JP2007244374A - 核酸応答性ゲルおよびその製造方法ならびにその利用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ハイブリダイズしている2本の一本鎖核酸からなるプローブが、高分子ゲルの網目構造内に固定されている核酸応答性ゲルであって、当該プローブは、2本の一本鎖核酸が可逆的に結合している。
【選択図】なし
Description
本発明に係る核酸応答性ゲルは、ハイブリダイズしている2本の一本鎖核酸からなるプローブが、高分子ゲルの網目構造内に固定されている核酸応答性ゲルであって、当該プローブは、2本の一本鎖核酸が可逆的に結合している。
本発明にかかる核酸応答性ゲルの製造方法は、特に限定されるものではなく、上記プローブを、ハイブリダイズした状態で、ゲルの網目構造に、架橋を形成するように化学的に結合できる方法であればいかなる方法であってもよい。
(III−1)核酸応答性ゲルを用いた核酸の検出方法
本発明に係る核酸応答性ゲルでは、高分子ゲルの網目構造内に固定されている2本の一本鎖核酸の一方に対して、ハイブリダイズし核酸の鎖交換を起こす標的核酸が存在すると、核酸応答性ゲルは膨潤する。それゆえ、本発明に係る核酸応答性ゲルは、標的核酸の検出に利用することができる。したがって、本発明に係る核酸応答性ゲルを用いた核酸の検出方法も本発明に含まれる。なお、標的核酸は2本の一本鎖核酸の一方に対して、ハイブリダイズしている部分において完全相補となる場合、他の一本鎖核酸より相同性が高い場合のように、より安定な二本鎖を形成する場合に限られず、同等に安定な二本鎖を形成する場合にも体積変化は起こるので、検出することを目的とする核酸に応じて、プローブを設計すればよい。なお、本明細書において、標的核酸とは、本発明の核酸応答性ゲルが応答して体積変化を起こす核酸をいう。
核酸応答性ゲルの利用に関する本発明には、上述した核酸の検出方法だけでなく、該検出方法を実施するための核酸検出キットが含まれる。本発明の核酸検出キットは、具体的には、少なくとも本発明の核酸応答性ゲルを含む構成であればよい。
本発明にかかる核酸応答性ゲルを、ゲルの膨潤に伴う体積変化を検知可能なセンサーに固定化した場合、このセンサーを利用して、簡便かつ確実に標的核酸を検出することができる核酸検出装置を製造することができる。
<ビニル基導入オリゴDNAの合成>
図1の反応式に示すように、5’末端がアミノ化されたオリゴDNAにビニル基を導入した。
続いて、図2の反応式に示すように、ハイブリダイズしている2本の一本鎖ビニル基導入オリゴDNAからなるプローブが高分子ゲルの網目構造に固定されている核酸応答性ゲルを製造した。なお、図2に示すように、2本の一本鎖ビニル基導入オリゴDNAは、ハイブリダイズしているが真ん中の「T−T」がミスマッチとなっている。
実施例1で製造した核酸応答性ゲルをTris緩衝液中で十分に平衡膨潤させた後、25℃で、核酸応答性ゲルに結合されているオリゴDNAの一方の一本鎖DNAに完全相補であるDNA溶液(0.2mM)に浸漬した。なお、DNA溶液は、Tris緩衝液にDNAを0.2mMとなるように溶解して調整した。円柱状である核酸応答性ゲルの直径変化を光学顕微鏡(オリンパス(株)製:BX51)を用いて測定し、膨潤変化を次式に示す膨潤率によって評価した。
膨潤率(Swelling ratio)=(d/d0)3 ・・・ (1)
ここで、d0はDNA溶液に浸漬する前のTris緩衝液中での核酸応答性ゲル(以下、「Tris緩衝液中での核酸応答性ゲル」と称する。)の円柱の直径(cm)、dはDNA溶液に浸漬した後のDNA溶液中での核酸応答性ゲル(以下、「DNA溶液中での核酸応答性ゲル」と称する。)の円柱の直径(cm)である。なお、対照として、ビニル基導入オリゴDNAを結合しない以外は実施例1と同様にして合成したポリアクリルアミド(PAAm)ゲルを用いて同様の測定を行った。また、円柱の直径は、円柱状の核酸応答性ゲルの側面の幅を光学顕微鏡で測定することにより得られた値である。
圧縮試験機((株)島津製作所製:EZ Test-10N)を用いて実施例1で製造した核酸応答性ゲルとポリアクリルアミド(PAAm)ゲルとの緩衝溶液中およびDNA溶液中での圧縮弾性率を測定し、次式によって核酸応答性ゲルの架橋密度νeを算出した。
G=R・T・νe・v2 1/3
ここでGは圧縮弾性率(Pa)、Rは気体定数、Tは絶対温度、νeは架橋密度(mol/m3)、v2は核酸応答性ゲルにおける、核酸応答性ゲル全体(プローブが固定されている高分子化合物+溶媒)に対するプローブが固定されている高分子化合物の体積分率である。
次に、実施例1で製造した核酸応答性ゲルについて、DNA溶液(0.2mM)として、核酸応答性ゲルに導入されているオリゴDNAの一方の一本鎖DNAと一塩基非相補である3種類のDNA溶液を用いて、実施例2と同様にして膨潤率の測定を行った。
本実施例では、核酸応答性ゲルに含有させるオリゴDNAの濃度を増加させて、膨潤率測定を行なった。
本実施例では、測定時における温度と核酸応答性ゲルとの関係について検討した。
Claims (18)
- ハイブリダイズしている2本の一本鎖核酸からなるプローブが、高分子ゲルの網目構造内に固定されている核酸応答性ゲルであって、
当該プローブは、2本の一本鎖核酸が可逆的に結合していることを特徴とする核酸応答性ゲル。 - 上記プローブは、2本の一本鎖核酸のそれぞれが、高分子ゲルの網目構造を形成する高分子化合物に結合することによって、架橋を形成するように、ゲルの網目構造内に固定されていることを特徴とする請求項1に記載の核酸応答性ゲル。
- 上記プローブは、2本の一本鎖核酸がハイブリダイズしている部分において、1塩基以上のミスマッチを有することを特徴とする請求項1または2に記載の核酸応答性ゲル。
- 2本の一本鎖核酸のそれぞれは、5’末端が高分子ゲルの網目構造を形成する高分子化合物に結合していることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸応答性ゲル。
- 2本の一本鎖核酸のそれぞれは、3’末端が高分子ゲルの網目構造を形成する高分子化合物に結合していることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸応答性ゲル。
- 上記核酸は、DNA、RNAまたはPNAであることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸応答性ゲル。
- 上記高分子ゲルは、(メタ)アクリルアミド、(メタ)アクリル酸、2−ヒドロキシエチルメタクリレート、アルキル(メタ)アクリレート、N,N’-ジメチル(メタ)アクリルアミド、N-イソプロピル(メタ)アクリルアミド、酢酸ビニル、およびアリルアミンからなる群より選択される少なくとも1種のモノマーを含むモノマーを重合させることによって得られる高分子ゲル、
または、ポリ(メタ)アクリルアミド、ポリ(メタ)アクリル酸、ポリ−2−ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリ−アルキル(メタ)アクリレート、ポリ−N,N’-ジメチル(メタ)アクリルアミド、ポリ−N−イソプロピル(メタ)アクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリアリルアミン、セルロース、キトサン、アルギン酸およびそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも1種の高分子化合物を架橋剤と反応させて網目構造を形成させることによって得られる高分子ゲルであることを特徴とする請求項1〜6のいずれか1項に記載の核酸応答性ゲル。 - 上記プローブを形成する2本の一本鎖核酸の塩基数は、2以上10000以下であることを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項に記載の核酸応答性ゲル。
- 核酸に応答して膨潤することを特徴とする請求項1〜8のいずれか1項に記載の核酸応答性ゲル。
- 核酸に応答して架橋密度が減少することを特徴とする請求項1〜9のいずれか1項に記載の核酸応答性ゲル。
- (メタ)アクリルアミド、(メタ)アクリル酸、2−ヒドロキシエチルメタクリレート、アルキル(メタ)アクリレート、N,N’-ジメチル(メタ)アクリルアミド、N-イソプロピル(メタ)アクリルアミド、酢酸ビニル、およびアリルアミンからなる群より選択される少なくとも1種のモノマーを含むモノマーと、反応性官能基が導入された2本の一本鎖核酸をハイブリダイズさせてなるプローブとを、架橋剤の存在下または不存在下で、共重合させることにより得られることを特徴とする核酸応答性ゲル。
- ポリ(メタ)アクリルアミド、ポリ(メタ)アクリル酸、ポリ−2−ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリ−アルキル(メタ)アクリレート、ポリ−N,N’-ジメチル(メタ)アクリルアミド、ポリ−N−イソプロピル(メタ)アクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリアリルアミン、セルロース、キトサン、アルギン酸およびそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも1種の高分子化合物に、反応性官能基が導入された2本の一本鎖核酸をハイブリダイズさせてなるプローブを結合させた後、架橋剤と反応させて網目構造を形成させることによって得られることを特徴とする核酸応答性ゲル。
- ハイブリダイズする2本の一本鎖核酸にそれぞれ反応性官能基を導入する反応性官能基導入工程と、
前記反応性官能基が導入された2本の一本鎖核酸をハイブリダイズさせてプローブを作製する二本鎖形成工程と、
得られたプローブを、高分子ゲルを形成するモノマーと、架橋剤の存在下または不存在下で、共重合させて核酸応答性ゲルを得る重合工程とを含むことを特徴とする核酸応答性ゲルの製造方法。 - ハイブリダイズする2本の一本鎖核酸にそれぞれ反応性官能基を導入する反応性官能基導入工程と、
前記反応性官能基が導入された2本の一本鎖核酸をハイブリダイズさせてプローブを作製する二本鎖形成工程と、
得られたプローブを高分子化合物と結合させるプローブ結合工程と、
上記プローブ結合工程によりプローブが結合された高分子化合物を、架橋剤と反応させて網目構造を形成する架橋工程とを含むことを特徴とする核酸応答性ゲルの製造方法。 - 請求項1〜12のいずれか1項に記載の核酸応答性ゲルと核酸を含有する検体とを接触させる工程と、標的核酸による鎖交換の有無を核酸応答性ゲルの体積変化で検出する工程とを含むことを特徴とする標的核酸の検出方法。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の核酸応答性ゲルを含有する核酸検出キット。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の核酸応答性ゲルを含有する核酸検出装置。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の核酸応答性ゲルと核酸を含有する検体とを接触させる工程と、標的核酸による鎖交換の有無を核酸応答性ゲルの体積変化で検出する工程とを含む標的核酸の検出方法の、検出精度を制御する方法であって、
上記核酸応答性ゲルと核酸を含有する検体とを接触させる工程を行なう温度を調整することを特徴とする標的核酸の検出方法の検出精度制御方法。
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