JPH04507344A - 顆粒球―マクロファージコロニー刺激因子受容体およびその誘導体における改良 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子受容体およびその誘導体における改良 この発明は一般に、ヒト組換え体および合成の顆粒球−マクロファージコロニー 刺激因子（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）受容体、およびその生化学的および／または生物学的 な対応物、同族体、または誘導体に関するものである。これらの分子は、治療薬 および診断薬の製造にとりわけ有用であり、またＧＭ−ＣＳＦの受容体結合に関 連するアゴニストおよびアンタゴニストの産生に有用である。

顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、好中球、好酸球 、および単球／マクロファージ系列細胞の増殖、分化および機能活性を調節する 糖タンパク質型の増殖・分化因子である［メトカーフ（１９８４年）、ゴーフお よびニコラ（１９８９年）、総説］。マウス［ゴーフら（１９８４年）］、およ びヒト［ウォングら（１９８５年）］のＧＭ−Ｃ３Ｆを暗号化した分子クローン が単離され、組換え体タンパク質は動物モデル系［メトカーフら（１９８７年） 、ドナヒユーら（１９８６年）］および種々の造血不全患者の臨床第１　／ＩＩ 相試験で試験された［モースティンら（１９８９年）、総説］。動物実験および 臨床試験の何れの場合も、ＧＭ−Ｃ３Ｆは単球、好中球、好酸球の循環量を増大 させ、循環する細胞の機能容量を向上させ、化学療法および／または骨髄移植に 伴う造血機能の回復速度を促進することが判明した［ゴーフおよびニコラ（１９ ８９年）、モースティンら（１９８９年）］。

マウスおよびヒトのどちらの系でも、オートラジオグラフィー分析で、ＧＭ−Ｃ ３Ｆ受容体は単球、好中球、および好酸球系列に属する細胞に少数（１細胞当た り数百）だけ存在することが判明した［ニコラ（１９８７年）、ディペルジオら （１９８８年）］。然しながら、内皮細胞［ブッソリーノら（１９８９年）コ、 小細胞肺ガン細胞系およびＳＶ４０を導入したサルＣＯ８細胞［コシタ・ボール ドウィンら（１９８９年）］等を含む非造血系細胞でも同様に機能的なＧＭ−Ｃ ＳＦ受容体が検出された。

ウォーカーおよびバージニス（１９８５年）は、マウス系で高親和性（Ｋ、約３ ０ｐＭ）および低親和性（Ｋ、約１　ｎＭ）の両方の受容体を検出したが、パー クら（１９８６年ａ）はＫＤ１〜３ｎＭ級の単一の受容体を検出した。ヒト系で は、造血系細胞および内皮細胞で高親和性の受容体（ＫＤ約３０ｐＭ）だけが報 告されたが［ギャッソンら（１９８６年）、ブッソリーノら（１９８９年）、パ ークら（１９８６年ｂ）］　、ＣＯ８細胞では低親和性受容体が報告された［コ シタ・ボールドウィンら（１９８９年）コ。マウス系で、ＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体は 、インターロイキン−３およびその他の活性因子によって間接的に下方調節され るが、ＧＭ−Ｃ８Ｆ受容体（複数もあり）はＧＭ−Ｃ３Ｆだけを認識する［ウォ ーカーら（１９８５年）、ニコラ（１９８７年）］。

ＧＭ−Ｃ８Ｆの生物学的効果の多くはピコモル濃度で観察され［メトカーフ（１ ９８４年）Ｌ発明者らは高親和性受容体が選択的に内部化されることを見いだし たから［ゴーフおよびニコラ（１９８９年）］、低親和性受容体が生物学的に機 能的であるのかどうかは明白でない。マウス系では、３７℃で［ウォーカーら（ １９８５年）］、ヒト系では、４°Ｃまたは３７℃で［エリオツドら（１９８９ 年）、ロベツら（１９８９年）、パークら（１９８９年）］、多能性Ｃ８Ｆ　（ インターロイキン−３）は、ある種の型の造血系細胞のＧＭ−Ｃ８Ｆ受容体を下 方調節することできるが、これはさまざまな受容体サブクラスによって仲介され るのか、または受容体−受容体相互作用によって仲介されるのかは明らかでない ［ギアリングら（１９８９年）、エリオツドら（１９８９年）、ロペツら（１９ ８９年）］。

本来、ＧＭ−Ｃ８Ｆは顆粒球／マクロファージ始原細胞の増殖刺激能によって定 義されたが、最近になって、これがその他の造血系［メトカーフら（１９８０年 ）コの始原細胞、および非造血系起源の細胞の増殖をも刺激することが明らかに なった。これらは、ヒト骨髄繊維芽細胞、前原性肉腫細胞系、および乳ガン細胞 系［デッドバーら（１９８８年）］、ヒト小細胞ガン細胞系［コシタ、ボールド ウィンら（１９８９年）］、ヒト内皮細胞［ブッソリーノら（１９８９年）］、 およびヒト胎盤細胞［ウェブマンらｌ：１９８９年）］等である。しかもＧＭ− Ｃ８Ｆは、試験管内でヒト内皮細胞の遊走［ブッソリーノら（１９８９年）］、 ヒト骨芽球様細胞の増殖および機能［エバンスら（１９８９年）］を刺激し、生 体内でマウス胎盤細胞の増殖を増大させる［ウェブマンら（１９８９年）］。

これらの生物学的な結果から考え、内皮細胞で高親和性の受容体だけが検出され 、繊維芽細胞および胎盤膜で低親和性の受容体だけが検出される事実にもかかわ らず、これらの細胞で検出されたＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体が機能的であることは明白 である。

造血系細胞では、低親和性ｈ　ＧＭ−ＣＳ　Ｆ受容体は３７℃でリガンド解離速 度が早く、内部化に乏しいが、高親和性受容体は、はるかに遅いリガンド解離速 度を示し効率的に内部化されることによって鑑別される。この複雑さに加えて、 ２つの型の高親和性ｈＧＭ−ＣＳＦ受容体が若干の造血系細胞および細胞系（正 常なものばかりではない）で報告された。１つの型は、ｈ　ＧＭ−ＣＳ　Ｆだけ を認識し、ヒト好中球にあるＧＭ−ＣＳＦ受容体の唯一の型であるが、別の型は 、明らかにｈＧＭ−Ｃ３Ｆおよびｈ−ＩＬ−３をほぼ同等の親和性で認識し、好 酸球にあるＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体の８０％を占める［ロベツら、（１９８９年）］ 。また逆にＩＬ−３に特異的な受容体、または交差反応性の受容体が報告された ［パークら、（１９８９年）］。

最後に架橋実験によって、マウスＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体の分子Ｉは５１０００　［ ウォーカーおよびバージニス（１９８５年）、または１３００００　Ｃパークら （１９８６年ａ）］であることが示唆されたが、ヒト受容体の分子量は８４００ ０と概算された［ディペルジオら（１９８８年）］。

ＧＭ−Ｃ８Ｆ受容体の特性の幾つかは推論されたが、受容体はこれまで単離また は精製されていない。

［発明の要旨］ この発明は、ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体を暗号化している遺伝子を提供する。この 遺伝子の発現によって、これまで入手できなかった大量の組換え体骨容体が提供 され、それによって、とりわけ受容体治療、診断、およびアゴニスト、アンタゴ ニスト等の開発を可能にする。

したがってこの発明の第１の特徴は、ヒト組換え体または合成のＧＭ−Ｃ８Ｆ受 容体、およびＧＭ−ＣＳＦへの結合能を有する可溶性領域（膜を伴わない）を含 んだ受容体部分を含むその誘導体に関するものである。

この発明の第２の特徴は、ヒト組換え体または合成のＧＭ−Ｃ８Ｆ受容体（およ びその誘導体）を認識する抗体に関するものであって、この抗体は、これらの分 子の検出および／または精製に有用なものである。

この発明の第３の特徴は、ＧＭ−Ｃ３Ｆの細胞結合受容体への結合をＧＭ−ＣＳ Ｆのアゴニストまたはアンタゴニストによって調節することに関する。

この発明の第４の特徴は、組換え体または合成のＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体、またはそ の誘導体の有効量を哺乳動物へ投与することによる哺乳動物、特にヒトにおける ＧＭ−Ｃ３Ｆが関係する疾患の処置方法を提供する。そのような方法の１つは、 哺乳動物におけるＧＭ−Ｃ３Ｆ刺激感受性細胞の増殖、分化、または機能の活性 化を調節することを含み、この方法は、非結合型ＧＭ−Ｃ３Ｆの量を低下させる のに十分な期間および条件下に、組換え体または合成のＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体、ま たはその誘導体の有効量を哺乳動物へ投与することからなる。有効量は静脈内、 筋肉内、皮下、または経口のような最も有効で、そして／または好都合な投与経 路で投与できるように、日常的な実験により容易に決定できる。徐放性製剤は特 殊な目的に好都合であり得る。好ましくは哺乳動物およびＧＭ−Ｃ９Ｆ受容体の 起源は相同性であり、一層好ましくはその相同系はヒトである。

この発明の第５の特徴は、哺乳動物におけるＧＭ−Ｃ８Ｆ刺激感受性細胞で構成 され、もしくはそれに随伴するガンおよび／またはその他、ＧＭ−Ｃ３Ｆが関係 する疾患の診断方法を提供する。この方法は、ＧＭ　Ｃ９Ｆ受容体またはその異 常を検出することを含む。この特徴のため、この発明はそのような診断目的のた めのキットを包含する。例えば放射線免疫検定、蛍光免疫検定、またはＥＬＩＳ Ａを利用する測定用診断キットが特に期待される。

この発明の第６の特徴は、ＧＭ−Ｃ３Ｆが関係する疾患の処置のための医薬の製 造に組換え体または合成のヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体を利用することに関する。

この発明の第７の特徴は、異種ＧＭ−Ｃ９Ｆに対して低親和性の受容体をクロー ン化したＧＭ−Ｃ５Ｆ依存性造血ｍ抱系に関する。

この発明の第８の特徴は、ＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体を暗号化したｃＤＮＡ断片につい てｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法に関するものであって、この 方法は ｃＤＮＡライブラリーを組立て、 それからｃＤＮＡ断片を調製し、 この断片を哺乳動物宿主細胞へトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞 を標識したＧＭ−ＣＳＦとインキュベートシ、 トランスフェクトした細胞集団を同定し、標識したＧＭ−Ｃ８Ｆを結合し、 標識したＧＭ−Ｃ３Ｆへ哺乳動物宿主細胞を結合させることができるｃＤＮＡ断 片を導入した宿主細胞クローンを調製し、このクローンを単離する からなる段階を含む。

［図面の簡単な説明］ 下記の図面により、この発明をさらに詳細に説明する。これらは単に例示的なも のであって、発明の範囲を限定する目的をもつものではない。

第１図は、１２５Ｉ−ｈＧＭ−ＣＳＦのＡ、１．２５％（ｗ／ｖ）’ＤＭＳＯで ５日間インキュベーション後のＨＬ６０細胞、および Ｂ、精製したヒト胎盤膜 への結合の飽和結合等墨線、およびスキャッチャード分析を示す。

（Ａ）は、ＤＭＳＯで処理したＨＬ６０細胞（１点当たり、５×１０６）を濃度 を増大させた’２５ｒ−ｈＧＭ−Ｃ８Ｆととも？’：、４℃で３時間インキュベ ートし、遠心直後、あるいはリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）　１ｌＩｌｌと４° Ｃで１０分間インキュベーションしたのち、特異的な細胞結合型放射能を測定し た。これらの結合データのスキャッチャード分析（下段）を解離前または解離後 について示す。未解離の細胞について電算機処理した高親和性および低親和性結 合成分を実線で示す。（Ｂ）は、実施例１のようにして調製したヒト胎盤膜浮遊 液４０μｍを濃度を増大させた１２Ｊ−ｈＧＭ−ＣＳＦとともに２０℃で１時間 インキュベートし、スキャッチャード変形を行った特異的結合を（Ｂ）図の下段 に示す。

第２図は、ヒト胎盤膜上のｈ　ＧＭ−ＣＳ　Ｆおよびｈ−ＩＬ−３受容体の結合 特異性を示す。未標識のｈＧＭ−Ｃ３Ｆ　（５００ｎ、ｇ）またはｈ　−ｉ　Ｌ −３（１００ｎｇ）を添加または添加せず、膜（４０μｍ）をＩ２５１−ｈＧＭ −Ｃ９Ｆ　（ＨＲＦ溶液１１０ｇ１中、２０００００　ｃｐｍ）と２０℃で１時 間インキュベートした（二重）。同様に上記と同量の未標識のｈＧＭ−ＣＳＦｌ またはＩＬ−３を添加または添加せず、膜（４０μｌ）を１２５１−ｈ−ＩＬ− ３（ＨＲＦ溶液溶液１１０巾 標品への結合合計（平均値士範囲）を示す。

第３図は、ＣＯ５−７細胞へトランスフェクトしたｈＧＭ−ＣＳＦ受容体の検出 および特異性を示す。

（ａ）ｃＤＮＡライブラリーのプール１３８でトランスフェクトしたＣ０８−７ 細胞１．５Ｘ１０’で検出された単一の明らかに陽性の細胞を示した細胞オート ラジオグラフィーの顕微鏡写真（オートラジオグラフィー粒子で覆われたＣＯ８ 細胞、倍率×２０）、 （ｂ）暗視野照射下に撮影した（ａ）と同じ顕微鏡写真、（ｃ）純粋なｈＧＭ− Ｃ３Ｆ受容体クローン（クローンｐＧＭＲ１３８）でトランスフェクトし、”５ １−ｈＧＭ−ＣＳＦ２ｎＭとインキュベートしたＣＯ３−７細胞の細胞オートラ ジオグラフィーの暗視野照射（倍率×１０）、（ｄ）（ｃ）と同じ、ただし細胞 を未標識のｈＧＭ−Ｃ８Ｆ受容体２０ｎＭとインキュベートした場合。オートラ ジオグラフィー粒子が劇的に減少している点に注意。

（ｅ）ＣＯ８−７細胞へトランスフェクトした胎盤ｈ　ＧＭ−ＣＳＦ受容体の特 異性。純粋なりローン（ｐＧＭＲ１３８）で４８時間前にトランスフェクトした ＣＯ３−７細胞を、未標識のｈＧＭ−Ｃ８ＦＳｈ−ＩＬ−３、マウス０開−ｃｓ Ｆ１ヒトＧ−Ｃ５Ｆ、またはヒトＩＬ−６１００ｎｇの存在または存在なしに１ ２５Ｉ−ｈＧＭ−ＣＳＦ結合能について検定した（二重）（平均値士範囲）。ト ランスフェクトした細胞（１点当たり３００００）を、ＥＤＴＡ　２０ｍＭおよ びコンドロイチン硫酸１００μｇ／ａ＋１および１２５ＩｌＧＭ−Ｃ３Ｆ　（１ ００１Ｉｌ中、７００００ｃｐｍ）を含有するＨＲＦ溶液中で２０℃で１時間イ ンキュベートした。

第４図は、ＣＯ３−７細胞へトランスフェクトした胎盤ｈＧＭ−Ｃ５Ｆ受容体の 飽和および競合結合分析を示す。純粋なりローン（ｐＧＭＲ１３８）で４８時間 前にトランスフェクトしたＣ０８−７細胞（１点当たり、３３０００）を、ＨＲ Ｆ　８５μｍ／ＥＤＴＡ　２Ｑ　ｍＭ／コンドロイチン硫酸１００μｇ／ｍｌの 一定容量の溶液中で濃度を増大させた”’Ｉ−ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ　（２０００００ ｃｐｍ）（Ａ図）、または一定量の”５１−ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ、および濃度を増大 させた未標識のｈＧＭ−Ｃ８Ｆまたはｈ−ＩＬ−３（Ｂ図）と２０℃で１．５時 間インキュベートした。Ａ図上段は結合合計、非特異的結合、および特異的結合 、下段は特異的結合のスキャッチャード変形を示す。Ｂ図上段は結合合計、下段 は特異的結合データのスキャッチャード変形を示す。

第５図は、ＤＭＳＯ処理したＨＬ６０細胞、およびトランスフェクトしたＣＯ３ −７細胞におけるｈＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気 泳動を使用した化学的架橋分析を示す。レーンＡ〜Ｄでは、ＤＭＳＯで９日間処 理したＨＬ６０細胞を１点当たり５Ｘ１０’使用し、レーンＥ−Ｊでは、トラン スフェクトしたＣ０８−７細胞を１点当たり７Ｘ１０’使用した。それぞれの場 合、”Ｉ−ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ　（２ｎＭ）と４℃で３時間給合させた。レーンＣお よびＤは、ＰＢＳ溶液１ｍｌ中で１０分間解離し、または解離せずに、低親和性 結合を除去し、レーンＡおよびＢは、ＣおよびＤと同様に、ただし結合反応の間 に未標識のｈＧＭ−Ｃ３Ｆ２０ｎＭを加えた。何れの場合も、ＤＳＳｌｏＭを架 橋に使用した（氷上で１５分間）。レーンＥ−Ｊは、トランスフェクトしたＣＯ ８細胞を＋２５Ｉ−ｈＧＭ−Ｃ３Ｆと結合させ、ついで氷上で１５分間、ＤＳＳ 　Ｏ＋ｎ）ｌ　（Ｅ）　、０．ＯＬＩＩＩＭ　（Ｆ）　、０．０５ｍＭ　（Ｇ） 　、０．１ｍＭ（Ｈ）　、０．５ｍＭ　（Ｉ）　、および１ｍＭ（Ｊ）と架橋さ せたことを表す。ゲル電気泳動を１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳゲル（Ａ−Ｄ）、およ び８％（ｗ／ｖ）ＳＤＳゲル（Ｅ−Ｊ）で実施し、オートラジオグラフィーを４ 週間（Ａ−Ｄ）および２日間（Ｅ〜Ｊ）感光させた。

分子量マーカー（ファーマシア、およびバイオラド）を示す。

第６（Ａ）図はｐＧＭＲ１３８およびｐ　ＧＭＲ２９の挿入体ｃＤＮＡの制限酵 素切断地図である。囲み部分は転写解読枠を表す。斜線部分および黒塗り部分は 、それぞれＧＭ−Ｃ３Ｆ−Ｒコード領域のシグナル配列および膜貫通領域を表す 。点描した囲み枠は上流の転写解読枠を表す。

第６（Ｂ）図はｐＧＭＲ１３８およびｐＧＭＲ２９の挿入体ｃＤＮＡのヌクレオ チド配列と、推定されるアミノ酸配列を組み合わせて示す。右端の数字はヌクレ オチドの位置を示し、配列上段の数字はアミノ酸配列を表す。＃印は可能性のあ るＮ−グリコジル化部位（Ａｓｎ−Ｘ−３ｅｒ／Ｔｈｒ）を示す。上線を引いた 区域は、それぞれ推定されるシグナルペプチドおよび膜貫通領域を示す。星印６ 個からなる組み合わせは起こり得るポリ（Ａ）付加シグナルを確認したものであ る。クローン１３８におけるポリ（Ａ）尾部は６１ヌクレオチドの鎖長であった 。

第７図は、ホップおよびウッズの方法（１９８３年）によるｈＧＭ−Ｃ５Ｆ受容 体配列の疎水性プロットである（スパンの長さ＝１５）。シグナル配列および膜 貫通ドメインにそれぞれ対応する２つの疎水性領域に注意。

第８図はヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体転写産物の検出を示した写真である。

Ａ、実施例１で説明したノーザンプロット分析により、ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体の 転写産物について、下記の供給源からのＲＮＡをプローブした。ＣＥＭ細胞（レ ーン１）　、ＨｅｐＧ２細胞（レーン２）　、ＨＬ６０細胞（レーン３、および ４）、ＴＰ　Ａ　（１００ｎｇ／ｍｌ）と３日間培養したＨＬ６０細胞（５×１ ０５細胞／ｍｌ）　（レーン５）。２８Ｓおよび１８Ｓ　ｒＲＮＡ分子の位置を 示す。別のゲルでは、同様にＲＮＡサイズ標準（Ｅ３　ＲＬ）を含めた。オート ラジオグラフィーの感光時間は５日間。

Ｂ　実施例１で説明したｃＤＮＡのＰＣＲに基づく増幅によるｈＧＭ−Ｃ３Ｆ受 容体転写産物について、下記の供給源からのＲＮＡをプローブした。Ｕ９３７細 胞（レーン１）　、ＡＭＬ１９３細胞（レーン２）　、ＨＬ６０細胞（レーン５ 、および６）　、ＣＥＭ細胞（レーン７）、ラジ細胞（レーン８）、ＨｅｐＧ２ 細胞（レーン９）、ヒーラ−細胞（レーン１０）。

レーン３．４、および１１は、それぞれ陰性対照として、ＣＤＮＡ合成およびＰ ＣＲ反応を実施した無細胞、ＣＤＮＡ合成を行わなかったＨＬ６０　ＲＮＡ、お よびマウス１６０Ｔ細胞からのｒ　ＲＮ　Ａブランク」を含む。

第９図は、他の成長因子受容体とｈＧＭ−Ｃ８Ｆ受容体の配列を並列して示す。

アミノ酸は当技術で標準的な１文字略記法によって示す。

Ａ、配列の模式図：囲み枠はコード領域を表す。斜線および黒塗り枠は、それぞ れシグナル配列および膜貫通領域を表す。保存された４個のシスティン残基（Ｃ ）および保存されたトリプトファン残基（Ｗ）の位置を縦線で示す。点線を付し た枠はｒＷｓ−ＷＳＪボックスを表す。配列は最初の保存されたシスティン残基 から揃えて並列させた。

Ｂ、並列させた配列の詳細：配列（１〜ｖｉｉ）の照合位置の上段にマーク（★ ）し、各配列のアミノ酸数を対応させた（カッコ内の数字はそれぞれ（ｉ）〜（ ｖｉｉ）の位置に相当する）：　ｈＧＭＲ（１２６，１３６，１６５，１７８， ２３６，２９４，３３１ｉ）、ｈＩＬ６Ｒ（１２１，１３２，１６５，１７６， ２３３，２９０，３７４）　、ｍＥＰＯＲ（５２，６２，９０，１０６，１６５ ，２１９、ＮＨ）　、ｈＩＬ２Ｒ（３６，４６，６０，７４，１２６，１８２、 ＮＨ）、ｒＰＲＬＲ（３１，４１，７０，８１，１４６，１９９、ＮＨ）。

ＮＨ：相同性なし。Ｃｏｎ５：造血系受容体配列に基づ（共通配列。共通配列の 場合を除き、点線は可変間隔を示し、ダッシュは配列を揃えるために挿入したギ ャップを示す。

第１０図はｈＧＭ−Ｒ−ＦＤｍ抱におけるウィルス性組込み体および転写産物を 示す。

（ａ）ＦＤＣ−ＰＩ細胞からのＤＮＡ　（レーン１）　、ｈＧＭ−Ｒ−ＦＤクロ ーン１．６．８．１０．１１．１３．２１．２４．３３．３４．４９．５０．５ ２、Ｓ３．５４．５５．５６．５７および５８（レーン２〜２０）、およびｈＧ Ｍ−Ｒ−ＦＤクローン２１．２１．１３．２１．１５．２１゜１７．２１．２１ ．２１．２２および２１．２３（レーン２１〜２７）をＰｓｔＩで消化し、実施 例１で報告したようにｈＧＭ−Ｒ配列についてプローブした。ｈＧＭ−Ｒウイル ス組立て体から誘導された共通な２．５Ｋｂｐ断片に注意。

（ｂ）ＦＤＣ−ＰＩ細胞からの全細胞質ＲＮＡ　（レーン１）、およびｈＧＭ− Ｒ−ＦＤクローン２１．１３．２１．１５．２１．１７．２１．２１．２１．２ ２．２１２３．２１．７．２１．８．２１．１０および２１．１１（レーン２〜 １１）を、実施例１で説明したようにウィルス性ｈＧＭ−Ｒ転写産物についてプ ローブした。主要様は５．５Ｋｂの鎖長であり、完全鎖長のスプライシングされ ていないウィルス転写産物に対応する。

第１１図は、クローン化したｈＧＭＲ−ＦＤ細胞系からの細胞の組換え体ｍ−ま たはｈＧＭ−Ｃ３Ｆによる増殖刺激に対する反応性を示す。ヒｔ−ＧＭ−Ｃ３Ｆ で維持された細胞系は、どちらの刺激によってもクローン原性細胞と類似の内容 物を示すが（例えばクローン５４）　、ｍ＋ｈＧＭ−Ｃ８Ｆで維持された細胞系 （例えばクローン２１）では、マウス反応性クローン原性細胞は、ヒト反応性細 胞より頻度が一層高い。どちらの型の細胞系でも、クローン原性細胞はマウスＧ Ｍ−Ｃ３Ｆに対するより、ヒトＧＭ−ＣＳＦに対して反応性が低い。

第１２図は、ｈ　ＧＭ−ＣＳ　Ｆ細胞クローンに対する１２Ｊ−ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ の飽和結合分析およびスキャッチャード変形を示す。

Ａ、Ｂ　：　ｈ＋ｍＧＭ−Ｃ３Ｆで維持されたクローン２１（１点当たり２Ｘ１ ０’細胞）、 ＣＳＤ　：　ｈＧＭ−Ｃ５Ｆだけで維持されたクローン５０（１点当たり０．８ Ｘ１０’細胞）。

ＡおよびＣは添加量を増大させた＋２”Ｉ−ｈＧＭ−Ｃ８Ｆとの特異的結合曲線 、ＢおよびＤはスキャッチャード変形である。スキャッチャード変形から、クロ ーン２１ではＫｏ＝　４　ｎＭ　（１細胞当たり４０００受容体）、クローン５ ０ではＫ　ｏ＝　６　ｎＭ　（１細胞当たり２ｏｏｏｏ受容体）が得られた。

第１３図は、３７℃でｈＧＭ−Ｒ−ＦＤクローン３３細胞（上図）、またはｈＧ Ｍ−Ｒ−ＦＤクローン５３細胞（下図）へ結合させた１２５１−ｈＧＭ−ＣＳＦ の内部化を示す曲線。前者の細胞はマウスおよびヒトのＧＭ−Ｃ８Ｆ混合物で維 持されたが、後者はｈＧＭ−Ｃ８Ｆだけで維持された。曲線は１２５Ｉ−ｈＧＭ −Ｃ３Ｆ添加後、ニコラらが報告した方法（１９８８年）により測定した細胞表 面に結合している放射能、および内部化された放射能の時間的変化を示す。ニコ ラら（１９８８年）の報告のように、実験点を結んだ曲線（重複試験管の平均値 ）を電算機により当てはめた。クローン３３では１点当たり１．９Ｘ１０’細胞 を使用し、１２５１−ｈＧＭ−Ｃ５Ｆ濃度は１３ｎＭ、クローン５３では１点当 たり１．８Ｘ１０’細胞を使用し、１２５Ｉ−ｈＧＭ−ＣＳ）”濃度は１３ｎＭ であった。

［発明の詳細な説明］ 本明細書では下記の略号を使用する。

ｈ、ｍＧＭ−Ｃ３Ｆ　ヒトまたはマウスの顆粒球−マクロファージコロニー刺激 因子 Ｇ−Ｃ９Ｆ　顆粒球コロニー刺激因子 ｍｕｌｔｉ−Ｃ３Ｆ　多能性コロニー刺激因子ＨＲＦ　１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎 児血清含有Ｈｅｐｅｓ緩衝化（１０ｍＭ、　ｐＨ７，４）　ＲＰＭＩ培地ＰＢＳ 　リン酸緩衝化食塩水 ＥＤＴＡ　四酢酸エチレンジアミン ＦＣ３ウシ胎児血清 ＥＰＯエリスロポイエチン ＰＲＬ　プロラクチン ＬＩＦ　白血病抑制因子 ＰＣＲポリメラーゼ連鎖反応 ＯＲＦ　転写解読枠 ｈ−ＧＭ−ＲヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体 ｈ−ＧＭ−Ｒ−ＦＤ　ｈＧＭ−ＲでトランスフェクトしたＦＤＣ−Ｐ１細胞 ＩＬ２ＲＩＬ−２受容体（β鎖） ＩＬ６ＲＩＬ−６受容体 ＧＭＲ，ＧＭ−Ｃ３Ｆ−Ｒ ＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体 ＫＤ　平衡解離定数 ＥＰＯＲＥＰＯ受容体 ＰＲＬＲＰＲＬ受容体 ＳＤＳ　ドデシル硫酸ナトリウム ＳＳＣ標準クエン酸食塩水 ｄＮＴＰ　デオキシヌクレオシド三リン酸ＤＳＳ　スペリン酸ジスクシンイミジ ルｒＧＭ−Ｃ５Ｆ受容体」とは、グリコジル化され、またはグリコジル化されな いタンパク様分子（即ち、アミノ酸を含有している）の細胞外ドメイン、膜貫通 ドメイン、および細胞質内尾部を含んでいる分子全体をいう。受容体分子は放射 線標識したＧＭ−Ｃ３Ｆ。

またはその誘導体を特異的に結合でき、その結合は、とりわけ未標識のＧＭ−Ｃ ３Ｆによって競合されるものと定義される。

「組換え体ＧＭ−Ｃ８Ｆ受容体」とは、プロモーターに対して正しい読み取り枠 で受容体またはその誘導体を好適な発現ベクターへ暗号化し、生じた組換え体発 現ベクターを好適な宿主へ導入し、組換え鉢受容体またはその誘導体の発現、お よび必要であればその宿主からの移動に好適な条件下でその宿主を成長させ、つ いでその組換え鉢受容体または誘導体を精製するｃＤＮＡ分子のライゲーション のような組換え手段によって生産され、他の関連分子（例えば脂質）を伴い、ま たは伴わず、グリコジル化され、またはグリコジル化されないポリペプチド分子 をいう。

ｒＧＭ−Ｃ３Ｆ刺激感受性細胞」とは、前述のようにＧＭ−Ｃ８Ｆが結合でき、 それによってその細胞の増殖または機能活性化の刺激を起こすことができる受容 体を保有している細胞をいう。ＧＭ−Ｃ８Ｆおよびその受容体に関連して用いる 「結合」の語は、その最も広い意味で使用され、ＧＭ−Ｃ５Ｆとその受容体との 間の、特に細胞結合型受容体に関連して、その受容体が局在している細胞の増殖 または機能活性化の刺激を誘発するのに十分な任意の結合を意味する。「非結合 型ＧＭ−ＣＳＦＪとは、一般に循環しているＧＭ−Ｃ８Ｆを意味する。

「実質的なアミノ酸相同性コとは、約７５％またはそれ以上、好ましくは８５％ より大きいかまたはそれに等しく、一層好ましくは９０〜９５２６より大きいか またはそれに等しい配列相同性を有する分子を意味する。

「ガン」とは、その最も広い意味で使用され、ガン、腫瘍、および白血病等を包 括的に含み、または個々の細胞を表す。結合型ＧＭ−ＣＳＦ受容体、またはその ヌクレオチド配列の「異常」とは、測定された個々の相同の分析、例えばハイブ リッダイゼーション検討によって検出可能なアミノ酸および／またはヌクレオチ ド配列における任意の変化を意味するのに用いられる。したがってガン細胞とは 、この発明によって提供されるＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体、またはそれを暗号化してい るヌクレオチド配列の使用によってその変化を検出し得る変化したＧＭ−Ｃ８Ｆ 受容体を含み得る。

ｃＤＮＡをクローン化し、発現する一般的な技術は、当業界で既知であり、例え ばマニアティスら（１９８２年）によって総説されている。単に例示的な目的の ため、この発明ではＣＯ８細胞発現ベクターπＨ３Ｍ　［アルフォおよびシード （１９８７年）コを使用して、Ｃ０８−７細胞で発現されるｈ　ＧＭ−ＣＳ　Ｆ 受容体を暗号化しているｃＤＮＡについて説明する。これは、この発明がその範 囲に任意のベクターおよび／または宿主で発現されるｈＧＭ−ＣＳＦ受容体を暗 号化しているｃＤＮＡを包含するという理解のもとに行われる。例えば対象とな るｃＤＮＡを原核系発現ベクターへ挿入し、これをエシェリキア・コリ、バシラ ス種、またはシュードモナス種のような細菌で発現させることは当業者にとって 日常的な実験の問題である。日常的な操作により、ｃＤＮＡを酵母、真菌、また は昆虫細胞系、ＣＯ８細胞以外の哺乳動物細胞系、または植物細胞のような真核 細胞で発現することができる。また既知の方法により、ＣＤＮＡを生殖細胞系、 または体細胞へ導入し、トランスジェニック動物を作ることができる。

この発明は、ヌクレオチド鎖の少なくとも１つがヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体、また はその誘導体を暗号化し、またはそれと相補的である１本鎖または２末鎖’ｃＤ ＤＮＡＳｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ、および任意のベクター、発現を提供し、ま たはウィルス性ベクター等を含みこれらを包含する。

好ましい実施態様として、この発明はヒト低親和性ＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体を暗号化 している遺伝子、またはその受容体と少なくとも７５％の配列同一性を有するポ リペプチドを暗号化し、ヒトＧＭ−Ｃ５Ｆに対する天然のヒト低親和性ＧＭ−Ｃ ＳＦ受容体の相対結合親和性の少な（とも１０分の１を保持しているその相同体 を含み、その遺伝子を使用可能なようにプロモーターへ結合した組換え体ＤＮＡ 分子を提供する。一層好ましくは、ポリペプチドは細胞外ドメイン、膜貫通ドメ イン、および細胞内ドメインを含む。

第６Ｂ図に示した配列は、特に低親和性ＧＭＣ３Ｆ受容体に関するものであるが 、本明細書に示した証拠から、低親和性ＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体そのものが高親和性 ＧＭ−Ｃ８Ｆ受容体の成分を構成しており、高親和性ＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体は低親 和性ＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体の多量体であり得ることが判る。したがって高親和性Ｇ Ｍ−Ｃ３Ｆ受容体は、具体的にこの発明の範囲に包含される。

この発明の特に好ましい実施態様では、第６Ｂ図に示したアミノ酸配列を有する ＧＭ−Ｃ８Ｆ受容体分子を提供する。この分子は約４５０００の分子量を有し、 ただ１つの疎水性膜貫通ドメイン、グリコジル化された細胞外ドメイン、および 短い（５４アミノ酸）細胞質内尾部を有する４００アミノ酸ポリペプチドである 。リガンド結合ドメイン（２３〜３１９）は１１個のシスティン残基を含む。

対象となる受容体はトリプシンキナーゼドメインを含まず、免疫グロブリン遺伝 子スーパーファミリーグループと相同性を示さないが、ヒトＩＬ−６、エリスロ ポイエチン、およびＩＬ−２（β−鎖）のようなその他の造血系成長因子の受容 体と配列相同性を共有している。このＧＭＣ８Ｆ受容体は、ＧＭ−Ｃ８Ｆに特異 性を有するが、ＩＬ−３には特異性をもたない単一親和型の結合親和性（ＫＤ＝ ２〜８ｎＭ）を示す。

本明細書で説明するように、十分に確立された方法および容易に入手可能な物質 を使用して、第６Ｂ図に示した受容体分子を暗号化しているｃＤＮＡ配列を組立 てることは当業者の十分に可能な範囲である。

上述のアミノ酸配列および生化学的特性が示されれば、確立された手法により、 本明細書で確立された配列で、アミノ酸の化学的付加によって作成された合成Ｇ Ｍ−ＣＳＦ受容体分子はこの発明の範囲に包含される。この発明はさらに、上述 の任意のまたはすべての受容体分子の領域またはドメインへ、アミノ酸の単・− または多重置換、欠失および／または付加を保有するＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体の組換 え体または合成誘導体を包含する。そのような誘導体は、ＧＭ−ＣＳＦまたはそ の誘導体に対する結合能の点で機能的な（即ち生物学的な）対応物であり得、モ して／または上述のＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体のアミノ酸配列と実質的なアミノ酸相同 性を示し得る。ＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体の好ましい１誘導体は、細胞外ドメイン（可 溶性部分）の全部または１部を含む。誘導体はまた、任意のまたはすべての受容 体分子を、グリコジル化され、またはグリコジル化されない形で包含する。例え ば使用した発現系および宿主に応じて、組換え体骨容体はグリコジル化され、ま たはグリコジル化され得ない。組換え体または合成のＧＭ−Ｃ８Ｆ受容体、また はその誘導体のグリコジル化された形、およびグリコジル化されない形は何れも この発明の範囲に包含される。機能的に活性なＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体の誘導体また は対応物は、本明細書で説明した方法を用いて容易に同定することができる。

またこの発明は、とりわけ先に定義したようなＧＭ−ＣＳＦ受容体を暗号化して いるｃＤＮＡを提供する。このｃＤＮＡは第６Ｂ図に示したヌクレオチド配列を 含んでいる。この発明の範囲は、上述のｃＤＮＡ配列に関連するヌクレオチドの 単一または多重置換、欠失および／または付加を保有しているｃＤＮＡ誘導体を 包含する。

そのような誘導体は完全なＧＭ−Ｃ８Ｆ受容体分子、またはアミノ酸の単一また は多重置換、欠失および／または付加を保有しているＧＭ−、Ｃ３Ｆ受容体のよ うなその誘導体を暗号化し得る。この発明はまた、対象となるヌクレオチド配列 と実質的に相同であるヌクレオチド配列を保有する、即ち少なくとも７５％の相 同性、好ましくは８０〜８５％の相同性、一層好ましくは９０〜９５％より大き い相同性を保有するｃＤＮＡを包含する。そのような誘導体を、例えば部位特異 的変異、ランダム変異、または核酸の酵素的切断および／またはライゲーション によって生産する方法は、このようにして修飾した核酸が、対象となる配列と有 意な相同性を有するかどうかを測定する方法（例えばハイブリダイゼーションに よって）と同様に当該技術上既知である。

この発明はさらに、ＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体、またはその誘導体、またはＧＭ−Ｃ３ Ｆ受容体暗号化配列へ隣接しているヌクレオチド配列へ融合したポリペプチドの ような分子を包含する。それに限定する目的のためではないが、例えばＧＭ−Ｃ ８Ｆ受容体、またはその誘導体、および別のポリペプチドまたはタンパク質から のアミノ酸配列を含んでいる融合配列を生産するのが望ましく、後者の例として 、特に原核系では、β−ガラクトシダーゼ、ホスファターゼ、ウレアーゼ等のよ うな酵素が挙げられる。多くの融合タンパク質は、その読み取り枠が同調し合う ように、２つのコード配列を互いに連結させた組換え体遺伝子の発現によって生 産される。別法として、ポリペプチドは化学的手段によって試験管内で連結する ことができる。ＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体、または個々の暗号化したヌクレオチド配列 のそのような融合またはハイブリッド誘導体は、すべてこの発明に包含される。

したがってこの発明は、組換え体または合成のＧＭ−ＣＳＦ受容体、およびその 誘導体を、例えば受容体治療法および診断法の開発に十分な量で提供する。

したがってこの発明のもう１つの特徴は、非結合型ＧＭ−ＣＳＦの量を低下させ るのに十分な期間および条件下に、ＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体またはその誘導体の有効 態を哺乳動物へ投与することを含む、哺乳動物における０ＭＣ３Ｆ刺激感受性細 胞の増殖または機能活性化を調節する方法に関する。対象となる方法は、リンホ カインが細胞結合型受容体へ結合できる前に、生体内で循環しているＧＭ−Ｃ３ Ｆを可溶性受容体へ結合させ、それによってＧＭ−Ｃ３Ｆ刺激感受性細胞への結 合に利用し得るＧＭ−Ｃ３Ｆ量を低下させることに基づいている。

この発明はさらに、完全な組換え体または合成のＧＭ−Ｃ８Ｆ受容体、またはそ の誘導体をＧＭ−Ｃ３Ｆ刺激感受性細胞の増殖または機能活性化の調節に利用す ることに関するが、ただし好ましくはその可溶性の、即ち細胞外ドメインを利用 する。

この方法は、白血病細胞がＧＭ−Ｃ８Ｆ受容体を発現する骨髄性白血病［ヤング およびグリフイン（１９８６年）コのような疾患状態を処置するのに特に有用で ある。例えば骨髄性白血病細胞の多くの型は、外来性コロニー刺激因子が利用で きなければ、試験管内で増殖をうけることができない［メトカーフ（１９８４年 ）］。したがって生体内に投与された組換え体または合成のＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体 、またはその誘導体は循環しているＧＭ−Ｃ５Ｆへ結合し、それによって細胞結 合型ＧＭ、−Ｃ３Ｆ受容体へのＧＭ−Ｃ３Ｆの結合と競合する。また対象となる 方法は、動物モデル系で観察されたＧＭ−Ｃ３濾過剰生産の毒性効果［ラングら （１９８７年）、ジョンソンら（１９８９年）］を解消する治療手段として役立 ち得る。

さらにこの発明は、組換え体または合成のＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体、またはその誘導 体に対する抗体、特にモノクローナル抗体に関する。そのような抗体はＧＭ−Ｃ ３Ｆ受容体を精製し、これを定】するのに特に有用である。またさらにこの発明 は、ＧＭ−Ｃ８Ｆ受容体の存在について、血漿、血清、または体液、細胞表面ま たは細胞抽出物を検定する目的のための上記の第１抗体に対する抗体（モノクロ ーナルまたはポリクローナル抗体）に関する。上記の一方または他方の抗体を、 例えばサンドイッチ検定に使用するリポータ−分子で標識し得る。所望によりア ジュバントの利用を含み、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の生産 およびスクリーニング方法、およびそのような抗体を放射能、蛍光、または化学 標識で標識する方法、放射線免疫検定法、蛍光免疫検定法、および酵素結合免疫 検定法（ＥＬＩＳＡ）、抗体を固体支持体へ結合して免疫吸着剤を作る方法は当 該技術上日常的なことである。

さらに組換え体または合成のＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体は、その細胞結合型受容体への ＧＭ−ＣＳＦの結合を増加し、または減少させるアゴニストおよびアンタゴニス トを開発するのに使用できる。例えばトランスフェクトして、組換え体ＧＭ−Ｃ ３Ｆ受容体を保有している細胞系は、そのような活性について化合物をスクリー ニングするのに使用し得る。さらにこの発明は、過剰なまたは不十分なＧＭ−Ｃ ＳＦ刺激感受性細胞の増殖または機能活性化によって起こる疾患状態の処置に、 そのようなアゴニストまたはアンタゴニストを使用することに関する。可能性の あるアゴニストまたはアンタゴニストとしては、天然産または合成のＧＭ−Ｃ３ Ｆ断片、およびその他の天然産または合成の化学的化合物等が含まれ、これらは マーカーとして細胞へ標識したＧＭ−ＣＳＦの結合を利用する上述の方法によっ てスクリーニングし得る。

この発明はまた、ＧＭ−Ｃ８Ｆまたはその誘導体をＧＭ−Ｃ３Ｆ関連疾患の処置 のための医薬の製造に使用することに関する。そのような疾患は、ＧＭ−Ｃ８Ｆ 刺激感受性細胞に起因し、またはそれに関連するガン、腫瘍、および白血病等で ある。

この発明のもう１つの特徴は、ＧＭ−Ｃ８Ｆ刺激感受性細胞で構成され、または それに関連するガンを診断するのに、ガン細胞で、細胞結合型ＧＭ−Ｃ３Ｆ受容 体またはその異常、またはそれを暗号化しているヌクレオチド配列を検出するこ とによる組換え体または合成のＧＭ−ＣＳＦ受容体、またはその誘導体、特にこ れらを暗号化しているヌクレオチド配列の利用に関する。

この発明では、機能的な低親和性ｈＧＭ−Ｃ９Ｆ受容体を胎盤からクローン化し 、これがＧＭ−Ｃ８Ｆだけを認識し、インターロイ胞へトランスフェクトすると 、これは胎盤膜上の受容体とほぼ同一の低親和性および同一の特異性を示した。

しかも造血系細胞上の低親和性のｈＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体と同様に、トランスフェ クトした受容体は、速やかなリガンド解離速度（ＴＩ／２＝５分）と乏しい内部 化（３７°Ｃ，２時間後で、約１０〜２０％）で示される特徴を示した。

さらに第９図に示したように、４個のシスティン残基の位置は、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、 ＩＬ−６、エリスロポイエチンおよびＩＬ−２（β−鎖）の受容体でそれぞれ近 似的に保存されており、これらの残基のうちの３個が見いだされる文脈は、４種 類の受容体間で一致している。これら４個のシスティン残基は分子鎖間ジスルフ ィド結合対を作るものと思われるが、推定免疫グロブリンドメイン構造［ヤマサ キら（１９８８年）］と結合するＩＬ−６受容体の２個のシスティン残基の何れ とも一致しない。

Ｔｒｐ２３６は保存されており、３種の受容体でＡｒｇ残基に近接している。４ 種類のすべての受容体配列間で、さらに相同性が膜貫通ドメインの丁度Ｎ−末端 で見いだされる（第９図）。ＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体の２９４位で始まる共通配列（ ｒＷＳ、ＷＳＪボ１．クス）が４種の受容体のすべてで認められる。この配列の 位置は３種の受容体（ＧＭ−Ｃ８Ｆ１エリスロポイエチン、ＩＬ−２受容体（β −鎖））で膜貫通ドメインへ近接しているが、ＩＬ−６受容体では遥かに離れて いる。

ｒＷＳ−ＷＳＪボックス（ＶＸＸＲＸＸ、６−、Ｉ、ＷＳＸＷＳ）に基づく記号 列を使用して最新のデータベース（プロティン・リサーチ・ファンデーション、 日本、１９８９年４月）を探索し、ラット・プロラクチン受容体［ｒＰＲＬ受容 体、ブーチンら（１９８８年）］て、その膜貫通ドメインの丁度Ｎ−末端で、こ の糸と相同な領域を見いだした（第９図）。意外なことに、ｒ　Ｐ　Ｒ，Ｌ受容 体にある４個の細胞外システィン残基のすべて、およびＬｙｓ−Ｔｒｐダブレッ トは、４種類の造血系受容体のそれと、はぼ同一の相対位置で見いだされる（第 ９Ａ図）。またｒＰＲＬ受容体は膜貫通システィン残基を有しているが［ブーチ ンら（１９８８年）］、その膜貫通配列はｈＧＭ−ＣＳＦ受容体と相同ではない 。対照的にプロラクチン受容体の近縁物質である成長ホルモン受容体［リューン グら（１９８８年）］では、それ以外の領域でプロラクチン受容体と７５〜１０ ０％の配列相似性を共有しているが［ブーチンら（１９８８年）］、ｒＷＳ−Ｗ ＳＪボックスは見いだされない。したがってｈＧＭ−Ｃ６Ｆ受容体は、上記の５ 種類の受容体［即ち、ｈＧＭ−Ｃ８Ｆ、ｈｌＬ−６、マウスＥＰＯＳｈＩＬ−２ （β−鎖）およびｒＰＲＬ受容体］からなる１組の成長および分化因子受容体の 新しいサブセットの一員であるものと思われる。

ＧＭ−ＣＳＦ受容体のｍ　ＲＮ　Ａでは、ＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体を暗号化している 長いＯＲＦに先行して短い２２コドンからなるＯＲＦがある。興味深いことは、 そのような短いＯＲＦがヒトＩＬ−６受容体［ヤマサキら、（１９８８年）］、 ］マウスＩＩ、、−１受容体シムズら（１９８８年）コ、およびヒトＩＬ−２受 容体α−鎖およびβ−鎖［ニカイドーら（１９８４年）、ハテケヤマら（１９８ ９年）コのＤＮＡ配列にある主受容体コード領域の５°でも見いだされ、これら は翻訳されると、作動して主受容体コード領域の翻訳を抑制するようである。そ のような機構は、正常細胞型でこれらの受容体の発現が低水準である理由を一部 説明しているのかもしれない。

以下に実施例をあげてこの発明をさらに詳細に説明する。実施例は単に発明を説 明するためのものであって、発明の範囲を限定する目的をもつものではない。

実施例１ 物質および方法 下記の物質または方法を以下の実施例に使用した。本明細書で説明する生物学的 な出発物質は当該技術で既知のものである。

ＣＯ８細胞発現ベクターπＨ３Ｍ　［アルフォおよびシード（１９８７年）］で 組立てられ、約５Ｘ１０’の独立したクローンからなるポリＡ′で選ばれたヒト 胎盤ＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーはＢ、シード博士（マサチューセッツ・ ジェネラル・ホスピタル、ボストン、米国）から提供された。ＭＣ１０６１／ｐ ３細胞を形質転換し、これを選別して約２Ｘ１０’クローンからなる５００プー ルとし、グリセリンストックを調製することにより、約１０７クローンを作成し た。各ストックからのミニブレブＤＮＡを電気穿孔法によってＣＯ５−７細胞へ トランスフェクトした。簡単に説明すると、１．５Ｘ１０’ＣＯ３−７細胞のリ ン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７，３）浮遊液１８０μｍをミニブレブＤＮ Ａ　（３μｇ）２０μｍと混合し、氷上で５分間冷凍した。０．４ｃｍギャップ のキュベツト中で、細胞を３００Ｖ、　１２５μＦＤ　（ｔｃ＝８．２〜１０． ５ｍ５ｅｃ）で電気穿孔し、５分間氷上へ戻し、最後にスライドグラスでできた 小型フラスコ（ラブ・チック、ヌンク社、ナパービル、米国）で、１０％（Ｖ　 ／　Ｖ　）ウシ胎児血清（Ｆ　ＣＳ）を含有するダルベツコの修飾したイーグル 培地（ＤＭＥ）２ｍｌで培養した。放射性ヨウ素化した抗ＩＣＡＭモノクローナ ル抗体Ｗ−ＣＡＭ−１［ボイドら（１９８８年）］で標識したＩＣＡＭ／ＣＤＭ ８　［シモンズら（１９８７年）］の対照トトランスフェクトンによる評価から 、これらの条件では、生存ＣＯ３−７細胞で１５〜２０％のトランスフェクショ ン頻度が得られた。４８時間後、培地を除き、トランスフェクトした単層を、放 射性ヨウ素化したヒトＧＭ−ＣＳＦ　［Ｈｅｐｅｓ緩衝化ＲＰＭＩ培地（ｐＨ７ ，２）／１０％ＦＣＳ１ｍｌ中、”　Ｉ　−ＧＭ−Ｃ３Ｆ　（１〜２ｎＭ）　４ 〜８Ｘ１０５ｃｐｏ］の結合（２０°０１６０分間）によ１て評価した。単層を 培地で２回洗浄し、２．５％（Ｗ／　Ｖ　）グルタルアルデヒド／ＰＢＳで固定 し、これを１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチンに浸漬した［ニコラおよびメトカーフ（１９ ８５年）］。スライドをコダックＮＴＢ２写真用乳液に４２°Ｃで浸漬し、乾燥 剤を含有する遮光箱中で４℃で４８時間暗所で感光させた。スライドをコダック Ｄ１９現像液（４０ｇ／水５００　ｍｌ）で３分間現像し、水ですすぎ、アグフ ァ０４３３Ｃ定着液で３分間定着したのち、１０％ギムザ染色水溶液（濾過）で 染色した。スライドを１０〜２０×倍率でスクリーニングし、２種類の陽性プー ル（＃２９および＃１３８）を選び出した。ＣＯ３−７細胞に”５Ｉ−ＧＭ−Ｃ ３Ｆ結合を起こさせることができる単一なｃＤＮＡクローンが得られるまで、対 応するエシェリキア・コリ形質転換体のグリセリンストックを小プール群へ分配 した。

配列決定方法 クローン２９および１３８の挿入体および種々の分子内断片をＭ１３ベクターへ サブクローン化し、修飾したＴ７ポリメラーゼ［テ−バーおよびリチャードソン （１９８７年）、ンークエナーゼ、ＵＳＢ］、およびプライマーを内部へサブク ローン化したセグメントを使用するシデオキシチェーンターミネーター法［サン カーら（１９７７年）］によって配列決定した。同義性についてはｄｌＴＰを使 用して解明した。これらのサブクローンの幾つかに対応するプライマーを使用し て、隣接するセグメントへ配列を伸長した。クローン１３８の２本鎖は両方とも 完全にその配列を決定した（近接する１形質当たりの平均ゲル形質は４．８７） 。サブクローン化したすへての境界領域は完全鎖長のクローンで再び配列決定し た。クローン２９のｍＲＮＡ−同義語性の鎖は完全に配列を決定し、同義性につ いては反対鏡上のオリゴヌクレオチドを使用して解明した。

ＲＮＡおよびＤＮＡの分析（ノーサンおよびサザンブロツテイング） 生としてボッの報告（１９８８年）に従って調製した細胞質内ポリアデニル化Ｒ ＮＡ　（約１．５μｇ）を、２０μｌＭモルホリノプロパンスルホン酸、５ｍＭ 酢酸ナトリウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，０）　＋６％（Ｖ　／　Ｖ　） ホルムアルデヒドを含有する１％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲルで分画して、ニトロ セルロースへトランスフェクトした。ハイブリダイゼーションの前に、ＲＮＡ含 有フィルターを、０．２％（ｗ／ｖ）フィコール、０．２％（ｗ／ｖ）ポリビニ ルピロリドン、０．２％（Ｗ／Ｖ）ウシ胎児血清アルブミン、２１１１Ｍピロリ ン酸ナトリウム、］、ｍＭＡ、ＴＰ、変性させたサケ精子ＤＮＡ　３０〜５０１ Ｉｇ／ｍｌ、およびエンエリキア・コリｔＲＮＡ　５０μｇ／ｍｌを含有する２ ＸＳＳＣに６７℃で数時間浸漬した。ハイブリダイゼーションはこれと同じ緩衝 液＋０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中で６７℃で実施した。ハイブリダイゼーション プローブは、ｃＤＮＡクローンｐＧＭＲ１３８の５゛末端を伸長し、ゲル精製し た１３００ｂｐＸｈｏｌ−ＥｃｏＲＩ断片であって、任意プライミング［ファイ ンバーブおよびフォーゲルスタイン（１９８３年）］によって約１０　”ｃｐｍ ／μｇの比活性まで放射線標識し、約５　Ｘ　１０　’ｃｐｍ／＋１でハイブリ ダイゼーションに加えた。フィルターを２ＸＳＳＣ，０，１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ で６７℃で十分に洗浄し、最後に、オートラジオグラフィーの前に０．２ＸＳＳ Ｃで６７℃で洗浄した。

高分子量ケノムＤＮＡの１０μｇアリコートをＰｓｔｌで消化し、０．８％アガ ロースゲルで電気泳動し、これをニトロセルロースへ移した。ハイブリダイゼー ションおよび洗浄の条件は、上記のＲＮＡ分析と同様に行った。ハイブリダイゼ ーションプローブは、ｈＧＭ−ＣＳＦ受容体コード領域の３゛末端を伸長し、ゲ ル精製した７８６ｂｐのに、ｐｎ−ＥｃｏＲＩ断片であって、ニックトランスレ ーションによって約２〜４　ｘ　１０　’ｃｐｍ／　ｕｇの比活性へ放射線標識 し、約２　Ｘ　１０７ｃｐｍ／ｍｌでハイブリダイゼーションに加えた。

ポリメラーゼ連鎖反応を用いるＲＮＡ検出ＲＮＡ　（約］、ｕｇ）を、５０ｍＭ トリス−ＣＩ（４２℃でｐ［１８，３）、２０ｍＭＫＣｌ、ｌＱｍＭＭｇｃＩ□ 、５ｍＭジチオトレイトール、各ｄＮＴＰそれぞれｌ　ｍＭ、オリゴ−ｄＴ＋ｓ 　２０μｇ／ｍｌ、およびＡＭＶ逆転写酵素（ベーリンガー・マンハイム）２０ 単位を含有する反応２０ＩＩｌに加え、４２℃で４０分間、第１鎖ｃＤＮＡ合成 を行った。第１鎖合成が完結したのち、蒸留水で反応を１０μｌに希釈し、これ を各ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）に５μｍずつ使用した。ポリメラーゼ連鎖 反応は、各ｄＮＴＰをそれぞれ２００　ｌＩＭ、それぞれに特異的なプライマー １μＭ１ジェネＡＭＰキットで供給された緩衝液（シータス社、米国）およびＴ ａｑポリメラーゼ１．２５単位を５０μｍ容量中に含有していた。ＰＣＲに使用 するプライマーは５３０ｂｐ断片を認識する５　’　−ＣＴＴＣＴＣＴＣＴＡＧ ＡＣＣＡＧＣＡ　（１３１〜１４７位）および５　’　−ＡＣＡＴＧＧＧＴＴＣ ＣＴＧＡＧＴＣ（６７６〜６６０位）であった。

ＰＣＲ反応条件は、パーキン・エルマー・シすラスＤＮＡ熱すイクラー中、９４ ℃で２分、６５℃で２分、７２℃で３分間で、２５サイクル行った。ＰＣＲ反応 の１部を１．２％（Ｗ／　Ｖ　）アガロースゲルで電気泳動し、これをニトロセ ルロースへ移した。フィルターをプレハイブリッド化し、ハイブリッド形成し、 上記と同様に洗浄した。ハイブリダイゼーションプローブは、ゲル精製した９０ ＭＲ１３８の１．９ｋｂｐ　ｃ　ＤＮＡ挿入体を、ランダムプライミングによっ て約１０９ｃｐｍ／μｇの比活性へ放射線標識し、約２　Ｘ　１０　’ｃｐｍ／ ｍｌでハイブリダイゼーションに加えた。

放射性リガンド エシェリキア・コリで、非グリコジル化型で生産し、精製した組換え体ヒトまた はマウスＧＭ−Ｃ８Ｆ　［デラマーターら（１９８５年）コを、修飾したー塩化 ヨウ素法［ニコラら（１９８８年）］により放射性ヨウ素化した。簡単に説明す ると、タンパク質２μｇ（２μｍ）とＮａＩ２５１　１ｍｃｉにューイングラン ド・ヌクレア、ドライアイヒ、西独）を、トウィーン２０を０．２％（ｗ／ｖ） 含有する０、２Ｍリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ７，２）４０μｍ溶液中でインキュベ ートした。溶液を撹拌混合しながら、−塩化ヨウ素（２ＭＮａＣＩ溶液、０．０ ３ｍＭ）を２０ツト（３ｕ１および６μｌ）に分けて添加した。反応混合物をセ ファデックスＧ−２５Ｍカラム（ファーマシア、アップサラ、スニーデン）へ通 し、遊離ヨウ素から巨大分子放射能を分離した［ヒルトンら（１９８９年）コ。

＋２５Ｉ−ｈＧＭ−Ｃ８Ｆは結合能１００％であり［カルボら（１９８３年）］ 、カルボら（１９８３年）の自己置換分析により、２００００〜４００００ｃｐ ｍ／ｎｇの比放射能を示した。’　２５Ｉ−ｍＧＭ−Ｃ８Ｆは比放射能１２００ ００ｃｐｍ／ｎｇで、結合能４０〜５０％であ−〕だ。未標識および標識した（ 比放射能４０００Ｏｃｐ口／ｎｇ）ヒトＩＬ−３はアマ−ジャム（パツキンガム シャイア、英国）から購入した。

結合実験 １．２５％（Ｗ／Ｖ）ジメチルスルホキシドを含有するＤＭＥ培地培地７冗０ （　１　０ｍＭ，　ｐＨ７．　２）で緩衝化し、１０％（　ｖ　／　ｖ　）ウシ 胎児血清（ＨＲＦ）を含有するＲＰＭＩ培地（ＨＲ）に、５ｘ１．０’細胞１５ ０μｍで再浮遊させた。未標識のｈＧＭ−Ｃ３Ｆ　（０．３μＭ）の存在または 存在なしで、細胞の５０μｍアリコートを、濃度増大させた１２Ｊ−ｈＧＭ”Ｃ ３Ｆ　（０〜２ｎＭ）と４℃で４時間インキュベートした。ついで細胞浮遊液を 冷凍したウシ胎児血清１８０μｌへ重層し、小型プラスチック製遠心用試験管で ７００ｇで５分間遠心し、外科用メスで試験管を切断することにより細胞ペレッ トを取り出した。ガンマ計数装置で、細胞に結合した放射能および遊離放射能を 重複試験管により別々に測定した。トランスフェクション４８〜７２時間後に上 清を除き、コンドロイチン硫酸２００μｇ／ｍｌを含有するＨＲ中で、付着細胞 を４０ｍＭＥＤＴＡとインキュベートし、３７°Ｃでさらに４０分間インキュベ ートすることにより、トランスフェクトしたＣ０８−７細胞を回収した［バドマ ナバンら（１９８８年）コ。分離し、解離させた細胞を７００ｇで５分間遠心し 、２０ｍＭＥＤＴＡおよびコンドロイチン硫酸１００μｇ／ｍｌを含有し、また は含有しないＨＲＦに再浮遊させた。飽和結合等墨線または競合実験をＨＬ６０ 細胞について実施した。主としてユーングらの報告（１９８７年）のように、新 鮮な出産期胎盤からヒト胎盤膜を調製した。胎盤６ｇから膜浮遊液４ｍｌを得た 。各結合点毎に、ＨＲＦ４０μｍおよび過剰の未標識ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ　（０．３ ｇＭ）の存在または存在なしで、膜浮遊液４０μｍを、濃度増大させた＋２５１ −ｈＧＭ−ＣＳＦと混合した。２０℃で１時間インキュベーションした後、膜を ３００００ｇで５分間遠心し、精密パスツールピペットで上清を除き、ガンマ計 数装置で膜ベレットおよび上清を別々に計数した。

前記のように、２０°Ｃで１時間のインキュベーション時間を用いて、”Ｉ−ｈ ＧＭ−ＣＳＦのｈＧＭ−Ｒ−ＦＤ細胞への飽和結合およびスキャッチャード変形 を実施した。ｍＧＭ−Ｃ３ＦによるｈＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体の交差調節、およびｈ ＧＭ−Ｃ８Ｆによる多能性Ｃ３ＦまたはｍＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体の交差調節を、ウ ォーカーらの報告（１９８５年）のように３７℃で３０分間の両温置時間、およ び０°Ｃで３時間の結合時間により実施した。表示した＋２５ｉ　−ｈＧＭ−Ｃ ＳＦＩ度で受容体内部化の研究を実施し、データを実験点の曲線光てはめによっ て分析した［ニコラら（１９８８年）］。

架橋実験 前記のように溶液中で１２Ｊ−ｈＧＭ−Ｃ３Ｆの細胞への結合を４℃で実施し、 細胞ペレットを、氷冷したリン酸Ｎａ緩衝化（２０ｍＭ，　ｐＨ７．　２）食塩 水（０．１５Ｍ）１ｍＭに再浮遊した。スペリン酸ジスクシンイミジル（シグマ 、ミズーリ、米国）の無水アセトニトリル溶液（１０μｍ）を直ちに添加して、 ０〜１ｍＭの目的濃度を得、細胞を氷上で１５分間インキュベートしたのち、細 胞ペレットを１３０００ｇで１分間遠心した。細胞ペレットをプロテアーゼ阻害 剤の存在でデオキシリボヌクレアーゼで処理し、前記のようにドデシル硫酸ナト リウムポリアクリルアミドケル電気泳動用に調製した［ニコラおよびピーターマ ン（１９８６年）］。

結合データ分析 特異的結合を、過剰の未標識ｈＧＭ　Ｃ３Ｆが存在しない場合、または存在する 場合の結合間の差として測定した。自己置換分析によって測定した”’　Ｉ　− ＧＭ−ＣＳ　Ｆの比放射能を用い、特異的結合（ｃｐｔｎ）をモル濃度へ変換し た。スキャッチャード変形へ変換する前に、マンソンおよびロドバードのリガン ド・プログラム（１９８０年）を用いて結合データの曲線光てはめを実施した。

２つの結合部位の当てはめは、データへの当てほめが、１結合部位の当てはめよ りも有意に改善された場合（ｐ＜０．０５）に限り採用した。

ｈＧＭ−Ｒレトロウィルスの生産および選別本明細書で説明したようにして調製 したｐＧＭＲ２９の挿入体ＣＤＮＡを含んでいる１、７ｋｂｐのＸｈｏｌ断片を 、多重クローニング部位をｐＭＰＺｅｎの単一のＸｈｏ１部位で置き換え、１． ７ｋｂｐのネオマイシン耐性発現カセット［ｐＤｏｌのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ 断片（コールマンら（１９８７年））の末端を平滑化し、Ｃ１ａｌリンカ−へラ イゲーションしたコをＣ］ａＩ部位［Ｊ、　チャンク、Ｏパーナートおよびに、 クリングラー、未発表データ］へ挿入したレトロウィルスベクターｐＭＰ　Ｚ　 ｅ　ｎの誘導体、ｐＪＺｅｎ２　（ＳＶＮｅｏ）のＸｈｏ１部位へ挿入した。以 前に報告されたように［ジョンソンら（１９８９年）］、ψ２パッケージング細 胞［マンら（１９８３年）コをｐＪＺｅｎ２　（ＳＶＮｅｏ）−ｈＧＭ−ＲＤＮ Ａともに電気泳動し、２日後に、抗生物質Ｇ４１８　（ゲネチシン、シグマ）４ ００μｇ／ｍｌを使用して、トランスフェクトした細胞を選別した。２種類のＧ ４１８耐性クローンを”Ｉ−ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ結合によるｈＧＭ−Ｒの高度表面発 現のため選び出した。受容体陽性ψ２クローンのレトロウィルス力価をＮＩＨ３ Ｔ３繊維芽細胞のポリブレン媒介感染によって試験した［チェブコら（１，９８ ４年）］。さらに検討を重ねて選び出したクローン（ψ２−ＧＭＲ）は１．２Ｘ １０’ウィルス粒子／ｍｌの力価を示した。

感染ＦＤＣ−Ｐ１細胞系の誘導体化 付着ψ２−ＧＭＲ細胞（３ｘｌＯ’／７５ｃｍ２フラスコ）を照射しく３５Ｇｙ ）、これを１０’ＦＤＣ−Ｐ１細胞［デクスターら（１９８０年）］と−緒に、 １０％ウシ胎児血清（Ｆ　ＣＳ）および１０％０％ポークライードマイトジェン した牌臓細胞ならし培地を含有するダルベツコの修飾したイーグル培地（ＤＭＥ Ｍ）２０ｍｌで培養した。４８時間の同時培養から洗浄した上清細胞を、寒天培 地て、ｍＧＭ−ＣＳＦの１０３Ｕ／ｍｌ、またはｈＧＭ−Ｃ８Ｆの６Ｘ１０３Ｕ ／ｍｌの何れか、またはこの両者の組み合わせと３００細胞／ｍ、１の密度で培 養した。３日間インキュベーションののち、ｍ　Ｇ　Ｍ　−ＣＳＦで発育したク ローンは５０〜１００細胞のサイズに達した。これと対照的に、ｈＧＭ−ＣＳＦ によって刺激した培養では、発育したクローン数は一層少なかった。これらは形 態学上分散しており、その多くは１０〜３０細胞を含んでいるだけであった。ｈ 　ＧＭ−Ｃ３Ｆによって刺激した培養で増殖した個々のクローンをミクロピペッ トを使用して採取し、クローン化した細胞系を樹立して、６×１０５Ｕ／ｍｌ　 ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ　（１２細胞系）、または６　Ｘ　１０３Ｕ／ｍｌｈＧＭ−Ｃ３ Ｆ＋１０３Ｕ／ｍｌ　ｍＧＭ−Ｃ３Ｆ　（３６細胞系）の何れかを含有するＤＭ ＥＭ　（２０％ＦＣ３含有）の１ｍｌ培養で維持した。２００細胞／ｍｌずつの 寒天培地培養でコロニーを増殖し、ついでインキュベーション７日後の個々のコ ロニーを採取し、これらのコロニーの培養を浮遊液中で続けることによって個々 の細胞系のサブクローン化を実施した。

寒天培養 寒天培養は、寒天培地１ｏ１（２０％ＦＣ８および０，３％寒天の最終濃度を有 するＤＭＥＭ）［メトカーフら（１９８４年）］、および培養細胞３００個を使 用して３５闘プラスチック製ペトリ皿（ヌンク、アゾレード）で実施した。

コロニー生成に使用した刺激は、エンエリキア・コリで、非グリコジル化型誘導 体として生産した精製組換え体ｍＧＭ−Ｃ３Ｆ（タンパク質１ｍｇ当たりの比活 性３Ｘ１０’Ｕ）、または精製組換え体ｈＧＭ−ＣＳＦ　（タンパク質１ｍｇ当 たりの比活性１０”Ｕ）であつた。これらを寒天培養調製中にＱ、１ｍｌ容量で 添加し、５％ＦＣ３の鉤９５％食塩水溶液を使用して２倍系列希釈法を実施した 。３０〜５０系列のコロニーをプールすることにより、７日間培養コロニー中の 平均細胞数を測定した。

実施例２ 高親和性および低親和性ＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体の検出本明細書で説明した方法によ り、高親和性および低親和性ＧＭ−Ｃ８Ｆ受容体の両受容体を、ヒト骨髄細胞で 、−次ヒト骨髄性白血病細胞、およびヒト前骨髄球性白血病細胞系、ＨＬ　−６ ０で検出した（第１図）。第１Ａ図は、５日間、１．２５％（ｗ／ｖ）ジメチル スルホキシド（ＤＭＳ○）で誘発し、分化させたＨＬ−６０細胞へ結合した＋２ ５Ｉ−ｈＧＭ−Ｃ３Ｆの４°Ｃでの飽和結合等墨線を示す。マンソンおよびロド バード（１９８０年）のリガンド・プログラムを用いた曲線光てはめを行ったの ち、このデータをスキャッチャードの方法（１９４９年）により変形すると、こ のデータの当てはめには、１カ所ではなく２カ所の結合部位が必要であることが 分かった（ｐ＜０．０５）。即ち、４６ｐＭのＫ。をチｆする高親和性受容体（ １細胞当たり４０）および２．９ｎＭのＫ。を有する低親和性受容体（１細胞当 たり１３０）である。同じ細胞で、結合型ＧＭ−Ｃ８Ｆを４°Ｃて１０分間解離 したのち、細胞上に残存する結合型１２５■−ｈＧＭ−Ｃ３Ｆを測定すると高親 和性結合部位だけが検出できた（第１Ａ図）。このことから、低親和性受容体は 高親和性受容体より一層速いリガンド解離速度を示すことが分かる。実施した結 合方法は、遊離リガンドから細胞結合型を迅速な１段階で分離する方法からなる から、この成績は、他の実験者ら［ギャッソンら（１９８８年）、パークら（１ ９８６年ｂ）、ケーラーら（１９８８年）］が低親和性受容体を検出できなかっ た理由を説明していると言える。これらの報告者は、ヒト造血系細胞で、２０〜 ６００ｐＭのに、を有する単−親和型に属するＧＭ−Ｃ８Ｆ受容体を報告してい る。

同様に精製したヒト胎盤細胞膜へのｈＧＭ−Ｃ３Ｆの特異的結合を検出したが（ 第１Ｂ図）、この結合は低親和性受容体（胎盤１ｍｇ当たり３Ｘ１０９受容体、 ＫＤ＝４．６Ｍ）の単−型に属していた。

ヒト胎盤ＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体はｈＧＭ−Ｃ３Ｆだけを認識し、ｈＩＬ−３を認識 しないよってある（第２図）。しかもｈｌＬ−３受容体はヒト胎盤膜上ては検出 されなかった（第２図）。

実施例３ ヒトＧＭＣ３Ｆ受容体のクローン化および発現ＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体をクローン化 するため、発現スクリーニング方法をサルＣＯ８細胞で使用した。検討した限り 、すべての細胞供給源でＧＭ−、Ｃ３Ｆ受容体の潤沢性が低かったので、大量の ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、およびその後のトランスフェクト陽性 の細胞の高感度の検出が必要であった。発明者らが採用した検出方法は、トラン スフェクトしたＣＯ８細胞を顕微鏡スライドグラス上で増殖させ、＋２５Ｉ−ｈ ＧＭ−Ｃ９Ｆをこれへ結合させ、ついで直接オートラジオグラフィーを行う方法 である。このスクリーニング手法は、放射性ヨウ素化したりガントを検出手段と して使用するこれまでの受容体クローン化方法［シムスら（１９８８年）、ド・ アンドレアら（１９８９年）］と比べて２つの主な利点を有する。第１にこの方 法は、２Ｘ１０’クローン供給源から単一のクローンが検出できるから極めて感 度が高い［１０３クローン中、１個（ド・アンドレアら（１９８９年））、３５ ０クローン中、１個（シムスら（１９８８年））と比較〕。第２にこの方法は、 非特異的な結合に起因する人為結果を容易に確認することができ、さもなければ 約１０６の陰性ＣＯ８細胞を含むスライド上でただ１個のＧＭ−Ｃ８Ｆ受容体陽 性細胞を確認することは不可能であった。

約５Ｘ１０’の独立した組換え体ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーを、さらにＣＯ ８細胞発現ベクター［アルフオおよびシード（１９８７年）］でそれぞれ約２Ｘ １０’クローンの５００プールへ分画し、各プールからのＤＮＡを、電気穿孔に よって１．５Ｘ１０６ｃ。

Ｓ細胞へ別々にトランスフェクトした。細胞をスライドグラス上で４８時間培養 し、これを比較的高１度の１２５１−ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ　（約２ｎＭ）とインキュ ベートし、固定し、ついで写真用乳液に浸漬した。スライドを現像し、個々に顕 微鏡で検査した。陽性細胞はオートラジオグラフィー粒子の存在によって確認し た。スクリーニングした最初の２５０プールのうちの２プールがら、１個または ２個の陽性細胞が得られた（プール２９および１３８）（第３図）。ｃ。

Ｓ細胞へ高容量の１２５Ｉ−ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ結合を伝達できる単一のｃＤＮＡが 得られるまで、これらのプールのうちの１つ（１３８）を、各段階でオートラジ オグラフィーを行うスクリーニングによってさらに小プールへ分配した（１５０ ０組換え体からなる２０プール、ついで８０組換え体からなる６ｏブール、最後 に２００個の単一クローン）。ＣＯ８細胞での３回の選別に続き、別のＤＮＡ陽 性プール（プール２９）中の個々のｃＤＮＡクローンを、クローンｐＧＭＲ１３ ８の１．８ｋｂｐ挿入体とのコロニー・ハイブリダイゼーションによって、究極 的にＧＭ−ＣＳＦ受容体のためのコードと確認した。クローン２９お−よび１３ ８のｃＤＮＡ挿入体を暗号化しているプラスミドを、それぞれｐ　ＧＭＲ２９お よびｐＧＭＲ１３８と命名した。

実施例４ 〉　クローン化したＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体の分析］　トランスフェクトしたＣＯ８ 細胞上の受容体に刻する［＋２５１］ｈＧＭ−Ｃ３Ｆの結合は、未標識のｈＧＭ −ＣＳＦによって競合されるが、マウスＧＭ−Ｃ８Ｆ　（ヒトの細胞には活性を 有しない）、またはヒト１Ｌ−３、Ｇ−Ｃ８Ｆ、またはＩＬ−６によって競合さ れないから、特異的である（第３図）。

クローン化したＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体（クローン１３８、実施例３）をＣＯ８細胞 へトランスフェクトしたときの結合特性を第４図に示す。トランスフェクトした ＣＯ８細胞への１２Ｊ−ｈＧＭ−Ｃ８Ｆ結合の２０℃での飽和結合等混線は、６ ．８ＢＭの平衡解離定数を宵する単一型の結合部位、および１細胞当たり６００ ０００の受容体を示した。これとは対照的に、トランスフェクトしないＣｏＳ細 胞、またはベクター単独でトランスフェクトしたＣＯ８細胞は、これらの細胞濃 度（１点当たり３〜７Ｘ１０’細胞）で有意な結合を示さなかった。オートラジ オグラフィー分析から、トランスフェクトした細胞の約２０％だけが受容体陽性 であり（トランスフェクション効率を反映）、シたがって陽性にトランスフェク トした細胞は、トランスフェクトされないＣＯ８細胞で報告された１細胞当たり １７００受容体［コシタ・ボールドウィンら（１９８９年）］の値と比較して、 恐らく１細胞当たり約３　Ｘ　１０’受容体であることが分かる。また未標識の ｈＧＭ−ＣＳＦによる＋２５　Ｉ　−ｈＧＭ−ＣＳＦの置換では、ＫＤ＝５，８ ＢＭの単一型に属する受容体だけが証明され、この結合は未標識のｈｒＬ−３に よって置換されなかった（第４Ｂ図）。ｂＣ；Ｍ−Ｃ３Ｆを標識または未標識の ものに変えたときに観察された類似の結合親和性から、ヨウ素化は、この受容体 に対するｈＧＭ−Ｃ８Ｆの結合親和性を有意に変化させないことが分かる。数回 の異なった実験で、トランスフェクトしたＣＯ８細胞への１２５Ｉ−ｈＧＭ−Ｃ ＳＦの結合を、浮遊液（細胞集合を防止するために２ＱｍＭＥＤＴＡおよびコン ドロイチン硫酸１００μｇ／ｍｌを添加または添加しない結合培地）、または付 着細胞で測定した。見かけのＫＩ）は４〜３ｎＭで変化したが、カルシウムも付 着もトランスフェクトした受容体の結合特性を有意に変えないことが分かった。

実施例５ 分子サイズ ＨＬ６０細胞およびトランスフェクトしたＣＯ８細胞上のｈＧＭ−〇ＳＦ受容体 の分子サイズを、スペリン酸ジスクシンイミンル（ＤＳＳ）との化学的架橋反応 にょフて測定した（第５図）。他の研究者［ディペルジオら（１９８８年）コが 観察したように、ＨＬ６０細胞上のＧＭ−ＣＳＦ受容体は約８５０００のＭｒを 有するので、１２Ｊ−ｈＧＭ−Ｃ９Ｆ　（Ｍｒ＝１５０００）との架橋ニョリ１ ｏｏｏｏｏのＭｒが得られた。速やかなリガンド解離前および解離後のどちらの 場合も［それぞれ低親和性結合の存在または存在なしで（第１図参照）］　、Ｍ ｒ１０００００の主架橋バンドおよびＭｒ９５０００ｆ７）副架構バ：ｚＦ　（ そｔＬ（’ｔＴ、Ｍｒ８５０００おＪ：び８００００の受容体を表す）が認めら れる。これらは単一の結合サブユニットの異なった糖鎖形成変異体を表し得る。

Ｃｏｓ細胞上でトランスフェクトした受容体への＋２５１−ｈＧＭ−Ｃ３Ｆの架 橋では、恐らく一層可変性のグリコジル化を反映するためか、バンド幅はＨＬ６ ０細胞で見られたものより若干広いが、類似の分子量（９００００〜１１０００ ０）の主バンドが得られた。減圧条件下で実施した類似の架橋ゲルでもこれと同 一の架橋結合受容体分子量が得られたことから、成熟受容体はジスルフィド結合 するサブユニットを含んでいないことが判明した。

実施例６ 配列分析 クローン２９および１３８の挿入体をサブクローン化し、標準的な手法により配 列決定した。第６図に示した複合配列で、クローン２９はヌクレオチド１〜１７ ０９によって表され、クローン１３８はヌクレオチド７〜１８０７で表される。

この２つの配列は、クローン２９で１１４８の位置に見られる１カ所のサイレン ト塩基の違い（Ｇ−Ａ）以外は同一である。各配列は、それぞれ先行する２２ア ミノ酸からなる短い転写解読枠（ＯＲＦ）に続く４００アミノ酸の大きいＯＲＦ を暗号化している。大きい方の転写解読枠が始まるとよく対応する文脈にあるが ［コザック（１９８７年）］、短い方のＯＲＦは文脈に乏しいメチオニンコドン で始まる。大きいＯＲＦは２２アミノ酸の推定シグナルペプチド配列て始まり、 残基Ｇｌｕ２３は、標準的なシグナルペプチド切断部位［フォノ・ハイシン（１ ９８６年）］との比較により、成熟タンパク質の最初のアミノ酸であると断定さ れる。

予測される３７８アミノ酸の成熟ＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体は４３７２８の分子量を有 すると計算されるが、これはクローンｐＧＭＲ１３８でトランスフェクトしたＨ Ｌ６０細胞およびＣ０８−７細胞への１”Ｉ−ｈＧＭ−Ｃ３Ｆの架橋によって観 察された受容体サイズの約半分である（第５図）。コア受容体ポリペプチドの予 測サイズと細胞上にある成熟受容体との間のこの差は、先に発明者らによって、 成熟受容体がジスルフィド結合したサブユニットを含んでいないことを明らかに されたことから、多分、１１カ所の推定２９７アミノ酸の細胞外ドメインにある Ｎ−結合糖鎖形成の可能性のある部位への炭水化物の付着に起因するのであろう 。疎水性プロット（第７図）は、Ｇ１ｙ３２０〜Ｐｈｅ３４６へまたがる２７個 の荷電されていないアミノ酸配列（第６図）が膜貫通ドメインを表していること を示唆している。この推定膜貫通ドメインに続いて、多くの膜貫通タンパク質の 細胞質ゾル面に共通する像である、膜へつながるセグメントの次に塩基性アミノ 酸の短い連鎖で始まる５５４アミノ酸の細胞内ドメインが続く。ＧＭ−Ｃ３Ｆ受 容体の５４アミノ酸からなる細胞内ドメインはＩＬ６−Ｒのそれと何ら明らかな 相同性を共有していない。

ＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体ｍＲＮＡの３゛の翻訳されない領域には、ヒト・ゲノムの約 ３％を構成する反復要素（残基１９４３〜１７６０）からなるｒＡ］ｕｊファミ リー［ジェリネックおよびシュミット（１９８２年）コと配列要素相同性がある 。さらにその下流にはポリ八尾部のすぐ前に２つのポリＡ付加シグナルがある（ 第６図）。

予測されたＧＭ−Ｃ３Ｆ結合細胞外ドメイン（アミノ酸２３〜３１９）は１１個 のシスティン残基を含んでいるが、これらは免疫グロブリンスーパーファミリー 受容体の特徴であるジスルフィド・ループ［ンムズら（１９８８年）、ヤマサキ ら（１９８８年）］を作らないようである。短い細胞内ドメイン（５４アミノ酸 ）はシグナル導入に役割を有し得る。このドメインは、チロシンキナーゼである ことが知られている何れの成長因子受容体の触媒性ドメイン［ハンクスら（１９ ８８年）］とも明白な配列相同性を有しない。ただしＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体をヒト ＩＬ−６受容体［ヤマサキら（１９８８年）コと直接比較すると有意な相同性が 明らかになった（第９図）。４個のシスティン残基の位置は近似的に保存され（ ＧＭ−Ｃ３Ｆ−ＲＣ，□６、Ｃｌ３６、Ｃ１６５、Ｃ１□ａ：　ＩＬ６　ＲＣｌ ２１、Ｃ１３２、Ｃ１６６、Ｃ１□６）、これらは免疫グロブリン様ドメインと 結合するＩＬ−６受容体［ヤマサキら（１９８８年）］の２個のシスティン残基 （Ｃ４７およびＣ９６）とは一致しない。さらに細胞内ドメインで相同性のバッ チ（複数）（第９図）、および２種の受容体の膜貫通ドメイン間で、どちら場合 も膜貫通システィン残基を含んだ恐らく予想外の相似性がある（ＧＭ−ＣＳＦ　 ＲＬｓｓ　Ｌ３４□：ＩＬ５−ＲＬ３７４　Ｌ３ｓａ）。膜貫通領域における一 つ一つの残基の保存は、それぞれ対応する摸における他の膜貫通タンパク質また は脂質と関連する共通の能力を示唆し得る。事実、セムリキ森林熱つィルスＥ１ スパイクタンパク質の膜貫通領域で、膜の内葉中央部に対応して類似的に配置さ れているシスティン残基は、バルミトイル化部位であることが判っている［シュ ミットら（１９８８年）コ。しかしながら膜の推定内面に対する膜内システィン 残基の相対位置ｒＲ３ｓａ　（ＨＬ６−Ｒ）およびに３４７（ＧＭ−Ｃ３Ｆ−Ｒ ）で表される］は、２つの受容体間で異なっており、したがってこの残基が機能 的または構造的に重要であるのなら、これらは各受容体で異なった役割を果たし 得るであろう。

ｈ、ＧＭ−〇ｓＦ受容体の細胞外ドメインは、ＩＬ−６受容体だけではな（、エ リスロポイエチン［ド・アンドレアら（１９８９年）コ、インターロイキン−２ ［ハテケヤマら（１９８９年）］、ラット・プロラクチン［ブーチンら（１９８ ８年）］、］インターロイキンー４［モズレーら（１９８９年）］、および］イ ンターロイキンー３イト−ら（１９９０年）コの受容体細胞外ドメインとも相同 性を示す。相同性の領域は、上述の４個のンステイン残基と、膜貫通領域の近く にあるＴｒｐ−３ｅｒ−Ｘ−Ｔｒｐ−３ｅｒ配列を中心に取り巻いている短いア ミノ酸量列を含む（第９図）。

ＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体を暗号化している長いＯＲＦに先行して短いＯＲＦがある。

その開始メチオニンは良好な翻訳開始のための共通配列（上記参照）とは無関係 な文脈にあるので、この読み取り枠は翻訳され得ないが［コザックら（１９８６ 年）］、多分、ポリペプチドを暗号化している。主受容体コード領域の５゛のそ のような短いＯＲＦはり、ＩＬ６受容体ｃＤＮＡでも見いだされ［ヤマサキら（ １９８８年）コ、事実、これらの１つ（２５ヌクレオチド上流）はｈ　Ｉ　Ｌ− ６受容体前駆物質の開始を指定する文脈より一層強い文脈でメチオニンで始まる 。この知見は、これらの短いＯＲＦが作動して主受容体コード領域の翻訳を抑制 するのかも知れないことを示唆している。

実施例７ ＧＭ−ＣＳＦ受容体の転写産物 ｃＤＮＡクローンｐＧＭＲ１３８をヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーから単離した ので、発明者らは、ＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体を発現することが知られている造血系細 胞でも、この転写産物に対応するｍＲＮＡが同様に存在しているかどうかを検討 した。

ノーサンプロット分析（例えば第８Ａ図）から、高親和性ＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体を 発現することが知られているＨＬ−６０細胞は、高度緊縮でｐＧＭＲ１３８プロ ーブヘハイブリッド形成する２、ｌｋｂの転写産物を含んでおり（レーン３〜５ ）、一方、ＣＥＭＴ−リンパ芽球様細胞およびＨｅｐＧ２肝細胞ガン細胞は、こ のプローブとハイブリッド形成する何ら検出可能な転写産物を含有していないこ とが判明した（レーン１および２）。

このＲＮＡ種の低い潤沢性のため、種々のＲＮＡに対応するｃＤＮＡのＰＣＲに 基づく増幅を使用して、種々の造血系および非造血系細胞からのＲＮＡの一層感 度のよい調査に着手した。そのような分析（例えば第８Ｂ図）から、ＨＬ−６０ 、Ｕ９３７、およびＡＭＬ１９３等を含む種々のヒト骨髄細胞系で、ＧＭＣ３Ｆ 受容体転写産物の存在が明らかになったが、ＣＥＭＴ−リンパ系、ラジ・バーキ ットリンパ腫、およびＨｅｐＧ２肝細胞では認められなかった。興味深いことに ヒーラ−細胞で同様にＧＭ−Ｃ８Ｆ受容体が認められ、このｃＤＮＡクローンに 対応する転写産物を有することが判明した（第８Ｂ図）。

実施例８ ｈＧＭ−Ｃ８Ｆ受容体のマウス細胞への導入前述のように胎盤細胞からクローン 化したヒトＧＭ−Ｃ３Ｆに対する低親和性受容体は、レトロウィルスベクターを 使用してマウスＧＭ−ＣＳＦ依存性造血細胞系（ＦＤＣ−Ｐｌ）へ導入されると 、その低親和性表現型を保持するが、細胞増殖に必要な生物学的シグナルを伝達 することはやはりできなかった。

使用したマウスＦＤＣ−ＰＬ造血細胞系はｈＧＭ−ＣＳＦ　１０’単位／ｍｌを 含有する培養で増殖せず、そのような培養で生存する細胞もない。ｈＧＭ−ＣＳ Ｆ受容体レトロウィルスを産生ずる２細胞と同時培養する４種の別々の実験で、 ｈＧＭ−Ｃ３Ｆによって刺激した寒天培養で、ＦＤＣ−Ｐ１細胞の０．３〜１％ をクローン的に増殖することができた。クローン化した細胞系（ｈＧＭ　ＲＦＤ 系）を個々のコロニーから発育させ、高濃度のｈＧＭ−ＣＳＦか、またはｍＧＭ −Ｃ３Ｆと低應度のｈＧＭ−Ｃ３Ｆとの混合物の何れかを使用してこれを維持し た。

１９種のそのようなｈＧＭ−Ｒ−ＦＤ系からのＤＮＡのササンブロット分析（第 １０ａ図、レーン２〜２０）によって、各クローンで単一なウィルス性組込み体 の存在が明らかになったが、クローン５７（レーン１９）では２つの組込み体が 明らかに認められた。潜在的に同胞種であったクローン５０および５２を除いて （レーン１３および１４）、ウィルス組込み部位は、ハイブリット形成したＤＮ Ａ断片の大きさがそれぞれ異なることによって明らかなように、ウィルス組込み 部位が各クローン系で異なり、系毎にそれぞれ独立したクローン起源であること が確かめられた。

実施例９ ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ：　（マウス＋ヒト）ＧＭ−Ｃ３Ｆで維持された細胞系間の相 違 クローン化した系の樹立後２５〜３９日に、無作為に選んだ１９種のこれらの系 の比較分析の結果、２つの型の系の間でクローン培養における挙動に明白な違い が明らかになった（第１１図）。

親ＦＤＣ−Ｐｌ細胞系をｍＧＭ−Ｃ３Ｆによって刺激すると、寒天培地では通常 ６０〜１００％のクローン化効率を示し、太き（密なコロニーを形成する。ｈＧ Ｍ−Ｃ３Ｆで維持されたｈＧＭ−Ｒ−ＦＤ系では、通常これよりも低いクローン 原性を示しく４２±１７％）、コロニー数の合計は、ｈまたはｍＧＭ−Ｃ３Ｆで 刺激された培地と類似していた（第１１図）。コロニーは特徴的に不規則な形を 示し、あるいは全体的に分散し、最大コロニーサイズは比較的小さかった。平行 してｍＧＭ−Ｃ８Ｆによる刺激で行った培養では、コロニーサイズは標準的にこ れよりも２〜４倍大きかった（９種類の細胞系で平均コロニーサイズは、ｍＧＭ −Ｃ３Ｆの場合は５３０±３４０細胞、これに対してｈ　ＧＭ−ＣＳ　Ｆの場合 は２４０±１１０細胞であった）。

（マウス＋ヒト）ＧＭ−Ｃ３Ｆで維持したｈＧＭ−Ｒ−ＦＤ細胞系をｈＧＭ−Ｃ ＳＦで刺激すると、コロニーの形態は類似しているが、クローン原性細胞の頻度 は、ｈＧＭ−Ｃ８Ｆ単独で維持した細胞系より低かった（１５±１５％）。ｍ＋ ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ混合物ては維持期間の増大とともに、ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ単独に反応 性であるクローン原性細胞の頻度は次第に低下を来した。これと著しく対照的に 、これらの系の細胞をｍＧＭ−Ｃ８Ｆで刺激すると、クローン原性細胞の頻度は はるかに高かった（９６±２１％）。これらのコロニーの形態およびサイズは親 ＦＤＣ−ＰＬ細胞の場合に似ており、ｍまたはｈＧＭ−Ｃ３Ｆで刺激したコロニ ーサイズの間で１０倍以上の差があった。１０種類の細胞系で平均コロニーサイ ズは、ｍＧＭ−Ｃ３Ｆの場合は１９００±８８０細胞で、これに対してｈＧＭ− Ｃ３Ｆの場合は１７０±１３０であった。

実施例１０ ヒトＧＭ　Ｃ３Ｆ・　（ヒト＋マウス）０Ｍ＝Ｃ３Ｆで維持された系のＧＭ−Ｃ ５Ｆに対する反応性 りまたはｍＧＭ−Ｃ３Ｆによる刺激に反応するｈＧＭ−Ｆ−ＲＤ系の用量−反応 曲線から、ｂＧＭ−ＣＳＦに対する反応性は、ｍＧＭ−ＣＳＦに対する反応性よ り５００〜１０００倍率で低いことが分かった（第１１図、第１表）。ｈＧＭ− Ｃ３Ｆを使用して増殖させた細胞系、およびｍ＋ｈＧＭ−Ｃ３Ｆの混合物で維持 された細胞系は、両タイプともｍＧＭ−Ｃ３Ｆに対して類似の反応性を示したが 、前者はｈＧＭ−Ｃ３Ｆに対して後者より２倍反応性が高かった（第１１図、第 １表）。

第１表　マウスまたはヒトＧＭ’−Ｃ３Ｆによる刺激に対するクローン化したｈ ＧＭ−Ｒ−ＦＤ細胞系の定量的な反応性およびそのヒトＧＭ−Ｃ３Ｆに対する結 合能 細胞系　刺激に要した単位　＋２５ｊ−ヒ）ＧＭ一番号　Ｃ２Ｆ ４Ｏ％最大コロニー　１０Ｇ細胞（ｃｐｍ）ｍＧＭ−Ｃ３Ｆ　ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ　 当たりの結合（第１表つづき） ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ単独で維持 ５４　２０　１．００００　９３００ ５０　１５　＜５０００　１４２００ 対照ＦＤＣ−Ｐ１細胞 ３００細胞を、２倍濃度に増大させたマウスまたはヒトＧＭ−Ｃ８Ｆを含有する 複製培地へ添加した。７８目にコロニー算定を実施し、５０％最大コロニー数を 刺激するＧＭ−Ｃ３Ｆ濃度を各滴定曲線から決定した。５Ｘ１０’細胞を使用し て、１３１１−標識ヒ１−ＧＭ−Ｃ５Ｆの結合を平行して測定した。

実施例１１ トランスフェクトしたＦＤＣ−Ｐ１細胞に対するｈＧＭ−ＣＳＦ受容体の作用特 徴 種々のクローン化したｈＧＭ−Ｒ−ＦＤ系を、＋２５１−ｈＧＭ−Ｃ８Ｆを特異 的に結合する結合能について検討した。それらはすべて有意な結合を示したが、 この結合の程度にはかなり変動があった（第１表）。ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ単独で連続 的に維持したクローンは、ｈＧＭ−ＣＳＦおよびｍＧＭ−Ｃ３Ｆの混合物で維持 したクローンより高い平均結合水準を示した（第１表）。

種々のｈＧＭ−Ｒ−、ＦＤクローンに対するＩ２Ｊ−ｈＧＭ−Ｃ８Ｆの結合に変 動があったにもかかわらず、飽和結合分析および結合データのスキャッチャード 変形は、検討したすべてのクローンで類似の結合親和性を示した（第１２図）（ スキャッチャード変形の勾配、ＫＤ＝４〜５ｎＭ）。この結合親和性は単−低親 和性型に属し、ヒト胎盤膜、トランスフェクトしたＣＯ３−７細胞、およびレト ロウィルス感染させた２種類のクローンの受容体の場合と同一であった。

ｈＧＭ−Ｒ−ＦＤクローンで、トランスフェクトした受容体に対するｈＧＭ−Ｃ ８ＦのＩＩＩｇ／ｍｌまでの濃度（３７°Ｃで３０分間）での結合は、これらの 細胞で同時トランスフェクトした天然ｍＧＭ−Ｃ８Ｆ受容体に対する１２Ｊ−ｍ ＧＭ−Ｃ３Ｆのその後の結合に影響しなかった。同様に、ｈＧＭ−Ｒ−ＦＤ細胞 上での天然受容体に対するｍＧＭ−Ｃ３Ｆ、またはマウス多能性Ｃ３Ｆの０．５ Ｂｇ／ｍｌまでの濃度（３７℃）での結合は、トランスフェクトしたｈＧＭ−Ｃ ８Ｆ受容体に対する”Ｉ　ｈＧＭ　Ｃ３Ｆのその後の結合に影響しなかった。

＋２５　Ｉ　−ｈＧＭ−ＣＳ　ＦをｈＧＭ−Ｒ，−ＦＤ細胞と３７℃でインキュ ベートすると、速やかに細胞表面のＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体と結合し、ついでゆっく りと細胞内へ内部化された。結合および内部化の速度はｍまたはｈＧＭ−Ｃ３Ｆ で維持したｈＧＭ−Ｒ−ＦＤクローンの場合と本質的に同じであった（第１３図 ）。ただしリガンド結合した（ｏｃｃｕｐｉｅｄ）　ｈ　ＧＭ　−ＣＳ　Ｆ受容 体の内部化の速度（ｋ、）は、ｈＧＭ−Ｒ−ＦＤ細胞（ｋ、＝　０．００４．２ ／分）では、ヒトＨＬ６０細抱の場合（ｋ、＝０．０６１／分）、およびＦＤＣ −ＰＬ細抱土でリガンド結合したマウスＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体の場合（ｋ、＝０． ０５６／分）［ニコラら（１９８８年）コよりも遅かった。

マウス造血系ＦＤＣ−Ｐ１細胞を、低親和性ヒト胎盤ＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体を暗号 化しているｃＤＮＡでレトロウィルス依存的にトランスフェクション後、細胞表 面のｈＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体は１０４〜１０５／細胞濃度て単一結合型の低親和性 を示した（Ｋ、＝４〜５ｎＭ）。注意深い分析にもかかわらず、高親和性結合は 検出されなかったが、トランスフェクトした細胞は、依然としてｈＧＭ−Ｃ３Ｆ 受容体を内部化することができ（内在性ｍＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体の場合より１０倍 率遅い速度ではあるが）　、ｈＧＭ−Ｃ３Ｆに反応する増定量的な反応性は、ｍ ＧＭ−Ｃ３Ｆに対する場合より５００〜１０００倍率低かったが、結合定数の測 定から、リガンド結合したｈＧＭＣ３ＦまたはｒｎＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体は、マウ スＦＤＣ−ＰＬ細胞に増殖シグナルを導入するのに同程度効率的であり得ること が示唆される。第１に、トランスフェクトされたｈＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体は内在性 のｍＧＭ−Ｃ３Ｆに対する高親和性受容体（Ｋｏ＝５０ｐＭ）［ウォーカーおよ びバージニス（１９８５年）コより１００倍率低い親和性（Ｋｏ＝５ｎＭ）でｈ ＧＭ−Ｃ３Ｆを結合する。第２に、リガンド結合したｈＧＭ−Ｃ８Ｆ受容体の内 部化速度（３７８Ｃ）が、リガンド結合したｍＧＭ−Ｃ５Ｆ受容体と比べて１０ 倍率遅いことは、見掛けの定常状態の「親和定数」がさらに１０倍率で異なるで あろう［ニコラら（１，９８８年）］ことを意味している。

実施例］、２ 再クローン化した亜系の進化 ｍ＋ｈＧＭ＝ｃｓＦを使用してｈＧＭ−Ｒ−ＦＤ細胞系から増殖させたコロニー の分析では、これらがｒｎＧＭ−Ｃ８Ｆだけに反応性である主細胞集団とｈＧＭ −Ｃ３Ｆに反応性である副集団を含んでいることが判明した。この後者の集団で は、ｍＧＭ−Ｃ８Ｆだけを使用して１週間増殖させるとコロニーが急速に減少し た。ｈＧＭ−Ｃ８Ｆだけを使用して維持した細胞系から増殖させたコロニーは、 どちらの型のＧＭ　ＣＳＦにも反応するクローン原性細胞の安定な内容を保有し ていた。

ｍＧＭ−Ｃ３Ｆで刺激し、もっばらｍＧＭ−Ｃ９Ｆだけで維持した系から誘導し た９種の亜系（ｓｕｂｌｉｎｅ）からの細胞は、通常、ｍＧＭ−Ｃ３Ｆて刺激し たときだけコロニーを形成しくクローン化効率６８±２４％）、生成したコロニ ーは一律に大型サイズのものであった。同様にｍ　十ｈ　Ｇ　Ｍ　−ＣＳ　Ｆで 刺激した培養から誘導し、ただしついてヒトＧＭ−Ｃ３Ｆで維持した１３種の亜 系からの細胞は、ｈまたはｍＧＭ−ＣＳＦて刺激した培養で、２つの型のコロニ ー間で２〜４倍率の特徴的なサイズ差を維持する中型サイズの比較的少数のコロ ニー（クローン化効率３７±２５％）を形成した。

ｈＧＭ−Ｃ３Ｆで刺激した系から誘導し、ｈＧＭ　Ｃ８Ｆで維持した６種のクロ ーン化した亜系の試験で、クローン原性細胞の５０±２６％は、抗生物質Ｇ　４ １８　８００ｎｇ／ｍｌを含有する培養でコロニーを形成することができた。こ れに反して、ｍＧＭ−Ｃ８Ｆを使用して維持した６種のクローン化した亜系から のクローン原性細胞は、Ｇ４１８の存在で一律にコロニーを形成することができ なかった。このことは、細胞をもっばらｍＧＭ−Ｃ３Ｆだけで刺激すると、挿入 したネオマイシン耐性遺伝子の転写産物が維持されなかったことを示唆している 。

初代系２１種の一連のｍＧＭ−Ｃ９Ｆ反応性亜系およびヒト反応性亜系からのＤ 　Ｎ　Ａササンプロット分析で、ｈＧＭ−Ｒウィルス仕組込み体の内容物および 文脈が、すべてのサブクローンで、ともに維持されていることが明らかにされ（ 例えば第１０Ａ図、レーン２１〜２７）、分岐した生物学的特性にもかかわらず 、これらの系の共通の起源が確認された。したがって細胞表面り、ＧＭ−ＣＳＦ 受容体のｈＧＭ−Ｃ３Ｆ反応性およびその特徴がともに欠乏したことは、ｈＧＭ −Ｒ組立て体の喪失に起因するのではないことが示唆された。

■１ＧＭ−Ｃ３Ｆで維持した６種の亜系からのＲＮＡは、ｂ、ＧＭ−Ｃ３Ｆで維 持された亜系で明白に潤沢なｈＧＭ−Ｒウィルス性の転写産物（レーン８〜１１ 、他の成績は示さず）と比べて、検出可能なｈＧＭ−Ｒウィルス性転写産物を何 ら含有せず（第１０Ｂ図、レーン２〜７）、そのような細胞での変化が、転写レ ベルまたは転写直後レベルで起こることを示唆していた。

即ち、クローン化したｈＧＭ−Ｒ，−ＦＤ細胞系の挙動は、それらをｈＧＭ−Ｃ ８Ｆ単独で維持したか、あるいはｈＧＭ−Ｃ８Ｆおよびｍ、ＧＭ−Ｃ３Ｆの混合 物で維持したかによって異なった。前者の細胞系は、ｈＧＭ−ＣＳＦまたはｍＧ Ｍ−ＣＳＦで、同等なりローン原性で安定な表現型を維持したが、クローン原性 は、ｍＧＭ−ＣＳＦで維持した細胞系の場合よりも有意に低かった。ｍＧＭ−Ｃ ３Ｆおよび低濃度のｈＧＭ−ＣＳＦの混合物で維持した細胞系ては、ｈＧＭ−Ｃ ８Ｆによる刺激に反応できる細胞の漸増的な喪失を示した。

ｈＧＭ−ＣＳＦで維持した細胞系の挙動はウィルス組込み部位によって影響され なかった。ｈＧＭ−Ｃ９Ｆ単独で培養することによって働く選別ストレスは、両 方のウィルス遺伝子の発現（ｈＧＭ−Ｃ３ＦおよびネオＲ）、受容体発現、およ びｈＧＭ−Ｃ９Ｆに対する定量的な反応性の一定水準を維持した。しかしながら これらの細胞によって示された低いクローン原性およびコロニーサイズは、子孫 細胞のｈＧＭ−Ｃ８Ｆ中で維持された系内で、ｈＧＭ−Ｃ８Ｆへの反応性を喪失 した連続的な世代を示唆している。それ以外に刺激が存在しない場合、これらの 細胞は非可逆的に増殖能を失い、その後のｍＧＭ−Ｃ９Ｆでの培養によって救済 できなかった。この現象は、ｍＧＭ−ＣＳＦだけの存在で維持された、サブクロ ーン化したｈＧＭ−Ｒ−ＦＤ系の分析によって確認された。そのようなサブクロ ーン化した系はそのウィルス挿入体を維持しているが、ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体お よびネオＲ遺伝子の両方の発現は、培養時間の増大とともに次第に減少してゼロ へ近づいた。ウィルス遺伝子が比較的高頻度で残っている理由は明らかでないが 、これは明らかにウィルス挿入部位によって左右されるのではない。事実、レト ロウィルス発現の抑制は、マウス造血系細胞［チヤツクら（１９８７年）、マグ リら（１９８７年）、エマ−マンおよびチミン（１９８４年）］を含む種々の異 なった細胞で観察された。ネオマイシン耐性遺伝子を駆動するためこの組立て体 で使用したＳＶ４０早期領域プロモーターは、トランス−およびシス−作用陰性 の調節因子に特に感受性であることが判明した［チヤツクら（１９８７年）、マ グリら（１９８７年）、エマ−マンおよびチミン（１９８４年）、ゴーマンら（ １９８５年）、ウィリアムスら（１９８６年）］。

ヒト胎盤ＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体がマウス造血系ＦＤＣ−Ｐ１細胞の増殖を刺激した 知見は、この受容体サブユニットが造血系細胞上のヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体成分 を構成し得るという示唆に支持を与える。また非造血系起源の低親和性ＧＭ−Ｃ ３Ｆ受容体は、高親和性結合成分が存在しなくても増殖シグナルを導入すること ができ、リガンド依存的な態様で造血系細胞に内部化され得るということが証明 された。事実、トランスフェクトしたＦＤＣ−ＰＩ細胞の生物学的反応性は、受 容体−リガント結合の基準で、ｍまたはり、ＧＭ−Ｃ３Ｆと殆ど同一であるから 、このことはさらに、ｈおよびｍＧＭ−Ｃ８Ｆ受容体双方のシグナル発信成分が 高度に保存され得、高親和性サブユニットの主な機能は、単に受容体内部化の速 度を増大し、低いＧＭ−ＣＳＦ外部濃度への造血系細胞の反応性を増大させるこ とであるかもしれないことを示唆している。導入されたｈ　ＧＭ−Ｃ５Ｆ受容体 の、外来性のｍＧＭ−Ｃ８Ｆまたは多能性Ｃ８Ｆ受容体との相互作用、または同 時内部化を含むデータに関して別の解釈は除外された。

ヒトおよびマウスＧＭ−Ｃ８Ｆ受容体間のシグナル発信の保存にもかかわらず、 ＧＭ−ＣＳＦ結合ドメインにおける機能的保存はなく、また高親和性ｍＧＭ−Ｃ ８Ｆ受容体を現すマウス細胞との相互作用による高親和性受容体へのｈＧ、Ｍ− Ｃ３Ｆ受容体の保存もなかった。高親和性ＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体に対する、クロー ン化した低親和性ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体の関係は不明のまま残っている。高親和 性ＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体が低親和性ＧＭ−Ｃ８Ｆ受容体と無関係である可能性はま だある。し７かしながら、発明者らが仮定したように、「アダプター」サブユニ ットとの相互作用によって低親和性サブユニットが高親和性サブユニットへ変換 され得るのであれば、この相互作用はこれらの種を越えて起こらないように思わ れる。

この発明のＧＭ−Ｃ３Ｆ受容体には、以下に挙げる治療的、診断的、および調製 用に可能性のある広範囲な応用が期待されるが、ただしこれだけに限定されるも のではない。

１、ＧＭ−Ｃ３Ｆに依存する骨髄性白血病の増殖抑制。

２、ＧＭ−Ｃ５Ｆを過剰投与された患者の処置。

３、ＧＭ−Ｃ３Ｆ投与患者に不都合な副作用の局所的な処置。

４、ｉ５剰反応または不適当な炎症反応患者における全身的または局所的なＧＭ −ＣＳＦａ度の調節。

５、慢性感染症（例えば、肺真菌感染、リステリア症、結核、急性呼吸困難症候 群）、自己免疫反応、または不適当なＧＭ　Ｃ８Ｆ産生患者の炎症反応の軽減。

６、治療成績および治療選択のための骨髄性白血病の層化分類。

７、ＧＭ−Ｃ３Ｆおよび化学療法剤の併用治療を受ける患者を選択する腫瘍（Ｇ Ｍ−Ｃ３Ｆ−Ｒのガンを除く）におけるＧＭ−ＣＳＦ−Ｒの異常発現の検出（例 えば肺ガン、乳ガン、膀胱カン、骨髄性白血病）。

８　再生不良性貧血および先天性好中球減少症におけるＧＭ　Ｃ８Ｆ反応性のあ る患者のスクリーニング。

９、自己免疫性抗ＧＭ−Ｃ８Ｆ−Ｒ抗体によって生じる疾患状態の確認（例えば 自己免疫性好中球減少症）。

１０　臨床研究および治療的用途のためのＧＭ−ＣＳＦの迅速精製を行うアフィ ニティーマトリックスの調製。

１１、ＧＭ−Ｃ３Ｆ作用の潜在的アゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニ ング。

１２、ａ　循環する可溶性ＧＭ−Ｃ８Ｆ−Ｒの同定および定量化、ｂ　治療前の 評価のための骨髄細胞のスクリーニング、Ｃ前処置患者における保存骨髄の評価 、ｄ、ＧＭ−Ｃ３Ｆ−Ｒの臨床試験におけるＧＭ−Ｃ３Ｆ−Ｒの薬効学的測定 に使用するｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｒに対する抗体の調製。

１３、治療および全身性脂質濃度の低下する用途のためのＧＭ−Ｃ３Ｆ作用を真 似る抗イデイオタイプ抗体の調製。

１４、骨髄性白血病のような疾患で異常ＧＭ−Ｃ８Ｆ受容体遺伝子を同定するた めの核酸プローブの調製。

これらの応用は、ｈＧＭ−Ｃ８Ｆについて列挙したが、当業者であれば、好適な 動物のＧＭ−Ｃ８Ｆの対応する動物用診断、治療、および調製用の応用がこの発 明の範囲に包含されることは明らかであろう。

引用した参考文献を以下の頁に列挙する。

この発明の一般的な態様は、以上説明した個々の詳細にのみ限定されるものでな いことは自明のことである。

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；ルセル、　Ｍ、Ｆ、、ホルト、Ｊ、Ｔ、、ニエンヒュイズ。

Ａ、Ｗ、、スタンリー、Ｅ、Ｒ，，シェア、Ｃ，Ｊ、（１９８６年）：ジャーナ ル・オブ・クリニカル・インベスティゲイション、第７７巻第１７４０−１７４ ６頁５７、　センジャー、Ｆ、；ニックレン、Ｓ、；コウルソン、Ａ、Ｒ，（１ ９７７年）：プロシーディング・オブ・ナチュラル・アカデミ−・オブ・サイエ ンスイズ（ＵＳＡ）、第７４巻第５４６３−５４６７頁 ５８、スカッチャード、Ｇ、（１９４９年）、アナルズ・オブ・ニューヨーク・ アカデミ−・オブ・サイエンスイズ、第５１巻第６６０−６７２頁 ５９、　スクミド１Ｍ、、スクミド、　Ｍ、Ｆ、Ｇ、　、ロフ、Ｒ１（１９８８ 年）：ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２６３巻第１８６ ３５−１８６３９頁６０、　シモンズ、Ｄ、；マクゴバ、　Ｍ、Ｗ、　、シード 、Ｂ、（１９８８年）、ネイチャー、第３３１巻第６２４−６２７頁６１　シム ズ、Ｊ、Ｅ、；マーチ、Ｃ１，、コスマン、Ｄ、；ウィドマー、Ｍ、Ｂ、；マク ドナルド、　Ｈ，Ｒ，、マクマハン、Ｃ，Ｊ。

、グレイボン、Ｃ，Ｅ、、ウィグナル、Ｊ、Ｍ、；ジャクワン。

Ｊ、Ｌ、；コール、Ｓ、Ｍ、；フレンド、Ｄ　：アルパート、ＡＲ：ギリス、Ｓ 、：ウダル、Ｄ、Ｌ、、ドウバー、Ｓ、に、　（１９８８年）・サイエンス、第 ２４１巻第５８５−５８９頁６２　タボール、Ｓ、およびリチャードソン、Ｃ， Ｃ，（１９８７年）：プロシーディング・オブ・ナチュラル・アカデミ−・オブ ・サイエンスイズ（ＵＳＡ）、第８４巻第４７６７−４７７１頁 ６３　ボン・ヘイン、Ｇ、（１９８６年）：ヌクリック・アシド・リサーチ、第 １４巻第４６８３＝４６９０頁６４、　ウェブマン、”ｒ、ｃｙ、；アサナサキ ス、■、；ギルバート１Ｌ。

；ブランチ、Ｄ　：ディ２Ｍ、；ミュー、Ｅ３．チョーアソト、Ｇ、（１９８９ 年）：トランスブランテインヨン・プロシーディングズ、第２１巻第５６６−５ ６８頁６５、ウォルカー、Ｆ、およびバーケス、Ａ、Ｗ、（１９８５年）：ヨー ロピアン・モルキュシー・バイオロジー・オーガニゼイション・ジャーナル、第 ４巻第９３３−９３９頁６６、　ウォルカー、Ｆ、；ニコラ、Ｎ、Ａ、；メット カーフ、Ｄ、：バーゲス、Ａ、Ｗ、（１９８５年）：セル、第４５巻第２６９− ２７６頁 ６７、　ウィリアムス、’Ｄ、Ａ、、オルキン、Ｓ、Ｈ，’、ミュリガン、Ｒ１ Ｃ，（１９８６年）・プロシーディング・オブ・ナチュラル・アカデミ−・オブ ・サイエンスイズ（ＵＳＡ）、第８３巻第２５６６−２５７０頁 ６８、　ワン、Ｃ，Ｃ，；ウィテック、Ｊ、Ｓ、、テンプル、Ｐ、Ａ、；ウィル ケンズ、に、Ｍ、；レアリー、Ａ、Ｇ、；ルクセンバーグ、Ｄ、Ｐ、；ジョーン ズ、Ｓ、Ｓ、；ブラウン、Ｅ、Ｌ、、ケイ。

Ｒ，、Ｍ、；オレイ、Ｅ、Ｃ，，ショウメイカー、Ｃ：ゴルデ。

Ｄ、Ｗ、；カーフマン、Ｒ−Ｊ、；ヘライック、Ｒ，Ｍ、　、ウォン、Ｅ、Ａ、 ：クラーク、Ｓ、Ｃ，（１９８５年）、サイエンス、第２２８巻第８１０−頁 ６９、　ヤマサキ、Ｋ　；ヒラタ、Ｙ、ニヤワラ、Ｍ　ニカワニジ、Ｙ。

；ンード、Ｂ、：タニグチ、Ｔ４；ヒラノ、Ｔ、：キシモトＴ、（１９８８年） ・サイエンス、第２４１巻第８２５−８２８頁 ７０、　イエン、Ｙ、Ｇ、：ジュビンスキー、Ｐ、Ｔ、：セングプタ、Ａ、：イ エン、Ｄ、Ｃ，：スタンリー、Ｅ、Ｒ，（１９８７年）：プロシーディング・オ ブ・ナチュラル・アカデミ−・オブ・サイエンスイズ（ＵＳＡ）　、第８４巻第 １２６８−１２７１頁 ７１、　イエン、Ｙ、Ｇ、、グリフイン、Ｊ、Ｄ、（１９８６年）・ブラッド、 第６８巻第１１７８−１１８１頁結合ｈＧＭ（ＳＦ　（ｐＭｌ　結合ｈＧＭ−（ ＳＦ　ｌｎＭｌ細胞結合型放射能 Ｏ遠心分離直後 晋　４℃１０分による解離後 イ）　解離前 令　解離後 ｎト　結合合計 一■ト　非特異的結合 一一一一　特異的結合 Ｂ １罠６８゜ ｔ １２５１−ｈＧＭ−Ｃ５Ｆ　特異的結合　１　〔ｐｍ　ｘｌｏ”　１結合／遊離 時間（分） −・　−細胞表面−結合放射能 一〇　−内部化放射能

Claims (53)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体を暗号化しているか、または暗号化しているヌクレ オチド配列と相補的である、ヌクレオチド配列を含んでいる１本鎖ＤＮＡ、２本 鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびＲＮＡからなる群から選ばれた精製された核酸。
2. ２．ヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体、またはその生化学的および／または生物学的な均 等物、相同体、またはそれらの誘導体を暗号化しているか、または暗号化してい るヌクレオチド配列と相補的である、ヌクレオチド配列を含んでいる１本鎖ＤＮ Ａ、２本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびＲＮＡからなる群から選ばれた請求項１記 載の精製された核酸。
3. ３．核酸がｃＤＮＡである請求項１または２記載の核酸。
4. ４．生化学的および／または生物学的な均等物、相同体、または誘導体が天然産 ＧＭ−ＣＳＦ受容体と実質的なアミノ酸相同性を有している請求項１、２、また は３記載の核酸。
5. ５．アミノ酸相同性が７５％またはそれより大きい請求項４記載の核酸。
6. ６．核酸がＤＮＡであって、第６Ｂ図に示したヌクレオチド配列を含んでいる請 求項１〜５の何れか１項記載の核酸。
7. ７．ヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体を暗号化している配列に隣接してさらに核酸配列を 追加的に含んでいる請求項１〜６の何れか１項記載の核酸。
8. ８．ＧＭ−ＣＳＦ受容体がＧＭ−ＣＳＦ結合能を有する細胞外ドメインを含んで いる請求項１〜７の何れか１項記載の核酸。
9. ９．ヒト低親和性ＧＭ−ＣＳＦ受容体を暗号化している遺伝子、またはその受容 体と少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチドを暗号化し、ヒトＧＭ −ＣＳＦに対する天然のヒト低親和性ＧＭ−ＣＳＦ受容体の相対結合親和性の少 なくとも１０分の１を保有しているその相同体を含んでいる組換え体ＤＮＡ分子 。
10. １０．ポリペプチドが細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメイン を含んでいる請求項９記載の組換え体ＤＮＡ分子。
11. １１．上記遺伝子がプロモーターと機能可能に結合している請求項９または１０ 記載の組換え体ＤＮＡ分子。
12. １２．請求項１〜８の何れか１項記載の核酸、または請求項９、１０または１１ 記載の組換え体ＤＮＡ分子を含んでいるプラスミドまたは複製可能なベクター。
13. １３．請求項１〜８の何れか１項記載の核酸を含んでいる組換え体細胞。
14. １４．原核細胞である請求項１３記載の組換え体細胞。
15. １５．真核細胞である請求項１３記載の組換え体細胞。
16. １６．哺乳動物、酵母、昆虫、真菌および植物の細胞からなる群がら選ばれる請 求項１５記載の真核細胞。
17. １７．サルＣＯＳ細胞である請求項１５記載の真核細胞。
18. １８．核酸が異種ＧＭ−ＣＳＦに対する低親和性受容体を暗号化している造血系 細胞である請求項１５記載の真核細胞。
19. １９．ＧＭ−ＣＳＦ依存性造血系細胞である請求項１８記載の真核細胞。
20. ２０．実質上、他のタンパク質を含有していない組換え体または合成のＧＭ−Ｃ ＳＦ受容体、またはその生化学的および／または生物学的な均等物、相同体、ま たはそれらの誘導体。
21. ２１．生化学的および／または生物学的な均等物、相同体、または誘導体が天然 産ＧＭ−ＣＳＦ受容体と実質的なアミノ酸相同性を有している請求項２０記載の 組換え体または合成のＧＭ−ＣＳＦ受容体。
22. ２２．アミノ酸相同性が７５％またはそれより大きい請求項２１記載の組換え体 または合成のＧＭ−ＣＳＦ受容体。
23. ２３．第６Ｂ図に示したアミノ酸配列を含んでいる請求項２０記載の組換え体ま たは合成のＧＭ−ＣＳＦ受容体。
24. ２４．融合タンパク質またはハイブリッドタンパク質である請求項２０〜２３の 何れか１項記載の組換え体または合成のＧＭ−ＣＳＦ受容体。
25. ２５．ＧＭ−ＣＳＦ受容体がＧＭ−ＣＳＦ結合能を有する細胞外ドメインを含ん でいる請求項２０〜２４の何れか１項記載の組換え体または合成のＧＭ−ＣＳＦ 受容体。
26. ２６．請求項１３〜１９の何れか１項記載の組換え体細胞によって生産されたＧ Ｍ−ＣＳＦ受容体。
27. ２７．請求項２０〜２６の何れか１項記載の組換え体または合成のＧＭ−ＣＳＦ 受容体、および製薬上許容し得る担体または希釈剤を含む医薬組成物。
28. ２８．請求項２０〜２６の何れか１項に記載の組換え体または合成のＧＭ−ＣＳ Ｆ受容体を特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片。
29. ２９．請求項２８記載の抗体またはその抗原結合断片、および製薬上許容し得る 担体または希釈剤をむ医薬組成物。
30. ３０．請求項２０〜２６に記載の組換え体または合成のＧＭ−ＣＳＦ受容体、ま たはその誘導体の有効量を哺乳動物へ投与する段階を含む上記哺乳動物における ＧＭ−ＣＳＦ関連疾患の処置方法。
31. ３１．請求項２８に記載の抗体またはその抗原結合断片の有効量を哺乳動物へ投 与する段階を含む哺乳動物におけるＧＭ−ＣＳＦ関連疾患の処置方法。
32. ３２．非結合型ＧＭ−ＣＳＦの量を減少させるのに十分な期間および条件下に、 ＧＭ−ＣＳＦ受容体またはその誘導体の有効量を哺乳動物へ投与する段階を含む 上記哺乳動物におけるＧＭ−ＣＳＦ刺激感受性細胞の増殖、分化、または機能活 性化の調節方法。
33. ３３．請求項２８記載の抗体またはその抗原結合断片の有効量を哺乳動物へ投与 する段階を含む上記哺乳動物におけるＧＭ−ＣＳＦ刺激感受性細胞の増殖、分化 、または機能活性化の調節方法。
34. ３４．哺乳動物の組織または生物学的な液を、請求項１〜１１の何れか１項記載 の核酸またはその組換え体ＤＮＡ分子と試験管内または生体内の何れかで接触さ せ、このようにして生成した生産物を検出する段階を含む哺乳動物におけるＧＭ −ＣＳＦ関連疾患の診断方法。
35. ３５．哺乳動物の組織または生物学的な液を、請求項１３〜１９の何れか１項記 載の組換え体細胞と試験管内または生体内の何れかで接触させ、このようにして 生成した生産物を検出する段階を含む哺乳動物におけるＧＭ−ＣＳＦ関連疾患の 診断方法。
36. ３６．哺乳動物の組織または生物学的な液を、請求項２０〜２６の何れか１項記 載の組換え体または合成のＧＭ−ＣＳＦ受容体と試験管内または生体内の何れか で接触させ、このようにして生成した生産物を検出する段階を含む哺乳動物にお けるＧＭ−ＣＳＦ関連疾患の診断方法。
37. ３７．哺乳動物の組織または生物学的な液を、請求項２８記載の抗体またはその 抗原結合断片と試験管内または生体内の何れかで接触させ、このようにして生成 した生産物を検出する段階を含む哺乳動物におけるＧＭ−ＣＳＦ関連疾患の診断 方法。
38. ３８．ＧＭ−ＣＳＦ関連疾患が、ＧＭ−ＣＳＦによる刺激に感受性の細胞よって 起こり、またはそれに関連するガン、腫瘍、または白血病である請求項３４〜３ ７の何れか１項に記載の診断方法。
39. ３９．（ａ）ｃＤＮＡライブラリーを構築し、（ｂ）それからｃＤＮＡ断片を調 製し、（ｃ）この断片を哺乳動物宿主細胞へトランスフェクトし、（ｄ）トラン スフェクトした細胞を標識したＧＭ−ＣＳＦとインキュベートし、 （ｅ）標識したＧＭ−ＣＳＦを結合しているトランスフェクトした細胞集団を同 定し、 （ｆ）哺乳動物宿主細胞に標識したＧＭ−ＣＳＦを結合させることができるｃＤ ＮＡ断片を導入した宿主細胞クローンを調製し、このクローンを単離する 段階を含むＧＭ−ＣＳＦ受容体を暗号化しているｃＤＮＡ断片についてｃＤＮＡ ライブラリーをスクリーニングする方法。
40. ４０．（ａ）ｃＤＮＡライブラリーを構築し、（ｂ）それからｃＤＮＡ断片を調 製し、（ｃ）この断片を哺乳動物宿主細胞へトランスフェクトする段階を含むＧ Ｍ−ＣＳＦ受容体を暗号化しているｃＤＮＡ断片についてｃＤＮＡライブラリー をスクリーニングする方法において、（ｄ）段階（ｃ）で生成したトランスフェ クトした細胞を、標識したＧＭ−ＣＳＦとインキュベートし、 （ｅ）標識したＧＭ−ＣＳＰを結合しているトランスフェクトした細胞集団を同 定し、 （ｆ）哺乳動物宿主細胞に標識したＧＭ−ＣＳＦを結合させることができるｃＤ ＮＡ断片を導入した宿主細胞のクローンを調製し、（ｇ）このクローンを単離す る 段階を含む改良。
41. ４１．請求項１３〜１９の何れか１項記載の組換え体細胞を好適な栄養培地で培 養し、ＧＭ−ＣＳＦ受容体を回収する段階を含むＧＭ−ＣＳＦ受容体の生産方法 。
42. ４２．（ａ）ＧＭ−ＣＳＦ受容体を発現する供給源からｃＤＮＡライブラリーを 提供し、 （ｂ）それからｃＤＮＡ断片を調製し、（ｃ）この断片を宿主細胞へトランスフ ェクトし、（ｄ）ＧＭ−ＣＳＦ受容体を発現する宿主細胞を同定し、（ｅ）ＧＭ −ＣＳＦ受容体を発現する細胞を回収し、（ｆ）（ｅ）段階で回収した宿主細胞 からＤＮＡを回収する段階を含むＧＭ−ＣＳＦ受容体を暗号化しているＤＮＡ配 列を調製する方法。
43. ４３．段階（ｄ）を請求項３９または請求項４０の方法によって実施する請求項 ４２記載の方法。
44. ４４．ｃＤＮＡライブラリーをヒト胎盤から誘導する請求項３９、４０、４２、 または４３の何れか１項記載の方法。
45. ４５．前記で定義されたプラスミドｐＧＭＲ１３８。
46. ４６．前記で定義されたプラスミドｐＧＭＲ２９。
47. ４７．前記で定義された細胞系ｈＧＭ−Ｒ−ＦＤ。
48. ４８．組換え体ＧＭ−ＣＳＦ受容体を保有するセルラインを検出可能なマーカー で標識したＧＭ−ＣＳＦと、試験すべき化合物の存在下で接触させ、トランスフ ェクトした細胞に対するＧＭ−ＣＳＦの結合が、対照化合物の結合と比較して増 加するか、減少するかを測定する段階を含むＧＭ−ＣＳＦの結合を増加し、また は減少させる能力についての化合物のスクリーニング方法。
49. ４９．細胞系がｈＧＭ−Ｒ−ＦＤである請求項４８記載の方法。
50. ５０．請求項１５または請求項１８記載の組換え体細胞を有する動物。
51. ５１．第６Ｂ図に示した配列内に含まれている配列、またはそれと相補的である 配列である核酸プローブ。
52. ５２．実施例および図面で示したと実質的に同じである、ＧＭ−ＣＳＦ受容体を 暗号化している核酸配列、その核酸配列を得る方法、およびその核酸配列を含ん でいるベクターおよび宿主。
53. ５３．実施例および図面で示したと実質的に同じである、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、 それに対する抗体、およびその受容体または抗体を利用する医薬組成物および処 置方法。