KR0180918B1 - 혈소판 응집 저해제 - Google Patents

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Abstract

특이 수용체 결합을 기준으로 혈소판 응집 억제제(PAI)의 존재 또는 부재에 대한 뱀독을 스크린하는 분석을 기술한다. 이 분석에 있어서, 넓은 범위의 뱀독에서 PAI의 동정 및 특성화를 달성하였다.
이들 여러 가지 활성 뱀독으로부터 분리 및 정제된 PAI를 기술하고 특성화한다. 또한 Arg-Gly-Asp(RGD)부착 서열은 없고 K*-(G/Sar)-D는 포함하는 PAI를 제조하고 피브리노겐 또는 폰 벨레브란트의 GP Ⅱb-Ⅲa와의 결합을 특이적으로 억제하는 것으로 나타난다.
상기 식에서 K*는 식 R1 2N(CH2)4CHNCO-의 변형된 리실 잔기이고, 여기서 각 R1은 독립적으로 H, 알킬(1-6C) 또는 최대로 하나의 R1이 R2-C=NR3이고 여기서 R2는 H, 알킬(1-6C), 페닐 또는 벤질이거나 또는 NR4이고, 여기서 각 R4는 독립적으로 H, 또는 알킬(1-6C)이고 R3은 H, 알킬(1-6C)페닐 또는 벤질이고, 또는 R2-C=NR3은 하기의 (a), (b), (c) 및 (d)로 구성된 군에서 선택된 라디칼이고, 여기서 m은 2-3의 정수이고 각 R5는 독립적으로 H 또는 알킬(1-6C)이고, 상기 0 또는 S가 다른 헤테로원자에 인접하지 않는 조건으로 하나 또는 2개의 (CH2)는 0 또는 S로 대체될 수 있다.

Description

[발명의 명칭]
혈소판 응집 저해제
[기술분야]
본 발명은 각종 뱀독으로부터 단리 및 정제된 혈소판 응집 저해제인 또는 그와 관련된 펩티드군에 관한 것이다. 이들 펩티드는 혈소판 관련 허혈(isochemic)질환의 치료 및 예방용 치료제로서 유용하다. 보다 상세하게는 본 발명은 혈소판 점착 및 응집에 관여하는 점착성 단백질에 대한 특정 수용체를 차단하는 펩티드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 뱀독으로부터 상기 폴리펩티드를 검출하고 그것을 실질적으로 균질하게 정제하는 방법, 및 합성적으로 또한 재조합 DNA 방법을 사용하여 이들 폴리펩티드의 일차 아미노산 서열을 사용하여 합성 펩티드를 제조하는 방법도 기재한다.
[배경기술]
심장병은 대부분 서구사회에서 첫째가는 사망원인이다. 심장병에 의한 사망은 흔히 혈소판과 유관한 허혈 증후군에 기인되며, 이 증후군은 아테롬성 동맥경화 및 동맥경화에 의해 개시되고, 다음에 한정되는 것은 아니나, 혈관성형, 경동맥내 절제, 혈관 이식조직의 접합 및 장기 심장혈관장치(예컨대 체내 상주 카테타 또는 션트 체외순환장치) 후의 급성 심근경색, 만성 불안정 협심증, 일과성 허혈습래 및 발작, 말초혈관병, 동맥혈전증, 자간전증(子癎前症), 색전증, 협착증 및/또는 혈전증이 여기에 포함된다. 이들 증상은 혈액유래(blood-borne) 조정인자에 의해 혈관벽 또는 루멘(lumen) 내에서 혈소판이 활성화됨으로써 개시되는 것으로 생각되는 각종 협착성 및 폐색성 혈관 질병에서 나타나지만 혈류를 저해하는 혈전을 형성하는 혈소판 응집체에 의해 명시화된다.
많은 연구가 혈소판 응집 및 혈전형성의 기작을 알아내는데 기여했다. 혈소판은 루멘의 협착화, 반점형성 및 이물체(예컨대 카테터)의 존재 등과 같은 각종 혈관 손상에 반응한다. 이들 손상에 대한 혈소판의 반응은 혈소판 점착과 활성화, 그리고 강력한 세포미토겐 인자를 포함하는 혈소판 과립성분의 방출을 포함하는 일련의 작용이다. 활성화된 혈소판 응집체는 피브린의 형성을 유도하고 이 피브린은 혈전을 더욱 안정화시킨다.
이 반응을 조절하는 기작에 대해 이제 많이 알려졌다. 자극받지 않은 혈소판은 라미닌(VLA2,VLA6) 및 콜라겐(VLA2,GPIV,기타)을 포함하는 수개의 점착성 단백질에 대한 수용체를 갖고 있지만, 최초에 혈소판이 내피하부에 부착되는 것은 혈소판막 당단백질(GP)이 부동화된 폰 빌레브란트(von Willebrand)인자에 결합하는 것에 의해 중재되는 것으로 믿어진다. 거기에 이은 혈소판 활성화는 ADP, 에피네프린, 트롬빈, 콜라겐 및 트롬브옥산 A2를 포함하는 기지의 생리학적 길항제들 중의 하나 또는 몇에 의해 개시된다.
혈소판 응집은 혈소판 막 표면 위의 GP Ⅱb-Ⅲa 복합체에 의해 중재된다. GP Ⅱb-Ⅲa는 자극받지 않는 혈소판의 표면 위에 불활성형으로 존재한다. 혈소판이 점착 및 생리학적 길항제에 의해 활성화될 때는 GP Ⅱb-Ⅲa도 또한 활성화되어, 피브리노겐(Fg), 폰 빌레브란트인자(vWF) 및 피브리노넥틴(Fn)에 대한 수용체가 되지만(Phillips et al., Blood (1988) 71; 831-843참조); 혈소판 응집 및 생체 내 혈전형성의 주원인이 되는 것으로 믿어지는 것은 피브리노겐 및/또는 폰 빌레브란트인자의 결합이다. 따라서 피브리노겐 또는 폰 빌레브란트인자가 GP Ⅱb-Ⅲa에 결합하는 것을 특이적으로 저해하는 물질이 혈소판 응집을 저해하고 생체 내 혈전형성을 저해할 수 있는 가능성을 가진다.
혈소판 GP Ⅱb-Ⅲa는 총괄하여 인테그린으로 알려져 있는 구조적으로 관련된 점착성 단백질 수용체의 상과(superfamily)의 일원으로 현재 알려져 있다. GP Ⅱb-Ⅲa와 마찬가지로 현재까지 알려진 모든 인테그린은 더 큰 알파-서브유니트(예컨대 GP Ⅱb)와 더 작은 베타-서브유니트(예컨대 GP Ⅲa)를 가진 두 서브유니트 분자이다. 인테그린 서브유니트의 공지된 서열들 사이에는 고도의 상동성이 있어 인테그린들이 공통의 전구체로부터 발생했음을 가리킨다. 인테그린은 각종 세포 점착에 작용하고 백혈구, 내피 세포, 평활근 세포 및 혈관계 내 기타 세포에서 발견되었다. GP Ⅱb-Ⅲa는 혈소판에 한정되어 있는 반면 인테그린은 넓게 분포되어 있기 때문에, 바람직한 한 응집제는 다른 인테그린과는 대조적으로 GP Ⅱb-Ⅲa를 선택적으로 저해할 것이다.
점착성 단백질이 활성화 혈소판에 결합되는 것을 차단하고 혈소판 응집을 저해하는 수종의 펩티드가 개시되었다(Hawiger 등의 미국특허 제4,661,471호; 및 Rouslahti 등의 미국특허 제4,614,517호, 제4,578,079호; 제4,792,525호; 및 영국 출원 GB 2,207,922A 참조). 그 펩티드의 한 종류에서는 서열 RGD가 중요하고 테트라펩티트 서열 RGDS, RGDT, RGDC가 특히 사용되었다. Fg, Vn, vWF 및 Fn을 포함하는 각종 점착성 단백질에서 아미노산 서열 RGDX가 발견된다. 이 서열은 점착성 단백질과 점착성 단백질 수용체 사이의 상호 작용에 중요한 역할을 하는 것이 증명되었는데 그 이유는 이 서열을 함유하는 펩티드는 점착성 단백질의 결합을 차단하기 때문이다(Pierschbacher, M. D. 등의 J. Biol Chem (1987) 262:17294-17298; Rugger 등의 Proc Natl Acad Sci (USA) (1986) 83:5708-5712; 및 Rouslati et al., Cell (1986) 44:517-518 참조). 이 서열을 함유하는 테트라펩티드는 1989년 6월 7일 공개된 EP 출원 제319,506호에 기재되어 있다. RGD 서열에 아르기닌 대신 호모아르기닌을 함유하는 짧은 펩티드는 1989년 8월 24일 공개된 PCT 출원 WO 89/07609에 개시되어 있다.
RGD 함유 펩티드 내에서 허용되는 구조적 변화가 Pierschbacher, M. D. 등의 J. Biol Chem(상기)에 의해 탐구되었다. 이들 연구에서는 RGD-함유 서열을 조작하는 것은 피브로넥틴이나 비트로넥틴이 기질에 결합하는 것을 저해하는 활성에 영향을 줄뿐 아니라 두 리간드의 결합간의 구변에 영향을 미친다는 것이 발견되었다. 피브로넥틴의 세포부착 도메인으로부터 얻은 펩티드 서열 GRGDSPC가 펩티드 모델로 사용되었다. L-Arg를 D-Arg로 치환하는 등의 치환은 어느 리간드의 결합이나 아무 영향을 미치지 않는 것 같으나, Gly 대신에 D-Ala를 또는 L-Asp 대신에 D-Asp를 대치하면 저해활성이 파괴된다. L-Ser 대신에 D-Ser를 치환했을 때 비트로넥틴과 비트로넥틴 수용체와의 상호 작용의 저해는 감소되었을 피브로넥틴과 피브로넥틴 수용체 사이의 작용에는 아무 영향이 없었으며; Ser 대신에 Asn을 치환했을 때는 피브로넥틴 결합의 저해는 향상되었으나 비트로넥틴 결합에는 감소된 효과를 갖는 펩티드가 얻어졌다. Ser 대신에 선택적으로 대치하는 것은 다른 영향도 있었다. Ser 대신에 트레오닌을 치환했을 때는 비트로넥틴 수용체에의 결합을 저해하는 능력이 향상된 펩티드가 얻어졌으며, L-Pro로 치환했을 때는 불활성 펩티드가 얻어졌다. 서열 Gly-Pen-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys-Al의 환형 펩티드가 또한 제조되었고 여기서 Pen은 페닐실아민이며 Pen과 Cys 사이에는 이황화물 결합이 형성되었다. 본 발명자의 생각으로는 페니실아민은 환 구조속박을 증가시키는 작용을 하는 한편 N-말단 Gly 및 카르복시-말단 Ala는 단리 아미노 및 카르복실기를 환으로부터 격리시키기 위해 가해진 것이다. 환형 펩티드는 환의 형성 전에 동일한 펩티드보다 비트로넥틴 결합을 더 강력하게 저해할 수 있었으나 피브로넥틴 결합 저해에는 효과가 없다.
최근에, 알킬화된 R 잔기를 함유하는 RGD 서열의 수식을 갖는 항혈전성 펩티드가 사마넨에 의해 보고되었다(Samanen, J., et al., J Cell Biochem (1990) Suppl 14A:A229). RGD-함유 펩티드에 있어서의 구조/활성 관계에 대한 고찰이 알리 등에 의해 발표되었다(Ali, F. E. et al., in Proc 11th Am Peptide Symp, Marshall et al., ed. ESCOM Leiden 1990).
1989년 11월 15일 공개된 유럽 특허출원 제341,915호는 2군의 펩티드를 개시하는데, 하나는 선형이고, 다른 것은 환형으로, 이들 펩티드는 혈소판 GP Ⅱb-Ⅲa 수용체에 결합하여 이것이 vWF, 피브로넥틴 및 피브리노겐-피브린에 결합하는 능력을 저해한다고 기재되어 있다. 이들 펩티드 결합의 특이성에 관한 데이터는 없다. 환형 펩티드군은 RGD 서열의 수식을 포함하는데 R은 D 또는 L 호모아르기닌, 디메틸 또는 디에틸 아르기닌, 라이신 또는 이들 잔기의 알파-알킬화 유도체에 의해 치환되어 있다. 최소 환형 구조는 단지 이황화물 결합을 형성하는 두 잔기 사이에 묶여진 RGD 서열을 단순히 포함한다.
다른 저해성 펩티드 종은 피브리노겐의 감마 사슬로부터 유래된 카르복실말단 서열을 모델로 하는 펩티드 서열 도데카펩티드 HHLGGAQKAGDV를 이용한다(Kloczewiak et al., Bio chemistry (1989) 28:2915-2919; Timmons et al., (Ibid), 2919-2923 미국특허 4,661,471(상기); EP 출원 298,820). 이 서열은 Fg와 vWF가 GP Ⅱb-Ⅲa에 결합하는 것 그리고 이어서 혈소판이 응집을 저해할지라도, 이 펩티드의 유용성은 그것이 혈소판 수용체와의 작용 친화성이 낮기 때문에 한정되어 있다(IC50=10-100μM).
최근에 몇 연구단체가 GP Ⅱb-Ⅲa 복합체에 대한 친화성이 극히 높은 신종의 저분자량 폴리펩티드인자를 뱀독으로부터 단리하여 특성화하였다. 후앙 등(Huang, T.-F., et al., J Biol Chem (1987) 262:16157-16163; Huang, T.-F., et al., Bio Chemistry (1989) 28:661-666)은 트리메레수루스 그라미네우스 독사(Trimeresurus gramineus)로부터 단리된, RGD 및 6개의 이황화물 결합을 함유하는 72 아미노산 펩티드인 트리그라민의 일차 구조를 보고하였다. 간 등(Gan, Z.-R., et al., J. Biol Chem (1988) 263:19827-19832)은 에치스 카리나투스(Echis carinatus)로부터 단리된, 역시 RGD 및 4개의 이황화물 결합을 함유하는 49 아미노산 펩티드인 에치스타틴의 성질 및 구조를 보고하고 있다. 윌리암스 등(Williams, J. A., et al., FASEB Journal (1989) 3:A310, Anstr, No. 487m)은 관련 펩티드인 엘레간틴, 알볼라브린 및 플라보비리딘의 서열 및 성질을 보고한다. 또한 비티스타틴의 특성화가 쉐부스키 등(Shebuski, R. J. et al., J Biol Chem (1989) 264:21550-21556)에 의해 보고되었고, 아그키스트로펜 피시보루스 피시보루스(Agkistrodon piscivorus piscivorus)로부터 차오 등(Chao, B. H., et al., Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:8050-8054)에 의해 보고되었다. 뱀독으로부터 유래되는 각종 GP Ⅱb-Ⅲa 길항제들 간의 관계는 덴니스 등에 의해 토의되었다(Dennis, M. S., et al., Proc Natl Acad Sci USA (1989) 87:2471-2475).
뱀독에서 유래되는 이 저해성 펩티드군에는 니이비아로브스킬 등(Niewwiarowski, S., et al., Thromb Haemostas (1989) 62:319(Abstr. SY-ⅩⅣ-5)에 의해 보고된, 트리메레수루스 알보라브리스(Trimeresurus albolabris)에서 단리된 알보라브린, 티. 엘레간스(T. elegans)로부터 단리된 엘레간틴, 티. 플라보비리디스(T. flavoviridis)로부터 단리된 플라보비리딘, 보트롭스 아트록스(Bothrops atrox)로부터 단리된 바트록소스타틴, 비티스 아리에틴스(Bitis arientans)로부터 단리된 비티스타틴이 포함된다. 또한 아플라긴은 악키스트로돈 피. 피시보루스(Agkistrodon p. piscivorus)로부터 정제되었고 카오 등(Chao, 13., et al., Thromb Haemostas (1989) 62:50(Abstr. 12))에 의해 보고되었으며 악키스트로돈 할리스(Agkistrodonhalys)으로부터 정제된 할리신은 후앙 등(Huang, T.-F., et al., Thromb Haemosts (1989) 62:48(Abstr. 112))에 의해 보고 되었다. 이들 펩티드는 모두 고도의 서열 상동성을 나타낸다. 또한 점착성 단백질이 인테그린 수용체에 결합하는 것을 저해하는 뱀독으로부터 얻은 현재까지 보고된 모든 펩티드는 RGD 서열을 갖고 있다.
이들 보고된 뱀독인자는 생체 외에서 강력한 혈소판 응집 저해제이지만 이들 펩티드는 비트로넥틴 및 피브로넥틴 수용체와 같은 다른 점착성 단백질 수용체에도 높은 친화성으로 결합한다(Knudsen, K. A., et al., Exp Cell Res (1988) 179:42-49; Ruciaski; B., et al., Thromb haemosts (1989) 62:50(Abstr. 120)). 이렇게 뱀독인자가 GP Ⅱb-Ⅲa에 대한 특이성이 부족한 것은 혈전 형성저해제로서 이들을 치료에 사용하기에 바람직하지 않은 면인데, 그 이유는 이들이 혈관계에 있는 다른 세포의 점착성 특히 인테그린에 의해 중재된 점착에 영향을 미칠 수 있기 때문이다.
혈소판 혈전 저해제의 생성을 위해 개발된 다른 방법에서는 점착성 단백질이 자극된 혈소판에 결합되는 것을 차단하는 뮤린의 항-GP Ⅱb-Ⅲa 모노클로날 항체를 사용한다. 이들 모노클로날 항체는 개에게 조직 플라소미노겐 활성인자로 리퍼퓨전(reperfusion) 한 뒤의 관상동맥 재 폐쇄를 방지하기 위해(Yasude, T., et al., J Clin Invest (1988) 81:1284-1281) 또한 부상한 개의 협착이 심한 관상 동맥내 주기적 혈류감소를 방지하기 위해 사용되었다. 사람에 있어 그런 모노클로날 항체를 사용했을 때의 있을 법한 부작용은 이 항체의 장기-지속 효과로 인해 그리고 이 항체의 잠재적 면역원성으로 인해서일 것이다.
분명히 바람직하지 않은 혈전 형성을 예방하거나 적어도 완화시키려면 추가의 치료법이 필요하다. 특히 지혈성을 저하시키지 않고 또한 기타 세포 점착성에 영향을 주지 않고 특정 위치에서의 혈전 형성을 차단 또는 저해할 수 있는 치료제가 중요한 치료적 이점을 제공할 것이다. 이상적으로 이들 약제는 강력하고 GP Ⅱb-Ⅲa에 특이적이고 대부분의 환자에게 비면역원적이며; 또한 투여하기 쉽고 안정하고 제조하기에 경제적이어야 한다. 또한 이들 약제는 일시적으로 작용해야 하고 장기-지혈을 방해함이 없이 혈전형성의 초기에 작용할 수 있어야 한다. 본 발명은 이들 및 기타 관련 요구를 만족한다.
[발명의 개시]
본 발명은 혈소판 응집에 의해 매개되는 혈전 형성을 특이적으로 저해하는 뱀독이나 기타 생물원에 있는 저분자량(10kd)인자를 확인하는 간단한 선별방법을 제공한다. 이 방법은 혈소판 응집은 혈소판을 ADP와 같은 적당한 자극제로 처리할 때에 피브리노겐 및/또는 vWF가 혈소판 표면의 GP Ⅱb-Ⅲa에 결합함으로써 주로 생긴다는 것을 이용하고 있다. 이런 기준, 즉 피브리노겐 및/또는 vWF가 단리된 수용체에 결합하는 것을 저해한다는 기준 및 피브리노넥틴(Fn)이 피브리노넥틴 수용체에 결합하는 것(Fn/FnR 결합)과 비트리노넥틴이 비트리노넥틴 수용체에 결합하는 것(Vn/VnR 결합) 그리고 Fn과 Vn이 GP Ⅱb-Ⅲa 결합하는 것과 같은 기타 인자의 결합을 저해하는 것과 관련된 유사 기준을 사용함으로써, 혈소판 응집 저해제(PAI)에 대한 특이성 프로필을 신속하고 편리하게 구할 수 있다. 이 방법이 PAI의 존재 또는 부존재를 알기 위해 광범위한 패널의 뱀독을 선별 및 특성화하고, 다른 인테그린을 저해하는 것과는 반대로 GP Ⅱb-Ⅲa에의 결합을 저해하는 그들의 특이성을 위해서 이 패널로부터 확인된 PAI의 특이성을 특정지우고, 이들 PAI의 유도체인 활성 펩티드를 확인하는데 이용되었다.
따라서 한 양태로, 본 발명은 체액(biological fluid) 내의 PAI의 존부를 위한 신속한 선별방법에 관한 것으로 이 방법은 피브리노겐의 존재 하에 시험반응으로 그 체액을 단리된 GP Ⅱb-Ⅲa와 접촉시키고, 이 시험반응에서 GP Ⅱb-Ⅲa에 결합된 피브리노겐의 양을 대조 반응에서 GP Ⅱb-Ⅲa에 결합된 피브리노겐의 양과 비교하는 것으로 이루어져 있다. 이 방법은 추가로 PAI의 특이성을 특정하기 위해 Fn을 Fn 수용체와, Vn을 Vn 수용체와, Fn을 GP Ⅱb-Ⅲa와 또는 vWF를 GP Ⅱb-Ⅲa와 접촉시키는 시험 및 대조 반응을 더 포함한다.
다른 양태로, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 활성 뱀독 중에서 확인되고 그 독으로부터 단리될 수 있는 단리된 형태의 신규 PAI에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 단리된 형태의 PAI에 관한 것으로 그 PAI는 에치스 콜로라타, 에리스티코피스 막마호니이; 아. 힙날레, 아. 아쿠투스, 아. 피시보로우스 류코스토마, 아. 피시보루스 코난티; 보트롭스 아스페르; 보트롭스 코티아라, 비. 자라라카, 비. 자라라쿠수, 비. 란스베르기, 비. 메두사, 비. 나수타, 비. 네우위에디, 비. 프라도이, 비. 슐레글리; 크로탈루스 아트록스, 시. 바실리쿠스, 시. 세라스테스, 세라스테스, 시. 두리수스 두리수스, 시. 두리수스 토토나타쿠스, 시. 호리두스호리두스, 시. 몰로수스 몰로수스, 시. 루베르 루베르, 시. 비리디스 세레베루스, 크로탈루스 브이. 헬레리, 클로탈루스 비. 루코수스, 크로탈루스 브이. 오레가누스, 크로탈루스 브이. 비리디스; 카케시스 무타스; 시스트루루스 카테나투스 테르게미누스, 및 시스트루루스 밀라루스 바르보우리(
으로부터 얻어진 것으로부터 제조된 또는 그것의 아미노산 서열을 가진 단리된 형태의 PAI가 바람직하다.
특히 바람직한 것은 에리스토코핀, 코티아린, 크로타르록신, 세라스틴, 두리신, 호리딘, 루베린, 라케신, 바실리신, 루토신, 몰로신, 오레가닌, 비리딘, 테르게미닌 및 바르보우린이다.
본 발명은 천연산 펩티드의 절단된(trun cated) 및/또는 수식된 형태이고 및/또는 -CN2NH- 또는 -CH2CH2-와 같은 선택적 결합으로 대치된 하나 이상의 펩티드 결합을 가진 상술한 아미노산 서열의 펩티드를 포함한다.
바람직한 양태로, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 확인되었고 피브리노겐(Fg) 및/또는 폰 빌레브란트인자(vWF)가 GP Ⅱb-Ⅲa에 결합하는 것을 특이적으로 저해하는 것으로 밝혀진 활성 뱀독으로부터 제조될 수 있는 단리된 형태의 PAI 및 그들의 절단된 및/또는 수식된 형태에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 양태로, 본 발명은 점착성 단백질 수용체에의 결합에 관여하는 서열은 서열 KGD를 함유하는 단리된 형태의 뱀독의 PAI에 관한 것이다.
다른 중요한 양태로, 본 발명은 일반적으로 비트로넥틴의 비트로넥틴 수용체에의 결합 또는 피브로넥틴의 피브로넥틴 수용체에의 결합을 저해할 때보다 실질적으로 더 높은 효력으로 Fg 또는 vWF의 GP Ⅱb-Ⅲa에의 결합을 저해할 수 있는 혈소판 응집 저해제인 펩티드 및 펩티드 관련 화합물군에 관한 것이다. 이들 펩티드는 선행기술 PAI 단백질에서 발견되는 RGDX 결합서열 대신에 결합서열 K*GDX를 가진 것을 특징으로 한다. K*는 화학식 R1 2N(CH2)4CHNHCO-의 치환된 또는 비치환된 리실잔기인데 상기 식에서 각 R1은 독립적으로 H이거나 또는 인접 질소의 알칼리성을 파괴하지 않을 정도로 충분히 잔여공여성인 치환기이고, 그리고 하나 또는 두 메틸렌잔기는 후술하는 바와 같이 선택적으로 O나 S에 의해 치환될 수 있다. 에스. 밀라루스. 바르보우리로부터 단리된 바르보우리 PAI는 이 펩티드계열이 한 예이다. 그러나 이 펩티드의 보다 짧은 형태와 펩티드 사슬 내 다른 곳에 수식된 1-10 아미노산잔기를 갖고 있고 그리고/또는 펩티드 결합이 다른 결합으로 대치되어 있는 유사한 서열들도 또한 사용될 수 있다. 다른 구체예에는 천연 RGDX 서열이 K*GDX로 대치되어 있는 단리된 PAI 펩티드가 포함되어 있다. 바르보우린의 경우에서처럼, 이들 단리된 PAI는 천연형일 수도 있고 또는 절단되어 있을 수도 있으며, 그리고/또는 1-10아미노산이 치환되거나 삭제되거나 있을 수도 있고 그리고/또는 펩티드 연결이 비펩티드 연결로 치환되어 있을 수도 있다.
본 발명의 범위 내의 또 다른 화합물군은 언급된 바와 같이 상기 화합물에서, RGD 또는 K*GD 서열 내의 글리실잔기가 사르코실잔기에 의해 대치되어 있는 것을 제외한 것이다. 이 군의 화합물들은 관련된 RGD 또는 K*GD-함유 펩티드의 효력 및 특이성을 유지하고 있다.
또 다른 구체예 군은 화학식
의 특이적 PAI 활성을 가진 펩티드 또는 수식된 펩티드이다.
상기 식에서, K*는 상기에서 언급된 바와 같이 화학식 R1 2N(CH2)4CHNHCO-의 치환된 또는 비치환된 리실잔기이고,
각 R1은 독립적으로 H, 알킬(1-6C)이거나 또는 최대한 R1이 R2-C=NR3이고,
상기 식에서 R2는 H, 알킬(1-6C), 또는 치환되거나 비치환된 페닐 또는 벤질잔기, 또는 NR4 2이고, 상기 식에서 각 R4는 독립적으로 H 또는 알킬(1-6C)이고,
R3은 H, 알킬(1-6C), 페닐 또는 벤질이거나, 또는
R2-C=NR3는
으로 이루어지는 군으로부터 선택된 한 라디칼이며;
상기 식에서 m은 2 또는 3이 정수이고 각 R5는 독립적으로 H 또는 알킬(1-6C)이며;
그리고 상기에서 O나 S가 다른 헤테로인자에 인접해 있지 않는다면, 1개 또는 2개의 (CH2)는 O 또는 S에 의해 대치될 수 있으며;
AA1은 작은 중성(극성 또는 비극성) 아미노산이고 n1은 0-3의 한 정수이고;
AA2는 중성, 비극성의 큰(방향족 또는 비방향족) 또는 극성 방향족 아미노산이고 n2는 0-3의 한 정수이고;
AA3은 프롤린 잔기 또는 수식된 프롤린잔기(하기 식에서 정의된 바와 같음)이고 n3은 0-1의 한 정수이고;
AA4는 중성의 작은 아미노산 또는 그의 N-알킬화된 형태이고 n4는 0-3의 정수이고;
X1과 X2의 각각은 독립적으로, 도시된 환형 화합물을 얻기 위해 X1과 X2사이에 결합을 형성할 수 있는 잔기이고; 그리고
Y1과 Y2의 각각은 독립적으로 비간섭적 치환기 또한 없을 수 있으며;
상기 식에서 하나 또는 둘 이상의 펩티드 결합은 선택적으로 -CH2NH-, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-(시스 및 트랜스), -COCH2-, -CH(OH)CH2- 및 -CH2SO-로 구성된 군으로부터 선택된 결합에 의해 대치될 수 있으며;
만약, n3이 0이면;
1) n2와 4의 합은 적어도 2이어야 하고; 또는
2) K*는 Har이나 K 이외의 것이어야 하고; 또는
3) X2는 시스(C), 페니실아민(Pen) 또는 2-아미노-3,3-시클로펜탄메틸렌-3-메르캅토 프로피온산(APmp) 이외의 것이어야 하고; 또는
4) Y1또는 Y2는 적어도 한 아미노산 잔기를 포함해야 하거나; 또는
5) 하나 또는 둘 이상의 펩티드 결합은 상기한 선택적 결합에 의해 대치된다.
본 발명의 다른 양태로는 이들 및 기타 관련 펩티드의 합성과 관련된 재조합 방법 및 물질, 그들의 시험관 내 합성방법, 이들 화합물을 함유하는 제약조성물, 이들 화합물 및 조성물을 사용하여 혈소판 응집 및 혈전형성을 저해하는 방법에 관한 것이다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 부분적으로 정제된 뱀독에 의한 피브로노겐과 GP Ⅱb-Ⅲa와의 결합 저해를 보여준다.
제2도는 피브리노rps/GP Ⅱb-Ⅲa 및 비브로넥틴/비브로넥틴 수용체 분석(assay)에 있어 조(crude)독액의 Centricon-10 초여과액의 사용량에 대응하는 점착 저해를 보여준다.
제3도는 에리스토코피스 막마호니로부터의 조 PAI의 HPLC 프로필을 보여준다. 사선 영역은 생리적 분획물(fractions)을 포함하고 있다.
제4도는 제3도로부터의 PAI 분획물의 HPLC 프로필을 보여준다.
사선영역은 생활성 분획물을 함유한다.
제5도는 제4도로부터의 PAI 분획물의 분석적 HPLC 프로필을 보여준다.
제6도는 에리스티코핀, 바르보우린, 테르게미닌, 세라스틴, 루베린, 라케신, 코티아린, 크로탁트록신, 호리린, 루토신, 비리딘, 몰로신, 바실리신, 두리신, 자라라신, 세레베린 및 오레가닌의 완전한 아미노선서열 및 자동화된 에드만 분해로 구한 효소 소화단편을 보여준다.
제7도는 조 시스트루루스 시. 테르게미누스의 독액의 G-50 분획물로부터 얻어진 PAI의 HPLC 프로필을 나타낸다.
제8도는 제7도로부터의 PAI 분획물의 HPLC 프로필을 나타낸다.
제9도는 몇 가지 수용액 분석에서의 결합 저해에 있어 제8도의 정제된 PAI의 활성을 나타낸다.
제10도는 조 시스트루루스 시. 바브보우리 독액의 G-50 분획물로부터 얻은 혈소판 응집 저해제의 HPLC 프로필을 표시한다.
제11도는 제10도의 활성 PAI 분획물의 HPLC 프로필을 표시한다.
제12도는 다수의 PAI의 아미노산 서열을 바르보우린의 서열과 비교한다.
제13도는 라케시스 무타스 독액으로부터의 조 PAI의 HPLC 프로필을 표시한다. 사선 영역은 생리학적 활성 분획물을 포함한다.
제14도는 제13도로부터의 PAI활성 분획물의 HPLC 프로필을 표시한다.
사선영역은 생리적 활성 분획물을 포함한다.
제15도는 라케시스 무타스로부터 얻은 제14도의 PAI 분획물의 분석적 HPLC 프로필을 표시한다.
제16도는 크로탈루스 비리디스 비리디스 독액으로부터의 조 PAI의 HPLC 프로필을 표시한다. 사선 영역은 생리적 활성 분획물을 포함한다.
제17도는 제16도의 PAI 분획물의 HPLC 프로필을 표시한다.
제18도는 피브리노겐/GP Ⅱb-Ⅲa 결합을 저해하기 위한 정제된 뱀독 펩티드의 사용량에 따른 효과를 에치스타틴과 비교하여 나타낸다.
제19도는 혈소판 농축 혈장(PRP)에 있어 ADP(4μM) 유도된 인간 혈소판 응집을 저해하기 위한 정제된 뱀독 펩티드의 사용량에 따른 효과를 에치스타틴과 비교하여 나타낸다.
제20도는 시. 시. 세라테스 독액의 HPLC 분획물으로부터의 활성도 프로필을 나타낸다.
제21도는 제20도의 활성 분획물의 HPLC 분석 결과를 나타낸다.
제22도는 시. 루베르 루베르로부터의 PAI의 HPLC 프로필의 활성도 프로필을 나타낸다.
제23도는 시. 아트록스로부터 얻은 균질 펩티드에 대한 분석적 C-18 컬럼의 활성도 프로필을 나타낸다.
제24도는 브트롭스 코티아라로부터 단리된 균질 펩티드의 분석적 HPLC 프로필을 나타낸다.
제25도는 피브리노겐의 GP Ⅱb-Ⅲa에의 결합 저해에 대한, 또한 비트로넥틴의 비트로넥틴 수용체에의 결합 저해에 대한 정제된 코티아린의 용량에 따른 효과를 나타낸다.
제26도는 피브리노겐의 GP Ⅱb-Ⅲa에의 결합에 대한 또한, 비트로넥틴의 비트로넥틴 수용체에의 결합에 대한 정제된 뱀독 펩티드의 효과를 표시한다.
제27도는 GP Ⅱb-Ⅲa 및 비트로넥틴 수용체에 대한, 유사체 #1, [E28L41C64]바르보우린(28-73)의 결합 활성의 결과를 나타낸다.
제28도는 합성 에리스티코핀 유사체는 피브리노겐의 GP Ⅱb-Ⅲa에의 결합을 저해할 수 있는 능력이 있으나, 비트로넥틴의 비트로넥틴 수용체에의 결합을 저해하는 능력이 없음을 나타낸다.
제29도는 피브리노겐의 GP Ⅱb-Ⅲa에의 결합을 저해하는 선형 및 환형 RGDW 화합물과 선형 및 환형 KGDW 화합물의 능력을 나타낸다.
제30도는 피브리노겐의 GP Ⅱb-Ⅲa에의 결합을 저해하고 비트로넥틴의 비트로넥틴 수용체에의 결합을 저해하는, 각종 KGDW 유사체의 능력을 나타낸다.
제31도는 M21 흑색종(melanoma) 세포가 비트로넥틴에 점착하는 것을 저해하는, 각종 천연 및 합성 혈소판 응집 저해제의 능력을 나타낸다.
제32도는 M21 흑색종 세포의 비트로넥틴에의 점착을 저해하는 RGDS 및 환형 RGD 화합물의 능력 및 M21 흑색종 세포의 비트로넥틴에의 점착을 저해하는 환형 KGDW 유사체의 능력 부족을 나타난다.
제33도는 혈소판의 응집 및 세포의 비트로넥틴에의 점착을 저해하는 유사체 번호 60, Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH2의 활성도를 나타낸다.
제34도는 유사체 19, Mpr-K-G-D-W-P-C-NH2에 대한 제33도의 활성도를 나타낸다.
제35도는 혈전증의 개방 흉개(open chest dog) 모델(Folts 모델)에 있어 주기적 혈류 감소(CFR)의 개시를 나타낸다.
제36도는 혈전증의 개방 흉개 모델(Folts 모델)에 있어 개시된 CFR에 대한 10mg 볼러스(bolus) 투여의 영향을 나타낸다.
제37도는 혈전증의 개방 흉개 모델(Folts 모델)에 있어 개시된 CFR에 대한 40mg 볼러스 투여의 영향을 나타낸다.
제38도는 바르보우린(1-73)의 아미노 서열을 코드하는 전체 길이 DNA 서열을 나타낸다.
제39도는 PhoA 리더 서열에 연결된[M-1 L41] 바르보우린(1-73)을 코드하는 DNA 서열을 나타낸다.
제40도는 박테리아 내 발현을 위해 PhoA 리더 서열에 연결된 유사체 #1을 코드하는 DNA 서열을 나타낸다.
제41도는 유사체 #1을 코드하는 DNA를 얻기 위한 PCR 반응에 이용되는 올리고뉴 클레오티드를 나타낸다. 유사체 자체에 포함된 아미노산들을 굵은 활자로 표시되어 있다.
제42도는 유사체 #1-코드화 DNA의 탠덤 반복부의 접합(junction) 서열을 나타낸다.
제43도는 탠덤(tandom) 반복부로서의 절단된 바르보우린 유전자의 다이아그램이다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 본 발명의 분석법에 의하여 활성으로 확인되는 뱀독으로부터 단리된 혈소판 응집저해제(PAI) 및 예컨대 고체상 펩티드 합성 등의 표준시험관 내 기술 또는 재조합 방법 또는 이들의 조합적 사용에 의하여 합성되는 유사한 구조의 화합물을 제공한다. 이들 저해제의 일부는 혈소판 응집이 저해작용에 매우 특이적이며 인테그린 패밀리(integrin family) 내의 다른 결합을 저해하지 않는다. 일부는 다른 특이성 범위를 가진다. 이하 단락에서는 뱀독으로부터 자연발생적 PAI의 단리; 예컨대 RGD 대신에 K*GD 서열을 통합시킴으로써 비트로넥틴/비트로넥틴 수용체 상호 작용을 저해하는 것보다 혈소판 응집을 저해하는데 실질적으로 더 강력한 저해제의 디자인; 이들 펩티드의 합성방법; 재조합체 생산방법; 본 발명 펩티드에 대한 항체; PAI를 함유하는 뱀독을 확인할 수 있는 분석방법; 및 본 발명의 PAI의 투여 및 이용에 대하여 기술한다.
PAI는 예컨대 Gan, Z. -R., et al., 및 Huang, T. -F., et al.,(상기)에 의해 기술된 바 있는 표준 분석법에서 자극된 혈소판의 응집을 방지할 수 있는 인자를 의미한다. 이들 분석에 있어서, 세척된 혈소판은 피브리노겐, Ca+2및 시험 물질과 함께 결합된다. 혈소판은 ADP(또는 기타 자극제 또는 이들의 조합)로 자극되고, 예컨대 시판되고 있는 응집 측정기를 이용하여 그 응집 유무를 관찰한다.
본 발명 PAI의 일부는 피브리노겐 및/또는 vWF와 GP Ⅱb-Ⅲa의 결합을 저해하는데 특이적인 것으로 밝혀졌다. 특이성은 정도의 문제이며 따라서 Fg 또는 vWF의 GP Ⅱb-Ⅲa에서 결합을 저해하는데 특이적인 PAI는 Fn의 FnR 또는 Vn의 VnR에의 결합을 저해하는 것보다 실질적으로 더 이 결합을 저해한다. 실질적으로 더란 의미는 저해 %가 일정한 PAI 농도에서 최소한 2배 더 높은 것을 의미하거나 또는 50%의 저해를 일으키는 PAI 농도가 다른 리간드/수용체 결합보다 Fg 또는 vWF/GP Ⅱb-Ⅲa에 대해 최소한 2배 더 낮다는 것을 의미한다.
[단리된 네거티브 PAI 및 정제방법]
본 발명의 혈소판 응집 저해제(PAI)는 활성으로 밝혀진 즉 이하에서 기술되는 본 발명의 발명에 의하여 PAI를 함유하는 것으로 밝혀진 뱀독으로부터 이하에서 기술되는 바와 같이, 단리된 형태로 제조될 수 있는 저분자량 펩티드를 포함한다.
본 발명의 방법은 예컨대 비트로넥틴 수용체 및 피브리노겐 수용체와 같이 다른 인테그린에 대항하여 GP Ⅱb-Ⅲa에의 결합을 선택적으로 저해하는 뱀독에서 효과적인 PAI의 존재를 용이하게 확인하고 특성화하게 한다. 이와 같은 확인 및 특성화에 근거하여 선택적으로 그리고 최적으로 기술분야에 개시되고 본 명세서에 예시된 다양한 표준방법을 이용하여 PAI를 단리 및 정제할 수 있다. 예컨대, 분자량에 근거한 분리법의 조합(전형적으로 10kd의 물질의 회수), 이온 교환 크로마토그래피 및 역상 HPLC가 사용될 수 있다. 또한 다른 기술도 이용될 수 있으나 활성 뱀독으로부터의 PAI에 적용되는 조작공정은 다음과 같다:
약 10 내지 100mg의 독을 묽은 아세트산에 용해하고 Sephadex G-50 등의 사이징(sizing) 컬럼에 적용시키고 동일 용매로 용출한다. 본 발명의 Fg/GP Ⅱb-Ⅲa 결합분석, 표준 혈소판 응집 분석(PAA) 또는 GP Ⅱb-Ⅲa의 점착 단백질 결합 활성에 의존하는 기타 유사한 분석을 이용하여 분획물에 대해 활성을 분석한다. 또한 독의 분획물 중에 10kg의 분획물은 한외여과 및 유사한 분석에 의해 회수될 수 있다.
그 다음 어느 공정에 의하여 단리된 저분자량 분획물을 예비 C-18 HPLC 컬럼 예컨대 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)/8% 아세토니트릴에 예비 평형된 Waters로부터 입수 가능한 C-18 Delta Pak 역상 HPLC 컬럼에 로드시킨다. 그 다음 흡수된 PAI를 0.1% TFA에서 8% 내지 60% 아세토니트릴 구배로 용출시킨다. 구배 및 유속은 종래 공정을 이용하여 최적화한다. PAA 또는 본 발명의 수용체 결합법에 의해 활성 분획물을 측정하였다. 그 다음 활성 분획물을 모으고 농축시키고 분석 HPLC 또는 SDS-PAGE를 이용하여 균질성을 테스트하였다. 회수된 PAI가 균질하게 될 때까지 역상 HPLC 구배 정제를 계속 실시하였다.
상기의 또는 다른 정제 방법에 의하여 얻어질 수 있는 본 발명의 PAI는
으로 구성되는 군으로부터 선택된 독으로부터의 PAI이다.
(barbourin)
로부터 얻어지는 PAI로부터 제조되는 단리된 형태의 PAI 또는 PAI의 아미노산 서열을 가지는 PAI이다.
특히 바람직한 PAI는 Fg 또는 vWF/GP Ⅱb-Ⅲa 결합을 저해하는데 특이적인 PAI 예컨대 Sistrurus m. barbouri로부터 얻어진 PAI이다.
에리스티코핀, 코티아린, 크로타트록신, 세라스틴, 두리신, 호리딘, 루베린, 라체신, 바실리신, 루토신, 몰로신, 오레가닌, 비리딘, 테르게미닌 및 바르보우린 등이 특히 바람직하다.
본 발명의 정제된 PAI는 표준공정에 따라 서열화되어 이어 표준 고체상 기술(특히 PAI의 더 짧은 형태에 대하여) 또는 재조합체 생산법을 이용하여 합성이 가능하게 된다. 예컨대 후앙 등(Huang et al., J Biol Chem(1987) 262:16157-16163)에 기술된 대로 펩티드의 카르복시아미도메틸화 또는 피리딜 에틸화한 다음 0.1% TFA 및 아세토니트릴을 이용하여 C-18 Delta Pak 컬럼 상에서 샘플을 탈염시킨 후 Applied Biosystems Sequenator를 이용한다.
결정된 서열의 단리된 PAI는 시험관 내 합성 시에 활성을 파괴하지 않고 서열 변경에 의해 수식될 수 있는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 이들 수식 형태는 원래 형태와 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 4 아미노산 치환이 다르거나 또는 절단된 형태이다. 또한 하기와 같이 다른 결합으로 하나 또는 그 이상의 펩티드 결합이 대치되어 진다. 특히 바람직한 치환은 하기와 같이 GP Ⅱb-Ⅲa 특이성을 부여하는 K*GD로 RGD를 대치하는 치환이다.
Sistrurus m. barbouri의 PAI는 균질하게 정제하고 서열화하여 바르보우린이라 칭한다. 지금까지 확인된 GP Ⅱb-Ⅲa 기능을 차단하는 뱀독의 펩티드 및 GP Ⅱb-Ⅲa에 대한 점착성 단백질과는 달리 바르보우린은 기술분야에 공지되어 있는 점착성 단백질의 표준 Arg-Gly-Asp 서열을 함유하지 않는다. 바르보우린의 겉보기 결합 서열은 Lys-Gly-Asp-(Trp)이다. 이 펩티드의 겉보기 결합 영역에 KGD 서열의 존재는 RGDX 서열에 근거하여 작은 합성 펩티드에서 Lys를 Arg로 대치하면 이들 펩티드가 인테그린 수용체에 결합하는 능력을 크게 약화시킨다는 관찰 사실로 매우 놀라운 것이다(Pierschbacher et al., Proc Natl Acad Sci(USA) (1984) 81:5985-5988; Williams et al., Thromb Res(1987) 46:457-471); Huang et al., J. Biol Chen (1987) 262:16157-16163). 이 치환은 Fg 및 vWF의 GP Ⅱb-Ⅲa로의 결합 및 그 반대로의 결합 예컨대 비트로넥틴 수용체에 비트로넥틴의 결합을 저해하는 바르보우린 펩티드의 특이성 부분적으로 기여한다고 생각된다.
[K*GDX-함유 펩티드]
본 발명의 방법에 의하여 단리된 바르보우린 펩티드는 공지 기술분야의 PAI 화합물에서 발견되는 RGDX와는 대조적인 결합 서열 KGDX를 가지는 것으로 밝혀졌다. 이 PAI 서열에 LGDX의 존재는 비트로넥틴 또는 피브로넥틴 수용체에 대항하여 GP Ⅱb-Ⅲa에 우선적인 친화성을 가지는 것과 관련이 있는 것 같다. 서열에서 리실잔기를 아르기닌으로 치환하는 효과는 하기에서 자세히 기술되듯이 질소의 보유 염기성에 따라 증가된 측쇄의 길이와 관련이 있는 것 같다. 놀랍게도, 증가된 활성 및 특이성의 원인이 되는 것은 리실 잔기 그 자체가 아니라 대치된 아르기닌의 이와 같은 상동적인 신장에 의하여 제공되는 공간인 것 같다. 따라서, 결합 서열에 K*GDX를 함유하는 본 발명의 펩티드는 비트로넥틴의 비트로넥틴 수용체에의 결합 및 피브로넥틴의 피브로넥틴 수용체에의 결합을 저해하는 능력과 비교하여 Fg 또는 vWF의 GP Ⅱb-Ⅲa에의 결합을 저해하는데 실질적으로 더 강력하다. 상기에서 언급한 바와 같이 바람직한 결합을 저해하는데 실질적으로 더 강력하다는 것은 50% 저해를 나타내는 PAI 농도가 대치 리간드의 다른 인테그린에의 결합에 대해서보다 Fg 또는 vWF의 GP Ⅱb-Ⅲa의 결합에 대하여 최소한 2배 더 낮거나 또는 저해 백분율이 일정 농도의 저해제에서 최소한 2배 더 높다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 K*는 치환되지 않은 리실 잔기 또는 엡실론 아미노기에 수소 치환을 포함하는 리실 잔기를 의미한다. 치환체는 이들이 부착될 질소의 염기성을 유지할 수 있도록 충분한 전자공여성을 가져야 한다. 따라서 K*는 식 R1 2N(CH2)4CHNHCO-의 리실 잔기로 정의된다. 상기 식에서 각 R1은 독립적으로 H, 알킬(1-6) 또는 많아야 하나의 R1은 R2-C-NR3이고 R2는 H, 알킬(1-6C) 또는 치환 또는 비치환 페닐 또는 벤질 잔기 또는 NR4 2이고 여기서 각 R4는 독립적으로 H 또는 알킬(1-6C)이고 그리고 R3은 H, 알킬(1-6C), 페닐 또는 벤질이고 또는 R2-C=NR3는
로 구성되는 군으로부터 선택되는 라디칼이고 상기에서 m은 2 내지 3의 정수이고 각 R5는 독립적으로 H 또는 알킬(1-6C)이고 그리고 상기에서 하나 또는 둘의 (CH2)는 O 또는 S가 다른 헤테로원자와 인접하지 않는다면, O 또는 S로 대치될 수 있다.
알킬은 메틸, 에틸, 이소프로필, N-헥실, 2-메틸부틸, 시클로헥실 등과 같은 지시된 수의 탄소원자의 직쇄 또는 분지쇄 또는 환형 히드로카르빌 잔기로 종래와 같이 정의된다.
또한 하나 또는 그 이상의 펩티드 결합은 축소 또는 제거에 의해 얻어진 치환 결합에 의하여 선택적으로 대치될 수 있다. 따라서, -CONH- 펩티드 결합의 하나 또는 그 이상은 공지 기술의 방법에 의하여 -CH2NH-, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-(시스 및 트랜스), -COCH2-, -CH(OH)CH2- 및 -CH2SO 등의 다른 결합 유형으로 대치될 수 있다. 이하 제시된 참고 문헌에서는 이들 선택적 결합부를 포함하는 펩티드 유사체의 제조에 대하여 기술하고 있다; Spatola, A. F., Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3, Peptide Backbone Modifications (개론); Sparola, A. F. in
특히 -CH2NH-가 바람직하다.
자연 발생적 뱀독 PAI의 단편 및/또는 수식 형태의 예는 서열:
의 [E28, L41, C64]바르보우린(28-73) 및
R2로 표시되는 벤질 및 페닐 잔기는 비방해 치환체로 치환되거나 또는 되지 않을 수도 있다. 바람직한 치환 패턴은 단지 하나의 치환체만이 방향족 핵, 바람직하게는 4-위치에 결합하는 패턴이다. 바람직한 치환체는 알킬, 특히 에틸 또는 메틸, 또는 페닐 등의 전자공여 치환체이다.
K*의 바람직한 구체예는 리신, 호모아르기닌, 포르밀호모아르기닌, 오르니틴, 아세티미딜 리신, NGNG에틸렌-호모아르기니 및 페닐이미딜 리신 등이 있다. 페닐이미딜 리신 잔기는 예컨대 식 pH-C(=NH)-NH(CH2)4CH(NH-)CO-를 가진다.
결합의 우선적 저해작용은 근본적 특성은 RGDX의 R을 K*로 치환하는데 있기 때문에 본 발명의 펩티드 또는 펩티드-관련 화합물의 군은 결합 서열에서 결합 서열에 R을 K*로 치환함으로서 수식된 GDDX를 정상적으로 함유하는 자연발생적 혈소판 응집저해제로 구성된다. 본 발명에는 치환을 가지는 점착성 단백질의 GP Ⅱb-Ⅲa에의 결합을 선택적으로 저해하는데 유효한 충분한 길이의 단편 및 이 활성을 파괴하지 않는 펩티드의 위치에 부적절한 치환을 가지는 전-길이 펩티드 또는 단편뿐만 아니라 이 치환을 가지는 원 펩티드들도 포함된다. 대부분 단편은 그 구조가 예컨대 환형화 등에 의해 조절된다면 적어도 7 아미노산의 펩티드 사슬 길이에 대응되는 잔기를 함유할 것이며 이와 같은 구조적 조절이 없다면 더 큰 길이의 단편일 수 있다. 일반적으로 K*GDX 요구 서열은 별도로 하고 펩티드의 비 K*GDX 부분에 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 4, 더욱 바람직하게는 1 내지 3의 아미노산 4치환이 있을 수 있다.
부기적으로, RGDX 또는 K*GDX의 G는 사르코닌 잔기에 의해 대치될 수 있다.
서열:
의 [K29]에르스틴코핀(4-51)을 포함한다.
이 표기에서 단편의 크기는 단편에 포함된 아미노산의 숫자로 이름 뒤의 괄호 안에 표시되어 있으며 괄호 안의 접두문자 및 숫자는 원래의 전-길이 펩티드에서 숫자 위치의 아미노산 치환을 나타낸다. 따라서 상기 바르보우린 단편에 대하여 단편의 길이는 원래 서열을 포함하는 28 내지 73 잔기에 뻗어 있으며 원래 서열의 숫자 위치의 28, 41 및 64 위치의 본래의 아미노산은 각각 Glu(E), Lue(L) 및 Cys(C)로 대치된다.
다른 예로서 트리그라민, 엘레간틴, 알보라브린, 크로타르록신, 플라보비리딘, 에치스타틴, 비티스타틴, 비리딘, 몰로신, 루토신, 바실리신, 아플라긴, 할리신, 호리딘, 테르게미닌, 라체신, 코티아린, 세레베린, 야라라신, 키스트린, 에리스티코핀, 비탄-에이 및 루베린/오레가닌에서 나타나는 RGD 서열의 아르기닌은 K*잔기로 대치되어 GP Ⅱb-Ⅲa에 대한 우선적인 친화성을 활성 PAI에 특이적으로 제공할 수 있다. 또한 적어도 20, 바람직하게는 적어도 30, 더욱 바람직하게는 적어도 40 아미노산을 함유하는 짧은 형태의 이들 펩티드도 원 펩티드 또는 이들 수식된 형태로부터 제조될 수 있다. 또한, 선택적으로, RGD/K*GD 서열에 부적절한 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 4, 아미노산이 바람직하게는 보존적 아미노산 치환으로 수식 또는 치환될 수 있다. 예컨대 보존적 아미노산 치환은 하기에서 자세히 기술되는 바와 같이, 산성 아미노산 잔기에 대해 산성 아미노산 잔기, 중성에 대해 중성, 염기성에 대해 염기성 잔기의 치환을 의미한다.
RGD 또는 K*GD의 글리실잔기가 활성을 유지하면서 사르코닐 잔기로 대치될 수 있는 또 다른 그룹의 예도 있다. 따라서, 상기와 같이 다른 방식으로 수식 및/또는 단리된 활성 PAI는 이 치환으로 더 수식될 수 있다.
뱀독으로부터의 단편 및/또는 수식된 PAI는 RGD를 K*GD로 대치함으로써 본 발명 Fg/vWF/GP Ⅱb-Ⅲa 결합-특이적 화합물 중에 포함되는 반면, 본 발명의 다른 구체예에서 특히 활성 펩티드는 K*GD 서열 그 자체의 화합 가능한 신장에 기초한다. 이 점에서, 본 발명의 펩티드 또는 펩티드-관련 화합물의 바람직한 그룹은 일반식:
상기에서 K*는 상기에서 정의된 바와 같은 치환 또는 비치환 리실이고;
AA1은 작은 중성(극성 또는 비극성) 아미노산이고 n1은 0 내지 3의 정수이고;
AA2는 중성, 비극성의 큰(방향족 또는 비방향족) 또는 극성 방향족 아미노산이고 n2는 0 내지 3의 정수이고;
AA3은 프롤린 잔기 또는 수식된 프롤린 잔기(이하에서 정의됨)이고 n3은 0 내지 1의 정수이고;
AA4는 중성의 작은 아미노산 또는 그것의 N-알킬화 형태이고 n4는 0 내지 3의 정수이고;
X1및 X2각각은 독립적으로 도시된 바와 같이 환형 화합물을 얻기 위한 X1및 X2사이의 결합을 형성할 수 있는 잔기이고; 및
하나 또는 그 이상의 펩티드 결합은 -CH2NH-, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-(시스 및 트랜스), -COCH2-, -CH(OH)CH2- 및 -CH2SO-로 구성되는 군으로부터 선택되는 결합으로 선택적으로 대치된다. 단, n3이 0이면
1) n2와 n4의 합은 최소한 2이어야 하고 또는
2) K*는 Har 또는 K가 아니어야 하고 또는
3) X2는 Cys(C), 페니실아민(Pen), 또는 2-아미노-3,3-시클로펜탄메틸렌-3-메르캅토프로피온산(APmp)과 다른 것이어야 하고 또는
4) Y1또는 Y2는 적어도 하나의 아미노실 잔기로 구성되고 또는
5) 하나 또는 그 이상의 펩티드 결합은 상기의 다른 결합으로 대치된다.
Y1및 Y2는 0 내지 25 아미노산 잔기의 펩티드 신장일 수 있으며 유도된 형태일 수 있다. 예컨대 Y1N-말단 신장은 아세틸화되거나 또는 그렇지 않으면 아실화된다; Y2C-말단 신장은 NH2또는 식 R-NH2또는 R2NH의 1차 또는 2차 아민으로 아미드화된다. 여기서 각 R은 독립적으로 메틸, n-부틸 또는 t-부틸 등의 1 내지 4C의 저급 알킬이다. 또한 Y1은 (H) 또는 아실일 수 있고 Y2는 (OH), NH2 또는 상기의 아민일 수 있다. 식 (1)의 화합물이 단순 환형 펩티드일 경우 Y1및 Y2는 존재하지 않는다.
X1및 X2는 전형적으로 예컨대 가장 바람직하게는 이황화 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기 등의 환형화 가능한 아미노산 잔기이다. 그러나 이황화 또는 기타 결합을 형성할 수 있는 기타 잔기 예컨대 Pen(페니실아민) 잔기(Pierschbacher et al., supra) 및 Mpr(메르캅토프로피오닐) 또는 Mvl(메르캅토발레릴) 잔기들도 사용된다. 추측되는 환형화를 위한 공유 결합의 기타 유형은 펩티드 결합 예컨대 아스파틸 잔기의 측쇄 카르복실과 트레오닌 잔기의 측쇄 알코올 사이에 형성되는 것과 같은 에스테르 결합 및 글루타밀 잔기의 측쇄 카르복실기와 리실잔기의 측쇄 아미노기 사이에 형성된 아미드 등이 포함된다. 사슬의 잔류부와 펩티드 결합(또는 상기의 수식된 펩티드 결합)을 형성할 수 있고 환형화에 영향을 미치는 공유 결합형성이 가능한 잔기가 사용될 수 있다. 예컨대 펩티드 결합이 N-말단의 NH2와 C-말단의 COOH 사이에 직접 형성되는 단순 환형 펩티드 등이 이에 속한다.
상기한 바와 같이, 하나 또는 그 이상의 지시된 펩티드 결합은 -CH2NH-, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-(시스 및 트랜스), -COCH2-, -CH(OH)CH2- 및 -CH2SO- 등의 치환 결합으로 대치될 수 있다.
상기 아미노산 잔기 AA1-AA4의 지명에 있어서는, 아미노산 잔기가 일반적으로 4개의 주요 하부류로 분류되는 분류 방법에 기초하여 기술하였다. 또한 이 분류는 이하에서 도식으로 제시된다.
산성; 본 잔기는 생리학적 pH에서 H 이온을 상실하여 음전하를 띠며 이 잔기는 생리학적 pH의 수용액 배지에 펩티드가 존재할 때 잔기가 포함되는 펩티드 구조의 표면 위치를 포착(seek)하도록 수용액으로 이끌려진다.
염기성; 이 잔기는 생리학적 pH에서 H 이온과 연관되어 양전하를 띠며 이 잔기는 생리학적 pH의 수용액 배지에 펩티드가 존재할 때 잔기가 포함되는 펩티드 구조의 표면위치를 포착하도록 수용액으로 이끌려진다.
중성/비극성; 이 잔기는 생리학적 pH에서 전하를 띠지 않으며 이 잔기는 펩티드가 수용액 배지에 존재할 때 잔기가 포함되는 펩티드 구조의 내부위치를 포착하도록 수용액으로부터 반발된다. 또한 이들 잔기는 이하에서 소수성으로 일컬어진다.
중성/극성; 이 잔기는 생리학적 pH에서 전하를 띠지 않으나 이 잔기는 펩티드가 수용액 배지에 존재할 때 잔기가 포함되는 펩티드 구조의 일부 위치를 포착하도록 수용액으로 이끌려진다.
물론 개개 잔기 분자의 통계학적 모임에서 일부 분자는 전하를 띨 것이며 일부는 띠지 않을 것이며 수용배지에서 더 큰 또는 더 작은 정도의 반발력 또는 인력이 있을 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 전하를 띤의 의미를 갖기 위해서는 상당한 백분율의 개개 분자(적어도 약 25%)가 생리학적 pH에서 전하를 띠어야 한다. 극성 또는 비극성으로 분류하기 위해 요구되는 인력 또는 척력의 정도는 임의적이며 따라서 본 발명에 의하여 특이적으로 심사 숙고되는 아미노산은 하나 또는 다른 것으로서 특이적으로 분류된다. 특이적으로 명명되지 않은 대부분의 아미노산은 공지 방식에 따라 분류된다.
또한 아미노산 잔기는 잔기의 측쇄 치환기에 대하여 설명을 필요로 하지 않는 분류로서 환형 또는 비환형 또는 비방향족 및 작은 또는 큰 잔기로서 하부 분류된다. 잔기는 카르복실 탄소를 포함하여 총 4 탄소원자 또는 그 이하의 탄소원자를 함유하면 작은 잔기로 취급된다. 물론 작은 잔기는 항상 비방향족이다.
자연 발생적인 단백질 아미노산에 대하여 상기 분류에 따른 서브 분류는 다음과 같다(하기 도식 참조):
산성 잔기; 아스파트산 및 글루탐산;
염기성/비환형 잔기; 아르기닌, 리신;
염기성/환형 잔기; 히스티틴;
중성/극성/작은 잔기; 글리신, 세린 및 시스테인;
중성/극성/비방향족/큰 잔기; 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민;
중성/극성/방향족/큰 잔기; 티로신;
중성/비극성/작은 잔기; 알라닌;
중성/비극성/비방향족/큰 잔기; 발린, 이소루신, 루신, 메티오닌;
중성/비극성/방향족/큰 잔기; 페닐알라닌 및 트립토판.
유전자-코드된 아미노산 프롤린은 기술적으로는 중성/비극성/환형/비방향족/큰 잔기 그룹에 속하지만 펩티드 사슬의 2차 구조에 미치는 밝혀진 효과 때문에 특별한 경우에 해당하며 따라서 이 분류 그룹에 포함되지 않고 별도로 분류된다. AA3은 프롤린 잔기 또는 수식된 프롤린 잔기로 지정된다.
아는 바와 같이 프롤린은 2-위치에 카르복실기를 가지는 5-원소 질소복소환식 분자이다. 수식된 프롤린 잔기는 질소에서 α위치에 카르복실기를 가지는 5 또는 6-원소 모두 질소인 복소환식 분자이다. 또한 부가적인 복소환식 원자도 고리에 포함된다. 따라서 수식된 프롤린 잔기는 피페콜산(2-카르복시피페리딘, Pip) 및 티아졸리딘(Thz) 잔기를 포함한다. 따라서 프롤린 또는 수식 프롤린 잔기는 식:
이다.
상기 식에서 메틸렌기의 하나 또는 둘은 NR, S 또는 O로 대체될 수 있으며 고리질소는 알킬 등의 비방해 치환체로 치환될 수 있다.
유전 코드로 코드되지 않은 흔히 직면하는 아미노산들로는 예컨대 베타-알라닌(beta-ala), 또는 3-아미노 프로피온산, 4-아미노 부틸산 등의 기타 오메가-아미노산, 알파-아미노이소부티르산(Aib), 사르코신(Sar), 오르니틴(Orn), 시트룰린(Cit), 호모아르기닌(Har), t-부틸알라닌(t-BuA), t-부틸글리신(t-BuG), B-메틸이소루신(N-MeIle), 페닐글리신(Phg) 및 시클로헥실알라닌(Cha), 노르루신(Nle), 시스테이산(Cya); 피페콜산(Pip), 티아졸리딘(Thz), 2-나프틸 알라닌(2-Nal) 및 메티오닌 술폭시드(MSO) 등이 있다. 또한 이들은 특정 카테고리에 용이하게 포함된다.
상기 정의에 기준하여,
Sar 및 베타-ala는 중성/비극성/작은 잔기이고; t-BuA, t-BuG, N-MeIle, Nle 및 Cha는 중성/비극성/비방향족/큰 잔기이고;
Cya는 산성 잔기이고;
Cit, 아세틸 Lys, 및 MSO는 중성/극성/비방향족/큰 잔기이고;
2-Nal 및 Phg는 중성/비극성/방향족/큰 잔기이고
Pip 및 Thz는 수정된 프롤린 잔기이다.
상기한 바를 이하 도식적으로 나타낸다.
[아미노산 분류도]
산성; Glu(E), Asp(D); 시스테인산(Cya)
각종 오메가-아미노산은 중성/비극성/소형(베타-ala, 즉 3-아미노프로피온산, 4-아미노부티르산) 또는 대형(기타 모두)으로 크기에 따라 분류된다.
유전자에서 코드화된 것에 대한 아미노산 치환체들도 본 발명의 범위 내에서 펩티드 화합물에 포함될 수 있고 이 개략도 내에 분류될 수 있다.
본 발명의 선택된 특정한 구체예를 나타내는 식에서, 아미노- 및 카르복시-말단기는, 흔히 구체적으로 나타내지는 않지만 달리 명시하지 않으면 생리학적 pH 값에서 그것들이 취하는 형태로 있다고 이해된다. 따라서, 생리학적 pH에서 N-말단 H+ 2와 C-말단-O-는 반드시 명시되고 나타내어지지는 않지만 구체예 또는 일반식에서 주어진다고 이해된다. 물론 비생리학적 pH 값에서 생성되는 것들을 포함하여 염기성 및 산성부가염도 본 발명의 화합물에 포함된다. 달리 언급하지 않으면, 잔기는 L- 형태이고; 일반식에서 구체화된 잔기는 L- 또는 D-일 수 있다. 일반적으로 본 발명의 펩티드는 0, 1 또는 2개의 D- 잔기를 포함하고 바람직하게는 0 또는 1, 가장 바람직하게는 0이다. 도시된 펩티드에서, 적절한 곳에서 각 코드화되는 잔기는 하기의 종래 리스트와 일치하여 아미노산의 속칭에 따라 단일문자로 나타내어진다:
유전적으로 코드화되지 않은 아미노산은 상기한 것처럼 약기한다.
본 출원에 나타낸 특정한 펩티드에서 광학적 이성질체를 가진 아미노산 잔기의 L- 형태는 달리 표시하지 않으면 칼표 어깨글자(†)로 나타낸다. 본 발명 펩티드의 잔기는 천연 L광학이성질체 형태이지만 하나 또는 둘, 바람직하게는 하나의 아미노산은 광학적 이성질체 D 형태로 치환될 수 있다.
카르복시- 또는 아미노-말단에 있는 것들을 포함하여 자유작용기는 예컨대 활성에는 영향을 미치지 않고서 화합물의 용해도를 변경시킬 수 있는 아미드화, 아실화 또는 기타 치환으로 변성될 수 있다. 본 발명의 아미드화펩티드를 생성하는데 있어서, 유사화합물은 예컨대 Boc-AAx-pMBHA-수지 또는 Boc-AAx-pBHA-수지를 사용하여 직접적으로 합성할 수 있다. 상기 식에서 AAx는 이하 상세히 기재하는 것처럼 바람직한 펩티드의 선택된 카르복시-말단 아미노산이다. 달리, 본 발명의 펩티드는 본 분야공지인 방법을 사용하여 펩티드 합성에 후속하여 화학적으로 또는 효소적으로 아미드화하거나 표준용액-상 펩티드 프로토콜로 제조될 수 있다.
본 발명의 새로운 펩티드의 몇몇 구체예가 바람직하다. K*(G/Sar) D 서열에서 G/Sar은 바람직하게는 G이다. AA1과 AA4는 바람직하게는 Gly, Ala 또는 Ser이고; n1은 바람직하게는 0-2이고, n4는 바람직하게는 1-2이다. AA2에 대해 바람직한 것은 중성/비극성/방향족 아미노산이고, 특히 트립토판과 페닐알라닌, 특히 트립토판이고, n2는 바람직하게는 1이다. X1과 X2는 바람직하게는 Cys, Mpr 또는 Pen(페니실아민)잔기이다. Y1은 바람직하게는 H, 아세틸 또는 Gly이고; Y2는 바람직하게는 -NH2또는 -H-NH2이다. 또한 일반적으로 바람직한 것은 Y2의 C- 말단이 아미드화된 형태이다.
따라서 본 발명의 PAI 유사체의 바람직한 구체예는 하기 식의 펩티드가 포함된다. 이들 모두가 이황화물 결합의 형성을 통해 환형으로 제공될 수 있지만 이들 결합은 구체적으로 나타나 있지 않다; 기타 환형은 cyclo로 나타내어진다.
특이한 혈소판 응집저해제로서 기타 다음과 같은 것이 있다:
[본 발명 펩티드의 화학적 합성]
본 발명의 범위 내의 화합물은 예컨대 고체상-펩티드 합성과 같이 본 분야공지인 방법으로 화학적으로 합성할 수 있다. 합성은 알파-아미노 보호된 아미노산을 사용하여 펩티드의 카르복시- 말단 단부로부터 개시된다. t-부틸옥시카르보닐(Boc) 보호기는, 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc) 따위의 기타 보호기도 적당하지만, 모든 아미노기에 대해 사용할 수 있다. 예컨대 Boc-Gly-OH, Boc-Ala-OH, Boc-His(Tos)-OH(즉, 선택된 카르복시- 말단 아미노산)은 클로로메틸화 폴리스티렌수지 지지체, P-메틸벤즈히드릴아민(pMBHA) 또는 PAM 수지로 에스테르화될 수 있다.
폴리스티렌수지 지지체는 바람직하게는 폴리스티렌 중합체가 몇몇 유기용매에 완전히 불용성이 되도록 하는, 가교결합제로서의 디비닐벤젠 약 0.5 내지 2%와의 스티렌의 공중합체가 바람직하다(Stewart, et al., Solid-Phase Peptide Synthesis (1969) W. H. Freeman Co., San Francisco and Merrifield, J Am Chem Soc 85 (9163) 2149-2154 참조). 펩티드 합성의 이들 및 기타 방법은 미합중국 특허 제3,862,925호, 제3,842,067호 제3,972,859호 및 제4,105,602호에 예시되어 있다.
합성은 수동합성방법을 사용하거나 제조업자가 제공한 지시매뉴얼에 제공된 지시에 따라 예를 들면 Applied Biosystems 430A 또는 431A 펩티드 합성기(Foster City, California)를 사용하여 자동으로 할 수 있다. 수지로부터 펩티드를 절단하는 것은 Lu, G. -S., 등이 기재한 저-고 HF탈보호 프로토콜(Int J Peptide Protein Res (1987) 29:545-557)을 사용하여 행할 수 있다. 뱀독 PAI의 유사체를 다시 접는(refolding) 것은 가스키 브이. 등이 약술한, 에키스타틴의 고체상 합성을 기술하고 있는 방법(Garsky, V., et al., Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:4022-4026)을 사용하여 행할 수 있다.
이황화물 결합이 없는 본 발명의 환형 펩티드는 너트의 미합중국 특허 제4,612,366호에 약술된 일반적인 방법을 사용하여 용액에서의 환형 고리구조의 형성과 고체상 합성을 조합하여 용이하게 제조할 수 있다. 따라서 표준 메리필드 수지에 제조된 선형 펩티드는 히드라진으로 수지로부터 절단한 다음 대응 아지드를 고리화하여 환형 펩티드를 형성할 수 있다.
펩티드 합성분야의 전문가들은 본 유사체 화합물의 합성과정 동안 본 발명의 개시에 따라 구성된 중간물질이 그것 자체가 신규하고 유용한 화합물이며 따라서 본 발명의 범위 내에 든다는 것을 용이하게 알 수 있을 것이다.
[재조합체 생산]
달리, 본 발명의 선택된 화합물은 공지의 방법에 따라 제조된 재조합체 DNA구조물의 발현으로 생산할 수 있다. 그러한 생산은 그러한 화합물의 다른 구체예 또는 다량을 제공하는데 바람직할 수 있다. 펩티드 서열은 비교적 짧기 때문에 재조합체 생산이 촉진된다; 그러나 재조합체 방법에 의한 생산은 적어도 8개의 아미노산 잔기의 펩티드를 위한 표준고체상 펩티드 합성에 대해 특히 바람직하다.
서열화된 PAI를 코드화하는 DNA는 시중 구입할 수 있는 핵산 합성방법을 사용하여 바람직하게 제조된다. 재조합체 숙주에서 PAI를 생산하기 위한 발현계를 구성하는 방법 또한 본 분야공지이다.
발현은 원핵생물 또는 진핵생물 숙주에서 행할 수 있다. 가장 흔하게는 원핵생물은 E. coli의 각종 균주로 나타내어진다. 그러나 기타 미생물균주도 사용될 수 있는데, 바실루스, 예컨대 Bacillus Subtilis, 각종의 Pseudomanas 또는 기타 박테리아균주이다. 그러한 원핵생물계에서 숙주와 양립할 수 있는 종으로부터 유래하는 제어서열과 복제 부위를 포함하는 플라스미드 벡터가 사용된다. 예컨대 E. coli에 대한 주된 작용벡터(workhorse vector)는 pBR322와 그 유도체이다. 전사개시를 위한 프로모터를 함유한, 리보소옴 결합부위 서열과 함께 오퍼레이터를 선택적으로 갖는, 흔히 사용되는 원핵생물 제어서열은 베타- 락타아제(페니실리나제)와 락토스(lac) 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템 및 람다-유도 PL 프로모터와 같은 흔히 사용되는 프로모터와 N-유전자 리보소옴 결합부위를 포함한다. 그러나 원핵생물과 양립할 수 있는 어떤 이용 가능한 프로모터 시스템도 사용될 수 있다.
원핵생물숙주에서 유용한 발현계는 적당한 원핵생물유전자로부터 유래하는 프로모터로 이루어진다. 예컨대 효모에 유용한 프로모터 계열은 당분해효소의 합성프로모터 예컨대 3-포스포글라세레이트 키나제 프로모터를 포함한다. 기타 효모 프로모터로는 YEp13으로부터 얻은 Leu2 유전자 또는 엔돌라제 유전자로부터의 것들이 있다.
적당한 포유동물 프로모터로는 SV40으로부터의 초기 및 후기 프로모터 또는 폴리오마, 아데노바이러스Ⅱ, 소의 파필로마 바이러스 또는 새의 사르코마 바이러스로부터 유래한 것과 같은 기타 바이러스성 프로모터가 있다. 적당한 바이러스 및 포유동물 인핸서는 위에 언급되어 있다. 식물세포가 발현계로 사용되는 경우 예를 들면 노팔린합성 프로모터가 적당하다.
발현계는 공지의 제한 및 연결방법을 사용하여 구성되고 적당한 숙주로 형질전환된다. 형질전환은 그러한 세포에 적당한 표준방법을 사용하여 행해진다. 발현계를 함유한 세포는 PAI의 생산제 적당한 조건하에서 배양되고 PAI는 회수되어 정제된다.
[항체]
본 발명의 정제된 PAI를 이용하면 이들 활성 펩티드 형태와 특이적으로 면역 반응하게 되는 항체를 생산할 수 있다. 뱀독으로부터 분리되거나 그렇지 않으면 합성된 정제 PAI를 함유한 조성물은 PAI 펩티드와 면역 반응하는 항체의 생산을 자극하는데 사용될 수 있다. 토끼, 쥐, 마우스, 양 및 닭과 같은 각종 척추동물에 PAI를 투여하는 것을 포함하는 표준면역 프로토콜은 정제된 펩티드와 면역 반응하는 항혈청을 생성한다. 면역원성을 향상시키기 위하여, 적당한 혈청알부민 또는 키홀 림펫(keyhole limpet) 헤모시아닌 따위의 적당한 항원적으로 중성인 담체에 단리하게 접합될 수 있다. 또한 단리 펩티드는 접합에 대한 다른 방도로서 메틸화된 BSA로 주입될 수 있다. 또한 면역된 포유동물의 항체-분비세포는 영구 분열되어 이후에 PAI와의 반응성에 대해 스크리닝될 수 있는 단일 클론성항체 패널을 생성할 수 있다. 결과의 다중 클론성 또는 단일 클론성 항체제제는 표준 면역분석 방법을 사용하여 생물학적 샘플에서 대응 FAI의 수준을 분석하는데 유용하다.
[본 발명 분석]
공지의 특이성을 가진 활성 PAI를 함유한 뱀독 출발물질의 확인은 본 발명의 분석으로 가능하다. 분석은 GP Ⅱb-Ⅲa 착체에 대한 피브리노겐의 시험관 내 결합을 차단하는 화합물이 또한 사람 혈소판의 트롬빈 또는 ADP-유도응집과 혈소판-트롬빈의 체내 형성을 저해할 수 있다는 관찰에 기초한다. 이러한 관찰은 피브리노겐-GP Ⅱb-Ⅲa 상호작용을 방해시키는 시험물질의 능력을 평가함으로써 강력한 PAI를 얻기 위한 기초를 제공한다.
분석에 있어서, 예를 들면 여기에 참고로 통합된 피츠제럴드 L. A. 등이 기재한 것처럼(Anal Biochem (1985) 151:169-177) 정제된 형태로 제조된 GP Ⅱb-Ⅲa는 비이드 시험관 또는 미세적정기 플레이트 따위의 고체지지체 상에 피복된다. 그런 다음 피복된 지지체를 피브리노겐 및 시험물질과 접하게 한 다음 충분한 시간 동안 배양하여 피브리노겐이 고정된 GP Ⅱb-Ⅲa에 최대로 결합되도록 한다. 피브리노겐은 주로 약 5-50nM의 농도로 제공되고 필요로 한다면 시험물질은 연속적으로 희석하여 첨가될 수 있다. 전형적인 배양은 35℃에서 2-4시간 동안이고 시간과 온도는 상호 의존적이다.
배양 후 피브리노겐과 시험물질을 함유한 용액을 제거하고 피브리노겐의 결합수준을 GP Ⅱb-Ⅲa에 결합된 피브리노겐을 정량화하여 측정하였다. 어떤 적당한 검출수단도 사용할 수 있지만 예를 들어 방사성, 형광 또는 비오티닐화 표지를 사용하여 표지화된 피브리노겐을 사용하는 것이 편리하다.
그러한 방법은 공지이며, 여기서 부연할 필요가 없다.
결과에 대한 평가는 시험물질이 없다는 것을 제외하고는 시험샘플과 동일한 대조샘플을 사용하여 할 수 있다. 이 경우에 저해백분율은 기준을 나타내는 것으로서 대조군에서 결합된 Fg의 양을 사용하여 계산할 수 있다. 따라서,
IC50따위의 기타 저해 효능 척도도 사용할 수 있다.
본 발명의 분석 시스템은 Fg를 다른 점착단백질로 GP Ⅱb-Ⅲa를 다른 수용체로 치환하는 것을 제외하고는 상기와 동일한 저해분석을 결합하여 PAI 특이성을 특정화하는 것이 더 포함된다. 특히 비트로넥틴 수용체에 대한 비트로넥틴의 결합; 피브로넥틴 수용체에 대한 피브로넥틴의 결합; GP Ⅱb-Ⅲa의 대한 피브로넥틴의 결합 및 GP Ⅱb-Ⅲa에 대한 피브리노겐 및/또는 vWF 결합의 저해도 분석할 수 있다. 이들 분석을 위한 점착단백질과 수용체는 본 분야에서 입수 가능하다.
[기타 분석]
본 발명의 플레이트 분석 외에 상기한 것처럼 혈소판응집 저해활성 및 관련활성에 대한 기타분석도 이용할 수 있다. 요약하면 흔히 사용되는 분석의 리스트는 다음과 같다:
1. 전술한 단락에 기재된 특정한 수용체를 사용하는 플레이트 분석;
2. 상기하거나 여기에 참고로 통합된 Gann, Z. -R., et al., J Biol Chem (1988) 263; 19827-19832; Juang, T. F., et al., J Biol Chem (1987) 262:16157-16163; Biochemistry (1989) 28:661-666에 기재된 것처럼 혈소판 응집에 직접 작용되는 표준분석;
3. 이하 실시예 1에 기재되고 폴츠(Folts, J. D., et al., Circulation (1976) 54:365)에 의해 기재된 것처럼 개에서의 생체내 혈전증 모델
4. 이하 실시예 19에서 기재한 것처럼 S35메티오닌-표지 세포를 사용한 세포점착에 대한 효과.
[투여 및 이용]
본 발명의 PAI는 혈전생성을 방지하는데 치료학적으로 유용하다. 그러한 치료에 적당한 징후는 제한되는 것은 아니나, 아테로마성 동맥경화증과 동맥경화증, 급성 심근경색, 만성불안정 협심증, 일시적인 허혈발병 및 발작, 말초혈관질환, 동맥혈전증, 자간전증, 색전증, 레스테노시스(restenosis) 및/또는 혈관형성술, 경동맥 혈관내막 절제술, 혈관조직이식의 문합술 및 만성심장혈관장치(예컨대 내재 카테테르 또는 측로 체외순환장치)에 따른 혈전증이 포함된다. 이들 증후군은 혈관벽에서의 혈소판 활성화로 개시된다고 생각되는 각종 협착성 및 폐색성 혈관장해를 나타낸다.
PAI는 불안전한 협심증과 동맥폐색 또는 혈전증에서의 동맥혈전생성의 방지 또는 부전뿐만 아니라 심근경색(MI)과 MI 후의 벽혈전생성을 방지하는데도 사용될 수 있다. 뇌관련 장해에 있어서, 일시적인 허혈발병의 치료 또는 예방 및 혈전발작 또는 발작 전단계의 치료가 포함된다.
PAI는 신장투석, 심폐측관, 혈관류 및 혈장반출법을 개선시키는 것을 포함하여 체외순환에서의 소모(consumption), 색전 또는 혈소판 응집을 방지하는데 사용될 수 있다.
PAI는 혈관내 장치와 관련된 소모 또는 색전 또는 혈소판 응집을 방지하여 대동맥내 벌룬펌프, 실보조장치 및 동맥 카테테르의 유용성을 향상시킨다.
PAI는 또한 심부정맥혈전, IVC, 신정맥 도는 문정맥 혈전 및 폐정맥 혈전과 같은 정맥혈전의 치료 또는 예방에 유용하다.
혈전 혈소판감소 자반병과 같은 혈소판 소모를 포함하여 각종 장해도 치료할 수 있다.
또한 본 발명의 PAI는 혈소판 응집저해가 필요한 다수의 비치료적인 적용에도 이용할 수 있다. 예컨대 충분한 양의 펩티드를 첨가함으로써 개선된 혈소판 및 전체 혈액 저장을 이룰 수 있는데 그 양은 계획된 저장시간, 저장조건, 저장물질의 궁극적인 이용 등에 따라 달라진다.
PAI 투여량은 원하는 효과와 치료적 세팅에 따라 광범위해질 수 있다. 주로 투여량은 약 0.01 내지 10mg/kg체중, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1mg/kg체중이다.
투여는 1주일 동안 또는 1개월 또는 2개월 이상 동안 매일 정맥내 투여와 같이 비경구투여가 바람직하고 펩티드의 크기에 따라 달라질 수 있다. 펩티드가 충분히 작으면(예컨대 약 8-10개의 아미노산잔기 미만) 비내, 설하 등 다른 투여경로를 이용할 수 있다.
주사제는 종래 형태로 제조할 수 있는데 액체용액 또는 현탁액, 주사에 앞서 액체 중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체형태, 또는 에멀션으로 제조될 수 있다. 적당한 부형제로는 예컨대 물, 항염하제, 덱스트로스, 만니톨, 락토스, 레시틴, 알부민, 글루탐산나트륨, 염산 시스테인 등이 있다. 또한 필요로 한다면 주사 가능한 제약학적 조성물은 습윤제, pH 완충제 등과 같이 소량의 비독성 보조물질을 함유할 수도 있다. 필요로 한다면 흡수향상제제(예컨대 리포조옴)도 이용할 수 있다.
[실시예 1]
뱀독 혈소판 점착 저해제 분석
A. 분석의 설명--플레이트 분석
정제된 혈소판 GP Ⅱb-Ⅲa 수용체를 피츠제럴드, L. A. 등의 방법으로 제조하였다.(Anal Biochem (1985) 151:169-177). 비트로넥틴 수용체를 스미드, J. W. 등의 방법으로 제조하였다.(J Biol Chem (1988) 263:18726-18731). 정제 후 수용체를 0.1-1.0mg/ml으로 0.1% Triton X-100에 저장하였다.
20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 1mM CaCl2, pH 7.4의 용액으로 1:200으로 희석하여 Triton X-100 농도를 그것의 임계 미셀(miccellar) 농도 이하로 만들고 각 웰에 100μl의 알리컷을 가한 후 바닥이 평평한 96개의 웰 ELISA 플레이트(Linbro EIA-Plus microtiter plate, Flow Laborationes)의 웰에 수용체를 피복하였다. 웰을 모두 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이트한 다음 흡인하여 건조시켰다. 비특이적 결합을 방지하기 위해 30℃에서 2시간 동안 상기 완충액에서 35mg/ml로 소혈정알부민(BSA)을 첨가함으로써 부가의 부위를 차단하였다. 그런 다음 결합 완충액(50nM Tris-HCl, 100mM NaCl, 2mM CaCl2, 1mg/ml BSA)으로 웰을 1회 세척하였다.
대응 리간드(피브리노겐, 폰 빌레브란트 인자 또는 비트로넥틴)를125I로 표지하거나 시판되는 시약 및 표준 프로토콜을 사용하여 비오틴에 결합시켰다. 표지된 리간드를 10nM(100μl/웰)의 최종 농도에서 수용체로 피복된 웰에 첨가하고 시험샘플의 존재 또는 비존재 하에 30℃에서 3시간 동안 배양하였다. 배양 후 웰을 흡인하여 건조시키고 결합된 리간드를 정량하였다.
125I- 표지된 리간드에 있어서, 단백질은 250μl SDS로 용해하였다. 비오티닐화된 리간드에 있어서, 결합단백질은 알칼리성 포스파타제에 결합된 안티비오틴 항체를 첨가한 다음 기질(p-니트로페닐포스페이트)을 첨가하고 405nm에서의 각 웰의 광밀도를 측정함으로써 검출하였다. 감소된 색전개 또는 감소된125I 함량은 리간드가 수용체에 결합하는 것을 저해하는 시험샘플로 배양한 웰에서 관찰되었다.
B, 조(crude)독에서의 점착 저해측정
시그마 케미칼 컴파니(St. Louis, MO) 또는 마이애미 써펜테리엄 랩즈(Salt Lake City, UT)로부터 구입한 68개의 조, 동결 건조된 뱀독을 완충액(50mM Tris, 100mM NaCl, 0.02% azide, 2mM CaCl2)에 1mg/ml로 용해시켰다. 1ml의 용액 알리컷을 Centrocon-10(YM membrane) 미세농축기(Amicon, Danvers, MA)를 통해 한외여과하였다. 여과액을 GP Ⅱb-Ⅲa/피브리노겐 시스템을 사용하여 A 단락의 수용체/리간드 분석에서의 시험샘플로 사용하고, 비오티닐화 피브리노겐을 사용하는 결합을 검출하였다. 결과는 표 1과 같다.
활성은 비프리나에(Viprinae) 전부는 아니지만 몇몇에서 존재하고 시험된 엘라파다에(Elapidae)의 모든 종에 있어서는 존재하지 않는다.
제1도는 4가지 종에 있어서 여과액을 다양하게 희석하여 얻은 결과를 나타낸다. 가장 크게 희석한 25μl/0.5ml에서도 3개의 활성 독은 최대 저해를 나타내었다.
C. 혈전증의 생체내 모델에서의 펩티드 활성측정
폴츠(Folts J. D., et al., Circulation (1976) 54:365)가 기재한 모델에서 개의 관상동맥에서의 혈전생성을 방지하는 능력에 대해 정제된 펩티드를 시험하였다. 이 모델에서 수축된 관상동맥에서의 유량감소는 혈소판 응집 때문이라고 피브리노겐이 GP Ⅱb-Ⅲa에 결합하는 것을 차단하는 제제는 이들 유량감소를 방지하는 것으로 나타났다(Coller, B. S., et al., Blood (1986) 68:783). 펩티드를 생리식염수에 용해시키고 단일 볼러스로서 말초정맥 내에 투입하였다.
D. 점착단백질에의 세포 점착에 있어서의 정제된 뱀독액 펩티드의 효과
높은 수준의 비트로넥틴 수용체를 발현하는 M21 흑색종세포를 S-메티오닌으로 대사적으로 표지한 다음 비트로넥틴으로 피복한 24개의 웰조직 배양 플레이트에 첨가하였다. 세포점착이 되도록 37℃에서 1시간 동안 배양하고 그런 후에 세척하여 비점착세포를 제거하였다. 세척 후 점착세포를 가용화하고 액체신틸레이션 계수기에 상등액을 적용하였다. 점착되어 남아 있는 세포분획물을 용해된 상등액의 cpm을 각 웰에 첨가된 세포의 총 수의 cpm으로 나누어 계산하였다. 세포점착에 있어서 정제된 뱀독 펩티드와 합성환형 펩티드의 효과를 배양 기간 동안 M21 세포에 그것들을 포함시킴으로써 측정하였다.
E. 점착 저해의 특이성
3종의 뱀독, Sistrurs m. barbouri, Crotalus ruber, 및 Crotalus basilicus로부터의 한외여액을 A단락의 피브리노겐/GP Ⅱb-Ⅲa 및 비트로넥틴/비트로넥틴 수용체 분석으로 시험하였다. 결과를 다양한 희석도에서 평가하였다. 제2도에 나타낸 것처럼 Sistrurus m. barbouri로부터의 독은 피브리노겐이 GP Ⅱb-Ⅲa에 결합하는 것을 저해하고; Crotalus ruber ruber의 독은 양 시스템에서 거의 동등하게 결합을 저해하고; Crotalus basilicus로부터의 독은 비트로넥틴/비트로넥틴 수용체 결합을 저해한다.
실시예 2-6과 8-12에 기재된 정제에 있어서, PAI 활성은 혈소판 응집의 직접 저해를 사용하여 분석하였다. 혈소판이 풍부한 혈장(PRP)을 건강한 사람 지원자로부터 얻었다. 응집계(aggregometer, Chrono-log Corp.)에 4μMADP를 0.5ml PRP에 첨가하여 응집을 유도하였다.
실시예 2-6의 정제된 PAIs의 아미노산 조성 분석결과를 나타내는 표가 실시예 6 다음에서 발견될 것이다; 실시예 8-11의 결과를 보여주는 것은 실시예 8 다음에 도시된다.
이 분석표는, 6N HCl로 펩티드를 가수분해하고, 모델 126 자료 시스템을 갖춘 베크만 121 HC 분석기를 사용하여 가수분해물을 분석하여 얻는다. 시스테인산을 J. Biol. Chem. (1969) 230:235-237의 Moore 방법에 따라 측정되었다. 트립토판은 측정되지 않았다.
[실시예 2]
에리스토코피스 마크마호니(Eristochphis macmahoni) 독에서 혈소판 응집저해제(PAI)의 정제
Eristochphis macmahoni 독(마이애미 Serpentarium 연구실, Lot # EM 23SZ) 45mg을 0.5% 트리플루오로초산(TFA) 1.0ml에 녹인 용액을 얼음으로 20분간 식히고, 14,000rpm 속도로 3분간 회전시켜 불용성 물질을 제거하고 1% TFA를 함유하는 5% 아세토니트릴로 평형시킨 3,9mm×30cm, C-18 Delta Pak 역-상 HPLC 컬럼(워터스, 밀포드, 매사츄세츠)에 로딩시켰다. Waters 600E 액체 크로마토그래피를 사용하여 5%에서 15% 아세토니트릴의 연속 구배(2%/분) 5분, 다음에 15%에서 30% 아세토니트릴의 구배 35분간 그리고 나서 50%까지의 아세토니트릴의 구배 20분 가동하였다. 전 구배를 통하여 1.5ml/분의 유속이 유지되고, 컬럼용출액을 2분 단위 분획물로 폴리프로필렌 튜브에 모았다.
컬럼용출액을 220m,/2.5 흡수 유니트 전 스케일(absorbance units full scale; AUFS)에서 모니터하였다.
분획물을 Speed-Vac 농축기(Savant)를 사용하여 원래 용량의 1/2가 되도록 농축하고 다음에 동결 건조시켰다. 그리고 나서 샘플은 전 혈 응집기(크로노-로그 회사, 하버타운, 펜실베니아)를 사용하여 20μM ADP로 유도시킨 혈소판이 풍부한 혈장에서 인간 혈소판 응집을 저해시키는 활성을 분석하기 위한 일정량의 알리틉(10-50μl)과 1ml의 증류수로 재구성되었다.
제3도에서 보여지는 바와 같이, 활성은 21-25% 아세토니트릴 농도에서 용출되는 분획물에서 발견되었다. 이 분획물을 동결 건조시키고, 다음과 같이 좀 더 좁은 아세토니트릴 구배를 사용하여 C-18 HPLC 컬럼에서 다시 이동시켰다; 처음에는 8% 아세토니트릴에서 25% 아세토니트릴까지 68분간(0.25%/분), 그리고 나서 60% 아세토니트릴까지 10분간으로 구배한다. 1분 간격으로 분획물을 모아, 건조하고 상기와 같이 인간혈소판의 혈소판 응집에서 저해활성을 재분석하였다.
제4도에서 보여지는 바와 같이, 활성은 24% 아세토니트릴에서 용출하였다. 활성 분획물은 분석용 HPLC로 220nm에서 검출하면 제5도에서 보여지는 바와 같은 하나의 대칭적인 생활성 성분으로 용출되었다. HPLC로 정제된 물질의 아미노산 분석은 표 2에서 설명한 바와 같이 펩티드가 7-8개의 시스테인을 포함하는 49개의 잔기를 갖고 있는 것을 나타냈다.
카복시아미도메틸화된 펩티드에 대하여 자동 에드만 분해를 시도하여 보았으나 어떤 서열도 검출할 수가 없었다. 그러므로 이 물질의 소화는 Lys-C와 Asp-N 엔도프로테이나제에 의하여 제6도에서 보는 바와 같은 서열의 단편이 얻어졌다. 이 분석은 49개의 잔기의 서열을 나타냈다. 그러나 이 아미노산 조성에서는 측정되어지지 않은 서열분석에서 트립토판 잔기가 2개 있다는 것은 확실하므로 원래의 펩티드는 51개의 아미노산 잔기를 포함하였다. 이와 같이, 측정된 서열에서 빠진 2개의 Glx와 한 개의 Arg 잔기는 펩티드의 블록화된 아미노 말단에 존재하는 듯했다. 한 개의 Glx 잔기는 본래의 펩티드를 블록화된 성질을 갖도록 하는 아미노 말단에 있는 피로글루타밀 잔기인 것이 거의 확실하여, 효소 피로글루타밀 아미노펩티다제(L-피로글루타밀 펩티드 가수분해효소, EC 3.4.11.8, 베링거맨하임 바이오케미칼즈, 인디아나폴리스, 인디애나주)로 본래의 카복시아미도메틸화된 펩티드로부터 이 잔기를 제거하였다. Podell과 Abraham에 의해, Biochem. Buophys. Res. Commun. (1978) 81:176-185에 기술된 프로토콜이 사용되었다. 펩티드 100μg을 기질-대-효소의 비가 100:1이 되는 펩티다제로 소화시키고, 다음에 혼합물을 Waters 분석용 C-18 컬럼으로 역-상 HPLC 정제를 하여 자동 에드만 분해에 적합한 물질을 얻었다. 분석결과와 에리스티코핀이라고 불리는 펩티드의 특정화된 전서열이 제6도에 도시되어 있다.
이 PAI의 아미노산의 완전한 서열이 제6도에 도시되어 있다. 이 펩티드는 결합 부위에 RGD를 가지고 있고 에키스타틴과 매우 상동적임을 나타낸다.
[실시예 3]
시스트루루스 카테나투스 테르게미누스(Sistrurus catenatus tergeminus) 독에서 PAI의 정제
Sistrurus c. tergeminus 독 360mg을 (마이애미 Serpentarium 연구소, Lot #ST6SZ) 0.5M 초산 7.0ml에 녹이고 Sephadex G-50 미세컬럼에(Pharmacia, 2.5×100cm)에 적용시켜 0.5M 초산으로 평형시키고 용출시킨다. 컬럼을 약 25ml/시간의 유속으로 작동시켜, 5ml 분획물씩 모았다. 각 분획물의 25μlTlr을 10분획물군으로 모아서(즉 분획물 1-10, 11-20 등) 분석하기 위하여 동결 건조하였다. 모아진 건조된 분획물들을 인간 혈소판의 ADP-자극된 응집에서의 저해 활성을 분석하기 위하여 물 및 알리틉에 다시 녹였다. 활성분획물(31-40)을 모아서 동결 건조하였다.
이 물질을 0.5% TFA 2ml에 녹이고 0.1% TFA를 함유하는 8% 아세토니트릴로 평형시킨 19mm×30cm C-18 Delta Pak 역-상 HPLC 컬럼(워터스)에 적용하였다. 8%에서 30% 아세토니트릴 농도로의 구배로 30분간 그리고 60% 아세토니트릴로 20분간, 18ml/분의 유속으로 작동시켰다. 컬럼용출액을 0.2분 간격으로 폴리프로필렌 튜브에 모아서 220nm/2.2 AUFS에서 검사하였다. 분획물을 Speed-Vac 농축기(Savant)로 농축하고 전술한 바와 같이 동결 건조하여 인간 혈소판 항응집 활성을 분석하였다.
PAI를 함유하는 분획물이 24-25% 아세토니트릴에서 용출된다는 것이 제7도에 나타난다. 활성분획물을 HPLC를 사용하여 220nm에서 분석하면 제8도에서 보여지는 바와 같이 대칭적 생체활성인 구성성분이 나타난다. 이 물질의 아미노산 분석은 표 2에서 보여지는 바와 같이 12개의 시스테인을 포함하여 71-72개의 잔기를 갖는 펩티드를 보여준다.
정제된 펩티드 일부를 요오드아세트아미드로 환원, 알킬화시키고 C-18 역-상HPLC 컬럼으로 정제한다. 23회의 에드만 분해에 의한 이 물질의 N-터미날 서열분석은 다음과 같은 아미노산 서열을 나타낸다:
Glu-Ala-Gly-Glu-Glu-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Ala-Asn-Pro-Cys-Cys-Asp-Ala-Ala-Thr-Cus-Lys-Leu.
테르게미닌(terqeminin)이라고 불리는 PAI의 아미노산의 완전한 서열이 제6도에 도시되어 있다.
정제된 펩티드는 실시예 1, A 단락에서 기술된 수용체에 기초한 분석법으로 시험되어졌다. 제9도에서 보여지는 바와 같이 순수 펩티드로 100nM보다 작은 농도에서 Fg와 vWFD가 GP Ⅱb-Ⅲa 수용체에 결합하는 것과 Vn과 vWF가 비트로넥틴 수용체에 결합하는 것을 저해하였다.
[실시예 4]
시스트루루스 밀라루스 바르보우리(Sistrurus milarus barbouri) 독에서 혈소판 응집 저해제의 정제
Sistrurus m. barbouri 독(마이애미 Serpentarium 연구소, Lot #SM12SZ) 200mg을 0.5M 초산 7.0ml에 녹이고 미세 Sephadex G-50(pharmacis, 2.5X100cm)의 컬럼에 적용시켜, 0.5M 초산으로 평형, 용출시켰다. 전기한 바와 같이 컬럼을 26ml/시간의 유속으로 작동시켜 5ml 분획물씩 모아서 항혈소판 응집활성을 분석하였다. 활성분획물(41-50)을 모아서 동결 건조시켰다. 이 물질을 0.5% TFA 2.0ml에 다시 녹이고, 실시예 3에서와 같이 예비 C-18 HPLC 컬럼에 로드시키고 같은 구배조건을 적용시키면서 용출시켰다. 컬럼에서 0.2분당 분획물을 폴리프로필렌 튜브에 모아서 농축하고, 동결 건조하고 혈소판 응집 저해활성을 분석하였다.
제10도는 이 HPLC 컬럼에서의 활성프로필을 보여준다. 활성분획물을 분석용 HPLC에 적용시키면, 90% 이상 균질인 몇 개의 분획물(45-47)을 나타낸다. 분획물 46(150μg)의 펩티드를 분석용 C-18 컬럼으로 균질하게 정제하여, 제11도에 보여지는 대칭적 피크를 수동으로 모았다. 이 물질을 아미노산 분석을 하면 표 2에서 설명하는 바와 같이 12개의 시스테인 잔기를 포함하여 71-72개의 아미노산의 펩티드임을 나타낸다.
정제된 펩티드(150μg)를 300μl의 반응 완충액에서(6M 구아니딘 HCl, 0.25M 트리스-HCl, 20mM EDTA, 20mM 디티오스레이톨(DTT), pH 7.5) 녹이고 1.5시간 동안 실온에서 펩티드를 환원시켰다. 이것을 실온에서 4-비닐피리딘(알드리히) 3μl과 한시간 더 반응시켰다. 1% TFA 200μl을 가하여 반응을 정지시키고 분석용 C-18 HPLC 컬럼에 로드시켜 8% 아세토니트릴에서 25% 아세토니트릴까지 20분간 그리고 나서 60% 아세토니트릴까지 10분간, 0.1% TFA를 함유하는 물에서의 아세토니트릴 구배로 용출시켰다.
상기와 같이, 피리딜 에틸화된 물질 일부분을 N-말단서열 분석을 하고 C-3 또는 C-18 역-상 HPLC 컬럼에서 아세토니트릴/물/TFA 구배용출을 하여 분리된 펩티드 분획물을 가지고, 엔도프로테이나제 Lys-c 및 엔도프로테이나제 Asp-N을 사용하여 환원되고 알킬화된 펩티드를 철저하게 단백질 가수분해를 하였다. Yarden, Y. 등에 의해 Nature (1986) 323:226에 기술된 바와 같은 가스상 서열측정기에서 자동 에드만 분해를 이용하여 원래의 펩티드와 분리된 단백질 분해분획물의 N-말단의 아미노산 서열이 측정되었다.
이렇게 분리된 바르보우린(Barbourin)이라고 명명된 펩티드의 아미노산의 완전한 서열이 단백질 분해분획물의 서열과 함께 제6도에 도시되어 있다. 다른 뱀독 점착 저해제의 서열과 이 서열의 비교가 제12도에 도시되어 있다.
[실시예 5]
라케시스 무타스(Lachesis muts) 독에서 PAI의 정제
Lachesis muts 독(마이애미 Serpentarium 연구소, Lot #LM15FZ) 99mg을 0.5% 트리플루오로초산 2.0ml에 녹이고 얼음에서 20분 동안 냉각시키고, 3분 동안 14,000rpm 속도로 회전시켜 불용성 물질을 제거하고 0.1% 트리플루오로초산을 함유하는 5% 아세토니트릴로 평형시킨 3.9mmX30cm, C-18 Delta Pak 역-상 HPLC 컬럼(Waters)에 로드시켰다. 5분에 걸쳐 5%에서 15% 아세토니트릴로 그리고 나서 35분에 걸쳐 30%로(2%/분) 구배시켰다. 유속은 1.5ml/분을 유지하면서 컬럼용출액을 220nm/3.0 AUFS에서 검사하였다. 2분마다 분획물을 모아서 Speed-Vac로 농축하여 동결 건조시켰다. 분획물들에 대하여 혈소판 응집 저해 활성을 분석하였다.
제13도는 18% 아세토니트릴에서 활성분획물이 용출되는 것을 나타낸다. 이 분획물들을 좀더 좁은 구배 즉 40분 동안 5-28% 아세토니트릴의 구배로 하여 C-18 컬럼에 재작동시켰다. 1분마다 분획물을 모아서, 농축하여, 동결 건조하여 혈소판 응집 저해 활성을 검사하여 그 결과를 제14도에 나타냈다. 이 활성성분을 분석용 C-18 컬럼에서 이동시켜, 용출된 중앙 피크 분획물을 수동으로 모았다. 용출된 물질은 제15도에 나타난 바와 같이 하나의 대칭피크를 이루며 아미노산 분석을 하면 표 2에서 보여지는 바와 같이, 12개의 시스테인을 포함하는 72-73개의 아미노산의 펩티드를 나타낸다.
Lachesin이라고 불리는 이러한 PAI의 아미노산의 완전한 서열이 제6도에 나타나 있다.
[실시예 6]
크로탈루스 비리디스 비리디스(Crotalus viridis viridis) 독에서 PAI의 정제
Crotalus viridis viridis 독 47mg을 0.% 트리플루오로초산 1ml에 녹이고, 20분 동안 얼음에서 식히고, 14,000rpm에서 3분 동안 회전시켜 불용성물질을 제거하여, 0.1% 트리플루오로초산을 함유하는 5% 아세토니트릴로 평형시킨 3.9mmX30cm C-18 Delta Pak 역-상 HPLC 컬럼(Waters)에 로드시켰다. 5분간 5%에서 15% 아세토니트릴의 구배 다음에 35분간 15%에서 30% 아세토니트릴의 구배 그리고 60분간 60% 아세토니트릴의 구배로 가동시켰다. 전 구배에서 1.5ml/분의 유속을 유지하고, 2분마다 분획물로 컬럼용출액을 폴리프로필렌 튜브에 모았다. 컬럼용출액을 220nm/3.0 AUFS에서 검사하였다. 분획물을 농축하고, 동결 건조하여 혈소판 응집 저해활성을 분석하였다.
제16도에 도시된 바와 같이, 18-19% 아세토니트릴의 활성분획물을 C-18 HPLC 컬럼에서 48분간 8%-20% 아세토니트릴의 구배(0.25%/분)로 이동시켰다. 분획물을 농축시키고 동결 건조시켜 활성을 분석하였다; 활성분획물을 10분간 8-16% 아세토니트릴, 15분간 16-20% 아세토니트릴, 그리고 나서 10분간 60%까지의 구배를 이용하는 C-18 컬럼에서 작동시켰다. 용출액을 각각의 정점에서 폴리프로필렌 튜브에 수동으로 모아서 220nm에서 검사하였다. 분석용 HPLC에서 활성피크를 재분석한 결과가 제17도에 나타나 있다. 이 피크에서 수행된 아미노산 분석은 표 2에서 설명하는 바와 같이 12개의 시스테인을 포함하여 72-73개의 잔기를 갖는 펩티드임을 나타낸다. 비리딘(viridin)이라고 불리는 이 PAI의 아미노산의 완전한 서열이 제6도에 도시되어 다른 PAI와 비교되어진 것은 제12도에 나타나 있다.
[실시예 7]
정제된 PAI와 에치스타틴(Echistatin)의 비교
실시예 2와 4에서 기술된 바와 같이 정제된 펩티드, 에리스티코핀 및 바르보우린을, 실시예 1 A단락에서 기술된 바와 같이 피브리노겐이 GP Ⅱb-Ⅲa에 결합하는 것을 저해하는 것에 대하여, 49-잔기 펩티드인 에치스타틴과 비교하였다. 제18도는 이 분석에서 정제된 PAIs가 기준 에치스타틴보다 2-3배 더 강력하다는 것을 나타낸다.
Echis carinatus, Sistrurus m. barbouri, 및 Eristicophis macmahoni 독에서 균질하게 정제한 펩티드를 ADP-자극된 혈소판 응집분석법으로 에치스타틴과 비교하였다. 지시된 농도에서 정제된 뱀독 펩티드를 농도를 증가시켜 가면서 가하였다.(미리 인큐베이션시킴 없이)(제19도). Eristicophis macmahoni 및 Sistrurus m. barbouri로부터 뱀독 펩티드는 상기에서 보여진 바와 같이, 피브리노겐이 GP Ⅱb-Ⅲa에 결합하는 것을 저해하는 관찰된 그들의 능력 순서에 따르면 에치스타틴보다 적어도 2배 더 강력했다.
[실시예 8]
크로탈루스 세라스테스 세라스테스(Crotalus cerastes cerastes) 독에서 PAI의 정제
Crotalus c. cerastes 독(마이애미 Serpentarium 연구소, Lot #LM4FZ) 1g을 0.5M 초산 7.0ml에 가하고 0.5M 초산으로 평형된 미세 Sephadex G-50 컬럼(Pharmacia, 2.5×100cm)에 적용시켜 용출시켰다. 컬럼을 25ml/시간의 유속으로 작동시켜 5ml 분획물씩 폴리프로필렌 튜브에 모았다. 이 분획물의 알리틉이 전기한 바에 따라 응집활성 저해활성을 분석되었다. 활성분획물(71-80)을 모아 동결 건조시켰다.
건조물질을 0.5% TFA 2.0ml에 재현탁시켜 원심 분리하여 불용성물질을 제거하고, 실시예 3에 기술한 바와 같이 예비 C-18 Waters HPLC 컬럼에 로드시켜 실시예 3에서 기술한 구배용출조건을 적용시켜 용출시켰다. 컬럼에서 나오는 분획물을 폴리프로필렌 튜브에 모아서 농축시키고 혈소판 응집 저해 활성을 분석하였다. 제20도는 HPLC 분획물에서의 활성프로필을 도시한다.
혈소판 응집저해활성을 가진 활성분획물을 모아서 동결 건조하여 같은 구배로 예비 C-18 HPLC 컬럼에서 재이동시켰다. 분획물들을 폴리프로필렌 튜브에 수동으로 모아서 앞에서와 같이 혈소판 응집저해활성을 다시 분석하였다. 활성분획물을 실시예 4에서 기술한 조건으로 분석용 C-18 컬럼에서 분석하여, 균질한 분획물을 모아서 동결 건조시켰다. 이 물질의 분석용 HPLC 분석이 제21도에 도시되어 있다.
정제된 펩티드를 아미노산 분석을 하면 표 3에서 설명한 바와 같이 12개의 시스테인 잔기를 포함하는 73-74 아미노산 펩티드인 것을 나타낸다.
정제된 펩티드(450μg)를 반응완충액(6M 구아니딘-HCl, 0.25M 트리스 HCl, 20mM EDTA, 20mM 디티오스레이톨(DTT), pH 7.50) 750μl에 녹여서 실온에서 1.5시간 동안 펩티드를 완전하게 환원시키고 실온에서 1시간 동안 과량의 이오드아세트아미드(Flulea, 16mg)로 반응시켰다. 1% TFA 500μl을 가하여 반응을 종결시키고 분석용 C-18 HPLC 컬럼에 로드시켜 20분간 8%에서 25% 아세토니트릴 구배, 그리고 나서 1-분간 60% 아세토니트릴 구배로 용출시켰다. UV 흡수피크를 1.5ml 에펜도로프 튜브에 수동으로 모아서 건조시켰다.
이 카복시아미도메틸화된 펩티드 일부를 N-말단 서열 분석하였다. 엔도프로테이나제 Lys-c와 엔도프로테이나제 Asp-N으로 카복시아미드메틸화된 펩티드를 철저하게 단백질 분해 절단하였다. 이렇게 소화시킨 분획물들을 아세토니트릴/물/TFA 구배용출 조건에서 C-3 또는 C-18 역-상 HPLC 컬럼에서 분리시켰다. 아미노산 서열은 실시예 4에서 기술한 바대로 측정하였다. 세라스틴(cerastin)의 결정된 아미노산의 완전한 서열이 제6도에 도시되어 있고 다른 PAI의 서열과 비교한 것은 제12도에 도시되어 있다.
[실시예 9]
Crotalus ruber ruber 독으로부터의 PAI의 정제
Crotalus ruber ruber 독(Miami Serpentarium labs, Lot #(F17SZ))을 0.5M 초산 8ml에 녹이고 실온에서 평형시킨 미세 Sephadex G-50의 컬럼(pharmacia, 2.5X100cm)에 적용한 다음 0.5M 초산으로 용출시켰다. 컬럼은 폴리프로필렌 튜브에 분획물을 5ml씩 모으면서 25ml/hr의 유속으로 가동했다. 분획물들은 기술된 혈소판 응집저해활성에 대해 분석되었다. 활성분획물(61-70)을 한데 모아 동결 건조시켰다. 건조물을 0.5% TFA 2.0ml에 재현탁시켰다. 불용성 물질을 원심분리에 의해 제거하고 기술된 대로 예비 C-18 Waters HPLC 컬럼에 로드시키고 실시예 3에 기술된 구배조건을 사용하여 용출시켰다. 폴리프로필렌 튜브에 모은 분획물들을 Speed-Vac 농축기로 농축하고 혈소판 응집저해활성에 대해 분석했다.
제22도는 이 HPLC 분획물에 대한 활성프로필을 나타낸다. 개개의 활성분획물을 동결 건조시켰다. 분획물 49 및 50을 함께 모아서 분석용 C-18 역-상 컬럼에 로드한 다음 20분에 걸쳐서 8% 아세토니트릴로부터 25%로 이어서 10분에 걸쳐서 69% 아세토니트릴로 이동하는 아세토니트릴 구배로 구성된 실시예 4에서 기술된 조건을 사용하여 용출시켜서 루베린(ruberin)이라고 명명된 균질한 펩티드를 얻었다. 카복시아미도메틸화된 펩티드의 자동 에드만 분해결과 제6도에 보여진 서열을 얻었다.
[실시예 10]
Crotalus atrox로부터의 PAI의 정제
Crotalus atrox 독(Miami Serpentarium labs, Lot #CX16AZ) 1g을 0.5M 초산 10ml에 녹이고 평형시킨 미세 Sephadex G-50의 컬럼(Pharmacia, 2.5X110cm)에 적용한 다음 0.5M 초산으로 실온에서 가동했다. 컬럼은 분획물을 5ml씩 폴리프로필렌 튜브에 모으면서 25ml/시간의 유속으로 가동했다. 분획물들을 앞서 기술된 대로 혈소판 응집저해활성에 대해 분석했다. 활성분획물(81-100)을 한데 모아 동결 건조시켰다. 건조물을 0.5% TFA 2.0ml에 녹이고 예비 C-18 HPLC 컬럼에 로드한 다음 실시예 3에서 기술된 대로 가동했다. 컬럼에서 나온 분획물들은 폴리프로필렌 튜브에 모으고, Speed-Vac 농축기로 농축하고 그리고 앞에서와 같이 혈소판 응집 저해활성에 대해 분석했다. 활성분획물을 분석용 C-18 컬럼에 재가동시켜서 균일한 펩티드를 얻었다(제23도). 이 물질의 아미노산 분석결과 펩티드는 표 3에 보여진 것처럼 12개의 시스테인 잔기를 포함하여 72개의 아미노산을 포함하고 있는 것을 알았다.
분리된 아미노산, 크로타트록신(crotatroxin)의 아미노산 서열이 제6도에 도시되어 있다.
[실시예 11]
Bothrops cotiara로부터의 PAI의 정제
Bothrops cotiara 독(Miami Serpentarium labs, Lot #B05SZ) 680mg을 0.5M 초산에 녹이고 평형시킨 미세 Sephades G-50의 컬럼(Pharmacia, 2.5X110cm)에 적용한 다음 0.5M 초산으로 용출시켰다. 컬럼은 분획물을 5ml씩 폴리프로필렌튜브에 모으면서 25ml/시간의 유속으로 가동했다. 분획물들을 앞서 기술된 대로 혈소판 응집저해활성에 대해 분석했다. 활성분획물(71-90)을 한데 모아 동결 건조시켰다. 건조물을 0.5% TFA 2.0ml에 재현탁시키고 Waters 예비 C-18 역상 컬럼에 로드했다. 컬럼을 실시예 3에 기술된 조건에서 용출시켰다. 분획물을 폴리프로필렌 튜브에 모으고, Speed-Vac 농축기로 농축시키고 그리고 혈소판 응집저해활성에 대해 분석했다. 활성분획물을 개별적으로 동결 건조시켰다. 피크(peak) 분획물 몇 개를 실시예 4에서 기술된 대로 분석용 C-18 컬럼에서 다시 적용시켰다. 균질한 펩티드의 분석용 HPLC 프로필이 제24도에 도시되어 있다. 이 물질의 아미노산 분석은 표 3에 나와 있듯이 이 펩티드는 12개의 시스테인 잔기를 포함하여 72개의 아미노산을 포함하고 있음을 나타낸다. 코티아린(cotiarin)이라 명명된 이 펩티드의 완전한 아미노산 서열은 제6도 및 제12도에 도시되어 있다.
정제된 펩티드는 실시예 1에서 기술된 수용체 분석법으로 시험하였다. 초기의 측정에 의하면 저농도의 코티아린(1-4nM)은 비트로넥틴(vitronectin)의 비로넥틴(vironectin)에의 결합을 선택적으로 저해했음에 반하여, 같은 농도가 제25도에 보여진 것처럼 피브리노겐의 GP Ⅱb-Ⅲa에의 결합에 있어서 상당히 더 낮은 저해활성을 보였다; 그렇지만 후속 실험은 이 결과를 증명하지 못했다.
[실시예 12]
Crotalus viridis lutosus로부터의 PAI의 정제
A. Crotalus viridis lutosus 독(Miami Serpentarium labs, Lot #CL18SZ) 1g을 0.5M 초산 8ml에 녹이고 평형시킨 미세 Sephadex G-50의 컬럼(Pharmacia, 2.5X110cm)에 적용한 다음 0.5M 초산으로 용출시켰다. 컬럼은 분획물을 5ml씩 폴리프로필렌 튜브에 모으면서 25ml/시간의 유속으로 가동했다. 분획물들을 혈소판 응집저해활성에 대해 분석했다. 분획물(71-100)을 모아서 동결 건조시켰다. 건조물을 0.5% TFA 2.0ml에 재현탁시켰다. 불용성물질을 원심분리에 의해 제거하고 예비 C-18 Waters 역-상 컬럼에 로드한 다음 실시예 3에서 기술된 구배용출 조건에서 용출시켰다. 컬럼에서 나온 분획물들을 폴리프로필렌 튜브에 모으고, Speed-Vac 농축기로 농축시키고 그리고 혈소판 응집 저해활성에 대해 분석했다. 활성분획물들을 그들 각각의 튜브에서 동결 건조시켰다. 피크활성을 갖는 분획물들을 실시예 4에 기술된 아세토니트릴 구배를 사용하여 Waters 분석용 C-18 컬럼에서 재통과시켰다. 분획물들을 1.5ml 에펜드로프 튜브에 수동으로 모았다. 균질적인 분획물들을 모아서 동결 건조시켰다. 이 물질의 분석 HPLC는 단 하나의 대칭적인 피크를 보였다. 루토신(lutosin)이라고 명명한 이 펩티드의 완전한 아미노산 서열은 제6도 및 제12도에 도시되어 있다.
B. A단락에서 설명된 방법과 유사한 방법으로, B. jararacussu, C. basilicus, C. durissus durissus, C. V. oreganus, C. h. horridus, C. v. helleri, C. durissus totonactus 및 C. m. molossus로부터 PAI를 분리하여 정제하였다. 이들 펩티드 중 몇 개의 아미노산 조성이 표 3에 나와 있다. C. h. horridus, C. basilicus, C. m. molossus, C. V. oreganus, C. d. durissus로부터 유래된, 각각 호리딘(horridin), 바시리신(basilicin), 몰로신(molossin), 오레가닌(oreganin) 및 두리신(durissin)이라고 명명된 PAI의 아미노산 서열이 제6도에 도시되어 있다. 실시예 1-12의 정제된 펩티드들에 대한 수용체 결합 자료는 제26도에 도시되어 있다.
아래의 실시예 13-16에서, 펩티드는 제조자의 지시에 따라 HOBt 활성에스테르로서 활성화된 t-Boc 아미노산을 사용하여 Applied Biosystems 431A 펩티드 합성기로 고체상 기술(solid-Phase technigne)에 의해 합성되었다. 그 기술은 Boc-AA1.....AA(n-1)-AA(n)-O-PAM- 폴리스티렌 수지의 제조에 대해서는 간단히 다음과 같다.
Boc-AA(n-1)-OH를 병합하기 위해서는 선택된 Boc-AA(n)-O-PAM-폴리스티렌수지 1/2mmol을 하기 스케쥴에 따라 처리한다:
1) TFA 탈보호; DCM에 30% TFA, 3분, DCM에 50% TFA, 16분
2) 세척 및 중화; DCM 세척(5X), 3분, DCM에 5% DIEA, 2분, NMP에 5% DIEA, 2분, NMP 세척(6X), 5분
3) 커플링; NMP에 4당량의 Boc-AA-HOBt 에스테르(55분 동안 미리 활성화), 38분, 15% DMSO/85% NMP를 만들기 위해 DMSO, 16분, 3.8당량 DIEA, 5분
4) 세척 및 수지샘플; NMP 세척, 3분
5) 캡핑; 10% 아세틱안히드리드, NMP에 5% DIEA, 8분
6) 세척; DCM 세척(6X), 4분
[실시예 13]
유사체 #1[E L C ]바르보우린(28-73)의 제조:
PAM-Gly 수지(0.6meg/g, Applied Biosystems, Foster City, CA) 1/2mmol을 요구되는 아미노산(순서대로 도입됨)과 함께 방법 A에 따라 처리했다. Boc-보호 아미노산은 다음과 같이 측쇄가 보호되었다; Arg(Tos), Asp(OcHex), CyS(4-MeBzl), Glu(Ochex), Lys(C1-Z), Thr(OBzl), Trp(CHo), 그리고 Tyr(Br-Z), 완전 보호된 펩티드-수지 사슬의 조립에 이어서, 아미노말단 Boc-기를 TFA를 가지고 제거하고 수지는 TFA-염 형태로 건조시켰다. 수지(1.3g)를 저-고(low-high) HF 탈보호 프로토콜에 따라 처리하고 이어서 진공에서(in vacuo) HF를 제거했다. 건조된 펩티드-수지 혼합물을 에틸에테르를 사용하여 프릿펀넬(fritted funnel)(coarse)로 옮기고 에테르와 클로로포름을 교대로 사용하여 수회 세척하여서, 유기보호기 및 탈보호에 사용된 포착제(Scavenger)의 대부분을 제거했다.
펩티드 혼합물을 0.4% 아세트산 2l에 첨가하고 진한 NH4OH로 pH를 7.99로 조정하였다. 이 용액으로부터 수지를 여과하고 용액을 교반시키지 않고 4℃에서 20시간 동안 방치하였다. 그 다음에 용액을 상온으로 가열하여 교반하지 않고 다시 3일간 방치하였다. 여과하여 침전물을 제거하고 아세트산으로 상등액 pH를 3.0으로 조정하여 동결 건조시켰다.
조 원료를 0.5M 아세트산 8.0ml에 용해하고 0.5M 아세트산으로 평형된 Sephadex G-50 미세컬럼(2.5X100cm)에 로드하였다. 컬럼을 20ml/시간으로 가동하고 분획물(4ml)을 폴리프로필렌 튜브에 모았다. 분획물의 알리틉을 건조하고, 전술한 바와 같이 물에 다시 현탁시켜 혈소판 응집저해활성을 시험하였다. 활성분획물(71-90)을 모아서 동결 건조시켰다.
건조된 물질(66mg)을 0.1M 아세트산 2.0ml에 재용해하여 0.1% TFA를 함유하고 있는 8% 아세토니트릴로 평형된 Waters 예비 C-18 컬럼(Water Perparative C-18 column)에 로드하였다. 8% 아세토니트릴에서 20%까지는 10분내에 그 다음에는 40분내에 30% 아세토니트릴로 느리게 구배를 주었다. 컬럼을 18ml/분으로 용출하고 분획물(12sec)을 폴리프로필렌 튜브에 모았다. 분획물을 Speed-Vac 농축기에서 1.0ml로 농축하였고 10μl의 알리틉을 혈소판 응집 시험하였다.
활성 분획물(29-32)을 각각 동결 건조하여 8-30% 아세토니트릴 구배를 갖는 C-18 HPLC 컬럼으로 분석하였다. 분획물(29와 30)을 모아서 1.0ml 0.5% TFA로 분석컬럼에 로드하였다. 주요 피크를 수동으로 모아서 동결 건조하여 순순한 펩티드 1.6mg를 제조하였다.
이 물질의 아미노산 분석하여 펩티드와 동일하다는 것을 확인하였다. 제26도와 제27도에는 GP Ⅱb-Ⅲa에 대한 피브리노겐과 VnR에 대한 비트로넥틴의 응집억제활성에 대한 이 물질의 분석결과가 도시되어 있다. 이 자료에서 1μM까지의 농도에서 GP Ⅱb-Ⅲa에 대한 이 유사체의 고친화력과 VnR에 대한 상대적인 친화력의 부족을 알 수 있다.
[실시예 14]
유사체 #2, [K29]에리스티코필(4-51)의 제조;
PAM-Gly 수지(0.6meq/g, 어플라이드 바이오시스템, 포스터시티, 캘리포니아) 0.5mmol을 요구되는 아미노산(차례로 도입)으로 A방법으로 처리하였다. BOC-보호 아미노산은 다음과 같은 측쇄 보호를 갖는다; Arg(Tos), Asp(OcHeX), Cys(4-MeBz1), Glu(O-cHex), Lys(C1-Z), Ser(OBz1), Thr(OBz1), TrP(CHO) 및 Tyr(Br-Z). 이 펩티드의 절단, 리폴딩(refolding) 및 정제는 전기 실시예와 동일하였다. 이 유사체에 대한 수용체 결합 자료를 제26도와 제28도에 나타내었다.
[실시예 15]
유사체 #3의 제조:
G-C-G-K-G-D-W-P-C-A-NH
PMBHA 수지(0.72meq/g, 어플라이드 바이오 시스템, 포스터시티, 캘리포니아) 0.5mmol을 요구되는 아미노산(차례로 도입)으로 A방법으로 처리하였다. Boc-보호 아미노산은 다음과 같은 측쇄보호를 갖는다; Asp(O-CHex), Cys(4-MeBz1) 및 Lys(Cl-z). 보호펩티드-수지 집합체를 완성한 후에, 아미노말단 Boc 기를 TFA로 제거하고 수지를 TFA-염 형태로 건조하였다. 수지(1.54g)를 10% 아니졸, 2% 에틸메틸황화물(HF)을 함유하고 있는 무수-수소 불화물로 30분간 -10℃에서 처리하고 부가적으로 0℃에서 30분간 더 처리하였다. HF를 진공에서 제거하고 펩티드/수지 혼합물을 디에틸에테르에 현탁시킨 다음 클로로포름과 에테르 3X로 교대로 세척하였다. 에테르로 최종 세척한 후에, 펩티드를 2.0M 아세트산으로 수지로부터 제거하고 증류수로 희석시켜 동결 건조시켰다.
조 펩티드(370mg)를 탈산소된 10mM NH OAc, pH8에 0.5mg/ml가 되도록 재용해하고 과잉의 0.01M 포타시움 페리시아나이드(K Fe(CN)) 용액을 적하하여 산화시키고, 부가적으로 20분간 교반하여 아세트산으로 pH5로 조정하였다. 펩티드 용액을 교반하면서 DOWEX AG 3X4 음이온-교환수지로 15분간 처리하고 수지를 여과하고 H2O로 희석시켜 동결 건조하여 조 환형 펩티드를 제조하였다. 조 환형-펩티드(392mg)를 용출제로서 0.5M 아세트산을 사용하는 Sephadex G-25F에서 탈염하여 정제한 다음 10mM NH OAc, pH4.5 용액에 100mM NH4OAc를 첨가하여 생긴 용출구배를 사용하는 CM-세파로즈(파르메시아)에서 이온 교환 크로마토그래피하였다. HPLC 분석으로 최소 순도가 90%인 분획물을 모아서 여러번 H2O로부터 동결 건조하여 175mg을 제조하였다. 최종 정제는 정재된 펩티드를 제조하기 위한 아세토니트릴/물/TFA 구배를 갖는 Water C-18 역-상 컬럼에서의 예비 HPLC 정제를 포함한다. 이 유사체에 대한 수용체 결합 자료를 제26도, 제29도 및 제30도에 나타내었다.
[실시예 16]
추가 유사체의 제조
다음과 같은 유사체를 대부분의 경우에 실시예 15에서 설명한 것과 비슷한 방법으로 합성하였다. 그러나 아래의 유사체 60은 바쥬스·에스 등의 방법(FEBS Letts(1980) 110-85-87)을 사용하여 유사체 #19의 리진 수지의 측쇄의 구아닌딘화를 통해 용액 내에서 제조하였다.
1mg의 유사체 #19를 디이소프로필에틸아민(DIEA) 하에서 1ml의 순수 에탄올 내에서 1mg의 1-아미디노-3,5-디메틸피라졸 질산염(Aldrich)과 상온에서 4일간 반응시켰다. 제조된 유사체 60을 0.1% 트리플루오로아세틱산 내에서 아세토니트릴의 구배를 사용하는 C-18 컬럼 상의 역-상 HPLC에 의해 과잉 반응제와 출발물질로부터 정제하였다. 이 물질 900μg을 정제된 형태로 단리시켰다.
[실시예 17]
펩티드의 PAI활성
상술한 표준 응집 저해분석으로 시험하였을 때, 유사체 #3-5는 ADP-유도 인간 혈소판 응집저해활성에 대해 IC50값이 5μM이였다. 그러나, 유사체 #6은 IC50값이 200μM 이상이었고 유사체 #7은 IC50값이 100μM이었다. 이 분석에서 본 발명의 유사체의 IC 값은 다음과 같다.
[실시예 18]
선형 대 환형 펩티드 활성
플레이트 분석에서 GP Ⅱb-Ⅲa에 대한 피브리노겐 결합 저해를 시험하였을 때, 선형 RGDW-NH2는 환형 GCGRGDWPCA-NH2(제29도)의 활성과 매우 유사하였다. 반면에, 선형 KGDW-NH2는 환형 GCGRGDWPCA-NH2(제29도) 보다 훨씬 낮았다. RGDW 화합물이 아니라 KGDW 화합물 경우에 환형화는 GP Ⅱb-Ⅲa에 대한 피브리노겐 결합을 저해하는 펩티드의 활성을 상당히 증진시켰다.
[실시예 19]
플레이트 결합의 결과
합성 펩티드에 대한 분석
실시예 17에서 합성된 펩티드를, 직접 혈소판 응집 저해능을 평가한 외에, 상술한 바와 같이 본 발명의 플레이트 분석으로 시험하였다. 유사체 4-8에 대한 결과를 제30도에 나타내었다. 도면에 나타낸 바와 같이, 이들 유사체는 비트로넥틴 수용체에 대한 비트로넥틴과 같이 GP Ⅱb-Ⅲa에 대한 피브리노겐의 결합 저해능이 다르며 정도가 변한다. 이군 중에서, 유사체 #7과 유사체 #5도 역시 매우 특이하며 우수한 혈소판 응집저해활성을 갖는다.
[실시예 20]
셀 점착에 대한 정제 펩티드의 효과
M21 흑색종 세포를35S-메티오닌으로 표지한 다음 정제된 뱀독 펩티드의 지정된 농도 하에서 비트로넥틴-피복 플레이트에 첨가하였다.
세포 점착을 C섹션에 기술한 것처럼 인큐베이션과 세척 후에 남아 있는 세포를 용해하여 측정하였다. 제31도에 나타낸 것처럼, 비록 바르보우린과 펩티드 1(틀렁케이티드 발보린)이 실시예 2와 3에 나타낸 것처럼 우수한 혈소판 응집저해제이지만 이것은 둘 다 비트로넥틴에 대한 세포 점착성에는 상당한 효과가 없다. 대조적으로 비트로넥틴 수용체에 대한 비트로넥틴 결합의 우수한 저해제인 코티아린은 비트로넥틴에 대한 세포 점착을 저해하는데 우수하다. 유사한 실험에서, 펩티드 #3, K가 R(GCGRGDWPCA-NH2) 및 RGDS로 치환된 펩티드 #3을 비트로넥틴에 대한 M21 세포 점착에 대해서 실험하였다. 제32도에 도시된 것처럼, RGDS와 GCGRGDWPCA-NH2는 우수한 세포 점착 저해제이며 GCGKGDWPCA-NH2는 60μM까지는 효과가 없었다.
[실시예 21]
유사체 60과 유사체 19의 비교
상기의 유사체 60과 유사체 19는 서열 K*GDX를 함유하는 본 발명의 펩티드이고 K*의 실시예를 제외하고는 동일하다. 유사체 60은 다음 식과 같다:
Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH2;
유사체 19는 다음 식과 같다:
Mpr-K-G-D-W-P-C-NH2.
이들 유사체를 실시예 20의 세포 점착 분석을 사용해서 표준 혈소판 응집저해분석으로 시험하였다. 이 결과를 제33도와 제34도에 나타내었다. 제33도에 도시된 것처럼, 유사체 #60은 혈소판 응집저해에 있어서 극히 작은 농도로도 효과적이며, 비트로넥틴에 대한 세포 점착을 방지하는데는 상대적으로 덜 효과적이다. 유사체 #19는 물론 우수한 혈소판 응집저해활성을 갖고 있으나; 유사체 #60보다는 혈소판 응집저해분석에 있어서는 덜 활성적이라는 것을 제34도로 알 수 있다. 유사체 #60은 혈소판 응집에 있어서 IC50이 대략 0.15nM이며; 유사체 #19는 IC50이 대략 1nM이다.
[실시예 22]
개(犬)의 관상동맥 내의 혈전증의 폴트모델
A. 개 흉개에 있어서의 혈류 감소의 개시(CFRs)
20kg의 개의 좌전방 하강(LAD) 관상동맥에 차단자를 설치하였다. 전자기(EM) 흐름 프로브(electromagnetic flow probe)로 측정한 상(phasic)혈류와 평균 혈류 및 도플러 플로프로브를 제35도에 나타내었다.
B. 개 흉개의 CFRs에 대한 환형 GCGKGDWPCA-NH2(유사체 #3)의 효과
10mg의 이 펩티드를 개의 외주정맥에 주사하였다. 상기에서 언급된 바와 같이 LAD에서 이 혈류가 제36도에 도시되었다. 흐름 감소의 감소된 기울기로 나타낸 CFRs의 부분절개부를 주목하다. 또한 흐름이 제어(A)에서와 같은 정도로 감소되지 않는다는 것을 주목하다.
C. 외주정맥에 40mg의 유사체 #3을 2차 주입하였다. 제37도에 나타낸 것처럼, CFRs의 완전한 절개부는 전체 흐름이 LAD로 다시 복구되었다는 것을 나타낸다.
[실시예 23]
바르보우린 펩티드에 대한 발현 벡터의 구성
바르보우린 펩티드(1-73) 전길이[L41]을 코드화하는 유전자를 제38도에 나타낸 것처럼 합성 올리고뉴클레오티드로 조합되었는데, 올리고뉴클레오티드는 키나아제처리되고 어닐링되고 표준방법에 따라 EcoRI-Hind Ⅲ이 절단된 M13mp18에 연결되어 있다. 박테리아 알카리성 인산염 유전자(pho A) 시그날 서열을 (왓슨, 엠. 이. 이., 핵산 리서취 (1984) 12:5145) 제39도에 도시된 [L41]바르보우린(1-73) 구조물의 EcoRI/NcoI 부위로 합성 올리고뉴클레오티드를 연결함으로써 바르보우린 구조물에 첨가하였다. 모든 구조물의 뉴클레오티드 서열은 상거 디데옥시 사슬 종결법으로 증명하였다.
이 펩티드의 절단된 형태는 또한 전길이 분자의 아미노산(28-73)만을 코드하는 합성 올리고뉴클레오티드로부터 구성된다. 두변형 즉, Q28의 E28로의 변형과 A64의 C64로의 변형을 쿤켈 등에 의해 설명된 부위지정 돌연변이(Meth Enzymol (1987) 154:367)에 따라 도입하였다. phoA 시그날 서열을 상술한 것처럼(40페이지) 절단된 형태에 첨가하였다. 또한, E. coli 열안정성 엔테로톡신 Ⅱ(픽켄. 알. 더블유, 등 Infect Immun(1983) 42:269)에 대한 시그날 서열을 EcoRI 및 NcoI 양립말단을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 절단된 형태에 첨가하였다. 모든 박테리아성 분비 구조물을 클론테크랩사 제품인 박테리아성 발현 벡터 pPROK-1(브로시어스, 제이. Gene(1984) 27:151, 동:161)에 EcoRI와 Hind Ⅲ 제한 엔도뉴클리스를 사용해서 서브크론하였다.
요구되는 펩티드의 유전자 코드와 탠덤 반복부를 중합효소 사슬반응(PCR)을 사용하여 제조하여 L41과 C64를 함유하고 있는 전길이 바르보우린 펩티드(1-73)로부터 복합체화 단위를 제조하였다.
제41도는 PCR 합성에 사용되는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. PCR 반응은 사이키. 알. 케이., 등의 방법(사이언스(1988)239:487)에 따라 진행된다. 얻어진 폴리머 접합은 제42도에 나타낸 것과 같은 서열의 양단에 메티오닌을 함유하며 구조물에 바람직한 제한 부위를 제공한다.
탠덤 반복부를 이 이중체(dimer)를 형성하기 위하여 개별적인 다중체(mutmer)형성 성분으로부터 예컨대, EcoRI/Hind Ⅲ를 절단한 M13mp18 벡터 내의 Bg1 Ⅱ/Hind Ⅲ 단편에 EcoRI/BamHI 단편을 연결함으로써 형성하였다. 생성된 이 이중체를 EcoRI와 BamHI로 절단하고 Bg1 Ⅱ/Hind Ⅲ에 다시 연결하여 삼중체(trimer)를 제조하고 원하는 크기가 될 때까지 계속한다. 이 구성을 제43도에 도시하였다.
그 다음에 다중체를 클론테크사제품인 에. 코리 벡터 pKK 233-2(아만. 이. 등 Gene(1985) 40:183)를 NcoI/Hind Ⅲ으로 절단하고 NcoI/BamHI 단량체 서브단편과 Bg1 Ⅱ/Hind Ⅲ의 복합체 서브단편을 연결함으로써 이 벡터에 연결하였다.
융합 단백질로서의 발현을 위해, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자(장. 씨. 엔., 등. Gene(9187) 55:189)의 약간 수식된 아미노말단부(아미노산 1 내지 72)를 함유하는 NcoI-EcoRI와 다중체 구조물의 EcoRI-Hind Ⅲ 서브단편과 함께 상기 절단된 벡터를 사용하였다.
[실시예 24]
재조합체 유전자의 발현
적절한 E. coli 숙주로 트랜스펙션한 후에 상기에서 언급된 모든 재조합체 플라즈미드로부터의 단백질 발현을 가나마리 등의 방법(Gene(1988) 66:295)에 따라 유도하였다. 생성물을 도데실 황산나트륨 폴리아크릴아미드겔 전기영동으로 그리고 혈소판 풍부 혈장에서의 ADP-유도 혈소판 응집 저해활성을 특징화하였다. 정제 후에, 다중체 단백질을 시아노겐 브로미드 절단으로 단량체 유니트로 전환시키고 생성물을 상기와 같이 분석하였다.

Claims (42)

  1. 시험 샘플에서 혈소판 응집저해제(PAI) 활성의 존재 또는 부재를 측정하는 방법에 있어서, 피브리노겐(Fg) 또는 폰 빌레브란트 인자(vWF)가 GP Ⅱb-Ⅲa와 결합할 수 있는 조건하에, Fg 또는 vWF의 용액의 존재 하에서 상기 샘플을 정제된 혈소판 GP Ⅱb-Ⅲa와 접촉시키는 단계, 대조 샘플에서 Fg 또는 vWF가 GP Ⅱb-Ⅲa와 결합하는 것과 비교하여 Fg 또는 vWF의 GP Ⅱb-Ⅲa와의 결합의 변화를 검출하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 샘플이 비트로넥틴과 비트로넥틴 수용체의 결합을 저해하는 활성을 갖는가를 측정하는 단계; 상기 샘플이 피브로넥틴과 피브로넥틴 수용체의 결합을 저해하는 활성을 갖는가를 측정하는 단계; 상기 샘플이 피브로넥틴과 GP Ⅱb-Ⅲa 수용체의 결합을 저해하는 활성을 갖는가를 측정하는 단계; 그리고 상기 샘플이 폰 빌레브란트 인자와 비트로넥틴 수용체의 결합을 저해하는 활성을 갖는가를 측정하는 단계; 로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 측정 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 방법.
  3. 피브리노겐 및/또는 폰 빌레브란트 인자와 GP Ⅱb-Ⅲa의 결합을 저해하는 혈소판 응집 저해제(PAI)의 특이적 활성이 있고 그리고 상대적인 비트로넥틴과 비트로넥틴 수용체와의 결합을 저해 또는 피브로넥틴과 피브로넥틴 수용체의 결합을 저해하지 않고, KGD 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 뱀독으로부터 획득 가능한 혈소판 응집 저해제(PAI).
  4. 제1항의 방법으로 활성이 존재하는 것으로 확인되고, 에치스 콜로라타(Echis colorata), 에리스티코피스 막마호니(Eristicophis macmahonii); 에이. 히프낼리(a. hypnale), 에이. 에쿠투스(A. acutus), 에이. 피스키보러스 루코스토마(A. piscivorous leucostoma), 에이. 피스키보러스 코난티(A. piscivorus conanti); 보트롭스 에이스퍼(Bothrops asper); 보트롭스 코티아라(Bothrops cotiara), 비. 자라라카(B. jararaca), 비. 자라라쿠스(B. jararacussu), 비. 란스버기(B.lansbergi), 비. 메루사(B. medusa), 비, 나수타(B. nasuta), 비. 뉴위디(B. neuwiedi), 비. 프라도이(B. pradoi), 비. 쉬레글리(B. schlegli); 크로탈루스 아트록스(Crotalus atrox), 시. 바실리쿠스(C. basilicus), 시. 세라스테스 세라스테스(C. cerastes cerastes), 시. 두리수스 두리수스(C. durissus durissus), 시. 두리수스 토토나타쿠스(C. durissus totonatacus), 시. 호리두스 호리두스(C. horridus horridus), 시. 몰로수스 몰로수스(C. molossus molossus), 시. 루버 루버(C. ruber ruber), 시. 비리디스 세레베루스(C. viridis cereberus), 크로탈루스 브이. 헬레리(Crotalus V. helleri), 크로탈루스 브이. 루토수스(Crotalus V. lutosus), 크로탈루스 브이. 오레가누스(Crotalus V. oreganus), 크로탈루스 브이. 비리디스(Crotalus V. viridis); 라케시스 마타스(Lachesis mutas); 시스트루루스 카테나투스 테르게미누스(Sistrurus catenatus tergeminus) 및 시스트루루스 밀라루스 바르보리(Sistrurus milarus barbouri)로 구성된 군으로부터 선택되는 뱀독으로부터 획득할 수 있는 것을 특징으로 하는 정제되고 단리된 PAI.
  5. 제4항에 있어서, 상기 뱀독이 에리스티코피스 막마호니(에리스티코핀); 보트롭스 코티아라(코티아린); 비. 자라라쿠수; 크로탈루스 아트록스(코트라 톡신); 크로탈루스 바실리쿠스(바실리신); 시. 세라스테스 세라스테스(세라스틴); 시. 두리수스 토토나타쿠스; 시. 에이치. 호리두스(호리딘); 크로탈루스 엠. 몰로수스(몰로신); 시. 브이. 헬레리; 시. 루버 루비(루버린); 크로탈루스 비리디스루토수스(루토신); 시. 브이. 비리디스(비리딘); 시. 브이, 오레가 누스(오레가닌) 시. 두리수스 두리수스(두리신); 라케시스 무타스 라케신); 시스트루루스 카테나투스 터게미누스(터게미); 및 에스. 밀라루스 바버리(바버린)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 정제되고 단리된 PAI.
  6. 제4항에 있어서, 상기 뱀독을 사이징 컬럼에 적용하여 분자량 10kd의 분획물을 함유하는 용액을 얻고, 상기 분획물을 역상 HPLC에 적용하여 다양한 분획물을 얻고, 피브리노겐과 GP Ⅱb-Ⅲa의 결합을 저해하는 분획물을 회수하는 단계로 이루어진 방법에 의해 뱀독으로부터 단리 및 정제된 것을 특징으로 하는 정제되고 단리된 PAI.
  7. 제6항에 있어서, 10kd 분획물을 사이징 겔을 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 뱀독을 적용하여 다양한 분획물을 용출하고, GP Ⅱb-Ⅲa에 결합하는 피브리노겐을 저해하는 분획물을 분리함으로써 얻어지는 것을 특징으로 하는 정제되고 단리된 PAI.
  8. 뱀독을 사이징 컬럼에 적용하여 분자량 10kd의 분획물을 함유하는 용액을 얻고, 상기 분획물을 역상 HPLC에 적용하여 다양한 분획물을 얻고, 피브리노겐과 GP Ⅱb-Ⅲa의 결합을 저해하는 분획물을 회수하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 뱀독으로부터 PAI를 정제하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 사이징 겔을 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 뱀독을 적용하여 다양한 분획물을 용출하고, 피브리노겐이 GP Ⅱb-Ⅲa에 결합하는 것을 저해하는 분획물을 분리함으로써 10kd 분획물을 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제3항에 따른 PAI와 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈전 형성을 저해하기 위한 약제학적 조성물.
  11. 제4항에 따른 PAI와 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈전 형성을 저해하기 위한 약제학적 조성물.
  12. 뱀독으로부터 분리될 수 있고, 저해서열로서 아미노산 서열 Lys-Gly-Asp(KGD)을 포함하는 정제 및 단리된 형태의 혈소판 응집 저해제.
  13. 제12항에 있어서, 다음의 아미노산 서열:
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 혈소판 응집 저해제 또는 그것의 수식 및/또는 절단된 형태.
  14. 일정한 농도에서 비트로넥틴의 비트로넥틴 수용체에의 결합 또는 피브로넥틴의 피브로넥틴 수용체에의 결합을 저해할 때보다 Fg 또는 vWF의 GP Ⅱb-Ⅲa에의 결합을 2배 이상 저해할 수 있는 특정 혈소판 응집 저해제(PAI)로서, 상기 PAI는 아미노산 서열 K*(Sar/G)D를 포함하고, 상기 식에서 K*는 일반식 R1 2N(CH2)4CHNHCO-의 치환된 또는 비치환된 리실잔기이고, 상기 식에서 각 R1은 독립적으로 H, 알킬(1-6C) 또는 최대로 하나의 R1이 R2-C=NR3이고, 상기 식에서 R2는 H, 알킬(1-6C) 또는 치환 또는 비치환 페닐 또는 벤질 잔기 또는 NR4 2이고 여기서 각 R4는 독립적으로 H 또는 알킬(1-6C)이고, R3은 H, 알킬(1-6C), 페닐 또는 벤질이고, 또는 R2-C=NR3은
    으로 구성된 군에서 선택된 라디칼이고, m은 2 또는3의 정수이고, 각 R5는 독립적으로 H 또는 알킬(1-6C)이고; 하나 또는 두 개의 (CH2)는 O 또는 S가 다른 헤테로원자에 인접하지 않는다는 조건으로 O 또는 S로 대치될 수 있고, 상기 K*(Sar/G)D는 적어도 8개의 아미노산의 환형 펩티드에 함유되는 것을 특징으로 하는 특이적인 PAI.
  15. 제14항에 있어서, RGD 또는 KGD 또는 그것의 절단된 및/또는 수식된 형태를 함유하는 자연적으로 발생하는 PAI의 주된 구조를 가지며, 여기서 상기 PAI 또는 그것의 절단된 및/또는 수식된 형태에서 발생하는 서열 RGD의 R잔기가 K*로 대치되거나, 상기 PAI 또는 그것의 절단된 및/또는 수식된 형태에서 발생하는 서열 RGD의 K는 K가 아닌 K*의 구체예에 의해 대치되는 것을 특징으로 하는 PAI.
  16. 제15항에 있어서, 상기 자연적으로 발생하는 PAI가 뱀독에 존재하는 것을 특징으로 하는 PAI.
  17. 제16항에 있어서, 상기 PAI가 트리그라민, 에치스타틴, 엘레강틴, 알볼라브린, 라체신, 플라보비리딘, 에리스티코핀, 터게미닌, 로다스토민, 아플라긴, 할리신, 비티스타틴, 푸베린, 세라스틴, 코티아린, 크로타트록신, 호리딘, 바실라신, 루코신, 몰로신, 두리신, 자라라신, 세레베린, 오레가닌, 비리딘 및 바버린으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 PAI.
  18. 일정한 농도에서 비트로넥틴의 비트로넥틴 수용체에의 결합 또는 피브로넥틴의 피브로넥틴 수용체에의 결합을 저해할 때보다 2배 이상으로 Fg 또는 vWF의 GP Ⅱb-Ⅲa에의 결합을 저해할 수 있으며, 다음의 일반식을 갖고 있는 특이적인 혈소판 응집 저해제(PAI)로서,
    상기식에서, K*는 일반식 R1 2N(CH2)4CHNHCO-의 리실잔기이고,
    상기식에서 각 R1은 독립적으로 H, 알킬(1-6C)이거나 또는 최대로 하나의 R1이 R2-C=NR3이고,
    상기 식에서 R2는 H, 알킬(1-6C), 또는 치환된 또는 비치환 페닐 또는 벤질잔기, 또는 NR4 2이고, 상기 식에서 각 R4는 독립적으로 H 또는 알킬(1-6C)이며,
    R3는 H, 알킬(1-6C), 페닐 또는 벤질이거나, 또는
    R2-C=NR3는
    로 구성된 군으로부터 선택된 라디칼이고, 상기식에서 m은 2 또는 3의 정수이고 각 R5는 독립적으로 H 또는 알킬(1-6C)이고; 그리고 하나 또는 두개의 (CH2)는 0 또는 S는 다른 헤테로원자에 인접하지 않는다는 조건으로 O 또는 S로 대치될 수 있으며; AA1은 작은 중성(극성 또는 비극성) 아미노산이고 n1은 0 내지 3의 정수이고; AA2는 중성, 비극성의 큰(방향족 또는 비방향족) 또는 극성 방향족 아미노산이고 n2는 0 내지 3의 정수이고; AA3은 프롤린 잔기 또는 수식된 프롤린 잔기(하기 식에서 정의된 바와 같음)이고 n3은 0 또는 1의 정수이고; AA4는 중성의 작은 아미노산 또는 그의 N-알킬화된 형태이고 n4는 0 내지 3의 정수이고; X1과 X2의 각각은 독립적으로, X1과 X2사이에 결합을 형성하여 도시된 바와 같은 환형 화합물을 생성할 수 있는 잔기이고; 그리고 Y1과 Y2의 각각은 독립적으로 비-간섭적 치환기이거나 또는 존재하지 않을 수 있고; 상기에서 하나 또는 둘 이상의 펩티드 결합은 선택적으로 -CH2NH-, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-(시스 및 트랜스), -COCH2-, -CH(OH)CH2- 및 -CH2SO-로 구성된 군으로부터 선택된 결합으로 대치될 수 있으며; 만일, n3이 0이면, 1) n2와 4의 합은 적어도 2이어야 하고; 또는 2) K*는 Har이나 K 이외의 것이어야 하고; 또는 3) X2는 시스(C), 페니실아민(Pen) 또는 2-아미노-3,3-시클로펜탄메틸렌-3-메르캅토 프로피온산(APmp)이어야 하고; 또는 4) Y1또는 Y2는 적어도 한 아미노산 잔기를 포함해야 하거나; 또는 5) 하나 이상의 펩티드 결합은 상기 선택적 결합으로 대치되는 것을 특징으로 하는 PAI.
  19. 제18항에 있어서, Y1은 H, 아실 또는 펩티드 잔기이거나 그의 유도체형이거나 또는 존재하지 않고, Y2는 OH, NH2또는 펩티드 잔기이거나 그의 유도체형이거나 또는 존재하지 않는 것을 특징으로 하는 PAI.
  20. 제19항에 있어서, Y1은 NH2-A-NH2이거나 또는 존재하지 않는 것을 특징으로 하는 PAI.
  21. 제19항에 있어서, Y1이 H, 아세틸, G이거나 또는 존재하지 않는 것을 특징으로 하는 PAI.
  22. 제18항에 있어서, X1및 X2가 시스테인(C), 메르캅토프로피오닐(Mpr) 및 페니실아민(Pen)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 PAI.
  23. 제18항에 있어서, AA1이 G이고 n1은 0 또는 1인 것을 특징으로 하는 PAI.
  24. 제18항에 있어서, AA2가 W, F, L, Y 및 V로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 PAI.
  25. 제24항에 있어서, AA2가 W인 것을 특징으로 하는 PAI.
  26. 제18항에 있어서, K*가 K, Har, 아세트이미딜-Lys 또는 페닐이미딜-Lys인 것을 특징으로 하는 PAI.
  27. 제26항에 있어서, 하기와 같이 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 PAI.
  28. 제27항에 있어서, 하기와 같이 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 PAI.
  29. 제28항에 있어서, 혈소판 응집 저해제가 PAI 60; Mpr-(Har)-G-D-W-P-C- NH2인 것을 특징으로 하는 PAI.
  30. 제28항에 있어서, 혈소판 응집 저해제가 PAI 63; Mpr-(Har)-G-D-W-P- Pen-NH2인 것을 특징으로 하는 PAI.
  31. 제28항에 있어서, 혈소판 응집 저해제가 PAI 70; Mpr-(페닐이미딜-Lys)-G-D-W-P-C- NH2인 것을 특징으로 하는 PAI.
  32. 제28항에 있어서, 혈소판 응집 저해제가 PAI 72; Mpr-(페닐이미딜-Lys)-G-D-W-P- PenNH2인 것을 특징으로 하는 PAI.
  33. 약제학적으로 허용 가능한 부형제와 제23항, 제25항 또는 제32항에 따른 PAI를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈전 형성을 저해하기 위한 제약조성물.
  34. 제27항에 있어서, 하기와 같이 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 PAI.
  35. 제28항에 있어서, 혈소판 응집 저해제가 Mpr-K-G-D-W-P-C-NH2인 것을 특징으로 하는 PAI.
  36. 제28항에 있어서, 혈소판 응집 저해제가 Mpr-K-G-D-W(포밀)-P-C-NH2인 것을 특징으로 하는 PAI.
  37. 제28항에 있어서, 혈소판 응집 저해제가 Mvl-K-G-D-W-P-C-NH2인 것을 특징으로 하는 PAI.
  38. 제28항에 있어서, 혈소판 응집 저해제가 Mpr-K-G-D-W-P-Pen-NH2인 것을 특징으로 하는 PAI.
  39. 제28항에 있어서, 혈소판 응집 저해제가 Mpr-K-G-D-W-(Pip)-Pen-NH2인 것을 특징으로 하는 PAI.
  40. 제28항에 있어서, 혈소판 응집 저해제가 Mpr-(아세트이미딜-Lys)-G-D-W-P-C-NH2인 것을 특징으로 하는 PAI.
  41. 제28항에 있어서, 혈소판 응집 저해제가 Mpr-(아세트이미딜-Lys)-G-D-W-P-Pen-NH2인 것을 특징으로 하는 PAI.
  42. 제28항에 있어서, 혈소판 응집 저해제가 Mpr-Har-G-D-W-(3,4-디히드로-Pro)-C-NH2인 것을 특징으로 하는 PAI.
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