰである請求の範囲第23項記載の発現ベクター。 25．前記第１部分が、（ａ）配列番号３の残基33〜514；（ｂ）配列番号７の残基25〜508；及び（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の対立遺伝子変異体から成る群から選択されたアミノ酸の配列から実質的に成る請求の範囲第24項記載の発現ベクター。 26．請求の範囲第14項記載の発現ベクターを導入されている、DNAセグメントによりコードされる受容体ポリペプチドを発現する培養された細胞。 27．前記細胞が、gp130又は白血病阻害因子受容体をさらに発現する請求の範囲第26項記載の細胞。 28．前記細胞が、外因的に供給される、増殖のための造血成長因子に依存する請求の範囲第26項記載の細胞。 29．（ａ）配列番号３の残基33〜235；（ｂ）（ａ）の対立遺伝子変異体；及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に対して少なくとも60％の同一性を有する配列から成る群から選択されたセグメントを含んで成る単離されたポリペプチドであって、ここで前記ポリペプチドが、造血受容体と通常関係しないトランスメンブラン及び細胞内ドメインを実質的に有さないことを特徴とするポリペプチド。 30．親和性標識をさらに含んで成る請求の範囲第29項記載のポリペプチド。 31．前記親和性標識が、ポリヒスチジン、プロテインＡ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、サブスタンスＰ、マルトース結合ドメイン、又は免疫グロブリンFcポリペプチドである請求の範囲第30項記載のポリペプチド。 32．固体支持体上に固定される請求の範囲第29項記載のポリペプチド。 33．ペプチド結合により連結される第１部分及び第２部分から実質的に成るキメラポリペプチドであって、前記第１部分が、（ａ）配列番号３に示される受容体ポリペプチド；（ｂ）（ａ）の対立遺伝子変異体；及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に対して少なくとも60％の同一性を有する受容体ポリペプチドから成る群から選択された受容体ポリペプチドのリガンド結合ドメインから実質的に成り、そして前記第２部分４が親和性標識から実質的に成ることを特徴とするキメラポリペプチド。 34．前記親和性標識が免疫グロブリンFcポリペプチドである請求の範囲第33項記載のポリペプチド。 35．前記第１部分が、（ａ）配列番号３の残基33〜514；（ｂ）配列番号７の残基25〜508；及び（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の対立遺伝子変異体から成る群から選択されたアミノ酸の配列から実質的に成る請求の範囲第33項記載のポリペプチド。 36．試験サンプル内のリガンドを検出するための方法であって、試験サンプルと、（ａ）配列番号３の残基33〜235；（ｂ）（ａ）の対立遺伝子変異体；及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に対して少なくとも60％の同一性を有する配列から成る群から選択されたセグメントを含んで成るポリペプチドとを接触せしめ；そして前記サンプルにおけるリガンドに対する前記ポリペプチドの結合性を検出することを含んで成る方法。 37．前記ポリペプチドが、（ａ）配列番号３の残基33〜235；（ｂ）配列番号７の残基25〜229；又は（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の対立遺伝子変異体を含んで成る請求の範囲第36項記載の方法。 38．前記ポリペプチドが、（ａ）配列番号３の残基33〜514；（ｂ）配列番号７の残基25〜508；及び（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の対立遺伝子変異体から成る群から選択されたアミノ酸の配列を含んで成る請求の範囲第36項記載の方法。 39．前記ポリペプチドがさらに、トランスメンブラン及び細胞内ドメインを含んで成る請求の範囲第36項記載の方法。 40．前記ポリペプチドが培養された細胞内に結合される膜であり、そして前記検出段階が前記培養された細胞における生物学的応答を測定することを含んで成る請求の範囲第39項記載の方法。 41．前記生物学的応答が、細胞増殖、又はレポーター遺伝子の転写の活性化である請求の範囲第40項記載の方法。 42．前記ポリペプチドが固体支持体上に固定される請求の範囲第36項記載の方法。 43．請求の範囲第29項記載のポリペプチドに対して特異的に結合する抗体。