JP2016155994A - ゲル素材及びその製造方法 - Google Patents
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Description
該水酸基含有化合物は、分子内に2個以上の水酸基を有する、ポリエーテル、多糖、又はヒドロキシエチルメタクリレートの重合体若しくは共重合体であり、
該水酸基含有化合物には2個以上の同一又は異なるDNAが結合してなる、
複合体。
項2.前記水酸基含有化合物の平均分子量が、1,000〜100,000である、項1に記載の複合体。
項3.前記水酸基含有化合物が、直鎖又は分岐鎖型のポリエチレングリコールである、項1又は2に記載の複合体。
項4.前記DNAの長さが、3〜20塩基である、項1〜3のいずれか一項に記載の複合体。
項5.前記DNAが、2本又はそれ以上の本数の鎖間で高次構造を形成できる塩基配列を含む、項1〜4のいずれか一項に記載の複合体。
項6.前記DNAが、GGG、GGGG、及びCCCCCからなる群から選択される少なくとも1種の塩基配列を含む、項1〜5のいずれか一項に記載の複合体。
項7.前記DNAが、GGG及び/又はGGGGの塩基配列を含む、項1〜6のいずれか一項に記載の複合体。
項8.項1〜7のいずれか一項に記載の複合体を含むゲル。
項9.金属カチオンを更に含む、項8に記載のゲル。
項10.項1〜7のいずれか一項に記載の複合体を含むゾルゲル可逆性組成物。
項11.項8又は9に記載のゲルを含む医薬組成物、食品組成物又は化粧料。
項12.液相合成系により、分子内に2個以上の水酸基を有する水酸基含有化合物の水酸基を介して、2個以上のDNAを伸長する工程を含む、項1〜7のいずれか一項に記載の複合体の製造方法。
項13.以下の(A)〜(E)工程を含む、前記DNAの長さがn塩基である、項1〜7のいずれか一項に記載の複合体の製造方法:
(A)溶媒中、活性化剤の存在下で水酸基含有化合物とデオキシヌクレオシドホスホロアミダイトとをカップリングする工程、
(B)溶媒中、酸化剤の存在下で(A)工程で得られたカップリング化物のリン原子を酸化する工程、
(C)溶媒中、(B)工程で得られた酸化されたカップリング化物を、脱保護剤と反応させて、該カップリング化物の5'末端にある保護基を除去する工程、
(D)上記(A)、(B)及び(C)工程をn-2回繰り返し、その後(A)工程及び(B)工程を経る工程、並びに
(E)(D)工程で得られた反応生成物を、脱保護剤と反応させて、核酸塩基及びリン酸ジエステルの保護基を除去する工程。
項14.項1〜7のいずれか一項に記載の複合体を含む溶液を、水溶性高分子を含む水溶液に添加する工程を含む、ゲルの製造方法。
項15.水溶性高分子を含む、項1〜7のいずれか一項に記載の複合体を含むゲルの製造用の水溶液。
項16.水溶性高分子を含む、項1〜7のいずれか一項に記載の複合体を含むゲルの保存用の水溶液。
GGG又はGGGGの塩基配列を有する場合は、Na+、K+、NH4 +などのカチオンの存在下で4つのグアニンが互いの水素結合によって平面構造(グアニンカルテット)を形成するので、本発明の複合体が4個会合することになる。
本工程では、アセトニトリル等の溶媒中、1H-テトラゾール、エチルチオテトラゾール等のテトラゾール誘導体、ジシアノイミダゾール等の活性化剤の存在下で水酸基含有化合物と所望のデオキシヌクレオシドホスホロアミダイト(deoxynucleoside phosporamidite)(ホスホロアミダイト試薬)をカップリングして、水酸基含有化合物の水酸基に所望のヌクレオシドが一塩基ずつ結合した中間体(1)(カップリング化物)を得る。当該デオキシヌクレオシドホスホロアミダイトは、5'炭素原子上の水酸基がジメトキシトリチル等の保護基により保護されており、核酸塩基も必要により保護基により保護されている。反応後には、反応液を濃縮した後に、tert-ブチルメチルエーテル等を貧溶媒として用いて、反応生成物を沈殿させることにより精製することができる。
本工程では、アセトニトリル等の溶媒中、tert-ブチルヒドロペルオキシドやヨウ素等の酸化剤の存在下で(A)工程で得られた中間体(1)を酸化して、リン原子が酸化された中間体(2)(酸化されたカップリング化物)を得る。反応後には、反応液を濃縮した後に、tert-ブチルメチルエーテル等を貧溶媒として用いて、反応生成物を沈殿させることにより精製することができる。
本工程では、ジクロロメタン等の溶媒中、(B)工程で得られた中間体(2)を、トリクロロ酢酸等の脱保護剤と反応させて、ジメトキシトリチル基等の5'末端の保護基が除去された中間体(3)を得る。反応後には、反応液を濃縮した後に、tert-ブチルメチルエーテル等を貧溶媒として用いて、反応生成物を沈殿させることにより精製することができる。
本工程では、上記(A)、(B)及び(C)工程をn-2回繰り返し、その後(A)工程及び(B)工程を経ることにより、水酸基含有化合物の水酸基に所望の塩基配列(n塩基)を有するDNAが結合した中間体(4)(反応生成物)を得る。
本工程では、(D)工程で得られた中間体(4)を、濃アンモニア水等の脱保護剤と反応させることにより、核酸塩基及びリン酸ジエステルの保護基を除去する。この反応は、通常、16〜60℃で行うことができ、反応時間は、通常0.5〜24時間程度である。
両末端OHのPEGを担体として、DNAの液相大量合成によりデオキシグアノシンを3残基導入する一例を示す(図1)。
密閉した3つ首の丸底フラスコ中にPEG (SIGMA-Aldrich, Mw = 4,600) 7.31 g (1.59 mmol)を加え、系を窒素置換した。脱水アセトニトリル(AN, Glen Research 40-4050-50)で3回共沸乾燥を行った後、内容物を脱水AN 20 mLに再溶解した。ここに、脱水AN 20 mLに溶かしたデオキシグアノシンのホスホロアミダイトモノマー(Glen Research 10-1020-20)4.0 gと、脱水AN 25 mLに溶かした1H-テトラゾール(東京化成工業) 1.34 gを同時にシリンジで加え、室温で1時間撹拌した。反応後の溶液をロータリーエバポレーター(SHIBATA, Rotavapor R-114)で減圧濃縮し、tert-ブチルメチルエーテル(TBME,和光純薬工業)を貧溶媒に用いて再沈殿を行うことで、PEGの両端にホスホロアミダイトモノマーが1塩基ずつカップリングした中間体1を得た。
1を100 mLナスフラスコに移し、脱水AN 20 mLに溶解させた。冷却したtert-ブチルヒドロペルオキシド(TBHP,東京化成工業) 4 mlを滴下し、室温で溶液を30分間撹拌した。反応後の溶液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、TBMEを貧溶媒に用いて再沈殿を行うことで、リン原子が酸化された中間体1'を得た(粗収量11.34 g)。
1'を100 mLナスフラスコに移し、3%トリクロロ酢酸/ジクロロメタン(TCA / DCM)混合溶液(Glen Research, 40-4140-62) 160 mLを氷冷下で滴下した。ついで、溶液を30分間室温で撹拌した。反応後の溶液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、TBMEを貧溶媒に用いて再沈殿を行うことで、末端のジメトキシトリチル(DMTr)基が除去された中間体1''を得た。
得られた中間体2 (200 mg)を40%メチルアミン水溶液/濃アンモニア水1:1混合液(東京化成工業) 10 mLに溶かし、室温で2時間静置することにより、核酸塩基、及びリン酸ジエステルの保護基を脱保護した。反応液に100 mg/mLのNaCl水溶液10 mLを加え、Glen Research社製DNA簡易精製カラムGLEN-PAK (60-5300-01) 3 gの所定の手順でDMTr基の除去及び脱塩精製を行った。10 mLで3回溶出した50%アセトニトリル溶液をロータリーエバポレーターで減圧乾燥することで、157 mg (収率96%)の最終目的物3を得た。
得られた目的物3を35.3 mgサンプル管に量り取り、pH 7.0に調整した0.1 Mリン酸緩衝液200 mLを加えた。ボルテックスで約1分間激しく震盪し、バス型ソニケーターで3分間超音波照射することで、サンプル濃度15wt%の溶液を得た。ここに2.8 M KCl水溶液を7.14μL加えてボルテックスすると(K+の最終濃度 0.1 M)、溶液は数秒以内にゲル化し、サンプル管を逆さまにしても流動しなかった。ゲル化前後の写真を図4に示す。レオメーター(Thermo Scientific, RS 6000)による測定結果では、貯蔵弾性率(G')がおよそ1.0 kPa、損失弾性率(G'')がおよそ0.1 kPaであった。
得られた目的物3の25μMリン酸緩衝液(0.1 M, pH 7.0)溶液のCDスペクトル(日本分光, J-1500)を測定した結果を図6に示す。図6によれば、K+添加後には260 nmの正のコットン効果及び240 nmの負のコットン効果が顕著に増大した。このことは、目的物3中のDNA部がパラレル型の四重鎖を形成していることを示す。
15wt%で調整したヒドロゲルは、10 Uのホスホジエステラーゼを含む0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.0)を100μL加えて37℃で静置すると、およそ1時間でゾル化した(図7)。このことは、ゲルの網目構造はDNAが架橋部となって維持されていることを示す。
実施例1で得られたdCCCCC-PEG-dCCCCCを85.6 mgサンプル管に量り取り、pH 8.0に調整した0.1 M MES緩衝液200 mL(NaCl 140 mM含有)を加えた。ボルテックスで約1分間激しく震盪し、バス型ソニケーターで3分間超音波照射することで、サンプル濃度30wt%の溶液を得た。このときのpHは、2.6であった。ここに1.0 M NaOH水溶液を37.5μL加えてボルテックスすると、溶液のpHは4.2に変化し、溶液は1〜2分間でゲル化し、サンプル管を逆さまにしても流動しなかった。
<実験方法>
・複合体溶液10μL (15wt%)
複合体:dG4-PEG4.6k-dG4 17.6 mg dG4-PEG4.6k-dG4は、PEG (Mw=4,600)の両端にGGGGの塩基配列を有するDNAが結合した複合体を意味する。
溶媒:0.1 M Tris/HCl 1000μL
蛍光物質:FLUORESBRITE PLAIN RED 0.5U 20μL
・外液1 mL
水溶性高分子又は低分子:以下に記載されているものを使用
溶媒:4 M KClaq250μL
0.1 Mリン酸バッファー 750μL
複合体溶液(dG4-PEG4-dG4, 15wt%) 10μLを、水溶性高分子又は低分子を溶解した外液(0.1 Mリン酸バッファー(pH 7.4, 1.0 M KCl))に滴下し,ゲルビーズを調製した。
・外液が合成高分子を含む場合(図9)
PEG2k、PEG4.6k、PEG10k、4-arm PEG5k、又は4-arm PEG20kを20wt%含む外液を使用してゲルビーズの調製を行った場合の結果を図9に示す。全ての外液においてゲルビーズを調製することができ、ゲルビーズは9日後にも溶解しなかった。
エチレングリコール、グリセリン、又はアクリルアミドを20wt%含む外液を使用してゲルビーズの調製を行った場合の結果を図10に示す。全ての外液で、完全なゲルビーズは調製できなかった。6時間後には全て溶解した。
デキストラン(Mw 40,000)、又はポリビニルアルコールを20wt%含む外液を使用してゲルビーズの調製を行った場合の結果を図11に示す。両方の外液で、ゲルビーズを調製することができた。ゲルビーズは8日後にも溶解しなかった。
PEG4.6kを0wt%、5wt%、10wt%、又は15wt%含む外液を使用してゲルビーズの調製を行った場合の結果を図12に示す。0wt%ではゲルビーズが72時間後には溶解した。5wt%、10wt%、15wt%では完全な形ではないもののゲルビーズが調製でき、8日後にも溶解しなかった。
<実験方法>
・複合体溶液10μL (15wt%)
複合体:dG4-PEG4.6k-dG4 17.6 mg
溶媒:0.1 M Tris/HCl 1000μL
蛍光物質:FLUORESBRITE PLAIN RED 0.5U 100μL
・外液1 mL
水溶性高分子又は低分子:以下に記載されているものを使用
溶媒:4 M KClaq250μL
0.1 Mリン酸バッファー 750μL
複合体溶液(dG4-PEG4-dG4, 15wt%) 10μLを、水溶性高分子又は低分子を溶解した外液(0.1 Mリン酸バッファー(pH 7.4 ,1.0 M KCl))に滴下し、ゲルビーズを調製した。
・外液が分子量が低い合成高分子を含む場合
PEG1000、又はPEG1540を20wt%含む外液を使用した場合、両方の系でゲルビーズを調製することができた。また、ゲルビーズは溶解しなかった。
アニオン性高分子であるポリアクリル酸(Mw 25,000)を20wt%含む外液を使用した場合、ゲルビーズを調製することができた。
<実験方法>
・複合体溶液10μL (15wt%)
複合体:dG4-PEG4.6k-dG4 17.6 mg
溶媒:0.1 M Tris/HCl 1000μL
蛍光物質:POLYBEAD FLUORESCENT YG MICROSPHERES 0.05μm、0.1μm、又は0.5μm 100μL
・外液1 mL (20wt%)
水溶性高分子:PEG4.6k 200 mg
溶媒:4 M KClaq 250μL
0.1 Mリン酸バッファー 750μL
複合体溶液(dG4-PEG4-dG4, 15wt%) 10μLを、水溶性高分子を溶解した外液(0.1 Mリン酸バッファー(pH 7.4,1.0 M KCl))に滴下し、ゲルビーズを調製した。
蛍光物質のサイズが0.05μmと0.1μmの系では蛍光物質のピークが見られ、0.05μmでより大きなピークが見られた。0.5μmの系ではピークに大きな変化は見られなかった。このことから0.05μmと0.1μmの系では蛍光物質がゲルビーズから溶出し、0.5μmの系ではゲルビーズから溶出していないことが分かる。
<実験方法>
濃度が20wt%になるように0.1 M Tris/HCl (pH 7.0, 0.5μm蛍光ポリスチレンビーズ含有)に溶解した4-arm PEG20k-DNA溶液10μLを、0.1 Mリン酸バッファー(10wt% PEG4.6k, pH 7.0, 1.0 M KCl)に滴下しゲルビーズを調製した。2つの0.1 M Tris/HClバッファー(20wt% PEG, 1.0 M KCl)を用意した。調製したゲルビーズの体積から求めたDNAセグメントのmol数と等量になるように一方のバッファーに相補鎖を加えてボルテックスで撹拌した。次に調製したゲルビーズを相補鎖を含む又は含まないTris/HClバッファーに加えて室温下で静置し、観測を行った。
4-arm PEG20k-DNAのDNA配列:5'-ACGCAGGG-3'
相補鎖のDNA配列:5'-CCCTGCGT-3'
<結果>
結果を図13及び14に示す。ゲルビーズに相補鎖を加えた場合は、ゲルビーズはDNAに応答して72時間後には分解した。
<実験方法>
(1) ホスホジエステラーゼI
濃度が20wt%になるように0.1 M Tris/HCl (pH 7.0, 0.5μm蛍光ポリスチレンビーズ含有)に溶解したdG4-PEG4.6k-dG4溶液10μLを、0.1 Mリン酸バッファー(10wt% PEG4.6k, pH 7.0, 1.0 M KCl)に滴下しゲルビーズを調製した。これを1.0 mLの0.1 Mリン酸バッファー(20wt% PEG, pH 7.0, 15 mM Mg2+, 1.0 M KCl, 50UホスホジエステラーゼI)のサンプル管No.02に移し、37℃の温浴でインキュベートした。
濃度が20wt%になるように0.1 M Tris/HCl (pH7.0, 0.5μm蛍光ポリスチレンビーズ含有)に溶解したdG4-PEG4.6k-dG4溶液10μLを、0.1 Mリン酸バッファー(10wt% PEG4.6k, pH 7.0, 1.0 M KCl)に滴下しゲルビーズを調製した。これを0.1 mLの0.1 Mリン酸バッファー(20wt% PEG, pH 7.0, 1.0 M KCl, 5UホスホジエステラーゼII)の入ったエッペンチューブに移し、37℃の温浴でインキュベートした。
濃度が20wt%になるように0.1 M Tris/HCl (pH7.0, 0.5μm蛍光ポリスチレンビーズ含有)に溶解したdG4-PEG4.6k-dG4溶液10μLを0.1 Mリン酸バッファー(10wt% PEG4.6k, pH 7.0, 1.0 M KCl)に滴下しゲルビーズを調製した。これを0.1 mLの0.1 Mリン酸バッファー(20wt% PEG, pH 7.0, 1.0 M KCl, 50U DNaseI)の入ったエッペンチューブに移し、37℃℃の温浴でインキュベートした。
(1)〜(3)の結果をそれぞれ図15〜17に示す。酵素分解を始めてから48時間後のサンプルは、どれも目視ではゲルビーズの分解は観察されなかった。
Claims (14)
- 水酸基含有化合物とDNAとから構成され、該水酸基含有化合物の水酸基にDNAが結合している複合体であって、
該水酸基含有化合物は、分子内に2個以上の水酸基を有する、ポリエーテル、多糖、又はヒドロキシエチルメタクリレートの重合体若しくは共重合体であり、
該水酸基含有化合物には2個以上の同一又は異なるDNAが結合してなる、
複合体。 - 前記水酸基含有化合物の平均分子量が、1,000〜100,000である、請求項1に記載の複合体。
- 前記水酸基含有化合物が、直鎖又は分岐鎖型のポリエチレングリコールである、請求項1又は2に記載の複合体。
- 前記DNAの長さが、3〜20塩基である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記DNAが、2本又はそれ以上の本数の鎖間で高次構造を形成できる塩基配列を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記DNAが、GGG、GGGG、及びCCCCCからなる群から選択される少なくとも1種の塩基配列を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記DNAが、GGG及び/又はGGGGの塩基配列を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の複合体。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の複合体を含むゲル。
- 金属カチオンを更に含む、請求項8に記載のゲル。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の複合体を含むゾルゲル可逆性組成物。
- 液相合成系により、分子内に2個以上の水酸基を有する水酸基含有化合物の水酸基を介して、2個以上のDNAを伸長する工程を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の複合体の製造方法。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の複合体を含む溶液を、水溶性高分子を含む水溶液に添加する工程を含む、ゲルの製造方法。
- 水溶性高分子を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の複合体を含むゲルの製造用の水溶液。
- 水溶性高分子を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の複合体を含むゲルの保存用の水溶液。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11951032B2 (en) | 2018-11-13 | 2024-04-09 | Contraline, Inc. | Systems and methods for delivering biomaterials |
US11957616B2 (en) | 2018-11-13 | 2024-04-16 | Contraline, Inc. | Systems and methods for delivering biomaterials |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP6584868B2 (ja) | 2019-10-02 |
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