TW565570B - Human IL-13 receptor beta - Google Patents

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本發明係關於具有對間白素·π (IL_13)具專一受體活性 之純化多肽類’其生物學上具活性之片段，與相對應之核 酸序列，以及其應用。 IL-13為最近經鑑定（丨’2)具有112個胺基酸，由 經活化T淋 巴細胞’ B淋巴細胞與於活化作用後之肥胖細胞所分泌之 細胞活素。 由於其與IL-4共同具有許多生物學性質，几_13已摘述為 一種類-IL-4細胞活素。其活性脅確與比^於B細胞（3·5)， 單核細胞（6-10)及其他非_造血細胞（η_12)上之作用相似。 另一方面，與IL-4相反地，其對休眠狀態或經活化τ細胞 具有特別之功效（13)。 IL-13對單核細胞/巨噬細胞，Β淋巴細胞與特定造血先 驅物之各種生物學活性，已詳述於AJ明提（Minty)，以及 IL-13之回顧文章中（參見，例如實施例14)。又，有些數據 指出’此細胞活素對其他類細胞具有多向性之功效。此等 直接受IL-13影響之非造血細胞為内皮與小神經膠質細 胞’角質細胞及腎與結腸癌細胞。 IL-13之抗發炎與免疫調節活性可用於，例如，治療自體 免疫，腫瘤及病毒病理學上。— 然而’此等生物學性質於臨床層次上之利用，需要有關 此等作用運作時所憑藉之訊號與機制的完整知識，使得能 夠在相關病理學上控制及調整它們。 -4- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 565570 A7 B7五、發明説明（2 ) 於對由細胞内生物分子所傳遞之訊號的分析中，其中階 段之一包含鑑定其膜上受體。該等對IL-13受體所完成之 最終研究顯示，IL-13與IL-4具有同一受體，或至少為某些 相同受體複合物之組成，以及同一訊號傳導物質（15-18)。 此受體表現於各類細胞之表面，其數量根據所認定之細胞 類型而變。A. J.明提（14)已指出IL-13與IL-4受體之比較性分 佈。 康朵（Kondo)等人（19)已描述具-有對IL-4高親和性之受體 的結構。此受體為一種二聚體，藉由具140 kDa之糖蛋白 (IL_4R)與IL·2受體的γ鏈（γ〇之結合而形成。IL-4可以高親和 性（Kd介於50至100 ρΜ)與具140 kDa之糖蛋白次單位（IL-4R 或gp 140)結合（15)。然而，此親和性當yc鍵與gp 140結合 時，可增加2至3倍。此外，此結合係藉由IL-4居間參與之 特定訊號傳遞所必需（19，20)。 與IL-13或與IL-4結合之交叉-競爭實驗已證實，IL-4可正 常地阻止IL-13之結合，而IL-13通常僅部份地阻止IL-4與其 受體結合（17，21)且無法與IL-4兩次單位之任一者結合，或 與藉由此二者之聯合而形成的複合體結合。基於此等觀 察，本發明之作者假定對IL-13具專一性之受體係由IL-4與 另一 IL-13-結合組成（IL-13RP)聯合'之受體複合體組成。 於能夠反應IL-13及IL-14 (TF-1系）而增生之紅白血病細胞 系上所進行之研究顯示，此兩種細胞活素在與其受體結合 -5-

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線 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 565570 A7 _B7_._ 五、發明説明（3 ) 後產生相似的細胞内反應（18)。相似地，交聯實驗顯示gp 140可與γ鏈.，或與新穎次單位（具有分子量55至70 kDa)形 成雜二聚體（17，21)。 又，最近於老鼠胚幹細胞系上所進行之研究，已可分離 出編碼具424胺基酸殘基之多肽（IL-13Ra)的基因組DNA與 cDNA，其暗示IL-13受體與IL-4受體共用同一鏈，而使能構 築高親和性之受體(22，23)，也就是說，其具有常數Kd值 介於約10 pM與100 pM之間的親卞性（低-親和性受體具有 常數Kd值介於2nM至10 nM之間）。 於醫學層級上，由於詳細了解IL-4及IL_13之現象與調節 作用，且尤其係能夠分開並各別控制由此二種細胞活素所 產生之作用而賦予之重要性，是以本發明作者一方面有興 趣於對IL-13高親和性而專一結合之多肽的特徵化，以及 另一方面有興趣於另一種單獨時以低親和性與IL-13專一 結合，而若與IL-4受體聯合時，即構築成對IL-13具高親和 性之受體的多肽之特徵化。 此等作者現已鑑定出一種以高於其他已知人類腎癌細胞 系（21)之量表現對IL-13具專一性受體之人類癌細胞系，且 已完成可對IL-13與IL-4/IL-13受體之結合（稱為IL-13RP)具 反應之主要次單位的選殖，以及1由IL-13受體與IL-4受體所 共有，以構成能使該2細胞活素之間產生交叉競爭作用之 共同鏈（稱為IL-13Ra)之選殖。因此本發明關於經純化專 -6- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 565570 A7 B7 五、發明説明（ ） 一地與IL-13鍵聯之多肽。 更特別地，本發明之標的物為其胺基酸序列對應於對IL-13具專一性受體（IL-13RP及IL-13Ra)之胺基酸序列的經純 化多肽，或其生物學上具活性片段。 本發明之標的物亦為編碼該多肽或其生物學上具活性片 段之經分離DNA序列。 此外，其關於含有至少一種如上所定義之核嘗酸序列的 表現載體，及以此等表現載體t可令該等核苷酸複製及/ 或表現之條件下轉感染之宿主細胞。 用以藉由經轉感染之宿主細胞製造重組型IL-13RP與IL-13Ra或其生物學上具活性片段之方法，亦為本發明之一 部分。 本發明亦包含，調節由IL-13所產生之免疫學上或發炎機 制之醫藥組合物，其包含IL-13Rp及/或IL-13Ra或其生物學 上具活性之片段。此外，其關於用以鑑定能夠調節IL-13ΙΙβ及/或IL-13Ra活性之試劑的方法，以及IL-13RP及/或 IL-13Ra或其片段用以篩選此等試劑，與用以製造能夠調 整IL-13受體活性之新穎產品的用途。 本發明亦包含對IL-13Rp及/或IL-13Ra具專一性之抗體或 控體衍生物。 最後，其關於用以調節由IL-13居間參與之免疫反應的治 療方法，其包含對患者投藥一種IL-13RP及/或IL-13Ra或其 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 裝 訂

565570 A7 B7 五、發明説明（ ） 生物學上具活性片段，或一種能夠專一地調節此受體活性 之化合物，與醫藥上可接受載體之組合物。 於以下本發明之說明中，使用下列定義： —以高親和性專一與IL-13結合之多肽（IL-13RP): —種包含 胺基酸序列SEQ ID No. 2之多肽，或其任一生物學上具活 性之片段或衍生物； 一單獨時以低親和性與IL-13專一結合，而若與IL-4受體聯 合時，即構築成對IL-13具高％和性之受體的多肽（IL-13Ra): —種包含胺基酸序列SEQ ID No. 4之多肽，或其任 一生物學上具活性之片段； 一生物學上具活性：能夠專一地與IL-13結合及/或於細胞 膜層級上參與由IL-13特別產生之訊號傳導作用，且/或能 夠與對IL-4具專一性之受體（IL-4R/gp 140)交互反應，以形 成能夠與IL-4及IL-13結合之複合物，且/或其係被專一於 具序列SEQ ID No. 2及/或具序列SEQ ID No. 4之多肽的抗體 辨識，且/或能夠謗發辨認具序列SEQ ID No. 2及/或序列 SEQ ID No. 4之多肽的抗體產生； —衍生物··任何為具序列SEQ ID No. 2及/或序列SEQ ID No. 4之多肽變異體之多肽，或任何_由序列SEQ ID No. 2或序列 SEQ ID No. 4之遺傳及/或化學#性上之修飾而產生之分 子，即’任何藉由突變，缺失，加入，取代作用及/或一 或限定數量胺基酸之化學修飾而得之分子，以及任何同型 -8- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 裝 訂

565570 A7 B7 五、發明説明（6 ) 序列，即，與序列SEQ ID No. 2或與序列SEQ ID No. 4相 同，與其任一片段或與其任一經修飾序列相同，含有一或 多個以D鏡像異構物形式之胺基酸的序列，具有固有至少 一種使其具生物學上活性之性質的該變異體，經修飾或同 型序列。 本發明之標的物為一種包含選自下列胺基酸序列之經純 化多肽： a) 序列 SEQ ID No· 2或序列 SEQ No· 4， b) 任何根據上述所給予定義，衍生自SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4之生物學上具活性序列。 衍生物之製造可能具有各種不同之目的，特別包括增加 對IL-13之受體親和性，改變IL-13與IL-4間之交叉競爭作 用，增進其產量，增加其對蛋白質酶之抗性，改變其生物 活性或確定其所具之新穎醫藥及/或生物性質。 於如上所述多肽之具生物活性變異體中，以藉由交替修 剪編碼上述其一胺基酸序列之基因的轉錄物（訊息者RNA) 所產生之片段為較佳。 於有利之變異體中，係將具序列SEQ ID No. 2之多肽的8 個C-末端胺基酸，以下列6個胺基酸取代：VRCVTL。 根據另一有利方面，本發明_關於一種可溶形式之IL-13ΙΙβ，稱為IL-13RPS，其特別包含延展至殘基343且較佳延 展至殘基337之具序列SEQ ID No. 2多肽之細胞外區域，以 -9- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 565570 A7 B7 五、發明説明（7 ) 及一種可溶形式之IL-13Ra，稱為IL-13Ras，其特別包含延 伸至殘基336且較佳延伸至殘基336及342之間之具序列SEQ ID No. 4多肽之細胞外區域。 包含序列SEQ ID No. 2或序列SEQ ID No. 4的多肽，代表 本發明之特別具體實施例。如實施例所示，此多肽可於人 類細胞膜上表現，以形成具功能性之IL-13受體且/或與IL-4受體組合而形成（與IL-2受體之γ鏈）IL_4與IL-13共有之受 體複合物。 一' 本發明之標的物亦為選自下列之經分離核酸序列： a) 序列 SEQ ID No· 1， b) 序列 SEQ ID No· 3， c) 能夠與序列SEQ ID No. 1或序列SEQ ID No. 3雜交，或與 其互補序列雜交且能編碼具有IL-13受體活性之多肽，或 令具有對IL-13及IL-4具高親和性之受體重建之核酸序列， d) 因為遺傳密碼子簡併性而衍生自序列a)與b)與c)之核酸 序列。 更特別地，本發明之標的物為編碼IL-13RP或IL-13Ra之 可溶部分，及任何由交替修剪IL-13RP或IL-HRoc之轉錄 物，固有至少一種上述生物特性_之變異體的序列。 較佳之具體實施例係以包含或/自核甞酸No. 1延伸至核 棼酸1081，且較佳地至序列SEQ ID No. 1中第1063核甞酸之 延伸物組成之核酸序列代表。 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 56557〇 A7 --- ----B7 五、發明説明（8 ) 另一較佳具體實施例係以包含或由自核苷酸No. 1延伸至 核荅酸No· 1〇59，且較佳地至序列SEQ ID No. 3中第1041與 1056號之間之延伸物組成之核酸序列代表。 有利地，根據本發明之核酸序列為編碼與成熟形 或IL-13Ra相當之蛋白質的序列，此成熟蛋白質為釋放訊 號多肽後之結果。 本發明之各種核甞酸序列，可為人造來源或其他。其可 為藉由以基於序列SEQ ID No. 1袁序列SEQ ID No. 3製造之 #木針’師選序列庫而獲得之DNA或RNA序列。此等序列庫 可藉習於該項技藝人士所知之習用分子生物技術製備得。 根據本發明之核甞酸序列亦可藉由化學合成，或另外藉 由包括化學或以酵素修飾經由篩選序列庫得之序列的方法 組合而製備得。 此等核嘗酸序列可使能製備，編碼根據本發明之多肽及 其生物學上具活性片段之核甞酸探針。適當之雜交條件相 當於熟習該項技藝人士所慣用之溫度與離子強度條件，較 佳地相當於介於1>5。(：與1\11-30。(：間，且更佳地介於Tnr5t 與Tm-10 c (尚迫切性）間之溫度條件，^為溶解溫度，定 義為50%驗基配對股分離時之溫又。此等探針亦屬本發明 之部分。其可使用作為用以藉雜L交實驗，測定對存在生物 樣品中本發明多肽具專一性之轉錄物，或測定因多樣性， 因突變或因微弱接合造成之變異體合成或基因異常的活體 -11 - ^紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） ----------- 565570 A7 B7 五、發明説明（ ） 外診斷工具。 本發明之探針包含至少10個核甞酸，且包含至多完整的 核苷酸序列SEQ ID No. 1或完整的核甞酸序列SEQ ID No. 3 或其互補股。 在最短之探針中（即，約10至15個核甞酸），適當之雜交 條件相當於習於該項技藝人士所慣常使用之溫度與離子強 度條件。 較佳地，本發明之探針係於使··用之前先行標定。為此， 包含數種習於該項技藝人士可使用之技術，例如螢光，放 射性，化學發光或酵素標定。 活體外診斷方法，其中此等核甞酸探針係用於偵測變異 體合成或基因異常，例如於編碼IL-13受體多肽或具生物 學活性片段之核酸序列層次上之雜合性喪失及基因重排， 係包含於本發明中。此類方法包含： —使本發明之核芸酸探針與生物樣本，於能使該探針與上 述核甞酸序列之間形成雜交複合物之條件下接觸，視需要 於預先之上述核苷酸序列的擴大步驟後進行； 一偵測所可能形成之雜交複合物； —視需要地，將與根據本發明探針形成雜交複合物之核甞 酸序列定序。 ： 此外，本發明之cDNA探針可有利地用於偵測染色體異 常。 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

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本發明之核#酸序歹!J亦可用於製造及使用作為定序反應 或根據所謂PCR (聚合酶鏈反應）技術或任何其變異形式之 特足擴大反應之有義及/或反義寡核荅酸引子。 > 又，根據本發明之核甞酸序列於治療領域上，具有用於 製備能特包括訊息者RNA之核豸序列雜交的反義序 列，且可用於基因療法。因此本發明之標的物為能夠抑制 (至少部分地）如上所述几-13受體多肽產生的反義序列。此 等序列有利地係由於轉錄物層言上構成編碼IL_i3R(3或江_ 13 Ra之謂框者組成。 其可更特別地用於治療過敏及發炎病症。 又，根據本發明之核甞酸序列，可用於製造具有辽_13受 體活性之重組型多肽（如上所定義）。 此等多肽可從如上所定義之核苷酸序列，根據習於該項 技藝已知用於製造重組型產物之技術而製得。於此案例 中，所使用之核苷酸序列係置於使其能在細胞宿主内表現 之訊號的控制下。所使用之細胞宿主可選自原核系統，如 細菌’或選自真核系統，如酵母菌，昆蟲細胞，CHO細胞 (中國倉鼠卵巢細胞）或任何有利地自商業上可得之其他系 統。較佳用於表現本發明多肽之細胞宿主係由纖維母細胞 系COS-7或COS-3組成。 控制多肽表現之訊號，例如啟動子，活化子或終結序 列，係依所使用之細胞宿主而選擇。為此，根據本發明之 -13-本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 565570 A7 B7 五、發明説明（ ） 核甞酸序列可插入所選宿主中之自行複製之載體，或所選 宿主之整合載體中。此等載體係根據習於該項技藝人士慣 用之方法製備，且所得之純系可藉由標準方法，例如電穿 透作用導入適當的宿主内。 含有至少一種如上所定義核苷酸酸序列之表現載體，亦 為本發明之一部分。 在COS-7或COS-3細胞之例子中，轉染作用可使用載體 pSE-Ι來完成，如（17)中所述。—— 此外，本發明亦關於經此等表現載體轉感染之宿主細 胞。此等細胞可藉將插入至如上所定義載體中之核苷酸序 列導入宿主細胞，接著將該細胞於使該等經轉感染之核甞 酸序列複製及/或表現之條件下培養而獲得。 此等細胞可用於製造具序列SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4 之重組型多肽或衍生物之方法中，該方法本身包含於本發 明範圍内，且其特徵在於將經轉感染之細胞於使具序列 SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4之多肽或衍生物表現之條件下 培養，及在於將該重組型多肤回收。 所使用之純化方法係習於該項技藝人士已知者。重組型 多肽可藉由各別或組合使用諸奴分餾，層析方法，使用特 殊專一性單株或多株抗體之免疫__親和性技術等方法，自細 胞溶胞產物及萃取物，自培養上清液中純化得。 可專一辨識上述根據本發明之IL-13R0及/或IL-13Ra之單 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 565570 A7 B7 五、發明説明（ ） 一或多株抗體，亦為本發明之一部分。多株抗體可自經根 據習用方法免疫對抗IL-13RP及/或IL-13Ra之動物的血清獲 得。 單株抗體可根據由庫勒（Kohler)與米爾斯坦（Milstein)(自 然，1975，256，495-497)所述，習知之融合瘤培養方法獲 得。 有利之抗體為直接對抗IL-13Rp及/或IL-13Ra細胞外區域 之抗體。 一^ 根據本發明之抗體為，例如，嵌合型抗體，人類化 (humanized)抗體，Fab與F(ab’)2片段。其亦可以已標定抗體 或免疫共轭物之形式存在。例如，其可與毒素，例如白喉 毒素或與放射性產品聯合。此等免疫毒素於此情形下可構 成可用於治療特定涉及過度表現IL-13RP及/或IL-13Ra之病 理的治療劑。 本發明之抗體，特別是單株抗體，亦可例如，藉由免疫 螢光或藉由金粒子或過氧化酶標定，用於特殊組織切片上 IL-13受體之免疫化學分析。 其亦可有利地用於任何需要觀察IL-13RP及/或IL-13Ra表 現之情況中，例如異常過度表I，或偵測膜表現之調節作 用。 本發明因此亦關於一種用以於可能含有以異常程度表現 之IL-13RP及/或IL-13Ra之生物樣本中，活體外診斷與IL- •15- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 裝 訂

565570 A7 B7 五、發明説明（ ） 13Rp及/或IL-13Ra異常表現相關病理之方法，其特徵在於 將至少一種.根據本發明之抗體與上述生物樣本，於使IL-13ΓΙβ及/或IL-13Roc與上述抗體之間可能形成免疫複合物， 且於其中偵測所可能形成之專一特定免疫複合物的條件下 接觸。 本發明亦關於用以於活體外診斷生物樣本中IL-13RP及/ 或IL-13Ra之異常表現，及/或用以測量IL-13受體於該樣本 中之表現程度的套組，其包含：—— —至少一種對IL-13RP及/或IL-13Ra專一之抗體或抗體，視 需要接附於支持物上， —用以顯示IL-13RP及/或IL-HRa與該抗體之間專一形成抗 原/抗體複合物，及/或定量此等複合物之裝置。 本發明之另一標的物係關於用以鑑定及/或分離專一於 IL-13RP及/或IL-13Roc或能調節其活性之配位體的方法，其 特徵在於將視需要未經鑑定之化合物或含有各種化合物之 混合物，與其表面上表現IL-13RP及/或IL-13Ra之細胞，於 使IL-13受體和上述化合物交互作用之條件下接觸，於後 者對受體具親和性，及該等化合物與IL-13Rp及/或IL-13Ra，或其他能夠調節其生物活性者結合之情形下，將 彼等探出並/或分離。 _ 於特別之具體實施例中，本發明此方法適用於鑑定及/ 或分離IL-13對其IL-13Rp及/或IL-13Ra受體之促動劑與拮抗 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 565570 A7 B7 五、發明説明（ ） 劑。 本發明亦包括包含相當於前述定義之多肽，作為活性成 份（較佳以可溶形式存在），以及醫藥上可接受載體的醫藥 組合物。 此類多肽可能確實作用於與表現於細胞表面之IL-13RP及 /或IL-13Ra競爭，並因此構成一種對IL-13與其受體結合具 專一性之拮抗劑，其可有利地用於合成欲調節於病理狀態 中由IL-13居間參與之反應的醫篆產品。 最後，本發明包含一種用以治療與由IL-13居間參與之免 疫反應相關聯病況的方法，其包含將IL-13R0及/或IL-13Ra (或其生物學上具活性之片段），或將能夠專一調節其活性 之化合物，與醫藥上可接受載體組合投藥予病患。 本發明之其他特徵與有利處，將以實施例與圖示呈現於 發明說明之其餘敘述中，其說明表示於下。 圖示說明 —圖1 :存在Caki-Ι細胞中之人類IL-13RP受體的特徵 化。 a) 經[1251]標定之IL-13的飽和曲i泉史考恰得（Scatchard)分析 (插圖）； _ b) 於漸增濃度之耒經標定IL-Π ( ·)與IL-4 (〇)存在下， [125I][Phe43]- IL-13-GlyTyrGlyTyr之結合； -17- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 565570 A7 B7 五、發明説明（ c) 使用放射性IL-13於無（a行）與有一百倍過量之未經標 定IL-13 ( b行）或IL-4 (c行）存在下之交聯實驗； d) 由IL-13與IL-4謗發，於對IL-4R鏈專一之單株抗體及IL-4 拮抗劑Y124DIL-4存在下，IL-6分泌之抑制作用。 —圖2 : IL-13RP之cDNA的核：y：酸序列，及IL-5R^几-13RP之蛋白質序列比較》 a) IL-13RP之cDNA的核甞酸序列。對應於經推論為核酸序 列訊號肽之胺基酸係以斜體字表·示，而對應於穿膜區者係 以粗體字表示。有功效之N-糖苷化位置（Asn-X_Ser/Thr)， 其下標示橫線； b) 列示IL-13R0之IL-5R序列之胺基酸^ mR及il-5R之蛋 白質序列係如上所述排列（24)。為此類蛋白質家族特徵之 半胱胺酸殘基與WSXWS主要部位係以框線表示。 一圖3 : IL-13RP mRNA之表現型式。 該RNA係自下列細胞製備得：caki-l (a行），A431 ^行） TF-1 (c 行），U937 (d行），Jurkat (e 行）及IM9 (f 行）。 一圖4 :對il-13之重組型IL-13Rp受體之特徵化 c〇S^7 細胞係以IL-13Rp cDNA轉感染並用於： a) 藉由飽和曲線之史考恰得分浙研究經放射性標定n 的結合（插圖）； ' 3 b) 使用放射性標定的IL_13於無（a行）或有一百倍過量、 未經標定IL-13存在下（b行）進行之交聯實驗； -18-

565570 A7 B7 五 、發明説明（

c-d) 使用經選殖之IL-HRP，IL_4R (gpHO)與γο鏈進行之 共轉感染實驗，接著經放射性標定IL-13 (c)或IL-4⑷之結 合分析。黑色與白色柱形分別代表IL-13及IL_4之專一性結 合。 一圖5 :藉由以短暫表現之可溶形受體（IL-13RPs)對IL-13 與IL-13RP之結合的抑制作用。 IL-13Rps於經2034轉感染之細胞上清液中的表現，係藉由 IL-13結合至經IL-13RP (2036)轉感·染之細胞的抑制作用測試 得。上清液係以藉將其於經碘化之配位體中稀釋一半之粗 製狀態進行測試。 2036 NSB :於過量未經標定IL-13存在下之非專一性結合。 2036 BT :於經2036轉感染細胞上之總結合量。 2036 + sgt 2034 :於經2034轉感染之細胞上清液存在下，與 經2036轉感染之細胞的結合。 2〇36 + sgt pSEI :對照組。 —圖6 :藉由穩定純系上可溶形式受體，對IL-13與IL-13ΙΙβ結合之抑制作用。 Τ2036-22 :無分泌IL-13Rps之純株上清液存在下，於純株 IL-13R0 (2036-22)上之總結合量（參考值100%)。 2034-4 ' 2036-6 2034-19 4 選殖株 IL-13RPS -19- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 裝 訂

線 565570 A7 B7 五 、發明説明（ 2034-21 1274-20 ··於不表現IL-13Rps之CHO細胞上清液存在下（對照 組）。 圖7 : IL-13Ra cDNA之核苷酸序列，及人類IL-13Rcc與鼠 類IL-13Ra之蛋白質序列比較。 a) IL-13Roc之cDNA的核甞酸序列。對應於經推論為核酸序 列訊號肽之胺基酸係以斜體字表示，而對應於穿膜區者係 以粗體字表示。有功效之N-糖兮化位置（Asn-X-Ser/Thr)， 其下標TF橫線， b) 列示人類IL-13Ra及鼠類IL-13Ra序列之胺基酸。人類IL-13R及鼠類IL-13Ra之蛋白質序列係如上所述排列（24)。為 此類蛋白質家族特徵之半胱胺酸殘基與WSXWS主要部位 係以框線表示。 —圖8 :對IL-13之重組型IL-13ROC受體之特徵化。CHO或 COS-3細胞係以IL-13Ra及/或IL-4RcDNA轉感染並用於： a) 藉由以經IL-ηβ cDNA轉感染（圖A)，經IL-13R0 cDNA與 IL-4R cDNA轉感染（圖B )，經IL_13Roc cDNA轉感染（圖C )及 經IL-13Ra cDNA與IL-4R cDNA轉感染（圖D )之CHO細胞的飽 和曲線史考恰得分析，研究經換_-125標定之IL-13的結合，

b) [125I]-IL-13於經 IL-13RpcDNA# 感染（圖 E)，經 IL-13RP cDNA與 IL-4R cDNA^ 感染（圖 F)，經 IL-13Ra cDNA轉感染 (圖 G)及經IL-13Ra cDNA 與 IL-4R cDNA轉感染（圖 Η)之 CHO -20- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 裝 訂

565570 A7 B7 五、發明説明（18 ) 細胞上的結合競爭實驗。白色與加影線柱形分別代表經放 射線標定IL-13於過量（1000倍過量）之IL-13或IL-4存在下之 專一性結合，黑色柱形代表總結合量。 圖9 :於CHO在IL-4或IL-13 (4或13)存在下活化後，表現 單獨對IL-4之受體（CHO-4)，單獨對IL_13Ra之受體（CHO-13) 或經組合對IL-13Ra與IL-4R之受體（CHO-4-13)的細胞抽出物 EMSA中之電泳移動性比較，c代表未經活化之對照組。 材料與方法 結合逛爻聯實驗： 結合與交聯實驗係如為[125I][Phe 43]-IL-13-GlyTyrGlyTyr (17)所述者完成。 IL-6分泌作用之謗導： 將Caki-Ι細胞（ATCC HTB46)以5xl04細胞/孔之密度置於24-孔平盤中，培養3天後，將融合性單層以不含胎牛血清之 DMEM培養基清洗三次，Caki-Ι細胞之刺激係以30毫微克/ 升IL-4或IL-13於Y124DIL-4或抗-gpl40單株抗體存在或不存 在下完成。於培養24小時後，-以ELISA技術（Innotest，法 國）測量被釋放至培養基中之IL-g定量。 A類IL-13RB cDNA之分離與分析： -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

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565570 A7 B7 五 、發明説明（ 將全部RNA自如上述之Caki-Ι細胞萃取出（25)。以包覆有 寡（dT)25(Dynal)之磁性珠將聚（A) RNA自總體RNA中分離 出。使用引子-承接子方法（26)與載體PSE-1 (27)構築含有 2xl05選殖株之cDNA庫。所使用以表現之選殖策略已曾於 先前敘述（17)。 i類 IL-13RB cDNA之製備： 將RNA樣品以逆轉錄酶複製，-並使用對應於序列+52至 +71之有意義引子及對應於+489至470之反有意義引子（編 碼係以圖2中所列示之cDNA序列為基準）進行PCR (聚合酶 鏈反應）。將經PCR-放大之產物與互補於cDNA之序列+445 至+461的探針雜交。大小標記係指示於該圖示之左侧。 &AlL-13Ra cDNA之分離輿分折： 1)鼠類IL-13Ra探針之製備 a) B9細胞（28)之培養 將B9細胞培養於補充以10%胎牛血清與50微克/毫升慶大 霉素之RPMI培養基（Gibco)中。 b) B9細胞之RNA之製備 _ 將細胞以PBS緩衝液（以磷酸鹽-緩衝之食鹽水，參考文獻 04104040-GIBCO-BRX)清洗兩次。待於1000 rpm下離心1〇分 鐘後，將細胞團塊懸浮於含下列組成之溶解緩衝液中： -22- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

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565570 A7 B7 五、發明説明（ ） 4M胍-硫氰酸酯；25 mM擰檬酸鈉pH 7 ; 0.5%肌胺酸；0· 1 Μ β2-巯基乙醇。 將懸浮液使用Ultraturax超音波振置器No. 231256 (JANKE 與KUNDEL)以最大功率超音波振盪1分鐘。將擰檬酸鈉pH 4加至0·2 Μ。將溶液以1體積酚/三氯甲烷混合物（v/v : 5/1) 萃取。 將含於水相中之RNA於-20。0下，藉助於1體積異丙酶沈 澱出。將團塊懸浮於溶解緩衝该：中。再次以酚/三氯甲烷 混合物萃取溶液，並以異丙醇沈澱RNA。待將團塊以70% 乙醇接著以100%乙醇清洗後，將RNA懸浮於水中。 c) 互補DNA之製備 使用聚T12引子自5微克總體RNA，製備得到cDNA。將總 體RNA培育於30微升體積緩衝液：50 mM Tris-HCl pH 8.3， 6 mM MgCl2，10 mM DTT，40 mM KC1，含有 0.5 mM各種去 氧核嘗酸鱗酸鹽類及30單位Rnasin (普羅美加，Promega)， 於37。(：下一小時，然後於50°C下10分鐘，再於37°C下10分 鐘，與200單位逆轉錄酶Rnase H (Gibco_BRL參考編號 8064A)共培育。將反應於65=下加熱10分鐘而終止。 d) 藉PCR技術專一性放大老鼠iL_-13RacDNA片段。 聚合作用之進行係在6微升cD_NA於50微升終體積（含下 列組合物之緩衝液·· 10 mM Tris-HCl pH 8·3，2.5 mM MgCl2，50 mM KC1，4dNTP 0.2 mM，2 微克 / 毫升各該二種 -23- 本紙張尺度適用中®國家標準(CNS) A4規格(21G x 297公《) 565570 A7 B7 五、發明説明（ 引子及2.5 U TAQ DNA聚合酶（貝克曼，Beckman))。引子對 係依希爾頓（Hilton)所發表之序列選擇（22)。 有義引子：核甞酸249至268 5' AGAGGAATTACCCCTGGATG 3( 反義引子：核甞酸1256至1275 5, TCAAGGAGCTGCTTTCTTCA 3' 反應係以30次含於94°C下1分鐘，58t：下1分鐘，72°C下 4分鐘之循環及接著於72°C下10免鐘之最終循環進行。 e) PCR放大產物之純化。 待於 1%存於 TAE缓衝液（40 mM，Tris-Ηα，1 mM EDTA pH 7.9)之瓊脂凝膠（Sigma)上，於100伏特下進行電泳1小時 後，將凝膠以1微克/毫升存於相同緩衝液之溴乙啡啶染 色。將對應於放大產物（IL-13Ra具有1027鹼基對（bp)之 cDNA片段）電泳泳帶使用Glass Max套組（Gibco)萃取。 f) 探針之製備。 將25毫微克含1〇27 bp對應於老鼠IL-13Ra受體之已純化 cDNA片段以璘-32，使用BRLP遺機引子DNA標定系統套組 於2.4xl09 dpm/微克之比活性下標定；或者，使用百靈佳 (Boeringher)套組於4xl08 dpm/微克之比活性下藉切割轉譯 作用標定100毫微克。 1 2)人類IL-13RacDNA之分離與分析 a)總體RNA之製備 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 裝 訂

565570 A7 B7 五、發明説明（22 ) 總體RNA係如上lb段所述，自Caki-Ι細胞萃取出。 b) 信息者RNA (聚A+流份）之純化 RNA之聚A+流份之純化係使用DYNAL寡（dT)25 Dynabeads 套組（參考編號610.05)，依照製造廠商所指示之步驟而完 成。其原理係基於使用其上接附有聚（dT)25寡核甞酸之超 順磁性聚苯乙烯珠。聚A+流份與偶合至陷入於磁性支持 物上之珠的寡（dT)25寡核甞酸雜交。 c) 北方墨點法。 一 將5微克聚A+訊息者RNA載於存在MOPS緩衝液（10 mM pH 7.4，0.5 mM EDTA)之1%瓊脂，8%甲醛變性凝膠上。待 泳動及轉移至N+ Hybond膜（艾默遜，Amersham)上，於20 X SSC緩衝液中後，將RNA藉於80°C烘箱中於真空下加熱固 定。然後將膜於42°C下於下列緩衝液中：lMNaa，30%甲 醯胺；1% SDS，5X Denhart’s ; 100微克/毫升鮭魚精子DNA 前雜交2小時。待經2小時前雜交後，將膜於相同緩衝液 中，以經由2.5xl06 dpm/毫升隨機激發製備得之老鼠IL-13Ra探針濃縮物雜交16小時。然後將膜於室溫下於2X SSC 緩衝液0.1% SDS中清洗30分鐘兩次，再於5(TC下於相同緩 衝液中清洗2小時。待於卡匣ς分子動力學）中曝光4天 後，以立即顯像機（分子動力學）> 該北方墨點進行分析。 於〇&10-1細胞，1；373與1；937中偵測得具4200 5?及1500 5卩與 2000 bp重疊之作多數轉錄物。 -25- 本紙張尺度適用中國國家榡準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

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565570 A7 B7 五 、發明説明（ 人類IL_13Ra與IL-13RP性質之特徵化·· 將COS-7或CHO細胞如上所述（17)於培養皿中進行轉感 染。待24小時後，將細胞以胰蛋白酶處理，並以8xl04細 胞/槽之密度培養於24-槽平板中。待於37°C下培養48小時 後，將細胞用於與如上所述經碘化IL-13之結合實驗（分析 以重覆三次完成，顯示小於10%之變度）（17)。對於轉感染 作用，將COS-7或CHO細胞於25-呼方公分平板中，使用0.6 毫克各種質體進行轉感染。待24小時後，將細胞單層以胰 蛋白酶處理，並以8xl04細胞/槽培養於12-槽平板中。三天 後，與經標定之IL-13及未經標定之IL-13與/或IL-4完成結 合及競爭實驗。結果以至少三次獨立進行之實驗為代表。 表現人類IL-13Ra及/或IL-4R之細胞核萃取物於EMSA中電 泳移動性之比較： 將2xl06 CHO細胞平舖於10公分培養皿上。待24小時後， 將細胞以6微克質體DNA轉感染（34)。於48小時後，將細胞 於37°C下培養於3毫升含或不含濃度為100毫微克每毫升之 IL-13或IL-4的培養基中30分鐘。_然後將細胞以PBS-0.5mM EDTA緩衝液清洗兩次，接著收~取於1.2毫升PBS中。然後 將細胞離心，並如（35)中所述製備得細胞萃取物。接著如 (36)中所述以10至20微克細胞萃取物及經32P (50,000-100,000 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 裝 訂

線 565570 A7 B7 五、發明説明（26 ) 用於選擇與表現之策略已於先前技藝描述（17)。使用 Caki-Ι細胞構築得含有2xl05重組型純株之cDNA庫。將該 庫以各1000 cDNA分成數批，其中各批之DNA以質體形 式導入COS_7細胞中（29)。經標定IL-13與經轉感染COS-7 細胞之結合使其能夠鑑定編碼IL-13受體之純選殖株的批 次。將陽性批次取出，並經再篩選直到鑑定得能完成合成 可與IL-13結合之細胞表面蛋白質的單一選殖株。最後分 離得兩種獨立的IL-13Rp cDNA°-TL-13Rp cDNA之完整核甞 酸序列及由其推衍出之胺基酸序列係列示於圖2 a中。該 cDNA排除聚-A尾端後具有1298個鹼基之長度，且具有含 106個鹼基之短的3’未轉譯區。標準AATAAA聚腺甞化作 用訊號係位於預定位置上。介於核苷酸53與1192間之開 放解讀框架表明一段具380個胺基酸之多肽。該序列編碼 一段具有可能訊號肽，單一穿膜區及短胞質内尾部之膜蛋 白。 四個可能的糖芸化位置係位於胞外區域内。其重要地指 出亦存在兩個被認為是第II型細胞活素受體家族之號記 的一致特色，第一個係衍生自N-末端雙硫橋聯環結構， 第二個為位於胞内區域C -末端之WSXWS類型特色。該 非常短之胞質序列可解釋為何其係Caki細胞中，唯一由 IL-4及IL-13共用之傳導細胞内訊號的受體複合物。 排列研究證明其與人類IL-5Ra鏈（51%相似性及27%同一 -29- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 565570 A7 B7 五、發明説明（ ） 性）及，較少程度，與促乳素受體之同源性（圖2 b )。令人 注意地指出.，IL-5R複合體由與IL-5結合但需要另一蛋白 質之α鏈，與IL-3共用之β鏈及GM-CSF受體組成，而形 成能夠傳導訊號之高親和性受體（3 1)。 實施例4 : 人類IL-13RP訊息者RNAs於各種細胞系中之偵測。 令人驚訝地，雖然於Caki-1 IT胞中有大量的IL-13RP表 現，但由北方墨點分析偵測得相似量之IL-13RP與IL-4R的 訊息者RNA。此項觀察暗示，此mRNA相較於IL-4R轉錄 體有較大之轉譯作用，並解釋為何於表現小量IL-13結合 位置之細胞系無法偵測到IL-13R0 mRNA。RT-PCR分析（圖 3 )顯示，於Caki-Ι細胞中所發現之轉錄體亦以較低程度出 現於角質細胞系A431，前骨髓細胞TF-1，前單核血球細 胞U937及細胞系B IM9中。於吉爾卡特（Jurkat) T細胞系 或前-B NALM 6細胞系中，未偵測到轉錄體。此等結果與 本發明作者對此等前述相同細胞系進行之IL-13結合研究 (17)，及與IL-13之已知生物學上標的物相符合。 實施例5 : 二 於經人類IL-13RP cDNA轉感染之COS-7細胞上所完成之結 合分析。 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

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565570 A7 B7 五、發明説明（28 ) 將COS-7細胞以編碼IL-13Rp專一結合標定之IL-13的經 分離cDNA轉感染。飽和曲線之史考恰得分析顯示，有一 具kd值為250±30pM及最大結合容量為5.6xl05受體/細胞 之單一組成位置存在（圖4a)。 重組型受體之親和性與Caki-Ι細胞中對IL-13Rp之kd 值，及於其他數種細胞中（17)之kd值為446 pM，十分符 合。因此，姑且不論其與IL-5Roc鏈之序列同源性，由於所 選殖之受體不需要第二個鏈來重$高親和性結合位置，故 其作用有所差異。 令人注意地指出，最近所述之蛋白質結合IL-15，在缺乏 其他兩種IL-15R複合物組成分存在下，具有以高親和性 與IL-15結合之特徵（32)。 於競爭實驗中，IL-13可以1.5±0.5 nM之抑制常數（Ki)抑制 經標定IL-13與所選殖受體之結合，然而IL-4不會抑制該結 合。因此所選殖之受體的藥理學與存在Caki-Ι細胞中之IL-13ΙΙβ者相似。交聯實驗顯示70 kDa之放射性標定帶。該帶 具有與於Caki細胞以及於其他細胞中（17)所觀察得相同之 泳動性。此複合物最有可能相當於以經標定IL-4所完成之 交聯實驗中，所觀察到除了 IL-4R 140 kDa帶以外的60-70 kDa帶。此亦可能暗示，在官能彳k受體複合物的兩蛋白質 之間存在強的交互反應。本發明之作者因此檢試是否IL-13RP與IL-4R會在細胞内交互作用，而重建一種能使該二 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 裝 訂

線 565570 A7 B7 五、發明説明（29 ) 種細胞活素間產生交叉競爭之受體。其表現實驗之結果列 示於第4c及4圖中。 其明顯地表示出，該二受體之表現，不論個別地或同時 表現，產生大量專一辨識該二種細胞活素中任一種之受 體。然而，當其共同表現時，有少數受體（5至10%)能夠 辨識該二種細胞活素。鏈以IL-4R與IL-13RP之共轉感染 作用，並未增加共同結合位置之數量。此等結果暗示； IL-13Rp與IL-4R鏈可於細胞膜中玄互作用，而重建一種可 能使IL-13與IL-4競爭結合之受體。重建受體之低百分比率 與支持有另一種以有限量存在COS細胞中，其為重建使IL_ 13及IL-4競爭結合之受體複合物所需的蛋白質（IL-13Ra)存 在相符合。 於以Yc鏈轉感染之實驗中所得之結果證明，此蛋白質並 非先前所暗示之限制因子（15)。此結論亦由γο訊息者RNA 不存在Caki-Ι細胞中而支持（21)。 另一項解釋該低數量重建受體之可能原因係該二種蛋白 質在細胞膜中存在不正確之化學計量。但是，使用不同相 對量之IL-4R與IL-13RP的共轉感染作用，並未顯示在重建 受體上之主要差異。藉由IL-13Ra cDNA之分離，於老鼠 (22)及人類中確定有另一種具有鈇大能力與IL-4R交互作用 之IL-HR存在的可能性。（參照實施例7 )。應注意，之表 現增進IL-4之結合，如先前所述（19)，但減低IL-13之結 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 565570 A7 __B7_._ 五、發明説明（3Q ) 合，此暗示不同鏈間有複合物交互作用。 實施例6 : 藉由可溶形式受體抑制IL-13與其膜上受體結合之研究。 經描述於瞬時表現（圖5)或安定純系（圖6)之結果。 該二種編碼IL-13RP及IL-13RPs之cDNA替代IL-2 cDNA之位 置插入載體p7055中（33)。所形成之質體分別稱為2036及 2034 ° —— a)瞬時表現 將CHO細胞以3xl05細胞/槽之濃度接種於12-槽平板中， 並於次日藉由對於COS細胞進行之DEAE-糊精方法，以質 體2036或2034，或以作為對照組之空質體pSE-Ι轉感染。 將細胞培養於使IL-13Rps堆積於經質體2034轉感染細胞 之上清液中，及使IL-13Rp於經質體2036轉感染細胞膜中良 好表現之條件下三天。 將經IL_13Rps (2034)或陰性對照組（空的pSE-Ι)轉感染細 胞之上清液收集，並將經IL_13Rp轉感染之細胞用於研究 IL· 13結合之抑制作用。 IL-13與表現IL-13RP (2036)之CHO細胞表面的結合作用， 係於此等以放射性配位體等倍_釋之粗上清液存在與否 下’或於過量未經-放射性標定之IL-n(NSB)存在下進行測 I °邊結合作用係於終體積為5〇〇亳升含3〇〇 pM放射性配 -33- 本紙張尺度適用中S S家操準(CNS) A4規格(21G X 297公嫠) 565570 A7 B7 五 、發明説明（ 位子的完整細胞上，以三次重複實驗完成。 b)安定純系. 藉由以編碼完整IL-13RP (含380個殘基之多肽）或可溶形 式IL-13RP (IL-13R0s，含對應於IL-13RP第1至337殘基之經 截斷多肽）之序列轉感染，得到兩種安定經轉形之CHO細 胞系。將此等序列插入載體p7055中。 將 CHO-DHFR·細胞以質體 2036 (IL-13RP)及 2034 (IL-13RPS) 轉感染，並如先前所述（33)篩選t組型選殖株。 將所得到一具有每細胞2至5x10s位置之CH0-IL-13RP (CHO 2036)選殖株，以105細胞每槽之密度接種至12-槽平板 中，並將細胞於兩天後用於IL-13RPs存在與否之結合實驗 中 〇 為此，將CHO-IL-13RpS (CHO 2034)選殖株以5xl05細胞每 盤之密度接種於6公分盤中，重覆三組實驗。待於培養基 中累積3天後，收集培養基（每盤取5毫升）用於IL-13於 CHO 2036選殖株之Ιί·13ΙΙβ上的結合抑制研究。以相同方 法，收集不表現可溶形IL-13RP之CHO細胞上清液。 於此等以放射性配位體等倍稀釋之粗上清液存在與否 下，或於過量未經放射標定之IL-13 (NSB)存在下，測量IL-13 於 CHO-2036-22選殖 株表面 之結合 作用。 該結合 作用係 於終體積為500毫升含300 pM放射性配位子的完整細胞 上，以三次重複實驗完成。 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 裝 訂

線 565570 A7 _____B7^__-_ 五、發明説明（32 ) 圖5與圖6之柱狀圖表示由IL-13RpS造成對IL-13於IL-13RP 上結合之抑制作用。於數個選殖株上可觀察到IL-13與其 受體結合上抑制作用。 實施例7 人類IL-13Roc受體之選殖 a)從Caki-1細胞之聚A+訊息者RNA製備cDNA庫。 自0.5毫微克聚A+訊息者RNAFt始，以具有下列序列（包 含BamHI切割位置）： 5* <GATCCGGGCCCTTTTTTTTTTTT <3， 之合成引子，於體積為30微升之下列緩衝液中： 50 mM Tris-HCl pH 8.3，6 mM MgCl2，10 mM DTT，40 mM KC1，含有各0.5 mM之去氧核甞三磷酸鹽，30 μΟί [a32P]dCTP及3〇單位Rnasin (普羅美加），製備經[32p]dCTP標 定之單股互補DNA (所得之互補DNA具有比活性為3000 dpm/毫微克）。待於37°C下培育1小時，然後於50°C下10分 鐘，再於37°C下10分鐘後，將含200單位逆轉錄酶酵素 Rnase H (Gibco-BRL)之4微升EDTA加入。然後將RNA模板藉 添加6微升2NNaOH溶液及於65t：：F培育5分鐘而分解。 為去除該合成引子’將互補DNA置於1亳升Sephacryl S4〇0管柱（法碼希雅，Pharmacia)，於TE緩衝液中平衡之上 純化。將最先的兩個具放射活性之流份收集組合，並以 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 565570 A7 B7 五、發明説明（ ） 1/10體積之10 Μ醋酸銨及2.5體積之乙醇沈澱，此於以氯仿 萃取後進行。然後將cDNA藉添加含20單位末端轉移酶酵 素（法碼希雅27073001)之dG同聚物尾端，而延長5,末端。 接著，於20微升具有下列組合物之緩衝液中：3〇1111^丁"5-HC1 pH 7.6 ; 1 mM氯化 # ; 140 mM四甲雙胂酸；〇.1 χηΜ DTT ; 1 mM dGTP，於37°C下培育15分鐘，然後將2微升0.5 M EDTA加入。再以氫氧化納於無加熱下處理，接著於 S400管柱上再純化，以氯仿萃取以乙醇沈澱。將丸粒溶 解於33微升TE緩衝液中。下一階段包含將預先已加上同聚 物dC尾端之選殖載體pT7T3-18，於以Pstl切割後與cDNA及 承接子配對。將cDNA (33微升）與75毫微克載體pT/T3-18 (5微升），120亳微克具下列序列（包含Apal切割位置）之承 接子（1微升）： 5 丨AAAAAAAAAAAAAGGGCCCG 3， 10微升200 mM NaCl溶液接觸，並將混合物於65°C下培育5 分鐘，然後令反應混合物冷卻至室溫。下一階段包含將選 殖載體與單股cDNA於100微升反應體積中，以32.5單位酵 素T4噬菌體DNA接合酶（法瑪希雅）於15°C下於具有下列組 成物之緩衝液中進行接合過夜：：50mM Tris-HCl pH 7.5，10 mM MgCl2，1 mM ATP。然後藉以酚接著以氣仿萃取，而 將蛋白質去除，然後將1/10體積之10 mM醋酸銨溶液與2.5 體積之乙醇加入。將混合物離心，將丸粒吸收於具有組成 -36 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 565570 A7 B7 五、發明説明（34 ) 物：33 mM Tris-醋酸鹽pH 7.9，62.5 mM醋酸鉀，1 mM醋酸 鎂及1 mM DTT之缓衝液中；將第2 cDNA股於30微升體積 中，以30單位酵素T4噬菌體DNA聚合酶（法瑪雅）及含ImM 四種去氧核甞三磷酸鹽之混合物以及二單位T4噬菌體基因 32之蛋白質（法瑪希雅）於37°C下合成1小時，將混合物以 酚萃取，並將痕量物質藉置於P10管柱（Biogel P 10-200-400 篩目-參考編碼15〇 1 l〇5〇-Biorad)上去除。 最後階段包含藉由於2.5 kVT—於製造廠商建議之條件 下使用Biorad Gene Pulser裝置進行重組型DNA之電穿透作 用，而將大腸样菌MC 1061細胞轉形，然後將細胞培養於 含有下列組成之LB培養基中1小時： 細菌胰化蛋白腺10克/升；酵母抽出物5克/升；NaCl 10克/ 升。 藉於轉形後培育1小時之後，取1/1000稀釋塗佈於補充以 1.5%瓊脂（w/v)及100微克/毫升音黴素之LB培養基平盤（以 下稱LB瓊脂培養基）上，測定所得之獨立選殖株數量。 所得獨立選殖株之數量為一百萬株。 b) cDNA庫之篩選 將整個庫塗佈於覆蓋有Biodyne A膜（PALL參考號BNNG 132)之瓊脂培養基上（培養皿直徑為150毫米）。待置於37 °(：下過夜後，將選磕株轉移接觸到新膜上。將後者藉將其 置於Wathman 3 MM濾紙（已以下列溶液浸潰：0·5 N NaOH， -37- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 565570 A7 一 _B7__ 五、發明説明（35 ) 1.5 M NaCl 5分鐘，然後0.5 M Tris-HCl pH 8，1.5 M NaCl 5分 鐘）上進行處理。待以蛋白酶k於下列緩衝液，1〇1111^丁1^-HC1 pH 8，10 mM EDTA，50 mM NaCn，0· 1% SDS，100微克 / 亳升蛋白酶K中，於37t：下處理30分鐘後，將膜徹底以2X SSC緩衝液（檸檬酸鈉-NaCl)清洗，然後於80°C下之真空烘 箱中乾燥20分鐘。 c) 膜之前雜交與雜交作用 然後將膜於421：下，於下列諼衝液：1M NaCl ; 30%甲 醛；1% SDS ; 5X Denhart’s 100微克/毫升鮭魚精子DNA中前 雜交2小時。待2小時前雜交作用後，將膜於相同缓衝液 中與藉由短斷轉譯製備得濃度為2.5xl06 dpm/毫升之老鼠 IL-13Ra探針雜交16小時。將膜於2X SSC，0.1% SDS缓衝液 中於室溫下清洗30分鐘兩次，然後於相同緩衝液中於5〇°C 下清洗2小時。待於-80°C下，於柯達X-OMAT底片存在下 曝光過夜，偵測到數個陽性選殖株》 d) 人類IL-13Ra選殖株之定序及序列之分析。 使用應用生物系統套組（參考編號401628)，得到該序 列。完整之IL-13Ra cDNA序列及從其推行得之胺基酸序列 列示於圖7中。該cDNA長為3999鹼基對（排除聚-A尾端部 分）具有一段含2145鹼基對之長袭經轉譯3,區域。 一段標準聚腺茹基化訊號存在預期之位置。介於核甞酸 34與1851之開放解讀框架，確定一段具427個胺基酸之多 -38- 本紙張尺度適用中國國家榡準(CNS) A4規格(21〇 X 297公釐） 565570 A7 B7 五、發明説明（ ） 肽。該序列編碼一種具有可能訊號肽與單一穿膜區域及短 細胞質内區域。 10個可能的糖甞化作用部位係位於胞外區域中。重要地 指出，亦存在兩個被認為係第11類細胞活素家族標記之一 致特徵，第一為衍生自N·末端雙硫橋聯彡承結構’弟'一為位 於Ο末端胞外區域之WSXWS型特色。 實施例8 一 於經人類IL-13Ra cDNA轉感染之COS-3或CHO細胞上所完成 之結合分析 將CHO細胞以編碼專一結合經標定IL_13之1L-13Ra的經分 離cDNA轉感染。飽和曲線之史考恰得分析顯示，有一具 有kd值為4.5±0.4 nM及最大結合容量為26000受體/細胞之單 一組成位置（圖8C及圖8G)。 共表現實驗之結果列示於圖8D及8H中。 圖8C結果之分析顯示IL-13Ra於CHO細胞之選殖株2036 中，有良好的表現。亦可注意到，於經IL-4R與IL-13Ra cDNA轉感染之CHO細胞中，IL-4R取代60% IL-13之結合（圖 8H)，但對IL-13Ra之kd值反而為7·5ηΜ，其為IL-13Ra位置 和IL-4R位置相等時之10倍之多。 表現hIL-4R (人類IL-4R)，經編碼人類IL-13Ra之cDNA轉 感染之CHO-hIL-4R細胞，專一地與經標定之IL-13結合。 -39 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

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565570 A7 B7 五 、發明説明（ 飽和曲線之史考恰得分析明白地顯示出2個組成位置， 其一具有kd偉為23±8·9 pM及最大結合容量為28000位置/細 胞之高親和性，而另一者具有kd值為4.2±1.4 nM及最大結 合容量為150000位置/細胞之低親和性（圖8D)。 該第二位置特徵為具有與被單獨表現之hIL-13Ra (人類 IL-13Ro〇相同的親和性，且由於其以大於hIL-4R之量表 現，故相當於未經聯合之IL-13Ra鏈。 此等於2種hIL-13Roc與hIL-4R鏈-存在下重建之高-親和性 受體，能夠辨識該2種細胞活素（圖8D及圖8H)。此甚至於 以其中IL-4取代所有結合IL-13之可比較量下共表現該2種 hIL-13Ra與hIL-4R鏈之COS/pSEl細胞上更加明顯。 重組型人類IL-13Ra之親和性可與所述對老鼠IL-13a受體 之親和性（2-10 nM)(參考文獻22)相比擬。 相對於先前所述之hIL-13Rp鏈，人類IL-13Ra其本身單獨 不構成高-親和性之結合位置。 因此於細胞膜中，IL-13Ra與IL-4R交互作用而重建一高 親和性之受體。 實施例9 . 於共表現hIL-13R與hIL-4R之CH0細胞中，由IL-13及IL-4所 引起STAT蛋白質之活化作用。 於人類PBMC細胞中，hIL-4與IL-13活化2種雙面聯體蛋白 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

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線 565570 A7 B7 五 、發明説明（ (janus)家族之酵胺酸激酶，Jak 1與Jak 2，其磷酸化一種潛 伏性轉錄因子，STAT6。此經活化之因子進入細胞核中， 並與由IL-4調節之基因的促進子中特定物質結合。 吾等選擇人類Cs促進子之Cs物質作為電泳移動性轉換分 析（EMSA)之探針，以證明由IL-13引起類以STAT6之結合因 子的活化作用。 將僅表現IL-13R，僅表現IL-4R，或共同表現該2鏈之 CHO細胞核萃取物，於37°C下以rtOO毫微克/毫升IL-13或IL-4刺激30分鐘，並與經放射標定之Cs物質培育。 表現hIL-13Ra與hIL-4R之細胞核萃取物，不論該細胞是 否經IL-4或IL-13謗發，於EMSA中形成具有相同移動性之 複合物（參見圖9)。另一方面，僅表現其中一種鏈之細 胞，則未偵測得任何複合物。 於表現hIL-13Ra與hIL-4Ra之CHO細胞中，IL-13與IL-4因 此引發相同的傳訊階程（signalling cascade)。 本發明所述之IL-13RP及IL-13Ra選殖，使能夠增進對參 與相較於由IL-4謗發之反應，其為專一地由IL-13誘發之反 應之因子的瞭解。另外，其使能夠發展一種用於研究於正 常及以IL-13為重要角色之病理狀況下，受體表現調節作 用之工具。 又，cDNA之可利用性使能夠繫助其他重建IL-4/IL-13受 體複合物所需蛋白質之選殖，且可用於製造或合理模擬能 -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 裝 訂

565570 A7 B7 五 發明説明（ 39 夠作為IL-13活性專一拮抗劑之新穎醫藥產品 參考文獻：

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(B) 街名：32,34 rueMARBEUF (C) 城市：巴黎 (D) 國名：法國 (E) 郵遞區號（ZIP) ·· 75374 (F) 電話·· 0153774133 (ii) 發明名稱：間白素-13受體 | (iii) 序歹丨J編號·· 4 (iv) 電腦可讀取形式： (A) 介質類型：軟式磁碟片 - (B) 電腦：IBM PC可相容

(C) 操作系統：PC-DOS/MS-DOS (D) 軟體··專利键入釋出#1·0，版本#1·25(ΕΡΟ) -44 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 565570 A7 ______B7_ 五、發明説明（42 ) (2)關於SEQIDNO:l之資料： (i) 序列特徵： (A) 長度：15%鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股數：單股 (D) 拓撲學：線形 (ii) 分子類型：cDNA (vi)原始來源： (A)有機體：人類（Homo sapiens) (F) 組織類型：癌 (G) 細胞類型：腎細胞 (H) 細胞系：caki-1 (xi)序列描述：SEQ ID ΝΟ:1: GGTGCCTGTC GGCGGGGAGA GAGGCAATAT CAAGGTTTTA AATCTCGGAG AAATGGCTTA 60 ATTCGTTTGC TTGGCTATCG GATGCTTATA TACCTTTCTG ATAAGCACAA CATTTGGCTG ·· 120 TACAAGCTTT TGCACTTCAT CTTCAGACAC CGAGATAAAA GTTAACCCTC CTCAGGATTT 180 | TGAGATAGTG *GATTATGAAG AGAACCCGGA' TACTTAGGTT ATCTCTATTT GCAATGGCAA.、 240 CCCCCACTGT CTCTGGATCA TTTTGTGTTG TGAAAGGAAT GCACAGTGGA ATATGAACTA 一 300 AAATACCGAA ACATTGGTAG TGAAACATGG AAGGCTAGTG TAGAGGTTAC CATCATTACT 360 AAGAATCTAC ATTACAAAGA TGGGTTTGAT CTTAACAAGG GCATTGAATT ATAGAAGGGC 420 GAAGATACAC ACGCTTTTAC CATGGCAATG CACAAATGGA TCAGAAGTTC AAAGTTCCAA · 480 TTGCTAGGAG TGGGCAGAAA CTACTTATTG GATATCACCA CAAGGAATTC CAGAAACTAA 540 AGTTCAGGAT TAAGTTTTGG GTAGAATGGA TTGCGTATAT TACAATTGGC AATATTTACT 600： CTGTTCTTGG AAACCTGGCA TAGGTTACAT TATGTCTGGG TACTTCTTGA TACCAATTAC 660 AACTTGTTTT ACTGGTATGA GGGCTTGGAT CATGCATTAA ATATATTTGG AAACAGTGTG 720 -45- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)

裝 訂

線 565570 A7 B7 五、發明説明（43 )

TTGATTACAT CAAGGCTGAT GGACAAAATA TAGGATGCAG ATTTCCCTAT TTGGCAATAA 780 AGGAGCAGTG AGGCATCAGA CTATAAAGAT TTCTATATTT GTGTTAATGG ATCATCAGAG 840 AACAAGCCTG AAATATCAAG GAATCAGATC CAGTTATTTC ACTTTTCAGC TTCAAAATAT 900 | AGTTAAACCT TTGCCGCCAG TCAGTTGGAA ATATCTTACT TTTACTCGGG AGAGTTCATG 960 TGAAATTAAG CTGAAATGGA GCATACCTTT GTTTAGGCGT GGACCTATTC CAGCAAGGTG 1020 TTTTGATTAT .GAAATTGAGA TCAGAGAAGA TGATACTACC GAAAGCATGG AGGAATTTTG 1080 1 GTGACTGCTA CAGTTGAAAA TGAAACATAC ACCTTGAAAA CAACAAATGA AACCCGAATA 1140 ATAGAGTTTT TAGTAGCAAT TATGCTTTGT AGTAAGAAGC AAAGTGAATA TTTATTGCTC 1200 ； AGATGACGGA ATTTGGGCAA AGAATCAAGT AGTGAGTGGA GTGATAAACA ATGCTGGGAA 1260 j GGTGAAGACC TATCGAAGAA AACTTTGCTA GTAGCTGGGA TCGTTTCTGG CTACCATTTG 1320 GTTTCATCTT AATATTAGTT ATATTTGTAA CCGGTCTGCT TAGTGAATGT TGCGTAAGCC 1380 AAACACCTAC CCAAAAATGA TTCCAGAATT TTTCTGTGAT ACATGAAGAA GATTTGCATC 1440 TTTCCATATC AAGAGACATG GTATTGACTC AACAGTTTCC AGTCATGGCC AAATGTTCAA 1500· TATGAGTCTC AATAAACTGA ATTTTTCTTG CGAATGTTG I53S (2)關於SEQIDNO:2之資料： (i) 序列特徵： (A) 長度：380胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)拓撲學：線形 (ii) 分子類型：蛋白質 (vi)原始來源： (A)有機體：人類（Homo sapiens) (F) 組織類型：癌 - (G) 細胞類型：腎細胞 (H) 細胞系：caki-l-46- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 裝

565570 A7 B7 五、發明説明（44 ) (xi)序列描述：SEQ ID NO:2:

Mec Ala Phe Val Cys Leu Ala lie Gly Cys Leu Tyr Thr Phe Leu lie 1 5 10 15

Ser Thr Thr Phe Gly Cys Thr Ser Ser Ser Asp Thr Glu lie Lys Val 20 25 30

Asn Pro Pro Gin Asd Phe Glu 工le Val Asp Pro Gly Tyr Leu Gly Tyr 35 . 40 45

Leu Tyr Leu Gin Trp Gin Pro Pro Leu Ser Leu Asp His Phe Lys Glu 50 55 60 • i

Cys Thr Val Glu Tyr Glu Leu Lys Tyr Arg Asn lie Gly Ser Glu Thr 65 70 75 80

Trp Lys Thr lie lie Thr Lys Asn Leu His Tyr Lys Aso Gly Phe Asp |

85 90 95 I

Leu Asn Lys Gly lie Glu Ala Lys lie His Thr Leu Leu Pro Trp Gin 100 105 110

Cys Thr Asn Gly Ser Glu Val Gin Ser Ser Τγό Ala Glu Thr Thr Tyr 115 120 125

Trp lie Ser Pro Gin Gly lie Pro Glu Thr Lys Val Gin Asd Met Asp 130 135 140 "

Cys Val Tyr Tyr Asn Trp Gin Tyr Leu Leu Cys Ser Trp Lys Pro Gly 145 150 155 160 lie Gly Val Leu Leu Asd Thr Asn Tyr Asn Leu Phe Tyr TrD Tyr Glu 165 ' 170 175

Gly Leu Asp His Ala Leu Gin Cys Val Asp Tyr lie Lys Ala Asp Gly 180 185 190

Gin Asn lie Gly Cys Arg Phe Pro Tyr Leu Glu Ala Ser Asp Tyr Lys 195 200 205

Asp Phe Tyr lie Cys Val Asn Gly Ser Ser Glu Asn Lys Pro lie Arg 210 215 220

Ser Ser Tyr Phe Thr Phe Gin Leu Gin Asn lie Val Lys Pro Leu Pro 225 230 一 235 240

Pro Val Tyr Leu Thr Phe Thr Arg Glu Ser Ser Cys Glu lie Lys Leu 245 - 250 255

Lys Trp Ser lie Pro Leu Gly Pro lie Pro Ala Arg Cys Phe Asd Tyr 260 265 270 *

Glu lie Glu He Arg Glu Asp Asp Thr Thr Leu Val Thr Ala Thr Val 275 280 285 -47- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 裝

565570 A7B7 五、發明説明（45 )

Glu Asn Glu Thr Tyr Thr Leu Lys Thr Thr Asn Glu Thr Arg Gin Leu 290 295 300

Cys Phe Val Val Aro Ser Lys Val Asn lie Tyr Cys Ser Asp Asd Gly 305 310 315 320 工le Trp Ser Glu Trp Ser Asp Lys Gin Cys Trp Glu Gly Glu Asp Leu 325 330 335

Ser Lys Lys Thr Leu Leu Arg Phe Τγό Leu Pro Phe Gly Phe lie Leu 340 345 350 lie Leu Val lie Phe Val Thr Gly Leu Leu Leu Arg Lys Pro Asn Thr · 355 360 365

Tyr Pro Lys Met lie Pro Glu Phe Phe Cys Asd Thr 370 375 380 (2)關於SEQ ID NO:3之資料： (i) 序列特徵： (A) 長度：4009鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股數：單股 (D) 拓撲學：線形

(ii) 分子類型：cDNA (iii) 假定：無 (iii)反意義：無 (vi)原始來源： (A)有機體：人類（Homo sapiens) (F) 組織類型：癌 . (G) 細胞類型：腎細胞 (H) 細胞系：caki-Ι ' (xi)序列描述：SEQ ID NO:3: -48- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐）

裝 訂

565570 A7B7 五、發明説明（46 ) TCAGCCCGGC CGGGCTCCGA GGCGAGAGGC TGCATGGAGT GGCCGGCGCG GCTCTGCGGG 60 CTGTGGGCGC TGCTGCTCTG CGCCGGCGGC GCGGGGGCGC CGCGCCTACG 120 GAAACTCAGC CACCTGTGAC AXATTTGAGT GTCTCTGTTG AAAACCTCTG CACAGTAATA 180 TGGACATGGA ATCCACCCGA GGGAGCCAGC TCAAATTGTA GTCTATGGTA TTTTAGTCAT 240 TTTGGCGACA AACAAGATAA GAAAATAGCT CCGGAAACTC GTCGTTCAAT AGAAGTACCC 300 ； CTGAATGAGA GGATTTGTCT GCAAGTGGGG TCCCAGTGTA GCACCAATGA GAGTGAGAAG 360 CCTAGCATTT TGGTTGAAAA ATGCATCTCA CCCCCAGAAG GTGATCCTGA GTCTGCTGTG 420 ACTGAGCTTC AATGCATTTG GCACAACCTG AGCTACATGA AGTGTTCTTG GCTCCCTGGA 480 AGGAATACCA GTCCCGACAC TAACTATACT CTCTACTATT GGCACAGAAG CCTGGAAAAA 540 ATTCATCAAT GTGAAAACAT CTTTAGAGAA GGCCAATACT TTGGTTGTTC CTTTGATCTG 600 ACCAAAGTGA AGGATTCCAG TTTTGAACAA CACAGTGTCC AAATAATGGT CAAGGATAAT 660 GCAGGAAAAA TTAAACCATC CTTCAATATA GTGCCTTTAA CTTCCCGTGT GAAACCTGAT 720 CCTCCACATA TTAAAAACCT CTCCTTCCAC AATGATGACC TATATGTGCA ATGGGAGAAT 780丨 CCACAGAATT TTATTAGCAG ATGCCTATTT TATGAAGTAG AAGTCAATAA CAGCCAAACT 340 : GAGACACATA ATGTTTTCTA CGTCCAAGAG GCTAAATGTG AGAATCCAGA ATTTGAGAGA 900 1 AATGTGGAGA ATACATCTTG TTTCATGGTC CCTGGTGTTC TTCCTGATAC TTTGAACACA . 960 GTCAGAATAA GAGTCAAAAC AAATAAGTTA TGCTATGAGG ATGACAAACT CTGGAGTAAT 1020 TGGAGCCAAG AAATGAGTAT AGGTAAGAAG CGCAATTCCA CACTCTACAT AACCATGTTA 1080 CTCATTGTTC CAGTCATCGT CGCAGGTGCA ATCATAGTAC TCCTGCTTTA CCTAAAAAGG 1140 CTCAAGATTA TTATATTCCC TCCAATTCCT GATCCTGGCA AGATTTTTAA AGAAATGTTT 1200 GGAGACCAGA ATGATGATAC TCTGCACTGG AAGAAGTACG ACATCTATGA GAAGCAAACC 1260 AAGGAGGAAA CCGACTCTGT AGTGCTGATA GAAAACCTGA AGAAAGCCTC TCAGTGATGG 1320 AGATAATTTA TTTTTACGTT CACTGTGACC TTGAGAAGAT TCTTCCCATT CTCCATTTGT 1380 TATCTGGGAA CTTATTAAAT GGAAACTGAA ACTACTGCAC CATTTAAAAA CAGGCAGCTC 1440 ATAAGAGCCA CAGGTCTTTA TGTTGAGTCG CGCACCGAAA AACTAAAAAT AATGGGCGCT 1500 TTGGAGAAGA GTGTGGAGTC ATTCTCATTG AATTATAAAA GCCAGCAGGC TTCAAACTAG 1560 GGGACAAAGC AAAAAGTGAT GATAGTGGTG GAGTTAATCT TATCAAGAGT TGTGACAACT 1620 TCCTGAGGGA TCTATACTTG CTTTGTGTTC TTTGTGTCAA CATGAACAAA TTTTATTTGT 1680 AGGGGAACTC ATTTGGGCTG CAAATGCTM TGTCAAACTT GAGTCACAAA GAACATGTAG 1740 AAAACAAAAT GGATAAAATC TGATATGTAT TGTTTGGGAT CCTATTGAAC CATGTTTGTG 1800 -49- 裝 訂 線 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 565570 A7 B7 五、發明説明（

GCTATTAAAA

CAATTTGGGA

CAAAATGGTG

TGCCTGTAAT

：G0AGGTTGCA

TCTGTCTAAA

CATCATTCCC

ATGATGACAA

TTAGGCTGTT

AAGTCTCTAA

GGTTTGTGCT

TGAGACTCCT

TTTAACTCCT

GTAGCCTTTT

CAGAGGATAA

TGCATATTTT

CAGAGATGAG

TTGAACCTAT

ATGATTAATT

ATGCTTTTGG

ATATCCCCTC

CTCTTTTAAC

GTCCGAGGCG

AAACCTCCTC

CCCAGCTACT

GTGAGCAGAG

AAACAAAACA

TTCGACAGCA

CTACAGAAAA

AGGGGCAGTG

CAATGTATTT

AGGCCCCCGG

CAGTTCTTGC

CAATTCCAAC

GACTTTCATT

TTAGCATCTC

GTAACTTCCA

GTGGTATCTT

TTCTCTTTCT

AAATAGCTTT

GGGGCATATA

TACTCTTACT

AGTCTGGGCT

GGCGGATCAC

TCTACTAAAA

CGGGAAGCTG

ATCACACCAC

AAACAAAACA

TTTTCCTCTG

ACCAGAGGCA

GAGGTAGAAT

TCTTCACCTC

GTGTGAAGCA

CACTTTTTTT

ACTGATTTCC

GGAAATTAGG

AGGTTAAGTG

TGTGAGGGTT

CACGTAGAAC

TTACAAGATG

TGTGTCTTAC

TTGGGTTCCA

TCCCCCAAAT

GGGTCCGGTG

TCGAGGTCAG

CTACAAAAAT

AGGCAGGTGA

TGCACTCTAG

AAACAAAAAA

CTTTGAAAGC

GCTTCTTTGC

GACTCCTTGG

TGCTACTCAA

CAGACCCCTT

TTTAATCTCC

CCTTTTGCAT

ATGTAAATCT

TGAGTAATCT

TTCAGCATTG

ATTGGTATTC

GGTCCAGGAT

ATTGGTAGCC

TTCTCACCTA

TTAAAGAAGT

GCTCACGCCT

GAGTTCCAGA

TAACTGGGTG

ATTGTTTGAA

CCTGGGTGAC

ACCTCTTAAT

CCCAGAAATC

CAAGACCTTT

GTATTAGAGT

GTAGCATTTA

CCAGGGGTTT

ACCAGTCATT

TCTCCCTCCT

GCTCAGGAGA

GAGAAACAAT

ATATTTGTGC

GCTTGAGAAA

TCCTCTTTTC

AGCCAGCCAA

TCCACACAAC

ATGGGAAATG

GTAATCCCAG

CCAGCCTGAC

TGGTGGCGCG

CCTGGGAGGT

AGAGCAAGAC

ATTCTGGAGT

AGTGTTGGCC

CAAAGCCATT

TTCAACCATG

CTGTGTCTTT

ACAGTCTATT

TTTCAGACCT

TCCCTTCCTT

CCTGGAGGAG

GACTAATTCT

ATTTTCTAAA

AAAAGAATAG

TCTGCCATAA

GGCTCTGTTT

ATATCCGTAT

AGAGGCATTT CCCCCACCCG ATTTCTCTCC TCACACACAG ACTCATATTA CTGGTAGGAA CTTGAGAACT 3120 TTATTTCCAA GTTGTTCAAA CATTTACCAA TCATATTAAT ACAATGATGC TATTTGCAAT 3180 j TCCTGCTCCT AGGGGAGGGG AGATAAGAAA CCCTCACTCT CTACAGGTTT GGGTACAAGT 3240 ί GGCAACCTGG TTCCATGGCC GTGTAGAAGC ATGGTGCCCT GGCTTCTCTG AGGAAGCTGG 3300 ' GGTTCATGAC AATGGCAGAT GTAAAGTTAT TCTTGAAGTC AGATTGAGGC TGGGAGACAG 3360 ； 一 j CCGTAGTAGA -.TGTTCTACTT TGTTCTGCTG TTCTCTA^AA AGAATATTTG GTTTTCCTGT 3420 j ATAGGAATGA GATTAATTCC TTTCCAGGTA ΤΤΤΤΑΤΑΑΊΤ CTGGGAAGCA AAACCCATGC 3480 i CTCCCCCTAG CCATTTTTAC TGTTATCCTA TTTAGATGGC CATGAAGAGG ATGCTGTGAA 3540 ATTCCCAACA AACATTGATG CTGACAGTCA TGCAGTCTGG GAGTGGGGAA GTGATCTTTT 3600 I860 1920 1980 I i 2040 I 2100 2160 2220 2280 2340 ; 1 2400 2460 2520 2580 2640 2700 27 60 2820 2880 2940 3000 3060 裝

-50- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 565570 A7 B7 五、發明説明（48 ) GTTCCCATCC TCTTCTTTTA GCAGTAAAAT AGCTGAGGGA AAAGGGAGGG AAAAGGAAGT - 3660 TATGGGAATA CCTGTGGTGG TTGTGATCCC TAGGTCTTGG GAGCTCTTGG AGGTGTCTGT 3720 ATCAGTGGAT TTCCCATCCC CTGTGGGAAA TTAGTAGGCT CATTTACTGT TTTAGGTCTA 3780 GCCTATGTGG ATTTTTTCCT AACATACCTA AGCAAACCCA GTGTCAGGAT GGTAATTCTT 3840 ATTCTTTCGT TCAGTTAAGT TTTTCCCTTC ATCTGGGCAC TGAAGGGATA TGTGAAACAA 3900 TGTTAACATT TTTGGTAGTC TTCAACCAGG GATTGTTTCT GTTTAACTTC TTATAGGAAA 3960 GCTTGAGTAA AATAAATATT GTCTTTTTGT ATGTCACCCA AAAAAAAAA 4009 (2)關於SEQ ID NO:4之資料： _ (i)序列特徵： (A) 長度·· 427胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)拓撲學：線形

Cii)分子類型：蛋白質 (vi)原始來源·· (A)有機體：人類（Homo sapiens) (F) 組織類型：癌 (G) 細,胞類型··腎細胞 (H) 細胞系：caki-Ι , (xi)序列描述：5£〇10 1^0:4··-

Met Glu Trp Pro Ala Arg Leu Cys Gly Leu Trp Ala Leu Leu Leu Cys 1 5 10 15

Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Pro Thr Glu Thr Gin 20 25 30

Pro Pro Val Thr Asn Leu Ser Val Ser Val Glu Asn Leu Cys Thr Val 35 40 45 -51 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 565570 A7 B7 五、發明説明（49 ) lie Trp Thr Trp Asn Pro Pro Glu Gly Ala Ser Ser Asn Cys Ser Leu 50 55 60 I Trp Tyr Phe Ser His Phe Gly Asp Lys Gin Asp Lys Lys lie Ala Pro 丨 65 70 75 I Glu Thr Arg Arg Ser lie Glu Val Pro Leu Asn Glu Arg 工le Cys Leu 85 90 95 Gin Val Gly Ser Gin Cys Ser Thr Asn Glu Ser Glu Lys Pro Ser lie 100 105 110 Leu Val Glu Lys Cvs lie Ser Pro Pro Glu GXy Asp Pro Glu Ser Ala 115 ' 120 125 yal Thr Glu Leu Gin Cys He Trp His Asn Leu Ser Tyr Met Lys Cys 130 135 140 Ser Trp Leu Pro Gly Arg Asn Thr Ser Pro Asp Thr Asn Tyr Thr Leu 145 150 155 160 Tyr Tyr TrD His Arg Ser Leu Glu Lys 工le His Gin Cys Glu Asn lie * 165 170 175 Phe Arg Glu Gly Gin Tyr Phe Gly Cys Ser Phe Asd Leu Thr Lys Val 180 185 * 190 Lys Asp Ser Ser Phe Glu Gin His Ser Val Gin 工le Met Val Lys Asd 195 200 205 Asn Ala Gly Lys lie Lys Pro Ser Phe Asn lie Val Pro Leu Thr Ser 210 215 220 Arg Val Lys Pro Asp Pro Pro His lie Lys Asn Leu Ser Phe His Asn 225 230 235 240 Asp Asp Leu Tyr Val Gin Trp Glu Asn Pro Gin Asn Phe lie Ser Arg 245 250 255 Cys Leu Phe Tyr Glu Val Glu Val Asn Asn . Ser Gin Thr Glu Thr His 260 265 270 Asn Val Phe Tyr Val Gin Glu Ala Lys Cys Glu Asn Pro Glu Phe Glu 275 280 285

Arg Asn Val Glu Asn Thr Ser Cys Phe Mec Val Pro Gly Val Leu Pro 290 295 - 300 Aso Thr Leu Asn Thr Val Arg lie Arg Val Lys Thr Asn Lys Leu Cys 305 310 . 315 320 Glu Asd Asd Lvs Leu Trp Ser Asn Trp Ser Gin Glu Met Ser lie ； · ' 325 330 335 | Gly Lys Lys Arg Asn Ser Thr Leu Tyr lie Thr Met Leu Leu lie Val ! 340 345 350 -52- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 裝 訂

線 565570 A7 B7 五、發明説明（5〇 )

Pro Val 工le Val Ala Gly Ala lie lie Val Leu Leu Leu Tyr Leu Lys 355 360.. 365

Arg Leu Lys lie lie lie Phe Pro Pro lie Pro Asd Pro Gly Lys lie 370 375 380

Phe Lys Glu Met Phe Gly Asp Gin Asn Asp Asp Thr Leu His Trp Lys 385 390 395 400

Lys Tyr Asp 工le Tyr Glu Lys Gin Thr Lys Glu Glu Thr Asp Ser Val 405 410 415

Val Leu lie Glu Asn Leu Lys Lys Ala Ser Gin 420 425 -53-

Claims (1)

1. 565570 第085115042號專利申請案 中文申請專利範圍替換本(92年8月）

   公告本 六、申請專利範圍 1. 一種人類I L · 1 3受體多肽’其係由胺基酸序列SEQ ID NO. 2組成；其中該SEQ ID NO· 2之序列如下所示： Mec Ala ?he Val Cys Leu Ala Gin Trp Gin Pro 55 Glu Tyr Glu Leu 70 lie lie Thr Lys 85 Gly lie Glu Ala 100 Gly Ser Glu Val Phe Gly Cys Thr 20 Gin Asp ?he Glu Ser Thr Thr Asn Pro Pro 35 Leu Tyr Leu 50 Cys Thr Val 65 ' Trp Lvs Thr Leu Asn Lys Cys Thr Asn 115 lie Gly Cys 10 Ser Ser Ser 25 lie Val Asp 40 · Pro Leu Ser Lys Tyr Arg Asn Leu His 90 Lys lie Kis 105 Gin Ser Ser 120 Leu Tyr Thr Asp Thr Glu Pro Gly TVr 45 Leu Asd His 60* Asn lie Gly 7 5 Tyr Lys Asp Thr Leu Leu Trp Ala Glu 125 Phe Leu、Ile 15 lie Lvs Vai 30 · Leu Gly Tyr Phe Lvs Glu Ser Glu Thr 80 Glv Phe Asp 95 Pro Trp Gin 110 Thr Thr Tyr 裝 T-d Ser Pro Gin Gly lie Pro Glu Thr Lys Val Gin Asd Met: Asp 130 135 140 Cys Val Tyr Tyr Asn Trp Gin Tyr Leu Leu Cys Ser Trp Lys Pro Gly 145 150 155 160 lie GW Val Leu Leu Asd Thr Asn Tyr Asn Leu Phe Tyr Τγό TVr Glu ^ 165 ' 170 175 Gly Leu Asd His AIsl Leu Gin Cys Val Asp Tyr lie Lys A1& Asp Gly 180 185 190 Gin Asn lie Glv Cvs Arg Phe Pro Tyr Leu Glu Ala Ser Asp Tyr Lys 195 - - 200 205 Asp Phe Tyr lie Cys Val Asn Gly Ser Ser Glu Asn Lys Pro lie Arg * 210 215 220 Se> Se^ Tvr Phe Thr Phe Gin Leu Gin Asn lie Val Lys Pro Leu Pro 225 ~ * 230 225 240 Pro Tvr Leu Thr Phe Thr Arg Glu Ser Ser Cys Glu lie Lys Leu - 245 250 255 Lvs Trp Ser lie Pro Leu Gly Pro lie Pro Ala Arg Cys Phe Asp Tyr - 260 265 270 O:\45\45720-920815 DOC 4 义度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210X 297公釐） 565570 8 8 8 8 A B c D 六、申請專利範圍 Glu lie Glu lie Arg C-lu Asp Asp Thr Thr Leu Val Thr Ala Thr Val 275 2S0 285 Glu Asn Glu Thr Tyr Thr Leu Lys Thr Thr Asn Glu Thr Arg Gin Leu 290 295 300 Cys Phe Val Val Arg Ser Lys Val Asn He Tvr Cvs Ser Asd Aso GV 305 310 315 * · 320 He Trp Ser Glu .Trp Ser Asp Lys C-In Cys Trp Glu GIv Glu Asd Leu 325 330 - 3 3*5 Ser Lys Lys Thr Leu Leu Arg Phe Trp Leu Pro Phe Giy Phe lie Leu 340 345 350 lie Leu Val lie Phe Val Thr Gly Leu Leu Leu Arg Lvs Pro Asn Thr 355 360 365 Tyr Pro Lys Met lie Pro Glu Phe Phe Cvs Asd Thr 370 375 ** · 380 2. —種純化之多肽，其特徵為其係序列SEQ ID NO. 2之多 肽之變體形式，其中8個C-末端殘基經下列6個殘基取 代：VRCVTL ;其中SEQ ID NO. 2之序列如申請專利範圍 第1項所定義。 3. 根據申請專利範圍第1項之多肽，其特徵為其為伸展至 殘基343之可溶形式。 4. 根據申請專利範圍第1項之多肽，其特徵為其為伸展至 殘基337之可溶形式。 5. —種分離之核酸序列，其係編碼根據申請專利範圍第1 至4項中任一項之多肽。 6. 根據申請專利範圍第5項之分離之核酸序列，其特徵為 其係選自： a)序列 SEQ ID NO· 1， O:\45\45720-920815 DOC 4 - 2 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 x 297公釐） A8 B8 C8 D8 _____ 六、申請專利範圍 b)因為遺傳密碼子簡併性而衍生自序列a)之核酸序 歹J ;其中SEQ ID NO. 1之序列如下所示： GGTGCCTGTC GGCGGGGAGA GAGGCAATAT CAAGGTTTTA AATCTCGGAG AAATGGCTTA 60 ATTCGTTTGC TTGGCTATCG GATGCTTATA TACCTTTCTG ATAAGCACAA CATTTGOCTG 120 7ACXAGCTTT TGCACTTCAT CTTCAGACAC CGAGATAAAA GTTAACCCTC CTCAGGATTT ISO TGAGATAGTG *GATTATGAAG AGAACCCGGA ' TACTTAGGTT ATCTCTATTT GCAATGGCAA. 240 CCCCCACTGT CTCTGGATCA TTTTGTGTTG TGAAAGGAAT GCACAGTGGA ATATGAACTA - 300 AAATACCGAA ACATTGGTAG TGAAACATGG AAGGCTAGTG TAGAGGTTAC CATCATTACT 360 AAGAATCTAC ATTACAAAGA TGGGTTTGAT CTTAACAAGG GCATTGAATT ATAGAAGGGC 420 GAAGATACAC ACGCTTTTAC CATGGCAATG CACAAATGGA TCAGAAGTTC AAAGTTCCAA . 480 TTGCTAGGAG TGGGCAGAAA CTACTTATTG GATATCACCA CAAGGAATTC CAGAAACTAA 540 AGTTCAGGAT TAAGTTTTGG GTAGAATGGA TTGCGTATXT TACAATTGGC AATATTTACT 600 CTGTTCTTGG A^J^CCTGGCA TAGCTTACAT TATGTCTGGG TACTTCTTGA TACCAATTAC 660 AACTTGTTTT ACTGGTATGA GGGCTTGGAT CATGCATTAA ATATATTTGG AAACAGTGTG 720 TTGATTACAT CAAGGCTGAT GGACAAAATA TAGGATGCAG ATTTCCCTAT TTGGCAATAA 7 80 AGGAGCAGTG AGGCATCAGA CTATAAAGAT TTCTATATTT GTGTTAATGG ATCATCAGAG 840 AACAAGCCTG AAATATCAAG GAATCAGATC CAGTTATTTC ACTTTTCAGC TTCAAAATAT 900 AGTTAAACCT TTGCCGCCAG TCAGTTGGAA ATATCTTACT TTTACTCGGG AGAGTTCATG 960 TGAAATTAAG CTGAAATGGA GCATACC7TT GTTTAGGCGT GGACCTATTC CAGCAAGGTG 1020 TTTTGATTAT .GAAATTGAGA TCAGAGAAGA TGATACTACC GAAAGCATGG AGGAATTTTG 1080 GTGACTGCTA CAGTTGAAAA TGAAACATAC ACCTTGAAAA CAACAAATGA AACCCGAATA 1140 ATAGAGTTTT TAGTAGCAAT TATGCTTTGT AGTAAGAAGC AAAGTGAATA TTTATTGCTC 1200 AGATGACGGA ATTTGGGCAA AGAATCAAGT AGTGAGTGGA GTGATAAACA ATGCTGGGAA 1260 GGTGAAGACC TATCGAAGAA AACTTTGCTA GTAGCTGGCA TCGTTTCTGG CTACCATTTG 1320 GTTTCATCTT AATATTAGTT ATATTTGTAA CCGGTCTGCT TAGTGAATGT TGCGTAAGCC 1380 AAACACCTAC CCAAAAATGA TTCCAGAATT TTTCTGTGAT ACATGAAGAA GATTTGCATC 144<> TTTCCATATC AAGAGACATG GTATTGACTC AACAGTTTCC AGTCATGGCC AAATGTTCAA 150 0 TATGAGTCTC AATAAACTGA ATTTTTCTTG CGAATGTTG 153S -3- O:\45\45720-920815.DOC4 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 565570

   申清專利範圍 A B c D 根據申請專利圍第5項之分離之核酸序列，其特徵為 其由序列SEQ ID NO. 1中之核荅酸N0: }延展至核苷酸 N〇: 1081鍵聯組成；其中SEQ ID NO· 1之序列如申請專 利範圍第5項所示。 8. 根據申請專利範圍第5項之分離之核酸序歹卜其特徵為 其由序列SEQ ID NO· 1中之核茹酸N〇: !延展至核荅酸 NO: 1063鍵聯組成；其中SEQ山N〇. 序列如申請專 利範圍第5項所示。 9. 根據申請專利範圍第6項之核酸序列，纟中a)中之核酸 序列係藉由雜交作用，做為用以於生物樣本中偵測編 碼根據申請專利範圍第1至4項中任一項之多肽的核酸 序列，或用以顯示變異合成或基因異常如異質結合性 喪失或基因重排之活體外診斷工具。 1〇·根據申請專利範圍第6項之核酸序列，其中a)中之核酸 序列係用於偵測染色體異常。 11· 一種用於編碼根據申請專利範圍第i至4項任一項之多 肽的核酸序列層級上偵測變異合成或基因異常之活體 外診斷方法，其特徵為其包含： 一將根據申請專利範圍第6項之a)中之核酸序列於能 使孩核酸序列與上述核苷酸間形成雜交複合物之條件 下，視須要於預先將上述核荅酸序列放大後接觸； —偵測所可能形成之雜交複合物； O:\45\45720-920815 DOC 4 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A*規格(2ι〇χ 2的公釐） 565570 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 一視須要，將與本發明形成雜交複合物之核奋酸定 序。 12.根據申請專利範圍第5項之核酸序列，其係用於製造根 據申請專利範圍第1至4項中任一項之重組型多肽。 〇Λ45\45720-920815 DOC4 ~ 5 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格（21〇x 297公釐）