DE19808591A1 - Standardisierter durchflußzytometrischer Vollblutassay - Google Patents
Standardisierter durchflußzytometrischer VollblutassayInfo
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Abstract
Für die Überwachung und Optimierung der Behandlung mit Fibrinogenrezeptorantagonisten, einer neuen Klasse von antithrombotischen Medikamenten, wird ein selektiver und quantitativer Test zur Bestimmung der therapeutischen Blockade der Fibrinogenrezeptoren auf Thrombozyten benötigt. DOLLAR A Der beschriebene durchflußzytometrische Assay ermöglicht durch das Prinzip der Kompetition eines fluorogenen Substrates mit dem therapeutisch verwendeten Fibrinogenrezeptorblocker um die Bindung am Rezeptor eine Quantifizierung des medikamentösen Effektes auf die Thrombozyten. Die Analyse unstimulierter und maximal stimulierter Thrombozyten erlaubt die Beurteilung der Medikamentenwirkung über die gesamte Breite der aktivierungsabhängig hochregulierten Expressionsdichte der Fibrinogenrezeptoren. Zur Überwachung der Geräteeinstellung und -leistung sowie Kalibrierung der Fluoreszenzintensitäten in absolute Anzahlen gebundener fluoreszenzmarkierter Substrate werden Beads eingesetzt.
Description
Die Erfindung betrifft einen standardisierten durchflußzytometrischen Vollblut
assay zur Quantifizierung der Fibrinogenrezeptorblockade durch Fibrinogen
rezeptorantagonisten.
Der Assay findet Anwendung in klinischen Disziplinen, die sich mit dem The
rapiemonitoring bei der Behandlung von Patienten mit Fibrinogenrezeptoran
tagonisten (z. B. Kardiologie, Angiologie, Neurologie) befassen, und in nicht
klinischen Disziplinen, die die Entwicklung und Erprobung neuer Substanzen
dieser Präparateklasse in vitro und im Tiermodell zum Ziel haben.
Der Fibrinogenrezeptor (Glykoproteinkomplex IIb/IIIa) wird ausschließlich auf
Blutplättchen (Thrombozyten) exprimiert und vermittelt über Bindung von Fi
brinogen am aktivierten Rezeptorkomplex die Aggregation von Thrombozyten
nach Aktivierung durch physiologische Stimuli. Damit kommt der Wechsel
wirkung von Fibrinogen und seinem Rezeptor auf Thrombozyten eine ent
scheidende Bedeutung zu - unter physiologischen Bedingungen bei der Bil
dung von Thrombozytenaggregaten zum Verschluß von Gefäßverletzungen
und bei der Erhaltung der Gefäßintegrität.
Unter pathologischen Bedingungen (wie z. B. degenerative arteriosklerotische
Gefäßerkrankungen, Diabetes mellitus, Autoimmunerkrankungen, Tumorer
krankungen u. a.) führt die gesteigerte Thrombozytenaktivierung zu einer ver
stärkten Bildung von plättchenreichen Aggregaten und damit zum thromboti
schen Verschluß von Gefäßen.
Aus diesem Grund entsteht mit der Entwicklung von Inhibitoren der Fibrino
genbindung am Fibrinogenrezeptor eine neue und sehr interessante Klasse
von antithrombozytären Medikamenten. Bereits im klinischen Einsatz ist ein
blockierender Antikörper (murin-human chimerer Klon c7E3 Fab; abciximab;
ReoPro®), der entsprechend der Ergebnisse aus der Phase III-Studie EPIC
(1) als zusätzliche Medikation neben Heparin und Acetylsalicylsäure (ASS)
bei Patienten mit akutem Herzinfarkt und instabiler Angina pectoris in ver
schiedenen Ländern zugelassen ist. Auf den Ergebnissen der drei Studien
arme beruht die z.Zt. empfohlene Anwendung des Medikamentes mit Bolus
und anschließender zwölfstündiger Infusion. Weitere peptidische und nicht
peptidische Fibrinogenrezeptorantagonisten (Eptifibatide [2], Lamifiban [3])
sind in verschiedenen Phasen ihrer klinischen Erprobung für die intravenöse
und orale Anwendung.
Der Einsatz der Fibrinogenrezeptorantagonisten erfolgt in Kombination mit
anderen antithrombotischen Medikamenten wie ASS und Heparin. Daher
stellt das selektive und quantitative Monitoring jedes Medikamentes allein und
in der Kombination eine entscheidende Voraussetzung zur Beurteilung der
Effektivität und für die Entwicklung von individuellen Dosierungsempfehlun
gen dar. Eine funktionell wirksame Inhibierung der Thrombozytenaggregation
tritt erst bei einer Blockade von mehr als 75% der Fibrinogerezeptoren auf
und erreicht ihr Maximum bei ca. 85% Blockade (4). Für die individuelle Do
sisanpassung bei der akuten intravenösen Gabe und auch bei der chroni
schen Anwendung oraler Substanzen ist daher die Quantifizierung im Bereich
unterhalb der Blockade von 75% der Rezeptoren von entscheidender Bedeu
tung.
Für das Monitoring der Fibrinogenrezeptorantagonisten wurden bisher folgen
de Methoden publiziert: a) Blutungszeit (5), b) Aggregometrie (6), c) Throm
belastografie (7), d) Platelet Function Analyzer-100 (PFA-100) (8), e)
plättchen-induzierte Thrombingenerierungszeit (9), f) Kompetition mit radio
aktiv-markierten Antikörpern (10) und Antikörperfragmenten (11), g) induzier
te Aggregation fibrinogenbeschichteter Plastekügelchen (4) und h) durchfluß
zytometrische Kompetitionsassays mit dem fluoreszenzmarkierten Medika
ment (12) bzw. i) einem fluoreszenzmarkierten Antikörper (13) oder fluores
zenzmarkiertem Fibrinogen (14).
Die Nachteile der bisher publizierten Methoden liegen in der mangelnden Se
lektivität für den Nachweis der Wirkung der Fibrinogenrezeptorantagonisten
bei der Kombinationstherapie mehrerer antithrombotischer Medikamente (a,
b, c, d, e), in der ungenügenden Quantifizierbarkeit der Rezeptorblockade (a,
b, c, d, e, g), in der Verwendung hochspezialisierter Geräte und Instrumente
(c, d, e, f), in der Anwendung radioaktiver Substanzen (f) und in der fehlen
den Verfügbarkeit fluoreszenzmarkierter Derivate der therapeutisch zugelas
senen Fibrinogenrezeptorblocker (h) sowie in der ungenügenden Standardi
sierung, Gerätekalibierung, Qualitätskontrolle und Beachtung der akti
vierungsabhängig steigenden Rezeptorexpressionsdichte (h, i).
Die Ursachen der Nachteile liegen in folgendem.
Die Methoden a)-e) (Blutungszeit, Aggregometrie, Thrombelastografie,
PFA-100-Messung und plättchen-induzierte Thrombingenerierung) können eine
angeborene oder erworbene Unterfunktion der Thrombozyten (z. B. infolge
antithrombotischer Therapie) nachweisen, ermöglichen aber methodisch be
dingt nicht die selektive Bestimmung der jeweiligen Einzelwirkung bei einer
antithrombotischen Kombinationstherapie. Der Einsatz der Fibrinogenrezep
torantagonisten erfolgt entsprechend dem aktuellen Wissenstand aber in
Kombination mit ASS und Heparin.
Darüberhinaus ist keine exakte Quantifizierung der Rezeptorblockade durch
Fibrinogenrezeptorantagonisten mit den Methoden a)-e) und g) möglich, da
eine niedrige Rezeptorbesetzung bis ca. 75% funktionell noch nicht bedeut
sam ist und damit nicht erfaßt werden kann. Für die individuelle Dosisanpas
sung ist aber gerade die Quantifizierung dieses subtherapeutischen Berei
ches wichtig.
Eine Reihe von Methoden erfordert technische Geräte und Labormöglichkei
ten, die hochspezialisiert, nur für wenige Fragestellungen einsetzbar sind und
daher nur für wenige Labors in Frage kommen. Thrombelastografie (c ) und
PFA-100-Gerät (d) wurden als Screeningmethoden für die Thrombozy
tenfunktion entwickelt und sind ausschließlich für diese Fragestellung einsetz
bar. Die Anwendung von radioaktiv markierten Antikörpern (f) erfordert
bau- und gerätetechnische sowie strahlenschutzrechtliche Voraussetzungen, die
bei neuen Routineassays heute vermieden werden sollten.
Der vorgestellte durchflußzytometrische Assay mit einem fluoreszenten Deri
vat des Medikamentes als Kompetitor (h) ist hochselektiv für den getesteten
Fibrinogenrezeptorantagonisten. Insbesondere für nichtpeptidische Fibrino
genrezeptorantagonisten ist aber dieses Testprinzip in vielen Fällen synthe
tisch nicht leicht zu lösen, da die Kopplung des Fluorophors am meist sehr
kleinen Inhibitor zu keiner Beeinflussung seiner Bindungseigenschaften füh
ren darf.
In dem als Abstract publizierten Assay von I.Besson und M.C.McGregor (i)
wird die Kompetition von Fibrinogenrezeptorantagonisten mit fluoreszenzmar
kierten Antikörpern vorgestellt. Hierin fehlen aber die für einen allgemein ein
setzbaren Routinetest notwendige Standardisierung, Gerätekalibrierung und
Minimierung der unspezifischen Bindung. Darüberhinaus konnte die Arbeits
gruppe von B.S.Coller (11) nachweisen, daß der Einsatz von intakten
IgG-Antikörpern aufgrund der zwei Bindungsvalenzen im Gegensatz zum mono
valenten Fab-Fragment nur 50% der tatsächlich vorhandenen Antigene de
tektiert. In keinem der publizierten Tests wird die aktivierungsabhängig stei
gende Expressionsdichte des GpIIb/IIIa-Rezeptors berücksichtigt.
Das Ziel der Erfindung besteht in der Entwicklung eines standardisierten, se
lektiven und quantitativen Assays zur Bestimmung der Rezeptorblockade
durch Fibrinogenrezeptorantagonisten auf unstimulierten und stimulierten
Thrombozyten.
Ein durchflußzytometrischer Assay auf dem Prinzip der Kompetition eines
fluoreszenten Substrates mit einem therapeutisch eingesetzten Fibrinogenre
zeptorantagonisten um die Bindung am Fibrinogenrezeptor ermöglicht die
quantitative und selektive Analyse der Fibrinogenrezeptorblockade und wird
in Verbindung mit der Minimierung der unspezifischen Hintergrundfluores
zenz, der Stimulation in vitro mit einem starken Agonisten, mit der Kalibrie
rung und Standardisierung der Gerätefluoreszenz sowie der Option zur Um
rechnung der gemessenen Fluoreszenzsignale in die Anzahl besetzter Fibri
nogenrezeptoren zu einem standardisierten Routinetest.
Die Erfindung wird nachfolgend im einzelnen dargestellt.
Das Prinzip des Assays besteht in der Kompetition therapeutisch eingesetzter
Fibrinogenrezeptorantagonisten (z. B. monoklonale Antikörper wie c7E3 [Reo-
Pro®], lineare oder zyklische RGD-Peptide wie Eptifibatide [Integrilin®] oder
nicht-peptidische Fibrinogenrezeptorantagonisten wie Lamifiban) mit einem
fluoreszenzmarkierten Fab-Fragment eines monoklonalen Antikörpers (z. B.
Fab der Klone P2, LYP18 oder c7E3), einem fluoreszenzmarkierten linearen
oder zyklischen RGD-Peptid oder einem nicht-peptidischen Fibrinogenrezep
torantagonisten um die Bindung am Fibrinogenrezeptor der Thrombozyten.
Vor Beginn der Therapie mit dem Fibrinogenrezeptorantagonisten wird eine
schönende Blutentnahme beim Patienten (geringe venöse Stauung, kurze
und weitlumige Kanüle) durchgeführt. Das Vollblut wird durch Verdünnen in
Pufferlösung (z. B. phosphatgepufferte Kochsalzlösung [PBS] oder Hank's
Balanced Salt Solution [HBSS]; pH 7,4), die humanes Immunglobulin [1 mg/
ml] zur Verminderung der unspezifischen Antiköperbindung enthält, auf eine
Zahl von 10.000 Thrombozyten/µl eingestellt.
Eine definierte Zahl von Thrombozyten wird unstimuliert mit einer sättigenden
Konzentration des fluoreszenzmarkierten Substrates inkubiert und so der ma
ximale Fluoreszenzwert der unstimulierten Probe ermittelt (entspricht 0% Re
zeptorblockade). Im Parallelansatz wird die gleiche Absolutzahl von Thrombo
zyten mit einem starken, proteaseresistenten Agonisten maximal stimuliert
(z. B. TRAP-6 mit N-terminaler Substitution von Serin durch Isoserin) (15). Der
Fluoreszenzwert nach anschließender Inkubation mit fluoreszenzmarkiertem
Substrat in sättigender Konzentration entspricht 0% Rezeptorblockade bei
maximal stimulierten Thrombozyten. In einem dritten Ansatz erfolgt wiederum
bei gleicher Absolutzahl der Thrombozyten die in vitro-Blockierung aller bloc
kierbaren GpIIb/IIIa-Rezeptoren mit dem therapeutisch eingesetzten Fibrino
genrezeptorantagonisten. Die Endkonzentration wird im Ansatz so gewählt,
daß sie dem Doppelten der Medikamentenkonzentration im Vollblut ent
spricht, die nach Bolusgabe der maximal zur Therapie zugelassenen
Medikamentendosis erreicht werden kann.
Die Identifizierung der Thrombozyten folgt in allen drei Ansätzen dem glei
chen Prinzip. Verwendet wird ein fluoreszenzmarkierter monoklonaler Anti
körper in sättigender Konzentration, der eine räumlich weit von der Fibrino
genbindungsstelle entfernte Struktur des Fibrinogenrezeptors erkennt und mit
einem anderen Fluoreszenzfarbstoff als das Substrat konjugiert ist. Es sollten
zwei Fluoreszenzfarbstoffe ausgewählt werden, deren Emissionsbereiche
sich nicht wesentlich überlappen (z. B. Fluoreszeinisothiocyanat [FITC] mit
Phycoerythrin-Cyan5 [PE-Cy5] oder Phycoerythrin [PE] mit PE-Cy5, so daß
keine Kompensationsprobleme auftreten. Für die Markierung des Substrates
erscheint FITC besonders geeignet, da aufgrund seines niedrigen Molekular
gewichtes die Gefahr einer sterischen Behinderung am GpIIb/IIIa-Rezeptor
gering ist.
Unter laufender Therapie mit einem Fibrinogenrezeptorantagonisten kann
nun nach Inkubation der unstimulierten bzw. stimulierten Patiententhrombo
zyten mit dem fluoreszenzmarkierten Substrat aus der gemessenen Fluores
zenzintensität auf den jeweiligen Prozentsatz therapeutisch blockierter bzw.
bei maximal stimulierten Thrombozyten blockierbarer Fibrinogenrezeptoren
geschlossen werden.
Die gemessenen arbiträren Fluoreszenzintensitäten können nicht direkt zur
Berechnung der Zahl geblockter Rezeptoren verwendet werden. Die Absolut
werte der Fluoreszenzintensitäten sind vom Durchflußzytometer, der Verstär
kereinstellung des Gerätes und vom fluoreszenten Substrat abhängig. Erst
die Kalibrierung der gemessenen Fluoreszenzsignale in die Anzahl blockierter
Fibrinogenrezeptoren erlaubt nicht nur einen Vergleich der prozentualen Re
zeptorbesetzung, sondern auch einen vom Durchflußzytometer und fluores
zenzmarkierten Substrat unabhängigen Vergleich der absoluten Rezeptor
zahlen zwischen verschiedenen Labors.
Bei Verwendung von murinen fluoreszenzmarkierten Fab-Fragmenten von
IgG-Antikörpern als kompetitives Substrat erfolgt die Inkubation einer sätti
genden Konzentration dieser Antikörperfragmente mit einem Set von 5 Po
pulationen von Plastekügelchen (Beads), die durch ihre unterschiedlichen
Bindungskapazitäten für monoklonale Antikörper charakterisiert sind (z. B.
Quantum Simply Cellular Microbead Kit® Sigma, Deisenhofen). Werden fluo
reszenzmarkierte Substrate verwendet, die keine murinen monoklonalen An
tikörper sind, muß die Kalibrierung bei bekanntem Fluoreszenzmolekül-Pro
teinmolekül-Verhältnis (F/P-Ratio) über ein Set von mehreren Plastekügel
chen durchgeführt werden. Diese Beadpopulationen sind mit demselben
Fluoreszenzfarbstoff wie das Substrat markiert und leuchten mit unterschied
licher, definierter Fluoreszenzstärke (Quantum Fluorescence Kit for MESF
units of FITC®, Sigma, Deisenhofen).
Bei quantitativen Messungen mit dem Durchflußzytometer muß mittels fluo
reszenzmarkierter Plastekügelchen die Leistungsstärke des Lasers täglich
kontrolliert werden. Hierfür wird das Fluoreszenzsignal dieser Beads unter
denselben Geräteeinstellungen wie bei Thrombozytenmessungen analysiert.
Durch Setzen eines Markers über der Beadpopulation wird deren mittlere
Fluoreszenzintensität bestimmt und durch Nachstellen der Verstärkerspan
nung konstant gehalten.
Bei Durchflußzytometern, die in der Online-Software die Möglichkeit eines
Autosetup haben (z. B. Coulter EPICS®XL mit System 2-Software), wird diese
zur automatischen Nachkorrektur aktiviert. Hierfür wird in dem Protokoll zur
Messung der Beads ein sehr schmaler Marker über der mittleren Fluo
reszenzintensität der Beads gesetzt. Liegt die mittlere Fluoreszenzintensität
der Beads bei Folgemessungen außerhalb dieses Markers, paßt die Software
die Verstärkerspannung automatisch an und optimiert so bedienerunabhän
gig die Geräteeinstellung.
Die Erfindung wird an Beispielen erläutert, ohne auf diese beschränkt zu sein.
- - Die nachfolgende Vorschrift wurde für die Quantifizierung der Fibrinogenre zeptorblockade durch das Medikament ReoPro® (murin-human chimerer Klon c7E3 Fab; abciximab) optimiert.
Als kompetitives fluoreszenzmarkiertes Substrat wurden FITC-markierte
Fab-Fragmente des Klons c7E3 verwendet. Die FITC-Kopplung erfolgte mit einem
kommerziellen Fluoreszenzmarkierungs-Kit (Sigma, Deisenhofen). Die Identi
fierung der Thrombozyten im Vollblut erfolgt mit dem PE-Cy5-markierten Anti
körperklon SZ21 (Coulter-Immunotech Diagnostics, Hamburg), der mit dem
c7E3-Klon nicht um die Bindungsstelle am Fibrinogenrezeptor kompetitiert
(13).
Das Vollblut des Patienten wird mit einem isoosmolaren Puffer (HBSS, pH
7,4, mit 1 mg/ml humanes Immunglobulin G) auf 10.000 Thrombozyten/µl ver
dünnt. 20 µl des verdünnten Vollblutes werden mit 5 µl des FITC-markierten
Fab-Fragmentes c7E3 (Proteinkonzentration 0,3 mg/ml) zur Bestimmung der
maximalen Fluoreszenz ohne Blockade des Fibrinogenrezeptors durch
Reo-Pro® für 10 min bei Raumtemperatur (RT) und dann für weitere 5 min bei RT
mit 10 µl PE-Cy5-markiertem Antikörper SZ21 zur Thrombozytenidentifizie
rung inkubiert. Die maximale Stimulation erfolgt im parallelen Ansatz mit einer
Aktivatorkonzentration von 500 µM iso-TRAP-6 für 30 min bei RT: Nach Auf
füllen mit 2 ml Pufferlösung werden 10.000 Thrombozyten am Durchflußzyto
meter mit einer Flußrate von 500-1000 Partikeln pro Sekunde gemessen. Die
Identifizierung der Thrombozyten erfolgt über ihre hohe Fluoreszenzintensität
für PE-Cy5 und ihre Größe, die als Vorwärtsstreulicht gemessen wird. Diese
Population wird mit einer Region markiert und in einer nächsten Darstellung
mit Vorwärts- gegen Seitstreulicht entsprechend den bekannten Streulicht
eigenschaften für Thrombozyten überprüft. Nach Setzen einer Region um die
erneut als Thrombozyten verifizierte Population und Ausschluß von Zellfrag
menten, Aggregaten, Erythrozyten und Leukozyten wird nun die mittlere Fluo
reszenzintensität in einer dritten Darstellung für die FITC-Fluoreszenz ermit
telt (entspricht 0% Blockade).
Parallel erfolgt ein Ansatz mit 20 µl verdünntem Vollblut und ReoPro® (End
konzentration 5 µg/ml) für 10 min bei RT. Anschließend wird zunächst mit 5 µl
markiertem c7E3-Fab-FITC für 10 min und schließlich mit 10 µl SZ21-PE-Cy5
für 5 min bei RT inkubiert. Nach Auffüllen mit 2 ml Puffer erfolgt die Messung.
Die so ermittelte mittlere Fluoreszenzintensität für die FITC-Fluoreszenz ent
spricht dem Wert "100% Blockade".
Die Umrechnung der gemessenen Fluoreszenzwerte wird mit dem Quantum
Fluorescence Kit for MESF units of FITC® (Sigma, Deisenhofen) entspre
chend den Herstellerangaben durchgeführt. Fünf verschiedene Beadpopula
tionen sind mit einer bekannten Anzahl von FITC-Molekülen gekoppelt. Dem
entsprechend kann einer bekannten Zahl von FITC-Molekülen eine Fluores
zenzintensität zugeordnet werden. Die mit den fünf Beadpopulationen erstell
te Eichgerade dient zur Umrechnung der gemessenen Fluoreszenzintensität
der Thrombozyten in die Anzahl gebundener FITC-Moleküle. Unter Verwen
dung der spektrophotometrisch bestimmten F/P-Ratio unserer c7E3-Fab-Fragmente
(Lot 12/97: 4,2) kann aus der Anzahl gebundener FITC-Moleküle
auf die am Thrombozyten gebundenen fluoreszenten Fab-Fragmente ge
schlossen werden. Vollblut und Beadsuspension werden unter identen
Geräteeinstellungen gemessen.
Für die Standardisierung und Überwachung der Geräteeinstellung werden
fluoreszente Beads (z. B. Flow-Set Fluorospheres®, Coulter-Immunotech Dia
gnostics, Hamburg), in einem separaten Protokoll mit sehr schmalen Mar
kern für ihr mittleres Vorwärtsstreulichtsignal und die Fluoreszenzsignale bei
525 nm (FITC) sowie < 650 nm (PE-Cy5) analysiert. Die Nachkorrektur für
Abweichungen von den gespeicherten Markereinstellungen im Meßprotokoll
erfolgt automatisch unter Nutzung der Auto-Setup-Funktion der System
2-Software des Durchflußzytometers EPICS XL der Fa. Coulter.
Der Assay weist merkliche Vorteile gegenüber den bisher bekannten Metho
den auf. Insbesondere ist er für klinisch und experimentell tätige Mediziner,
Laborchemiker und Naturwissenschaftler angrenzender biologischer Gebiete
interessant. Für die klinische Anwendung des ersten zugelassenen Fibrino
genrezeptorantagonisten (ReoPro®) existiert z.Zt. nur eine auf dem Körper
gewicht basierende Dosisempfehlung für die Bolusgabe und anschließende
zwölfstündige Infusion entsprechend dem Ergebnis einer multizentrischen
Studie. Eine individuelle Dosisadaptierung, die durch das Erreichen einer vor
gegebenen prozentualen Blockierung der Fibrinogenrezeptoren des Patien
ten gesteuert wird, würde die klinische Effektivität und Sicherheit des Medika
mentes weiter verbessern. Der vorliegende Assay bietet die methodische
Grundlage für die Datenerhebung und den Vergleich der Meßergebnisse zwi
schen verschiedenen Labors. Für die genannte Problemstellung ist bislang
kein Assay verfügbar, der den komplexen Anforderungen gerecht wird.
Neben der Anwendung im klinischen Umfeld kann der Assay auch für die Te
stung der Wirkung neuer Fibrinogen rezeptorantagonisten in vitro und im Tier
modell genutzt werden. Die Kenntnisse über Dosis-Wirkungsbeziehungen
bereits charakterisierter Rezeptorinhibitoren sind mit neuen Substanzen ver
gleichbar.
- 1. Lefkovits, J., Ivanhoe, R.J., Califf, R.M., Bergelson, B.A., Anderson, K.M., Stoner, G.L., Weisman, H.F. Topol, E.J. Effects of platelet glycoprotein IIb/IIIa receptor blockade by a chimeric monoclonal antibody (abciximab) on acute and six-month outcomes after percutaneous transluminal cpronary angiopla sty for acute myocardial infarction. Am J Cardiol 77 (1996) 1045-51
- 2. Tcheng, J.E., Impact of eptifibatide on early ischemic events in acute ische mic coronary syndromes: a review of the IMPAGT II trial. Integrilin to Minimi ze Platelet Aggregation and Coronary Thrombosis. Am J Cardiol 80 (1997) 21B-28B
- 3. Theroux, P., Kouz, S., Roy, L., Knudtson, M.L., Doitati, J.G., Marquis, J.F., Nasmith, J., Fung, A.Y., Boudreault, J.R., Delage, F., Dupuis, R., Kells, C., Bokslag, M., Steiner, B., Rapold, H.J. Platelet membrane receptor glycopro tein IIb/IIIa antagonism in unstable angina. The Canadian Lamifiban Study. Circulation 94 (1996) 899-905
- 4. Coller, B.S., Lang, D., Scudder, L.E. Rapid and simple platelet function assay to assess glycoprotein IIb/IIIa receptor blockade. Circulation 95 (1997) 860-67
- 5. Channing-Rodgers, R.P., Levin, J. A critical reappraisal of the bleeding time. Semin Thromb Haemost 16 (1990) 1-20
- 6. Mascelli, M.A., Lance, E., Mack, S., Weisman, H., Schaible, T., Jordan, R. Rapid assessment of platelet inhibition using a modified whole blood aggre gometer (Aggrestat) in PTCA patients receiving ReoPro. J Am Coll Cardiol 27 (1996) 361
- 7. Greilich, P.E., Alving, B.M., O'Neill, K.L., Chang, A.S., Reid,T.J. Modified thromboelastography: a rapid, simple method for monitoring c7E3 Fab in he parinized patients. Blood 86 (1995) 545
- 8. Kundu, S., Heilmann, E., Sio, R., Garcia, C., Ostgaard, R. Characterization of the platelet function analyzer, PFA-100™. Thromb Haemost 73 (1995) 1061
- 9. Breddin, H.K., Brreddin, H., Kirchmaier, C.M., Keppler,S. Methods to monitor the effects of the glycoprotein IIb/IIIa inhibitors and their interaction with other antithrombotic agents. Thromb Haemost 73 (1995) 1446
- 10. Coller, B.S., Scudder, L.E., Beer, J., Gold, H.K., Folts, J.D., Cavagnaro, J., Jordan, R., Wagner, C., Iuliucci, J., Knight, D., Ghrayed, J., Smith, C., Weisman, H., Berger, H. Monoclonal antibodies to platelet gpIIb/IIIa as anti thrombotic agents. Ann N Y Acad Sci 614 (1991) 193-213
- 11. Wagner, C.L., Mascelli, M.A., Neblock, D.S., Weisman, H.F., Coller, B.S., Jordan, R.E. Analysis of gpIIb/IIIa receptor number by quantification of 7E3 binding to human platelets. Blood 88 (1996) 907-914
- 12. Anderson, D.R., Zayed, E., Embree, J., Theroux, P., Steiner, B. Flow cy tometry as a quantitative measure of the antiplatelet activity of a glycoprotein IIB/IIIA inhibitor. Blood 86 (1995) 893a
- 13. Besson, I., McGregor, M.C. Effect of antagonists on gpIIb/IIIa receptor occupancy: Use of a whole blood flow cytometry assay. Thromb Haemost Suppl (1997) 664
- 14. Faraday, N., Goldschmidt-Clermont, P., Dise, K., Bray, P.F. Qunatitation of soluble fibrinogen binding to platelets by fluorescence-activated flow cyto metry. J Lab Clin Med 123 (1994) 728-740
- 15. Coller, B.S., Springer, K.T., Scudder, L.E., Kutok, J.L., Cemso, M., Prest wich, G.D. Substituting isoserine for serine in the thrombin receptor activating peptide SFLLRN confers resistance to aminopeptidase M-induced cleavage and inactivation. J Biol Chem 268 (1993) 20741-20743
Claims (16)
1. Assay für die Verwendung in der Durchflußzytometrie zur Analyse der
Rezeptorblockade durch therapeutisch eingesetzte Fibrinogenrezeptor
antagonisten,
bestehend aus
- a) einem therapeutisch eingesetzten Fibrinogenrezeptorantagonisten wie monoklonale Antikörper oder Fab-Fragmente monoklonaler Anti körper oder lineare oder zyklische Peptide oder nicht-peptidische Reptorantagonisten oder Aptamere
- b) einem kompetitiven fluoreszenzmarkiertem Fibrinogenrezeptoranta gonisten wie monoklonale Antikörper oder Fab-Fragmente monoklo naler Antikörper oder lineare oder zyklische Peptide oder nicht-pep tidische Reptorantagonisten oder Aptamere.
2. Verfahren zur Bestimmung der Fibrinogenrezeptorblockade auf Throm
bozyten, dadurch gekennzeichnet, daß eine Kompetition eines fluores
zenten Substrates mit einem therapeutisch eingesetzten Fibrinogenre
zeptorantagonisten um die Bindung am Fibrinogenrezeptor die quantita
tive und selektive Analyse der Fibrinogenrezeptorblockade dergestalt er
möglicht, daß
- a) als kompetitives fluoreszenzmarkiertes Substrat monoklonale Anti körper oder Fab-Fragmente monoklonaler Antikörper oder lineare oder zyklische Peptide oder nicht-peptidische Reptorantagonisten oder Aptamere verwendet werden, die in an sich bekannter Weise mit einem kommerziellen Fluoreszenzmarkierungskit mit einem in der Durchflußzytometrie üblichen Fluoreszenzfarbstoff wie Fluoresceini sothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE), energy coupled dye (ECD), PerCP®, Phycoerythrin-Cyan 5 (PE-Cy5) oder Allophycocyanin (APC) markiert sind,
- b) als therapeutisch eingesetzter Fibrinogenrezeptorantagonist mono klonale Antikörper oder Fab-Fragmente monoklonaler Antikörper oder lineare oder zyklische Peptide oder nicht-peptidische Reptor antagonisten oder Aptamere eingesetzt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß
- a) dem Patienten Blut entnommen wird,
- b) das Vollblut auf eine Zahl von 10.000 Thrombozyten/µl eingestellt wird,
- c) ein Teil des verdünnten Vollblutes unstimuliert mit einer sättigenden Konzentration des fluoreszenzmarkierten Substrates inkubiert wird und nachfolgend der Fluoreszenzwert der unstimulierten Probe er mittelt wird,
- d) ein anderer Teil des verdünnten Vollblutes, der die gleiche Anzahl von Thrombozyten enthält, mit einem starken, proteaseresisten Ago nisten stimuliert wird und der Fluoreszenzwert nach anschließender Inkubation mit einer sättigenden Konzentration des fluoreszenzmar kierten Substrates gemessen wird,
- e) ein dritter Teil des verdünnten Vollblutes, der die gleiche Anzahl von Thrombozyten enthält, in vitro mit dem therapeutisch eingesetzten Fibrinogenrezeptorantagonisten versetzt wird,
- f) die Thrombozyten in den drei Volumina nach gleicher Methodik iden tifiziert werden,
- g) aus den gemessenen Fluoreszenzintensitäten die therapeutisch blockierten bzw. blockierbaren Fibrinogenrezeptoren rechnerisch be stimmt werden,
- h) nachdem die gemessene Fluoreszenzintensität der Thrombozyten in die Anzahl gebundener Fluoreszenzmoleküle umgerechnet wird, was nach Kalibrierung des Gerätes mit fünf verschieden fluoreszenten Beadpopulationen gelingt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Einstellen
auf 10.000 Thrombozyten/µl durch Verdünnen mit Pufferlösung wie
phoshatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder mit Hanks Balanced
Salts (HBSS) bei pH 7,4 mit einem Gehalt von 1 mg/ml humanem Im
munglobulin G erfolgt.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der maximale
Fluoreszwert der unstimulierten Probe den Nullwert der Rezeptorblocka
de darstellt.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Stimulie
rung der Thrombozyten mit einem proteaseresistenten starken Agonisten
wie TRAP-6 mit N-terminaler Substitution von Serin durch Isoserin er
folgt.
7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der maximale
Fluoreszwert der stimulierten Probe den Nullwert der Rezeptorblockade
bei maximal stimulierten Thrombozyten darstellt.
8. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß mit dem the
rapeutisch eingesetzten Fibrinogerezeptorantagonisten die Fibrinogenre
zeptoren blockiert werden.
9. Verfahren nach Anspruch 3 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß der the
rapeutisch eingesetzte Fibrinogerezeptorantagonist in einer solchen
Menge zugesetzt wird, daß seine Endkonzentration dem Doppelten der
zur Therapie zugelassenen Medikamentendosis entspricht.
10. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Identifi
zierung der Thrombozyte dergestalt erfolgt, daß der jeweiligen verdünn
ten Vollblutprobe ein fluoreszenzmarkierter monoklonaler Antikörper in
sättigender Konzentration zugesetzt wird, der eine räumlich weit von der
Fibrinogenbindungsstelle entfernte Struktur des Fibrinogenrezeptors er
kennt und mit einem anderen Fluoreszfarbstoff als das kompetitve Sub
strat markiert ist.
11. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß mit dem the
rapeutisch eingesetzten Fibrinogerezeptorantagonisten die Fibrinogenre
zeptoren blockiert werden.
12. Verfahren nach Anspruch 3 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß der the
rapeutisch eingesetzte Fibrinogerezeptorantagonist in einer solchen
Menge zugesetzt wird, daß seine Endkonzentration dem Doppelten der
zur Therapie zugelassenen Medikamentendosis entspricht.
13. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Identifi
zierung der Thrombozyte dergestalt erfolgt, daß der jeweiligen verdünn
ten Vollblutprobe ein fluoreszenzmarkierter monoklonaler Antikörper in
sättigender Konzentration zugesetzt wird, der eine räumlich weit von der
Fibrinogenbindungsstelle entfernte Struktur des Fibrinogenrezeptors er
kennt und mit einem anderen Fluoreszfarbstoff als das kompetitve Sub
strat markiert ist.
14. Verfahren nach Anspruch 3 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß als
monoklonale Antikörper die Klone SZ21 oder gleichwertige andere einge
setzt werden.
15. Verfahren nach Anspruch 3 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß die
beiden Fluoreszenzfarbstoffe dergestalt ausgewählt werden, daß sie sich
in ihren Emissionsbereichen nicht wesentlich überlappen.
16. Verfahren nach Anspruch 3,10 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß als
Fluoreszenzfarbstoffpaare FITC mit PE-Cy5 oder FITC mit PerCP oder
PE mit PE-Cy5 oder PE mit PerCP verwendet werden.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1998108591 DE19808591C2 (de) | 1998-02-28 | 1998-02-28 | Standardisierter durchflußzytometrischer Vollblutassay |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1998108591 DE19808591C2 (de) | 1998-02-28 | 1998-02-28 | Standardisierter durchflußzytometrischer Vollblutassay |
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Family Applications (1)
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| DE1998108591 Expired - Fee Related DE19808591C2 (de) | 1998-02-28 | 1998-02-28 | Standardisierter durchflußzytometrischer Vollblutassay |
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| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE19808591C2 (de) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004013274A3 (en) * | 2002-08-01 | 2004-05-13 | Noxxon Pharma Ag | Ghrelin binding nucleic acids |
| WO2005003166A1 (en) * | 2003-07-08 | 2005-01-13 | Amersham Health As | Fluorescein-labelled peptides |
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-
1998
- 1998-02-28 DE DE1998108591 patent/DE19808591C2/de not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
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|---|
| Datenbank: Medline auf STN. AN 94135699, AB. * |
| SATOH, T. (u.a.), in: Thrombosis Research, 1993, Bd.72, Nr.5, S.389-400 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004013274A3 (en) * | 2002-08-01 | 2004-05-13 | Noxxon Pharma Ag | Ghrelin binding nucleic acids |
| US7750140B2 (en) | 2002-08-01 | 2010-07-06 | Noxxon Pharma Ag | Ghrelin binding nucleic acids |
| WO2005003166A1 (en) * | 2003-07-08 | 2005-01-13 | Amersham Health As | Fluorescein-labelled peptides |
| US8101734B2 (en) | 2005-04-08 | 2012-01-24 | Noxxon Pharma Ag | Ghrelin binding nucleic acids |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| DE19808591C2 (de) | 2000-02-03 |
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