NO304267B1

NO304267B1 - AnalogifremgangsmÕte for fremstilling av en terapeutisk aktiv spesifikk blodplateaggregasjonsinhibitor (PAI) peptid

Info

Publication number: NO304267B1
Application number: NO914962A
Authority: NO
Inventors: Robert M Scarborough; David Lawrence Wolf; Israel F Charo
Original assignee: Cor Therapeutics Inc
Priority date: 1989-06-16
Filing date: 1991-12-16
Publication date: 1998-11-23
Also published as: ATE146969T1; DE69029579D1; DK0477295T3; NO982249L; NO312965B1; WO1990015620A1; NO982249D0; ES2097150T3; AU636159B2; EP0477295B1; NO914962L; LU90488I2; CA2059124C; FI104364B; DE69029579T3; EP0477295A1; NL990043I1; AU6036990A; DE69029579T2; US5318899A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører analogifremgangsmåte for fremstilling av en terapeutisk aktiv spesifikk blodplateaggregasjonsinhibitor (PAI) peptid med evne til å inhibere bindingen av Fg eller vWF, GP Ilb-IIIa med vesentlig mer, dvs. at enten er prosent inhibisjon minst to ganger høyere ved en gitt konsentrasjon av PAI eller at konsentrasjonen av PAI som forårsaker 50$ inhibisjon, er minst to ganger mindre for Fg eller vWF/GP Ilb-IIIa bindingsinhibisjonen enn for alternativ 1igand/-reseptorbinding.

Peptidene er beslektet med blodplateaggregasjonsinhibitorer, isolert og renset fra forskjellige slangevenomer. Disse peptidene er nyttige som terapeutiske midler for behandling av, og forhindring av, blodplateassosierte, ischemiske forstyrrelser. De blokkerer spesifikke reseptorer for adhesiv-proteiner involvert i adherens og aggregasjon av blodplater.

Hjertesykdom er hovedårsaken til dødsfall i de fleste vest-lige land. Dødsfall forårsaket av hjertesykdom er ofte indusert av blodplate-avhengige ischemiske syndromer som blir initiert av aterosklerose og arteriosklerose og omfatter, men er ikke begrenset til, akutt myokardialt infarkt, kronisk ustabil angina, transient ischemiske angrep og slag, perifer vaskulaer sykdom, arteriell trombose, preeklampsi, embolisme, restenose og/eller trombose etter angioplasti, karotid endarterektomi, anastomose av vaskulære podninger, og kronisk kardiovaskulære anordninger (f.eks. inngående katetere eller ledende "ekstrakorporale sirkulerende anordninger"). Disse syndromene representerer forskjellige stenotiske og okklusive vaskulære forstyrrelser som antas å bli initiert ved blod-plateaktivering enten på karvegger eller innenfor hulrommet av blodbårne mediatorer, men er manifistert av blodplateaggregater som danner tromber som hemmer strømningen av blod.

Mange studier har bidratt til en forståelse av mekanismen ved blodplateaggregering og trombedannelse. Blodplater reagerer overfor forskjellige skader på blodkar, såsom innsnevring av åpningen, plakkdannelse og tilstedeværelse av fremmede legemer (f.eks. katetre), o.l. Responsen til blodplatene i disse skadene er en sekvens av hendelser som omfatter blod-plateadherens og aktivering, og frigjøring av blodplate-komponenter, inkludert potente cellulære mytogene faktorer. De aktiverte blodplateaggregatene induserer dannelsen av fibrin som videre stabiliserer trombene.

Mye er nå kjent om mekanismene som regulerer disse respon-sene. Til tross for at ustimulerte blodplater inneholder reseptorer for flere adhesive proteiner inkludert laminin (VLA 2, VLA 6) og kollagen (VLA 2, GPIV, andre), antas den opprinnelige kobling av blodplatene til subendotelet å være formidlet av bindingen av blodplatemembranglykoproteinet (GP) Ib til den immobiliserte von Willebrand faktoren. Påfølgende aktivering av blodplater kan bli initiert av en eller flere kjente fysiologiske agonister inkludert: ADP, efenifrin, trombin, kollagen og tromboksan A2.

Blodplateaggregasjonen er mediert av GP Ilb-IIIa komplekset på overflaten av blodplatemembranen. GP Ilb-IIIa eksisterer på overflaten av ustimulerte blodplater i en inaktiv form. Når blodplatene blir aktivert ved adhesjon og de fysiologiske agonistene, blir GP Ilb-IIIb også aktivert slik at den blir en reseptor for fibrinogen (Fg), von Willebrand faktor (wWF), og fibronektin (Fn) (se Phillips et al., Blood (1988) 71:831-843); det antas derimot at bindingen av fibrinogen og/eller von Willebrand faktor er hovedsakelig ansvarlig for blod-aggregasjon og trombedannelsen in vivo. Forbindelser som spesifikt inhiberer bindingen av fibrinogen eller von Willebrand faktor til GP Ilb-IIIa inhiberer blodplateaggregasjon og kan være kandidater for inhibering av trombedannelsen in vivo.

Blodplate GP Ilb-IIIa er nå kjent for å være et medlem av en superfamilie av strukturelt beslektede adhesive proteinreseptorer kjent kollektivt som "integriner". Som GP Ilb- Illa er alle integrinene som er kjent opp til nå, molekylet med to subenheter med en større alfa-subenhet (f.eks. GP Ilb) og en mindre beta-superenhet (f.eks. GP Illa). Det er en høy grad av homologi mellom de kjente sekvensene til integrin-subenhetene, og dette tyder på at integrinene er utviklet fra en felles forløper. Integrinene virker i forskjellige cellulære adhesjoner, og er blitt funnet i leukocytter, endote-liske celler, glatte muskelceller og andre celler i muskula-turen. P.g.a. at integriner er meget spredte, mens GP Ilb-Illa er begrenset til blodplatene, vil et foretrukket anti-aggregeringsmiddel selektivt inhibere GP Ilb-IIIa i forhold til andre integriner.

Flere klasser av peptider er blitt beskrevet som blokkerer bindingen av adhesive proteiner til aktiverte blodplater, og som inhiberer blodplateaggregasjonen (se Hawiger et al., US patent 4.661.471; og Rouslahti et al., US patentene 4.614.517; 4.578.079; 4.792.525; og UK-søknad GB 2.207.922A). I en klasse av peptider er sekvensene RGD kritisk, og tetra-peptidsekvensene RGDS, RGDT, RGDC er blitt anvendt spesifikt. Aminosyresekvensen RGDX finnes i forskjellige adhesiv-proteiner inkludert Fg, Vn, vWF og Fn. Denne sekvensen er blitt demonstrert å spille en viktig rolle ved interaksjonen ved adhesive proteiner med adhesive proteinreseptorer p.g.a. at peptider inneholdende disse sekvensene blokkerer bindingen av adhesive proteiner. Se f.eks. Pierschbacher, M.D. et al., J. Biol. Chem (1987) 26217294-17298; Ruggeri et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USDA) (1986) 83:5708-5712; og Rouslahti et al. Cell (1986) 44:517-518. Tetrapeptider inneholdende denne sekvensen er beskrevet i EP søknad 319.506 publisert 7. juni 1989. Korte peptider inneholdende homoarginin istedenfor arginin i RGD-sekvensene er beskrevet i PCT-søknad W089/07609 publisert 24. august 1989.

De strukturelle variasjonene som er tillatt i RGD-inneholdende peptider, er blitt undersøkt av Pierschbacher M.D. et al., J. Biol. Chem. (supra). I disse studiene ble det funnet at manipulering av den RGD-inneholdende sekvensen ikke bare påvirket aktiviteten relatert til inhibisjon av bindingen av fibronektin eller vitronektin til substratet, men kunne også påvirke differensieringen mellom bindingene av de to ligandene. Peptidsekvensen GRGDSPC som ble tatt fra cellekoblingsdomenen til fibronektin, ble anvendt som et modellpeptid. Visse substitusjoner, såsom erstatning av L-Arg med D-Arg ser ikke ut til å ha noen virkning på bindingen av hvilke som helst av liganden, men substituering av D-Ala for Gly, eller D-Asp for L-Asp ødelegger inhibisjonsaktivite-ten. P.g.a. at substituering D-Ser med L-Ser reduserte inhibisjonen av nitronektininteraksjonen med vitronektin-reseptoren, var det liten virkning på fibronektininteraksjo-nen med fibronektinreseptoren; substitusjon av Asn for Ser resulterte i et peptid som hadde forsterket inhibisjon av fibronektinbinding, og en redusert virkning på vitronektinbindingen. Alternative substisjoner for Ser hadde andre virkninger. Treonin substituert for Ser ga et peptid med øket inhibisjon for binding til nitronektinreseptoren og substitusjon av L-Pro førte til et inaktivt peptid. Et cyklisk peptid ble også fremstilt av sekvensen Gly-Pen-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys-Ala, der "Pen" er penicillamin, og en disulfidbro ble dannet mellom Pen og Cys. Penicillamin hadde ifølge forfatterne en funksjon som førte til økning av kon-formasjonshemming på ringen, mens N-terminal Gly og karboksy-terminal Ala ble tilsatt for å distansere de frie amino- og karboksylgruppene fra ringen. Dette cykliske peptidet kunne inhibere nitronektinbindingen sterkere enn det samme peptidet før cyklisering, men var ineffektiv når det gjelder in-hiber ing av fibronektinbindingen.

Nylig ble et antitrombotisk peptid med en modifikasjon av RGD-sekvensen som hadde "R"-residiet alkylert, rapportert av Samanen, J. et al., J Cell Biochem (1990) Suppl 14A:A229. En oversikt på struktur/aktivitetsforhold i RGD-inneholdende peptider er blitt publisert av Ali, F.E. et al. i Proe. llth Am. Peptide Symp., Marshall et al., ed. ESCOM Leiden 1990. Europeisk patentsøknad, publ. nr. 341.915 publisert 15. november 1989 beskriver to grupper av peptider, den ene er lineær og den andre er cyklisk, som binder blodplate GP Ilb-Illa reseptoren og dermed for å inhibere dets evne til å binde vWF, fibronektin og f ibronogen-f ibrin. Det er ikke tilveiebragt data som vedrører spesifisiteten av binding av disse peptidene. Gruppen av cykliske peptider inkluderer modifikasjoner av RGD-sekvensen der R er substituert med D eller L homarginin, dimetyl eller dietylarginin, lysin eller et alfa-alkylert derivat av disse residiene. Minimale cykliske strukturer omfatter bare "R" GD-sekvensen innlemmet mellom de to residiene som danner disulfidbroen.

En separat klasse av inhibitoriske peptider anvender peptid-sekvenser vist på den karboksylterminale sekvensen avledet fra gamma-kjeden til fibrinogen, dodecapeptid HHLGGAQKAGDV (Kloczewiak et al., Biochemistry (1989) 28:2915-2919; Timmons et al., (Ibid), 2919-2923 US patent 4.661.471 (ovenfor); EP-søknad 298.820). Til tross for at denne sekvensen inhiberer Fg og vWF-bindingen til GP Ilb-IIIa og påfølgende blodplateaggregasjon, er nyttigheten av dette peptidet begrenset p.g.a. at det har en lav affinitet for interakjon med blod-platereseptorene (IC50= 10-100 uM).

I den senere tiden har flere grupper isolert ogkarakteriserten ny klasse polypeptidfaktorer med lav molekylvekt fra slangevenomer som har ekstremt høy affinitet for GP Ilb-IIIa kompleks. Huang, T.-F., et al., J. Biol Chem )1987) 262:16157-16163; Huang, T.-F., et al., Biochemistry (1989) 28:661-666 rapporterer den primære strukturen til trigramin, et 72 aminosyrepeptid inneholdende RGD og 6 disulfidbroer Isolert fra Trimeresurus gramineus. Gan, Z.-R., et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:19827-19832 rapporterer egenskapene og strukturen til echistatin, et 49 aminosyrepeptid som også inneholder RGD og 4 antatte disulfidbroer som er isolert fra Echis carinatus. Williams, J.A. et al., FASEB Journal

(1989) 3:A310, Abstr. No. 487m, rapporterer sekvensen og egenskapene til de beslektede peptidene elegantln, albolabrin og flavovlrldln. I tillegg ble karakterisering av bitistatin rapportert av Shebuski, R. J. et al., J. Biol. Chem. (1989) 264:21550-21556; og PAI fra Agkistrodon piscivorus piscivorus rapportert av Chao, B. H., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA

(1989) 86:8050-8054. Forholdet mellom forskjellige GP Ilb-Illa antagonister fra slangevenomer ble diskutert av Dennis, M.S., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1989) 87:2471-2475.

Innbefattet i denne gruppen av inhibitoriske peptider fra slangevenomer er alboadrin isolert fra Trimeresurus albo-labris, elegatin isolert fra T. elegans, flavoviridin isolert fra T. flavoviridis, baktroxostatin isolert fra Bothrops atrox, bistatin isolert fra Bitis arietans rapportert av Niewiarowski, S. , et al., Throms Haemostas (1989) 62:319 (Abstr. SY-XIV-5). I tillegg er applaggin blitt renset fra Agkistrodon p. piscivorus og rapportert av Chao, B. et al., Throms. Haemostas (1989) 62:50 (Abstr. 120) og halysin, renset fra Agkistrodon halys som ble rapportert av Huang, T. F. et al., Throms haemostas (1989) 62:48 (Abstr. 112). Alle disse peptidene viser en høy grad av sekvenshomologi. Alle peptidene rapportert opp til nå fra slangevenomer som inhiberer bindingen av adhesive proteiner til integrinreseptorer, inneholder RGD-sekvensen.

Til tross for at disse rapporterte slangevenomfaktorene er potente inhibitorer av blodplateaggregasjonen in vitro, så bindes disse peptidene med høy affinitet også til andre medlemmer av adhesivproteinreseptorer såsom vitronektin og f ibronektinreseptorer (Knudsen, K. A. et al., Exp. Cell. Res. (1988) 179:42-49; Rucinski, B. et al., Throms Haemostas

(1989) 62:50 (Abstr. 120). Denne mangelen på spesifisitet for slangevenomfaktorer for GP Ilb-IIIa er et uønsket trekk ved deres terapeutiske anvendelse som inhibitorer av trombedannelsen, p.g.a. at de har potensiale for å tilveiebringe de adhesive egenskapene til andre celler i vaskulaturet, spesielt adhesjonene formidlet av integriner.

En annen tilnærmelse utviklet for dannelsen av blodplate-trombeinhibitorer har vært anvendelse av murine anti-GP Ilb-Illa monoklonale antistoffer som blokkerer bindingen av de adhesive proteinene for å stimulere blodplatene. Disse monoklonale antistoffene er blitt anvendt for å forhindre koronar arterioreokklusjon etter reperfusjon med en vevs-plasminogenaktor i hunder (Yasuda, T. et al., J. Clin. Invest. (1988) 81:1284-1291) og forhindre cyklisk reduksjon av strømningen i skadede kaninkoronararterier med en høy grad av stenose. Potensielle bivirkninger ved anvendelse av slike monoklonale antistoffer i mennesker kan resultere fra deres lengdevirkende virkninger og fra deres potensielle immunoge-nisitet.

Ytterligere terapeutiske behandlingsregimer er nødvendig for å forhindre eller i det minste mitigere uønsket trombedannelse. Terapeutiske midler som kan blokkere eller inhibere trombedannelsen ved spesifikke lokalisasjoner uten kompromittering av hemostasen og uten å påvirke andre cellulære adhesjoner, vil tilveiebringe store terapeutiske for-deler. Disse midlene bør være potente, spesifikke for GP Ilb-IIIa og ikke-immunogene overfor de fleste pasientene, og bør også være lette å administrere, stabile og økonomisk å fremstille. Disse midlene bør virke forbigående, og kunne virke på de tidligste stadiene av trombedannelsen uten å interferere med lang-tidshemostasen.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en analogifremgangsmåte for fremstilling av en terapeutisk aktiv spesifikk blodplateaggregasjonsinhibitor (PAI) peptid med evne til å inhibere bindingen av Fg eller vWF, GP Ilb-IIIa med vesentlig mer, det vil si at enten er prosent inhibisjon minst to ganger høyere ved en gitt konsentrasjon av PAI eller at konsentrasjonen av PAI som forårsaker 50$ inhibisjon, er minst to ganger mindre for Fg eller vWF/GP Ilb-IIIa-bindingsinhibisjonen enn for alternativ ligand/-reseptorbinding, dvs. potenthet enn inhibering av bindingen av vitronektin til vitronektinreseptoren eller fibronektin til fibronektinreseptoren, der PAI har formelen:

hvori K<*>er et lysylresidie med formelen:

R<1>2N(CH2)4CHNHC0- ,

hvori hver R<1>er uavhengig H, alkyl (1-6C) eller optil en R<1>erR<2->C=NR3 ,

hvori R<2>er H, alkyl (1-6C) eller er en substituert eller usubstituert fenyl eller benzylrest, eller NR<4>2der hver R<4>er uavhengig H eller alkyl (1-6C), og

R<3>er H, alkyl (1-6C), fenyl eller benzyl, eller r<2->C=NR<3>er en rest valgt fra gruppen bestående av:

hvor m er et tall på 2-3, og hver R^ er uavhengig H eller alkyl (1-6C);

og der en eller to (CH2) kan bli erstattet med 0 eller S forutsatt at nevnte 0 eller S ikke er ved siden av et annet heteroatom;

AAjer en liten, nøytral (polar eller upolar) aminosyre, og ni er et tall på 0-3;

AA2er en nøytral, upolar, stor (aromatisk eller uaromatisk) eller en polar aromatisk aminosyre, og n2 er et tall på 0-3;

AÅ3er et prolinresidie eller et modifisert prolinresidie og n3 er et tall på 0-1;

AA4er en nøytral, liten aminosyre eller den N-acylerte form derav, og n4 er et tall på 0-3;

hver av og X2er uavhengig en residie som kan danne en binding mellom X^og X2for å oppnå en cyklisk forbindelse som vist;

hver av Yj og Y2er uavhengig en ikke-interfererende substituent, eller kan være fraværende;

hvor en eller flere peptidbindinger eventuelt kan bli erstattet av en binding valgt fra gruppen bestående av —CH2NE—, -CH2S-, CH2CE2-, -CE=CH- (cis og trans), -C0CH2-, -CH(0H)CH2- og -CH2S0-;

forutsatt at dersom n3 er 0; er enten:

1) summen av n2 og n4 minst 2; eller

2) K<*>må være forskjellig fra Har eller K; eller

3) X2må være forskjellige fra Cys (C), penicillamin (Pen), eller 2-amino-3,3-cyklopentanmetylen-3-merkaptopropionsyre (APmp); eller 4) en eller flere peptidbindinger er erstattet med nevnte alternerende binding, kjennetegnet ved at den

omfatter:

begynne syntesen fra den karboksy-terminale enden av nevnte peptid ved anvendelse av en aminosyre som har en alfa-amlnobeskyttende gruppe, i det nevnte aminosyre er bundet til en harpiskbærer, fullføre oppstillingen av en beskyttet peptid-harpikskjede, fjerning av nevnte beskyttelsesgruppe, spaltning av nevnte peptid fra nevnte harpiks, syklisering av nevnte peptid og eventuelt rensing av nevnte peptid.

Forståelsen om at blodplateaggregering hovedsakelig blir oppnådd gjennom binding av fibrinogen og/eller vWF til GP Ilb-IIIa på overflaten av blodoplatene når blodplatene blir behandlet med hensiktsmessig stimuli, såsom ADP er viktig. Ved anvendelse av disse kriteriene, dvs. inhibisjon av binding av fibrinogen og/eller vWF til isolert reseptor og analoge kriterier relatert til inhibisjon av binding av fibronektin (Fn) til fibronektinreseptoren (Fn/FnR-binding) og vitronektin til vitronektinreseptoren (Vn/VnR-binding), samt binding av andre faktorer, såsom Fn og Vn til GP Ilb-Illa, en spesifisitetsprofil for blodplateaggregasjons-inhibitoren (PAI) kan hurtig og hensiktsmessig bli oppnådd. Denne tilnærmelsen er blitt anvendt for å screene og karakterisere et omfattende panel av slangevenomer for tilstedeværelse eller fravær av PAI, for å karakterisere spesifisiteten til PAI identifisert fra dette panelet på deres spesifisitet til å inhibere binding til GP Ilb-IIIa i forhold til inhibering av andre integriner, og å identifisere aktive peptider som er derivater av PAI.

PAI kan bli isolert fra aktiv slangevenom og fra Echis colorata, Eristicophis macmahonii; A. hypnale, A. acutus, A. piscivorous leucostoma, A. piscivorus conanti; Bothrops asper; Bothrops cotiara, B. jararaca, B. jararacussi, B. lansbergi, B. medusa, B. nasuta, B. neuwiedi, B. pradoi, B. schlegli, Crotalus atrox, C. basilicus, C. cerastes cerastes, C. durissus surissus, C. durissus totonatacus, C. horridus horridus, C. molossus molossus, C. ruber ruber, C. viridis cereberus, Crotalus v. helleri, Crotalus v. lutosus, Crotalus v. oreganus, Crotalus v. viridis; Lachesis mutas; Sistrurus catenatus tergeminus, og Sistrurus milarus barbouri.

PAI i isolert form fremstilt fra, eller med aminosyresekvensene til de som er oppnådd fra Eristicophis macmahonii (eristicophin); Bothrops cotiara (cotiarin); B. jararacussu; Crotalus atrox (crotatroxin); Crotalus basilicus (basilicin); C. cerastes cerastes (cerastin); C. durissus totanatacus (durissin); C. durissus durissus (durissin); C. h. horridus (horridin); Crotalus m. molossus (molossin); C. ruber ruber (ruberin); Crotalus viridis lutosus (lutosin); C. v. viridis (viridin); Crotalus v. oreganus (oreganin); Crotalus v. helleri; Lachesis mutas (lachesin); Sistrurus catenatus tergeminus (tergeminin); og S. milarus barbouri (barbourin) er foretrukne.

Spesielt foretrukket er eristicophin, cotiarin, crotatroxin, cerastin, durissin, horridin, ruberin, lachesin, basilicin, lutosin, molossin, oreganin, viridin, tergeminin og barbourin .

I et annet hovedaspekt er oppfinnelsen rettet mot fremstilling av en gruppe peptider eller peptid-relaterte forbindelser som generelt er blodplateaggregasjonsinhibitorer som kan inhibere bindingen av Fg eller vWF til GP Ilb-IIIa ved en vesentlig høyere potenthet enn den hvor det inhiberer bindingen av vitronektin til vitronektinreseptoren eller fibronektin til fibronektinreseptoren. Disse peptidene erkarakterisert vedå ha bindingssekvensen K<*>GDX istedenfor RGDX-bindingssekvensen som finnes i tidligere PAI-proteiner. Barbourin PAI isolert fra S. milarus barbouri er en illustra-sjon på denne serie av peptider. Kortere former av dette peptidet kan derimot også bli anvendt, samt analoge sekvenser som også inneholder 1-10 aminosyreresidiemodifikasjoner andre steder i peptidkjeden, og/eller erstatning av peptidbindinger med alternative bindinger. Andre illustrerende utførelses-former omfatter isolerte PAI-peptider med en nativ RGDX-sekvens der denne er erstattet med K<*>GDX. Som når det gjelder barbourin kan disse isolerte PAI være i nativ form eller være forkortede og/eller inneholde 1-10 aminosyreresidiesubstitu-sjon eller delesjoner, og/eller kan ha ikke-peptidbindinger substituert for peptidbindinger.

En annen illustrerende gruppe av utførelsesformer er peptider eller modifiserte peptider med en spesifikk PAI-aktivitet med formel:

hvor K<*>er en substituert eller usubstituert lysylrest med formel R<1>2N(CH2)4CHNHCO- som beskrevet ovenfor,

der hver R<1>er uavhengig H, alkyl (1-6C) eller mest en R<1>er R<2->C=NR<3>,

der R<2>er H, alkyl (1-6C) eller en substituert eller usubstituert fenyl- eller benzylrest, eller NR<4>2der hver R<4>er uavhengig H eller alkyl(1-6C), og

R<3>er H, alkyl(1-6C), fenyl eller benzyl, eller

R<2->C=NR<3>er en rest valgt fra gruppen bestående av:

hvor m er et tall på 2-3, og hver R<5>er uavhengig H eller alkyl(1-6C);

AA-l er en liten, nøytral (polar eller upolar) aminosyre, og ni er et tall på 0-3;

AA2er en nøytral, upolar, stor (aromatisk eller ikke-aromatisk) eller en polar aromatisk aminosyre, og n2 er et tall på 0-3;

AA3er en prolinrest eller en modifisert prolinrest (som definert nedenfor), og n3 er et tall på 0-1;

AA4er en nøytral, liten aminosyre eller n-alkylert form derav, og n4 er et tall på 0-3;

hver av og X2er uavhengig en rest som kan danne en binding mellom X^og X2for å oppnå en cyklisk forbindelse som vist; og

hver av og Y2er uavhengig en ikke-interfererende substituent, eller kan være fraværende;

hvori en eller flere peptidbindinger eventuelt kan bli erstattet av en binding valgt fra gruppen bestående av —CH2NH-, -CH2S-, -CH=CH- (cis og trans), -C0CH2-, -CH(0H)CH2-og -CH2S0-;

forutsatt at dersom n3 er 0; enten:

1) summen av n2 og n4 må være minst 2; eller

2) KH må være forskjellig fra Har eller K; eller

3) X2må være forskjellig fra cys (C), penicillamin (Pen) eller 2-amino-3,3-cyklopentanmetylen-3-merkaptopropionsyre (APmo); eller 4) Y±eller Y2må omfatte minst en aminosyreresidie; eller 5) en eller flere peptidbindinger blir erstattet med nevnte alternative binding.

Andre aspekter av oppfinnelsen vedrører rekombinante fremgangsmåter og materialer vedrørende fremstilling av disse og andre beslektede peptider, fremgangsmåter ved in vitro fremstilling derav, farmasøytiske sammensetninger inneholdende disse forbindelsene, og fremgangsmåte for å inhibere blodplateaggregasjon og trombedannelse ved anvendelse av disse forbindelsene og sammensetningene.

Kort beskrivelse av tegningene:

Fig. 1 viser inhibisjon av bindingen av fibrinogen til GP Ilb-IIIa ved delvis rensede slangevenomer. Fig. 2 viser dose-responsadhesjonsinhibisjonen av Centricon-10 ultrafiltrater av råvenomer i både fibrinogen/GP Ilb-IIIa og vitronektin/vitronektinreseptoranalyser. Fig. 3 viser HPLC-profilen til rå PAI fra Eristicophis macmahoni venom. Det skraverte området inneholder de biologisk aktive fraksjonene. Fig. 4 viser HPLC-prof ilen til PAI-fraksjonene fra fig. 3. Det skraverte området inneholder de bioaktive fraksjonene. Fig. 5 viser den analytiske HPLC-profilen til PAI fraksjonene fra fig. 4. Fig. 6 viser de fullstendige aminosyresekvensene til eristicophin, barbourin, tergeminin, cerastin, ruberin, lachesin, cotiarin, crotatroxin, horridin. lutosin, viridin, molossin, basilicin, durissin, jararacin, cerebrin og oreganin, og enzymspaltede fragmenter bestemt ved automatisert Edman-degradering. Fig. 7 viser HPLC-prof ilen til PAI oppnådd fra G-50 fraksjonene til rå Sistrurus c. tergeminus venom. Fig. 8 viser HPLC-profilen til PAI fraksjonene fra fig. 7. Fig. 9 viser aktiviteten til renset PAI ifølge fig. 8 i inhiberende binding i flere reseptoranalyser. Fig. 10 viser HPLC-profi len til blodplateaggregasjons-inhibitoren oppnådd fra G-50 fraksjonene til rå Sistrurus m. barbouri ven. De skraverte områder inneholder de bioaktive fraksjonene. Fig. 11 viser HPLC-profilen til aktive PAI-fraksjoner ifølge fig. 10. Fig. 12 sammenligner aminosyresekvensene til et antall PAI i forhold til barbourin. Fig. 13 viser HPLC-prof ilen til rå PAI fra Lachesis mutas venom. Skraverte områder inneholder de biologisk aktive f raksjonene. Fig. 14 viser HPLC profilen til PAI-aktive fraksjoner fra fig. 13. Det skraverte området inneholder de biologisk aktive fraksjonene. Fig. 15 viser den analytiske HPLC-profilen til PAI-fraksjonene ifølge fig. 14 fra Lachesis mutas. Fig. 16 viser HPLC-profilen til rå PAI fra Crotalus viridis viridis venom. Det skraverte området inneholder de biologisk aktive fraksjonene. Fig. 17 viser HPLC-profilen til PAI-fraksjonene ifølge fig. 16. Fig. 18 viser dose-responsvirkningene til renset slangevenompeptider for inhibert fibrinogem/GP Ilb-IIIa binding sammenlignet med echistatin. Fig. 19 viser dose-responsvirkningene av rensede slangevenompeptider for inhibert ADP (4 jjM) indusert human blodplateaggregasjon i blodplateanriket plasma (PRP), sammenlignet med echistatin. Fig. 20 viser aktivitetsprofilen fra HPLC-fraksjonering av C.

c. cerastes venom.

Fig. 21 viser resultatene av HPLC-analysen av aktive fraksjoner fra fig. 20. Fig. 22 viser aktivitetsprofilen av HPLC-fraksjonering av PAI fra C. ruber ruber. Fig. 23 viser aktivitetsprofilen fra en analytisk C-18-kolonne på homogent peptid oppnådd fra C. atrox. Fig. 24 viser den analytiske HPLC-profilen til det homogene peptidet isolert fra Bothrops cotiara. Fig. 25 viser dose-responsvirkningene av renset cotiarin på inhibering av bindingen av fibrinogen til GP Ilb-IIIa og inhlbering av bindingen av vitronektin til vitronektin-reseptoren. Fig. 26 viser virkningene av renset slangevenompeptider på bindingen av fibrinogen til GP Ilb-IIIa og vitronektin til vitronektin-reseptoren. Fig. 27 viser resultatene av bindingsaktiviteten for analog nr. l, [E<2>8L41C64)barbourin (28-73) med hensyn på GP Ilb-Illa og vitronektinreseptoren. Fig. 28 viser evnen som syntetisk eristicophinanalogen har til å inhibere bindingen av fibrinogen til GP Ilb-IIIa og manglende evne til å inhibere bindingen av vitronektin til vitronektinreseptoren. Fig. 29 viser evnen som lineære og cykliske RGDW-forbindelser og lineære og cykliske KGDW-forbindelser har til å inhibere bindingen av fibrinogen til GP Ilb-IIIa. Fig. 30 viser evnen som forskjellige KGDW-analoger har til å inhibere bindingen av fibrinogen til GP Ilb-IIIa og inhibere bindingen av vitronektin til vitronektinreseptoren. Fig. 31 viser evnen som forskjellige native og syntetiske blodplateaggrgasjonsinhibitorer har til å inhibere koblingen av M21 melanomceller til vitronektin. Fig. 32 viser evnen som RGDS og en cyklisk RGD-forbindelse har til å inhibere koblingen av M21 melanomceller til vitronektin og den manglende evnen som en cyklisk KGDW-analog har til å inhibere koblingen av M21 melanomceller til vitronektin . Fig. 33 viser aktiviteten til analog nr. 60, Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NHg, for inhibering av aggregasjonen av blodplater og celleadhesjon til vitronektin. Fig. 34 viser aktivitetene ifølge fig. 33 for analog 19, Mpr-K-G-D-W-P-C-NH2. Fig. 35 viser initiering av cykliske strømningsreduksjoner (CFRs) i en åpen brysthundsmodell for trombose (Folts modell). Fig. 36 viser virkningene av en 10 mg bolusdoseadministrering på CFRs initiert i åpen brysthundmodell for trombose (Folts modell). Fig. 37 viser virkningene av en 40 mg bolusdoseadministrasjon på CFRs initiert i åpen brysthundmodell for trombose (Folts modell). Fig. 38 viser full-lengde DNA sekvens kodende for aminosyresekvensen til barbourin (1-73). Fig. 39 viser DNA-sekvensen kodende for [M-lL41]barbourin (1-73) ligert til PhoA-ledersekvens. Fig. 40 viser DNA-sekvensen kodende for analog nr. 1 koblet til en PhoA-sekvens for ekspresjon i bakterier. Fig. 41 viser oligonukleotider anvendt i en PCR-reaksjon for å oppnå DNA-kodende analog nr. 1. Aminosyrene inkludert i analogen per se er vist i uthevet skrift. Fig. 42 viser grensesekvensen til tandemgjentagelsene av analog nr. 1-kodende DNA. Fig. 43 viser et diagram av det forkortede barbouringenet som tandemgj entagelser.

Fremgangsmåter for å utføre oppfinnelsen

Oppfinnelsen tilveiebringer blodplateaggregasjonsinhibitorer (PAI) som kan bli isolert fra slangevenom som er blitt identifisert som aktiv ved en analysefremgangsmåte og forbindelser som har lignende strukturer og blir fremstilt ved anvendelse av standard in vitro teknikker, såsom fastfase-peptidsyntese eller anvendelse av rekombinante fremgangsmåter, eller kombinasjon av disse. Noen av disse inhibi-torene er unikt spesifikke for inhibisjon av blodplateaggregasjon, og inhiberer ikke alternativ binding innenfor integrinfamilien. Andre har forskjellige spesifisitets-områder. Nedenfor beskrives isolering av naturlig forekommende PAI fra slangevenom; konstruksjon av inhibitorer som har vesentlig høyere potenthet når det gjelder inhibering av blodplateaggregasjonen enn inhibering av f.eks. vitronektin/- vitronektinreseptorinteraksjonen ved inkorporering av en K*GD-sekvens i forhol til RGD; fremgangsmåte for fremstilling av disse peptidene; fremgangsmåte for rekombinant produksjon; antistoffer dannet mot peptidene fremstilt ifølge opp finnelsen; analysefremgangsmåten som muliggjør identifikasjon av slangevenomer som inneholder PAI; og administrasjon og anvendelse av PAI.

Med PAI menes en faktor som kan forhindre aggregasjonen av stimulerte blodplater i standardanalyser, f.eks. de som er beskrevet av Gan, Z.R., et al., og Huang, T.-F., et al., (ovenfor). I disse analysene blir vaskede blodplater kombi-nert med fibrinogen, Ca<+2>og materialet som blir testet. Blodplatene blir stimulert med ADP (eller andre kjente stimuleringsmidler eller kombinasjoner derav), og aggregasjon (eller mangel derpå) blir observert ved f.eks. anvendelse av et kommersielt tilgjengelig aggregometer.

Noen av PAI fremstilt ifølge oppfinnelsen er identifisert som spesifikke for inhibisjonen av bindingen av fibrinogen og/eller vWF til GP Ilb-IIIa. Det fremgår at spesifisiteten er av forskjellig grad, og inhiberer derfor en PAI spesifikk for inhibisjon av Fg eller vWF-binding til GP Ilb-IIIa denne bindingen vesentlig mer enn den inhiberer bindingen av Fn til FnR, eller Vn til VnR. Med "vesentlig mer" menes at enten er prosent inhibisjon minst to ganger høyere ved en gitt konsentrasjon av PAI eller at konsentrasjonen av PAI som forårsaker 50$ inhibisjon, er minst to ganger mindre for Fg eller vWF/GP Ilb-IIIa-bindingsinhibisjonen enn for alternativ ligand/- reseptorbinding.

Isolert nativt PAI og rensningsmetoder

Blodplateaggregasjonsinhibitorer (PAI) omfatter peptider med lav molekylvekt som kan bli fremstilt i isolert form, som beskrevet nedenfor, fra slangevenom som er blitt identifisert som "aktivt", dvs. er blitt funnet å inneholde PAI.

Det er mulig med en enkel identifikasjon og karakterisering av tilstedeværelse av en effektiv PAI i slangevenom som selektivt inhiberer bindingen til GP Ilb-IIIa i forhold til andre integriner som, f.eks. vitronektinreseptoren og f ibronektinreseptoren. Ved en slik identifikasjon og eventuelt og optimalt, karakterisering, kan PAI bli isolert og renset ved anvendelse av forskjellige standardteknikker illustrert heri og beskrevet innenfor fagområdet. En kombinasjon av separasjon basert på molekylvekt (vanlig isolering av forbindelser på < 10 kd), ionebyttekromatografi og revers fase HPLC kan bli anvendt. Andre teknikker kan også bli anvendt, men en egnet fremgangsmåte anvendbar for PAI fra et hvilket som helst aktivt slangevenom er som følger: Omtrent 10-1000 mg venom blir løst opp i fortynnet eddiksyre og applisert på en størrelseskolonne, såsom Sephadex G-50, og eluert i det samme oppløsningsmiddelet. Fraksjonene blir analysert for aktivitet ved anvendelse av Fg/GP Ilb-IIIa-bindingsanalyse ifølge oppfinnelsen, en standard blod-plateaggregasjonsanalyse (PAA) eller en hvilken som helst lignende analyse som er basert på den adhesive protein-bindingsaktiviteten til GP Ilb-IIIa. Alternativt kan fraksjonen på < 10 kd ifølge fraksjonen til venomet bli isolert ved anvendelse av ultrafiltrering og analysert på lignende måte.

Lav MW-fraksjon isolert ved hvilken som helst av fremgangsmåtene ble deretter applisert på en preparativ C-18 HPLC-kolonne, såsom en C-18 Delta Pak revers fase HPLC-kolonne, tilgjengelig fra Waters, preekvilibrert i 0,1$ trifluoreddiksyre (TFA)/8# acetonitril. Adsorbert PAI ble deretter eluert ved anvendelse av en gradient på 8%- b% acetonitril i 0,1$ TFA. Stigningen på gradienten og strømningshastigheten blir optimalisert ved anvendelse av rutinemessige prosedyrer. Aktive fraksjoner blir bestemt ved PAI eller ved reseptor-bindingsfremgangsmåte. De aktive fraksjonene ble deretter slått sammen, konsentrert og testet for homogenitet ved anvendelse av analytisk HPLC eller SDS-PAGE. Ytterligere revers-fase HPLC-gradientrensning blir anvendt helt til isolert PAI er homogen.

PAI fremstilt ifølge oppfinnelsen, og følgelig oppnåelig ved foregående eller andre rensingsmetoder innbefatter dem fra venomer valgt fra gruppen bestående av Echis colorata, Eristicophis macmahonii; A. hypnale, A. acutus, A. piscivorous leucostoma, A. piscivorus conanti; Bothrops asper; Bothrops cotiara, B. jararaca, B. jararacussu, B. lansbergi, B. medusa, B. nasuta, B. neuwiedi, B. pradoi, B. schlegli; Crotalus atrox, C. basilicus, C. cerastes cerastes, C. durissus durissus, C. durissus tononatacus, C. horridus horridus, C. molossus molossus, C. ruber ruber, C. viridis cereberus, Crotalus v. helleri, Crotalus v. lutosus, Crotalus v. oreganus, Crotalus v. viridis; Lachesis mutas; Sistrurus catenatus tergeminus, og Sistrurus milarus barbouri.

Foretrukket er PAI i isolert form fremstilt fra, eller med aminosyresekvensene til, de som er oppnådd fra Eristicophis macmahonii (eristicofin); Bothrops cotiara (cotiarin); B. jararacussu; Crotalus atrox (crotatroxin); Crotalus basilicus (basilicin); C. cerastes cerastes (cerastin); C. durissus totonatacus (durissin); Crotalus d. durissus (durissin); C. h. horridus (horridin); Crotalus m. molossus (molossin); C. ruber ruber (ruberin); Crotalus viridis lutosus (lutosin); Cv. viridis (viridin); Crotalus v. oreganus (oreganin); Crotalus v. helleri; Lachesis mutas (lachesin); Sistrurus catenatus tergeminus (tergeminin); og S. milarus barbouri (barbourin). Spesielt foretrukket er PAI spesifikk for inhibering av Fg eller vWF/GP Ilb-IIIa-binding, f.eks. de fra Sistrurus m. barbouri.

Spesielt foretrukket er eristicophin, cotiarin, crotatroksin, cerastin, durissin, horridin, ruberin, lachesin, basilicin, lutosin, molossin, oreganin, viridin, tergeminin og barbourin .

Renset PAI kan bli sekvensert ved anvendelse av standard prosedyrer og som dermed muliggjør syntese ved anvendelse av standard fastfase-teknikker (spesielt for kortere former av PAI) eller rekombinant produksjon. F.eks. kan en Applied Biosystems Sequenator bli anvendt ifølge karboksyamido-metylering eller pyridyletylering av peptidet som beskrevet av Huang et al., J. Biol. Chem (1987) 262:16157-16163 etterfult av avsaltning av prøven på en C-18 Delta Pak kolonne ved anvendelse av 0,1$ TFA og acetonitril.

Isolert PAI med bestemt sekvens kan, når fremstilt in vitro, bli modifisert ved frekvensaltereringer som ikke ødelegger aktiviteten. Generelt vil disse modifiserte formene være forskjellige fra de native formene med 1-10, fortrinnsvis 1-4, aminosyresubstitusj oner eller vil være I forkortede former. I tillegg kan en eller flere peptidbindinger bli erstattet med alternative bindinger som beskrevet nedenfor. Spesielt substitusjon ved erstatning av RGD med K<*>GD for å tilveiebringe GP Ilb-IIIa spesifisitet som beskrevet nedenfor.

PAI til Sistrurus m. barbouri er blitt renset til homogenitet og sekvensert, og betegnet "barbourin". Til forskjell fra de adhesive proteinene for GP Ilb-IIIa identifisert frem til nå og peptidene fra slangevenomene som blokkerer GP Ilb-IIIa funksjonen, inneholder barbourin ikke standard Arg-Lys-Asp sekvensen til de adhesive proteinene kjent innenfor dette området. Den tilsynelatende bidingssekvensen i barbourin er Lys-Gly-Asp-(Trp). Tilstedeværelse av KGD-sekvensen i den tilsynelatende bindingsregionen til dette peptidet er spesielt overraskende i lys av observasjonen om at erstatning av Lys for Arg i små syntetiske peptider basert på RDGX-sekvensen reduserer evnen som disse peptidene har til å bli bundet til integrinreseptorene (Pierschbacher et al., Proe. Nati. Acad. Sei (USA) (1984) 81:5985-5988; Williams et al., Thromb Res (1987) 46:457-471); Huang et al., J. Biol. Chem.

(1987) 262:16157-16163. Det antas at denne substitusjonen kan delvis være ansvarlig for spesifisiteten til barbourin-peptidet for inhibering av Fg og vWF-binding til GP Ilb-IIIa, i motsetning til f.eks. inhibisjon av vitronektinbindingen til vitronektinreseptoren.

K«GDX- inneholdende peptider

"Barbourin"-peptidet er blitt vist å ha bindingssekvensen KGDX i forhold til RGDX som finnes i PAI-forbindelsene ifølge tidligere teknikk. Tilstedeværelse av KGDX i denne PAI-sekvensen ser ut til å være assosiert med en preferensiell affinitet for GP Ilb-IIIa i forhold til vitronektin eller fibronektinreseptorene. Virkningen av substitusjonen av et lysylresidie for et arginin i frekvensen ser ut til å være knyttet til den økte lengden av sidekjeden sammen med opprettholdt basisitet til nitrogenet som ytterligere beskrevet nedenfor. Det ser ut som om det ikke er lysylresidiet per se som står for den økte aktiviteten og spesifisiteten, men heller området som blir tilveiebragt ved denne homologe ekstensjonen av erstattet arginin. Peptidene som inneholder K<*>GDX i bindingssekvensen, er vesentlig mer potente til å inhibere bindingen av Fg eller vWF til GP Ilb-IIIa sammenlignet med deres evne til å inhibere bindingen av vitronektin til vitronektinreseptoren og binding av fibronektin til fibronektinreseptoren. Som angitt ovenfor menes "vesentlig mer" potent til inhibering av den foretrukne bindingen at prosent inhibisjon er minst to ganger større ved en gitt konsentrasjon av inhibitor eller at konsentrasjonen av PAI som forårsaker 50$ inhibisjon, er minst 2-3 ganger mindre for binding av Fg eller vWF til GP Ilb-IIIa enn for binding av andre ligander til andre integriner.

"Alkyl" blir hensiktsmessig definert som en lineær eller forgrenet kjede eller cyklisk heterokarbylrest med angitte antall karbonatomer såsom metyl, etyl, isopropyl, N-heksyl, 2-metylbutyl, cykloheksyl, o.l.

Benzyl- og fenylresidier representert ved R<2>kan være usub-stituerte, eller være substituert med ikke-interfererende substituenter. Foretrukne substitusjonsmønstere er de hvori bare en substituent er bundet til den aromatiske kjernen, fortrinnsvis i 4-posisjonen. Foretrukne substituenter er elektrondonerende substituenter såsom alkyl, spesielt etyl eller metyl, eller fenyl.

Eksempler på fragmenter og/eller modifiserte former av naturlig forekommende slangevenom PAI omfatter [E<28>,L<41>,C^<4>]bar-bourin (28-73) med sekvensen: og [K<2>^]eristicophin (4-51) av sekvensen.

I denne beskrivelsen er størrelsen på fragmentet angitt i parenteser etter navnet med tallene på aminosyrene som var innbefattet i fragmentet, og forstavelsesbokstavene i parenteser og tallene angir aminosyresubstitusjoner ved de numme-rerte posisjonene i det native full-lengdepeptidet. For barbourinfragmentet ovenfor dekker lengden av fragmentet residiene 28-73 inklusivt den native sekvensen og aminosyrene som er opprinnelig i posisjonene 28, 41 og 64 til den numme-rerte native sekvensen som er blitt erstattet med Glu (E), Leu (L) og Cys (C).

Som ytterligere eksempler kan argininet til RGD-sekvensen som fremkommer i trigramin, elegantin, albolabrin, crotatroksin, flavoviridin, echistatin, bitistatin, viridin, molossin, lutosin, basilicin, applagin, halysin, horridin, tergeminin, lachesin, cotiarin, cereberin, jararacin, kistrin, eristicofin, bitan-a og ruberin/oreganin kan bli erstattet med et K'-residie for å tilveiebringe spesifikt aktive PAI med en foretrukket affinitet for GP Ilb-IIIa. I tillegg kan forkortede former av disse peptidene, inneholdende minst 20, fortrinnsvis minst 30, og mer foretrukket minst 40 aminosyrer, bli fremstilt fra det native peptidet eller i denne modifiserte formen. I tillegg, eller i alternativet, kan 1-10, fortrinnsvis 1-4 aminosyrer irrelevante for RGD/K<*>GD-sekvensen bli substituert eller modifisert, fortrinnsvis med konservativ aminosyresubstitusjoner. Med konservative aminosyresubstitusjoner menes f.eks. substitusjon av et surt aminosyreresidie med et surt aminosyreresidie, nøytral for nøytral, basisk for basisk, osv. som ytterligere beskrevet nedenfor.

Y±og Y2kan være peptidekstensjoner på 0-25 aminosyreresidier og kan være i derivatisert form. Y^N-terminalekstensjonen kan f.eks. bli acetylert eller på annen måte acylert; Y2C-terminalekstensjonen kan bli amidert med NH2eller med et primært eller sekundært amin med formel R-NH2eller R2NH hvori hver R er uavhengig en lavere alkyl med 1-4C såsom metyl, n-butyl eller t-butyl. Y^kan også være (H) eller acyl; Y kan være (OH), NH2eller et amin som ovenfor. Der forbindelsen med formel (1) er et enkelt cyklisk peptid, er Yi og Y2fraværende.

Xi og X2er vanligvis aminosyreresidier som har evne til cyklisering såsom f.eks. og mest foretrukket cysteinresidier som kan danne en disulfidring. Andre residier som kan danne disulfid eller andre bindinger, kan også bli anvendt - f.eks. Pen (penicillamin) —residiet beskrevet av Pierschbacher et al. (supra) eller Mpr (merkarptopropionyl) eller Mvl (merkaptovaleryl) —residiet. Andre typer for kovalente bindinger for cyklisering som kan bli tatt I betraktning, omfatter peptidbindinger som f.eks. et amid dannet mellom side-kjedeaminogruppen til et lysylresidie med en side-kjedekarboksylgruppe til et glutamylresidie og esterbindin-ger, som vil bli dannet mellom en side-kjedealkohol til et treoninresidie med en side-kjedekarboksyl til et aspartyl-residie. Et hvilket som helst kompatibelt residie som har evne til å danne peptidbindinger med det gjenværende av kjeden (eller modifiserte peptidbindinger som beskrevet ovenfor) og med evne til dannelse av kovalent binding for å oppnå cyklisering, kan bli anvendt. Dette innbefatter f.eks. enkle cykliske peptider, hvori en peptidbinding er direkte dannet mellom NH2og N-terminusen og COOH ved C-terminusen.

Som beskrevet ovenfor kan en eller flere av de indikerte peptidbindingene bli erstattet av en erstatningsbinding såsom -CH2NH-, -CH2-S-, CH2CH2-, -CH=CH- (cis og trans), -C0CH2-,

-CH(OH)CH2- og -CH2SO-.

I betegnelsen på aminosyreresidiene AA1-AA4ovenfor har beskrivelsen blitt dannet på grunnlag av en spesifiserings-metode hvori aminosyreresidiene generelt kan bli subklassifi-sert i fire hoved-subklasser. Denne klassifiseringen er også vist i diagramform nedenfor.

Surt: Residiet har en negativ ladning p.g.a. tap av H-ion ved fysiologisk pH, og residiet er tiltrukket ved vandig opp-løsning for å søke overflateposisjoner i konformasjonen til et peptid hvor det er innbefattet når peptidet er i vandig medium ved en fysiologisk pH.

Basisk: Residiet har en positiv ladning p.g.a. assosiasjonen med H-ionet ved en fysiologisk pH, og residiet er tiltrukket av vandig oppløsning for å søke overflateposisjoner i konformasjonen til et peptid hvor det er innbefattet når peptidet er i vandig medium ved en fysiologisk pH.

Nøytral/upolar: Residiene er ikke ladede ved fysiologisk pH, og residiet blir frastøtt ved vandig oppløsning for å søke de indre posisjonene i konformasjonen til peptidet hvori det er innbefattet når peptidet er i vandig medium. Disse residiene blir også betegnet "hydrofob" heri.

Nøytrale/polare: Residiene er ikke ladet ved en fysiologisk pH, men residiet er tiltrukket av vandig oppløsning for å søke de ytre posisjonene i konf ormas j onen til et peptid som det er innbefattet i når peptidet er i vandig medium.

Det er en selvfølge at det er en statistisk samling av individuelle residiemolekyler der noen molekyler er ladede og noen ikke, og det vil være en tiltrekning for eller fra-støting fra et vandig medium i en større eller mindre grad. For å oppfylle definisjonen av "ladet" blir en signifikant prosentandel (minst omtrent 25$) av de individuelle moleky-lene ladet ved en fysiologisk pH. Tiltrekningsgraden eller frastøtningen som er nødvendig for klassifikasjon som polar eller upolar, er vilkårlig, og aminosyrer som spesifikt er betraktet i oppfinnelsen, er blitt spesifikt klassifisert som den ene eller den andre. De fleste aminosyrene som ikke er spesifikt navngitte, kan bli klassifisert på grunnlag av kjent adferd.

Aminosyreresidier kan videre bli underklassifisert som cykliske eller ikke-cykliske og aromatiske eller ikke-aromatiske, selvforklarende klassifikasjoner med hensyn på side-kjedesubstituentgruppene til residiene, og som små eller store. Residiet blir betraktet som lite dersom det inne holder totalt 4 karbonatomer eller mindre, inklusivt karboksylkarbonet. Små residier er selvfølgelig alltid ikke-arornatiske.

For de naturlig forekommende proteinaminosyrene er under-klassifikasjonen ifølge foregående skjema som følger (se også diagrammet nedenfor).

Surt: Aspartinsyre og glutaminsyre;

basisk/ikke-cyklisk: arginin, lysin;

basisk/cyklisk: histidin;

nøytralt/polart/lite: glycin, serin og cystein;

nøytralt/polart/stort/ikke-aromatisk: treonin, asparagin, glutamin;

nøytralt/polart/stort/aromatisk: tyrosin;

nøytralt/upolart/lite: alanin;

nøytralt/upolart/stort/ikke-aromatisk: valin, isoleucin, leucin, metionin;

nøytralt/upolart/stort/aromatisk; fenylalanin og tryptofan.

Den gen-kodede aminosyren prolin som teknisk tilhører grup-pene nøytral/upolar/stort/cyklisk og ikke-aromatisk, er et spesielt tilfelle p.g.a. dets kjente virkninger på den sekundære konformasjonen til peptidkjedene , og er derfor ikke innbefattet i denne definerte gruppen, men er klassifisert separat. AA3er betegnet som et prolinresidie eller et "modifisert prolinresidie". Prolin er som kjent en fem-leddet nitrogenheterocykel med en karboksylgruppe i 2- posisjonen. Modifiserte prolinresidier er alle nitrogen fem— eller seks-leddede heterocykler med karboksylgrupper i posi-sjon alfa til nitrogen; ytterligere heterocykliske atomer kan også bli innbefattet i ringen. Modifiserte prolinresidier innbefatter residier av pipekolinsyre (2-karboksypi-peridin, forkortet Pip) og tiazolidin (Thz). Prolin eller modifiserte prolinresidier har følgelig formelen:

hvor en eller to av metylengruppene kan bli erstattet med NR, S eller 0, og hvor et hvilket som helst ringnitrogen eventuelt kan bli substituert med en ikke-interfererende substituent såsom alkyl.

Disse vanlige oppstående aminosyrer som ikke blir kodet av den genetiske koden, omfatter f.eks. beta-alanin (beta-Ala), eller andre omega-aminosyrer, såsom 3-aminopropion-, 4-amino-smørsyrer, osv., alfa-aminoisosmørsyre (Aib), sarkosin (Sar), Ornitin (Orn), citrullin (Cit), homoarginin (Har), t-butyl-alanin (t-BuA), t-butylglycin (t-BuG), N-metylisoleucin (N-Melle), fenylglycin (Phg), og cykloheksylalanin (Cha), nor-leucin (Nie), cysteinsyre (Cya); pipekolinsyre (Pip), tiazolidin (Thz), 2-naftylalanin (2-Nal) og metioninsulfoksyd (MSO). Disse faller også hensiktsmessig inn i bestemte kategorier.

Basert på ovennevnte definisjon er Sar og beta-ala nøytral/- upolar/lite;

t-BuA, t-BuG, N-Melle, Nie og Cha er nøytral/upolar/stor/- ikke-ar ornat i sk;

Har og Orn er basisk/ikke-cyklisk;

Cya er sur;

Cit, acetyl-Lys og MSO er nøytral/polar/stor/ikke-aromatisk;

2-Nal og Phg er nøytral/upolar/stor/aromatisk; og Pip og Thz er modifiserte prolinresidier;

Det ovennevnte kan bli vist diagrammatisk som følger:

Amlnosvreklassif ikas. 1onssk. 1ema

De forskjellige omega-aminosyrene er klassifisert ifølge størrelse som nøytral/upolar/lite (beta-ala, dvs., 3-aminopropinisk, 4-aminobutyrisk) eller stort (alle andre).

Andre aminosyresubstitusjoner for dem som er kodet i genet kan også bli innbefattet i peptidforbindelsene innenfor rammen av oppfinnelsen og kan bli klassifisert innenfor denne generelle sakjemaet.

I formlene som representerer valgte spesifikke utførelses-former av foreliggende oppfinnelse, vil amino- og karboksy-termlnale grupper, til tross for at disse ofte ikke er spesifikt vist, være i den formen som de vil være i ved fysiologiske pH-verdier, dersom ikke annet er angitt. Dermed er N-terminal H<+>g og C-terminal 0~ ved fysiologisk pH til stede til tross for at dette ikke nødvendigvis er spesifisert eller vist, enten i spesifikke eksempler eller i generiske formler. De basiske og sure addisjonssaltene inkludert dem som blir dannet ved ikke-fysiologiske pH-verdier, er også innbefattet i forbindelsene ifølge oppfinnelsen. Dersom ikke annet er angitt, er residiene i L-form, og i de generiske formlene kan de spesifiserte residiene være enten L- eller D-. Peptidene ifølge oppfinnelsen har generelt 0, 1 eller 2

D-residier, fortrinnsvis 0 eller 1, mest foretrukket er 0. I de viste peptidene er hver kodet residie hvor dette er hensiktsmessig, representert ved en enkelt bokstavbetegnelse som tilsvarer trivialnavnet til aminosyren i henhold til følgende konvensjonelle liste:

Aminosyrene som ikke blir kodet genetisk, er forkortet som angitt ovenfor.

I de spesifikke peptidene vist heri er L-formen til et hvilket som helst aminosyreresidie som har en optisk isomer, til hensikt dersom ikke annet er indikert med en anmerkning ("f). P.g.a. residiene i peptidene fremstilt ifølge oppfinnelsen er normalt i den naturlige L-optiske isomerformen, kan en eller to, fortrinnsvis en, aminosyre bli erstattet med optisk isomer D-form.

Frie funksjonelle grupper, inkludert dem ved karboksy- eller amino-terminusen, kan også bli modifisert ved amidering, acylering eller annen substitusjon, som f.eks. kan forandre oppløseligheten til forbindelsene uten å påvirke deres aktivitet.

Ved dannelse av amiderte peptider kan de analoge forbindelsene bli fremstilt direkte f.eks. ved anvendelse av Boc-AAx-pMBHA-harpiksen eller Boc-AAx-BHA-harpiksen, hvori AAXer den valgte karboksy-terminale aminosyren til det ønskede peptidet som beskrevet nedenfor. Alternativt kan peptidene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse bli kjemisk eller enzymatisk amidert etter peptidfremstillingen ved anvendelse av fremgangsmåter som er velkjente innenfor fagområdet, eller fremstilt ved standard oppløsnings-fasepeptidsynteseprotokoller.

Visse utførelsesformer av novo-peptidene er foretrukne. I K<*>(G/Sar)D-sekvensen, er G/Sar fortrinnsvis G. AA^og AA4er fortrinnsvis Gly, Ala eller Ser; ni er fortrinnsvis 0-2, n4 er fortrinnsvis 1-2. Foretrukket for AA2er nøytrale/- upolare/aromatiske aminosyrer, spesielt tryptofan og fenylalanin, spesielt tryptofan, n2 er fortrinnsvis 1. X^og X2er fortrinnsvis Cys, Mps eller Pen (penicillamin)-residier. Y-^ er fortrinnsvis H, acetyl eller Gly; Y2er fortrinnsvis -NH2eller —A-NH2. Også generelt foretrukket er C-terminale amiderte former av Y2.

PAI-analogene kan omfatte peptider med følgende formler. Til tross for at alle disse har evne til å utvise cyklisk form gjennom dannelse av disulfidbindinger, er disse bindingene ikke vist spesifikt, og andre cykliske former er betegnet med "cyklo".

Foretrukne peptider

Spesielt foretrukket er peptidene med formlene:

Klemlsk fremstilling av peptidene

Forbindelsene kan bli fremstilt kjemisk ved hjelp av velkjente fremgangsmåter såsom f.eks. fast-fasepeptidsyntese. Fremstilling forløper fra den karboksy-terminale enden av peptidet ved anvendelse av en alfa-aminobeskyttet aminosyre, t-butylkoksykarbonyl (Boe )-beskyttende grupper kan bli anvendt for alle aminogruppene til tross for at andre beskyttende grupper såsom fluorenylmetyloksykarbonyl (Fmoc) er egnede. F.eks. kan Boc-Gly-OE, Boc-Ala-OH, Boc-His (Tos)-OH, (dvs. valgte karboksy-terminale aminosyrer) bli forestret til klormetylerte polystyrenharpiksbærere, p-metylbenz-hydrylamin (pMBHA) eller PAM-harpikser. Polystyrenharpiks-bæreren er fortrinnsvis en kopolymer av styren med omtrent 0,5 til 2% divinylbenzen som et kryss-bindende middel som forårsaker at polystyrenpolymeren blir fullstendig uopp-løselig i visse organiske oppløsningsmidler, se Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis (1969), "W. H. Freeman Co., San Francisco og Merrifield, J. Am. Soc. (1963) 85:2149-2154. Disse og andre fremgangsmåter for fremstilling av peptidet er også eksemplifisert ved US patentene 3.862.925; 3.842.067; 3.972.859; og 4.105.602.

Fremstillingen kan anvende manuelle synteseteknikker eller bli anvendt automatisk, f.eks. en Applied BioSystems 430A eller 431A Peptide Synthesizer (Foster City, California) ifølge instruksjonene tilveiebragt i instruksjonsmanualen som ble tilført av fremstilleren. Spaltning av peptidene fra harpiksen kan bli utført ved anvendelse av "lav-høy" HF av-spaltningsprotokollene som beskrevet i Lu, G.-S. et al., Int. J. Peptide & Protein Res (1987) 29:545-557. Refolding av analogene til slangevenom PAI kan bli utført ved anvendelse av fremgangsmåtene beskrevet i Garsky, V. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1989) 86:4022-4026 som beskriver fast-fasefremstilling av echistatin.

De cykliske peptidene som ikke har disulfidbindinger, kan hensiktsmessig bli fremstilt ved en kombinasjon av fast-fasesyntese og dannelse av cyklisk ringstruktur i oppløsning ved anvendelse av de generelle fremgangsmåtene som beskrevet i US patent 4.612.366 til Nutt. Lineære peptider fremstilt på standard Merridield harpiks, kan dermed bli spaltet fra harpiksen med hydrazin, etterfulgt av cyklisering av det tilsvarende acidet for å danne cykliske peptider.

Det er Innlysende for fagfolk innenfor dette området at mellomproduktet som blir konstruert i henhold til foreliggende beskrivelse i løpet av fremstillingen av fore liggende analoge forbindelser er i seg selv nye, og nyttige forbindelser og hører dermed inn under rammen av oppfinnelsen .

Rekombinant produksjon

Alternativt kan valgte forbindelser bli fremstilt ved ekspresjon av rekombinante DNA-konstruksjoner fremstilt i henhold til velkjente fremgangsmåter. Slik produksjon kan være ønskelig for å tilveiebringe store mengder eller alternative utførelsesformer av slike forbindelser. P.g.a. at peptidsekvensene er relativt korte blir den rekombinante produksjonen enklere, men produksjonen ved de rekombinante metoder er spesielt foretrukket i forhold til standard fast-fasepeptidsyntese for peptider på minst åtte aminosyreresidier.

DNA som koder for sekvensert PAI, blir fortrinnsvis fremstilt ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige nukleinsyre-syntesemetoder. Metoder for å konstruere ekspresjonssystemet for fremstilling av PAI i rekombinante verter, er også generelt kjent innenfor fagområdet.

Ekspresjon kan bli oppnådd i enten prokaryote eller eukaryote verter. Prokaryote er som oftest respresentert ved forskjellige E. coli-stammer. Andre mikrobielle stammer kan også bli anvendt, såsom bacilli, f.eks. Bacillus subtilis, forskjellige Pseudomonas-arter eller andre bakterielle stammer. I slike prokaryote systemer blir plasmidvektorer som inneholder replikasjonsseter og kontrollsekvenser avledet fra en art kompatibel med verten anvendt. F.eks. en arbei-dende vektor for E. coli er pBR322 og derivatene derav. Vanlig anvendte prokaryote kontrollsekvenser som inneholder promotere for transkripsjonsinitiering, eventuelt med en operator, sammen med ribosombindings-setesekvenser, inn befatter slike vanlig anvendte promotere som beta-laktamase (penicillinase) og laktose (lac )-promotersystemer, tryptofan (trp)-promotersystemer og lambda-avledet PL-promoter og N-gen ribosombindingssete. Derimot kan et hvilket som helst promotersystem kompatibelt med prokaryoter bli anvendt.

Ekspresjonssystemene som var nyttige i eukaryote verter, omfatter promotere avledet fra hensiktsmessige eukaryote gener. En klasse promotere som er nyttige i gjær, f.eks., omfatter promotere for fremstilling av glykolyttiske enzymer, .eks. de for 3-fosfoglyceratkinase. Andre gjærpromotere omfatter dem for anolasegenet eller Leu2-genet oppnådd fra YEpl3.

Egnede pattedyrpromotere omfatter tidlige og sene promotere fra SV40 eller andre virale promotere såsom de som var avledet fra polyomaadenovirus II, bovint papillomavirus eller apesarkomaviruser. Egnede virale og pattedyrenhancere er angitt ovenfor. Dersom planteceller blir anvendt som et ekspresjonssystem, er nopalinsyntesepromoteren f.eks., hensiktsmessig.

Ekspresjonssystemene blir konstruert ved anvendelse av velkjente restriksjons- og ligeringstknikker og transformert inn i hensiktsmessige verter.

Transformasjonen blir utført ved anvendelse av standard teknikker som er hensiktsmessige for slike celler. Cellene som inneholder ekspresjonssystemene, bblir dyrket under betingel-ser som er hensiktsmessig for produksjon av PAI, og PAI blir deretter omdannet og renset.

Antistoffer

Tilgjengeliheten av renset PAI fremstilt ifølge oppfinnelsen muliggjør oså fremstilling av antistoffene spesifikt immunoreaktive med disse formene av det aktive peptidet. Sammensetninger inneholdende renset PAI isolert fra slangevenom eller fremstilt på annen måte, kan bli anvendt for å stimulere produksjonen av antistoffer som immunoreagerer med PAI-peptidet. Standardimmunoseringsprotokoller som involverer administrering av PAI til forskjellige vertebrater, såsom kaniner, rotter, mus, sauer og kyllinger, resulterer i anti-sera som er immunoreaktive med det rensede peptidet. PAI kan bli hensiktsmessig konjugert til en egnet antigenisk nøytral-bærer, såsom et hensiktsmessig serumalbumin eller keyhole limpet hemocyanin, for å forsterke immunogenisiteten. I tillegg kan det frie peptidet bli injisert med metylert BSA som et alternaiv til konjugasjon. Videre kan antistoff-utskillende celler til det immuniserte pattedyret bli udødeliggjort for å fremstille monoklonale antistoffpaneler som dretter kan bli screenet for reaktivitet med PAI.

De resulterende polyklonale eller monoklonale antistoff-preparatene er nyttige i analyser for nivåer av korrespon-derende PAI i biologiske prøver ved anvendelse av standard immunoanalyseprosedyrer.

Analyse

Identifikasjon av slangevenomutgangsmaterialet som inneholder aktivt PAI, og der PAI har kjent spesifisitet er mulig ved analysen. Analysen bygger på den observasjonen at forbindelser som blokkerer bindingen av fibrinogen til GP Ilb-Illa in vitro også kan inhibere trombin eller ADP-indusert aggregasjon av humane blodplater og dannelsen av blodplate-tromber in vivo. Denne observasjonen danner grunnlaget for oppnåelse av potent PAI ved vurdering av evnen som test-materialene har, til å ødelegge fibrinogen-GP Ilb-IIIa-interaksj oner.

I analysen blir GP Ilb-IIIa fremstilt i renset form f.eks. som beskrevet av Fitzgerald. L.A. et al., Anal. Biochem.

(1985) 151:169-177, inkorporert heri ved referanse, som bli belat på en fast bærer såsom kuler, reagensrør eller mikro-titerplater. Den belagte bæreren blir deretter kontaktet med fibrinogen og med forsøksmateriale og inkubert i tilstrekkelig tid for å muliggjøre maksimal binding av fibrinogen til immobilisert GP Ilb-IIIa. Fibinogen ble vanligvis tilveiebragt ved en konsentrasjon på omtrent 5-50 nm, og forsøksmaterialet kan om ønskelig bli tilsatt en serie fortynninger. Vanlige inkubasjoner er 2-4 timer ved 35°C, der tiden og temperaturen er avhengig av hverandre.

Etter inkubasjonen blir oppløsningen inneholdende fibrinogen og forsøksmaterialet fjernet, og nivået av binding av fibrinogen blir målt ved kvantifisering av bundet fibrinogen til GP Ilb-IIIa. Hvilken som helst egnet måte for deteksjon kan bli anvendt, men det er hensiktsmessig å anvende merket fibrinogen, f.eks. ved anvendelse av radioaktive, fluor-escerende eller biotinylerte markører. Slike fremgangsmåter er velkjente og trenger ikke å bli beskrevet heri.

Vurdering av resultatene blir gjort lettere ved anvendelse av en kontrollprøve, vanligvis identisk med forsøksprøven med unntagelse av at forsøksprøven er fraværende. I dette tilfelle kan prosent inhibisjon bli beregnet ved anvendelse av mengden Fg bundet i kontrollen som grunnlag slik at

Andre mål på inhibisjonseffektivitet, som ICgg, kan også bli anvendt.

Analysesystemene omfatter videre karakterisering av PAI-spesifisiteten ved bindingsinhibisjonsanalyser identiske med dem ovenfor, men substituering av andre adhesive proteiner for Fg og andre reseptorer for Fg Ilb-IIIa. Inhibisjon av bindingen av vitronektin til vitronektinreseptoren; fibronektin til fibronektinreseptoren; fibronektin til GP Ilb-IIIa og fibrinogen og/eller vWF til GP Ilb-IIIa kan spesielt bli vurdert. Adhesivproteinet og reseptorene for disse analysene er tilgjengelige innenfor fagområdet.

Andre analyser

I tillegg til plateanalysene er andre analyser for blodplateaggregasjonsinhibisjonsaktivitet og beslektede aktiviteter også tilgjengelige, som angitt ovenfor. En liste av vanlige anvendte analyser er som følger: 1. Plateanalyser som anvender spesifikke reseptorer beskrevet i tidligere paragrafer; 2. standardanalyser direkte anvendt på blodplateaggregasjon, såsom de som er beskrevet av Gann, Z.R., et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:19827-19832; Huang, T.F. et al., J. Biol Chem (1987) 262:16157-16163; Biochemistry (1989) 28:661-666, sitert ovenfor og inkorporert heri; 3. en in vivo-trombosemodell i hunder som beskrevet nedenfor i eksempel 1 og av Folts, J. D. et al., Circulation (1976) 54:365; og 4. effekt på celleadhesjonen ved anvendelse av S35 metionin-merkede celler som beskrevet nedenfor i eksempel 19.

Administrasjon og anvendelse

PAI fremstilt ifølge oppfinnelsen er nyttig terapeutisk for å forhindre trombedannelsen. Indikasjoner hensiktsmessige for slik behandling omfatter, uten begrensning, aterosklerose og arteriosklerose, akutt myokardial infarkt, kronisk ustabil angina, transient ischemiske angrep og slag, perifer vaskulær sykdom, arteriell trombose, preeclampsi, emboli, restenose og/eller trombose etter angioplasti, karotid endarterektomi, anastomose av vaskulære podninger og kroniske kardiovaskulære anordninger (f.eks. inn-gående katetere eller forlengende "ekstrakorporeale sirkulerende anordninger"). Disse symp-tomene representerer forskjellige stenotiske og okklusive vaskulære forstyrrelser antatt å være initiert av blodplate-aktiveringen på karveggene.

PAI kan bli anvendt for forhindring eller opphør av arteriell trombedannelse, i ustabil angina og arteriell emboli eller trombose, samt som behandling eller forhindring av myokardialt infarkt (MI) og mural trombedannelse post MI. For hjerte-relaterte forstyrrelser, behanling eller forhindring av transient kjemiske angrep og behandling av trombotiske slag eller slag-i-utvikling er innbefattet. PAI kan også bli anvendt for å forhindre blodplateaggregasjon, embolisering eller forbruk i ekstrakorporeale sirkulasjoner, inkludert forbedring av dyredialyse, kardiopulmonær "bypasses", hemo-perfusjoner og plasmafereser.

PAI forhindrer blodplateaggregasjon, embolisering eller forbruk assosiert med intravaskulære anordninger og administrasjonsresultater i forbedret anvendelse av intra-aortiske ballongpumper, ventrikulære assisteringsanordninger og arterielle katetere.

PAI vil også være nyttig for behandling eller forhindring av venetrombose som i dyp venetrombose, IVC, renalvene eller portalvenetrombose og lungevenetrombose.

Forskjellige forstyrrelser som involverer blodplatekonsump-sjon, såsom trombotisk trombocytopenipurpura er også blitt behandlet.

I tillegg kan PAI bli anvendt i mange ikke-terapeutiske anvendelser hvor det er ønskelig å hemme blodplateaggregasjonen. F.eks. kan forbedret blodplate og fullblodlagring bli oppnådd ved tilsetning av tilstrekkelige mengder av peptidene der mengden vil variere avhengig av lengden på foreslått lagringstid, lagringsbetingelser, anvendelse av det lagrede materialet, osv.

PAI-doseringen kan variere avhengig av ønskede virkninger og det terapeutiske oppsettet. Vanlige doseringer er mellom omtrent 0,01 og 10 mg/kg, fortrinnsvis mellom omtrent 0,01 til 0,1 mg/kg kroppsvekt. Administrasjon er fortrinnsvis parenteral, såsom intravenøs på daglig basis i opptil en uke eller opptil en eller to måneder eller mer, og dette varierer med peptidstørrelsen. Dersom peptidene er tilstrekkelig små

(dvs. mindre enn omtrent 8-10 aminosyreresidier), kan andre administrasjonsveier bli anvendt, såsom intranasalt, sub-lingualt eller lignende.

Injiserbare blandinger kan bli fremstilt i konvensjonelle former, enten som flytende oppløsninger eller suspensjoner, faste former egnede for oppløsning eller suspensjon i væske før injeksjon, eller som emulsjoner. Egnede eksipienter er f.eks. vann, saltvann, dekstrose, mannitol, laktose, lecitin, albumin, natriumglutamat, cysteinhydroklorid eller lignende. I tillegg kan om ønskelig de injiserbare farmasøytiske sammensetningene inneholde mindre mengder ikke-toksiske hjelpeforbindelser såsom fuktemidler, pH-bufrende midler, o.l. Om ønskelig kan absorpsjonsfremmende preparater (f.eks. liposomer) anvendes.

Eksempel 1

Analyse for blodplateadhes. lonsinhibltorer fra slangevenom

A. Beskrivelse av analyser - plateanalyser

Renset blodplate GP Ilb-IIIa reseptor ble fremstilt som beskrevet av Fitzgerald, L.A. et al., Anal. Biochem. (1985) 151:169-177. Vitronektinreseptor ble fremstilt som beskrevet av Smith, J.W., J. Biol. Chem. (1988) 263:18726-18731. Etter rensing ble reseptorene lagret i 0,1# Triton X-100 ved 0,1-1,0 mg/ml.

Reseptorene ble belagt på veggene av 96-brønn flat-bundet ELISA-plater (Linbro EIA-Plus mikrotiterplate, Flow Labora-tories) etter fortynning 1:200 med en oppløsning av 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl , 1 mM CaCl2, pH 7,4, for å redusere Triton X-100 konsentrasjonen til under dets kritiske micelle-konsentrasjon og tilsetning av en aliquiot av 100 pl til hver brønn. Brønnene ble inkubert over natt ved 4°C og deretter utluftet til tørrhet. Ytterligere seter ble blokkert ved tilsetning av bovint serumalbumin (BSA) ved 35 mg/ml i ovennevnte buffer i 2 timer ved 30°C for å forhindre uspesifikk binding. Brønnene ble deretter vasket en gang med bindings-buffer (50 nM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mg/ml

BSA).

De tilsvarende ligandene (fibrinogen, von Willebrand faktor eller vitronektin) ble merket medi25l eller konjugert til biotin ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige reagenser og standardprotokoller. Merkede ligander ble tilsatt til de reseptor-belagte brønnene i final konsentrasjon på 10 nM (100 pl/brønn) og Inkubert i 3 timer ved 30°C i nærvær eller fravær av forsøksprøver. Etter inkubasjon ble brønnene aspirert til tørrhet og bundet ligand kvantifisert.

For225^-mer^ede ligander blir protein oppløst ved 250 pl SDS. For biotinylerte ligander blir bundet protein detektert ved tilsetning av antibiotinantistoff konjugert til alkali-fosfatase etterfulgt av tilsetning av substrat (p-nitrofenyl-fosfat) og bestemmelse av den optiske tettheten til hver brønn ved 405 nm. Redusert fargeutvikling eller redusert<125>I-innhold er observert i brønner inkubert med forsøks-prøver som inhiberer bindingen av ligand til reseptor.

B. Bestemmelse av adhes. 1onsinhibis. 1on av rå venom

68 rå, lyofiliserte slangevenomer oppnådd fra enten Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) eller Miami Serpentarium Labs (Salt Lake City, UT) ble løst opp ved 1 mg/ml i buffer (50 nM Tris, 100 mM NaCl, 0,02# azid, 2 mM CaCl2). 1 ml aliquoter av oppløsningene ble utsatt for ultrafiltrering gjennom Centrocon-10 (YM membran) mikrokonsentratorer (Ami-con, Danvers, MA). Filtratene blandes som testprøver i reseptor/ligandanalysen ifølge paragraf A ved anvendelse av GP Ilb-IIIa fibrinogensystemet og detektering av binding ved anvendelse av biotinylert fibrinogen. Resultatene er vist i tabell 1.

Aktiviteten er til stede i noen, men ikke alle, arter av Viperinae, men er fraværende i alle artene som er undersøkt fra Elapidae.

Fig. 1 viser resultatene av forskjellige fortynninger av filtratet for fire arter. Selv ved største fortynning, 25 pl/0,5 ml, viser de tre aktive venomene maksimal inhibisjon.

C. Bestemmelse av aktiviteten til peptider i en in vivo

modell for trombose

Rensede peptider ble testet for deres evne til å forhindre dannelsen av tromber i koronararterier fra hund i modellen beskrevet av Folts (Folts, J.D. et al., Circulation (1976) 54:365. I denne modellen er strømningsreduksjoner i en inn-snevret koronararterie blitt vist å være forårsaket av dannelsen av blodplateaggregater, og midler som blokkerer bindingen av fibrinogen til GP Ilb-IIIa er blitt vist å forhindre disse strømningsreduksjonene (Coiler, B.S. et al., Blood (1986) 68:783. Peptidene ble løst opp i normalt saltvann og administrert i en perifer vene som en enkeltbolus.

D. Virkninger av renset slangevenompeptider på celle-kobllng til adhesive proteiner

M21 melanomceller, som uttrykker høye nivåer av vitronektin-reseptoren, ble metabolsk merket bed35S-metionin, og deretter tilsatt til 24-brønn-vevskulturplater belagt med vitronektin. En Inkubasjonsperiode på 1 time ved 37°C ble gitt for cellekobling, og dette ble etterfulgt av en vask for å fjerne ikke-adherente celler. Etter vaskingen ble adherente celler solubilisert og supernatantene plassert i en væskescintillasjonsteller. Fraksjonen av celler som forble adherente, ble beregnet ved å dele cpm i de oppløste supernatantene med cpm i det totale celleantallet tilsatt til hver brønn. Virkningene av renset slangevenompeptider og syntetiske, cykliske peptider på celleadhesjonen ble bestemt ved å innbefatte dem med M21-celler i løpet av inkubasjons-perioden .

E. Spesifisiteten til adhes. ionsinhiblsjonen

Ultrafiltrater fra tre arter av slangevenom, Sistrurus m. barbouri, Crotalus ruber ruber og Crotalus basilicus ble testet i både fibrinogen/GP Ilb-IIIa og vitronektin/vitro-nektinreseptoranalysene fra paragraf A. Resultatene ble vurdert ved forskjellige fortynninger. Som vist i fig. 2 inhiberer venomet fra Sistrurus m. barbouri fortrinnsvis bindingen av fibrinogen til GP Ilb-IIIa, og venomen til Crotalus ruber ruber inhiberer bindingen i begge systemene omtrent likt; og venomen fra Crotalus basilicus inhiberer fortrinnsvis vitronektin/vitronektinreseptorbindingen.

I rensningene beskrevet i eksemplene 2-6 og 8-12 ble PAI-aktiviteten analysert ved anvendelse av en direkte inhibisjon av blodplateaggregasjonen. Blodplaterikt plasma (PRP) ble oppnådd fra en frisk human voluntør. Aggregasjonen ble indu sert ved tilsetningen av 4 pM ADP til 0,5 ml PRP i et aggregometer (Chrono-log Corp.).

En tabell som viser resultatene av aminosyresammensetnings-analysen av rensede PAI ifølge eksemplene 2-6 finnes etter eksempel 6, og de som viser resultatene for eksemplene 8-11, er vist etter eksempel 8.

Denne analysen ble oppnådd ved en hydrolyse av peptidene ved anvendelse av 6 N HC1 og analysering av hydrolysatet ved anvendelse av en Beckman 121 HCl-analysator utstyrt med et Model 126 datasystem. Cysteinsyre ble bestemt ifølge fremgangsmåten til Moore, J. Biol. Chem. (1969) 230:235-237. Tryptofan ble ikke bestemt.

Eksempel 2

Rensing av blodplateaggregas. lonsinhlbltor ( PAI) fra Eristocophis macmahoni- venom

En oppløsning av 45 mg Eristocophis macmahoni-venom (Miami Serpentarium Labs, Lot No. EM23SZ) i 1,0 ml 0, 5% trifluoreddiksyre (TFA) ble avkjølt på is i 20 min., sentrifugert ved 14.000 rpm i 3 min. for å fjerne uoppløselig materiale og applisert på en 39 mm x 30 cm, C-18 Delta Pak revers-fase HPLC-kolonne (Waters, Milford, MA) ekvilibrert med 5% acetonitril inneholdende 1% TFA. En gradient som løper fra 5% til 15% acetonitril over 5 min., (2^/min.) etterfulgt av en gradient fra 15% til 3056 acetonitril over 35 min., og deretter til 50% acetonitril over 20 min., ble kjørt ved anvendelse av en Waters 600E væskekromatograf. En strømningshastighet på 1,5 ml/min. ble opprettholdt gjennom gradienten, og kolonne-avløpet ble samlet opp i 2 min. fraksjoner inn i poly-propylenrør.

Eluatet fra kolonnen ble registrert ved 220 nm/2,5 absorbans-enheter full skala (AUFS).

Fraksjoner ble konsentrert til det halve av deres opprinnelige volum ved anvendelse av deres Speed-Vac-konsentrator (Savant) etterfulgt av lyofilisering. Prøvene ble deretter rekonstituert i 1 ml destillert vann og aliquoter (10-50 pl) ble analysert for deres evne til å hemme human blodplateaggregasjon i plate-rikt plasma indusert med 20 pm ADP ved anvendelse av et fullblodaggregometer (Chrono-Log Corp., Havertown, PA).

Som vist i fig. 3 ble aktivitet funnet i fraksjoner som eluerte ved 21-25$ acetonitrilkonsentrasjon. Disse fraksjonene ble deretter lyofilisert og kjørt på nytt på C-18 HPLC-kolonne ved anvendelse grunnere acetonitrilgradient som føl-ger: De opprinnelige betingelsene besto av 8$ acetonitril etterfulgt av en gradient til 25$ acetonitril over 68 min.

(0,25$/min.), deretter til 60$ acetonitril i 10 min. Ett-minutts fraksjoner ble oppsamlet, tørket og analysert på nytt for inhibitorisk aktivitet i blodplateaggregasjonen til humane blodplater som ovenfor.

Som vist i fig. 4 eluerte aktiviteten ved 24$ acetonitril. De aktive fraksjonene ble deretter utsatt for analytisk HPLC med deteksjon ved 220 nm og eluerte som en enkelt symmetrisk bioaktiv komponent som vist i fig. 5. Aminosyreanalyse av det HPLC-rensede materiale viste at peptidet inneholder 49 residier inkludert 7-8 cysteiner, som angitt i tabell 2.

Forsøk på automatisert Edman-degradering av det karboksyamidometylerte peptidet tilveiebragte ikke noen detekterbar sekvens. Spaltning av dette materiale ble derfor utført ved Lys-C og Asp-N endoproteinaser som ga fragmentet som ble sekvensert og er vist i fig. 6. Denne analysen viste en sekvens på 48 residier. P.g.a. av to tryptofanresidier fremkommer fra denne frekvensanalysen som ikke ble bestemt i aminosyresammensetningen, inneholder det intakte peptidet 51 aminosyreresidier. To Glx og et Arg-residie som mangler fra den bestemte sekvensen, var antageligvis til stede ved den blokkerte aminoterminusen til peptidet. Siden det var meget sannsynlig at et av Glx-residiene var et pyroglutamylresidie ved aminoterminusen som fører til den blokkerte naturen til det Intakte peptidet, fjernet oppfinnerne denne gruppen fra det intakte, karboksyamidometylerte peptidet med enzymet pyroglutamylaminopeptidase (L-pyroglutamylpeptidhydrolase, EC 3.4.11.8, Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN). Protokoller beskrevet av Podell og Abraham, Biochem. Biophys. Res. Commun. (1978) 81:176-185 ble anvendt. Spaltning av 100 pg peptid med peptidasen i et substrat-til-enzymforhold på 100:1, etterfulgt av revers-fase HPLC-rensning av blandingen på en Waters analytisk C-18 kolonne ga materiale som var egnet for automatisert Edman degradering. Resultatene av denne analysen og oppføring av hele sekvensen til dette peptidet som ble betegnet "eristicophin", er vist i fig. 6.

Hele aminosyresekvensen til denne PAI er vist i fig. 6. Dette peptidet har RGD i bindingsregionen, og viser betrakte-lig homolog! med echistatin.

Eksempel 3

Rensing av PAI fra Sistrurus catenatus tergeminus- venom

360 mg Sistrurus c. tergeminus-venom (Miami Serpentarium Labs, Lot No. ST6SZ) ble løst opp i 7,0 ml 0,5 M eddiksyre og applisert på en Sephadex G-50 fine-kolonne (Pharmacia, 2,5 x 100 cm) ekvilibrert og eluert med 0,5 M eddiksyre. Kolonnen ble kjørt ved en strømningshastighet på omtrent 25 ml/time, og 5 ml fraksjoner ble oppsamlet. 25 pl av hver av fraksjonene ble slått sammen i grupper på 10 fraksjoner (dvs.

fraksjonene 1-10, 11-20, etc.) og lyofillsert for analyse. De tørkede sammenslåtte fraksjonene ble på ny løst opp 1 vann og aliquoter analysert for lnhibitorlsk aktivitet i ADP-stimulert aggregasjon av humane blodplater. Aktive fraksjoner (31-40) ble slått sammen og lyofillsert.

Dette materialet ble løst opp i 2 ml 0,5$ TFA og applisert på en 19 mm x 30 cm C-18 Delta Pak reversfase HPLC-kolonne (Waters) ekvilibrert med 8$ acetonitril inneholdende 0,1$ TFA. En gradient fra 8$ til 30$ acetonitrilkonsentrering over 30 min. og deretter til 60$ acetonitril over 20 min ble kjørt ved en strømningshastighet på 18 ml/min. Eluatet fra kolonnen ble oppsamlet i propylenrør i 0,2 min. fraksjoner og registrert ved 220 nm/2.2 AUFS. Fraksjonene ble konsentrert på en Speed-Vac konsentrator (Savant), lyofillsert og analysert for antiaggregasjonsaktivitet med humane blodplater som tidligere beskrevet.

Fig. 7 viser at den PAI-inneholdende fraksjonen eluerer ved 24-25$ acetonitril. Analyse av disse aktive fraksjonene ved anvendelse av HPLC med deteksjon ved 220 nm viste en symmetrisk bioaktiv komponent, som vist i fig. 8. Aminosyreanalyse av dette materiale viste et peptid med 71-72 residier, inkludert 12 cysteiner, som vist i tabell 2.

En del av det rensede peptidet ble redusert og alkylert med iodacetamid og renset på en C-18 revers-fase HPLC-kolonne. N-terminalsekvensanalyse av dette materiale viste følgende aminosyresekvens for 23 cykluser av Edman-degradering: Glu-Ala-Gly-Glu-Glu-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Ala-Asn-Pro-Cys-Cys-Asp-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-Leu.

Den fullstendige aminosyresekvensen til denne PAI som er betegnet "tergeminin", er vist i fig. 6.

Det rensede peptidet ble testet i de reseptor-baserte analysene beskrevet 1 eks. 1, paragraf 8. Konsentrasjonene av det rene peptidet ved mindre enn 100 nm inhiberte bindingen av Fg og vWF til GP Ilb-IIIa og av Vn og vWF til vitronektin-reseptoren, som vist i fig. 9.

Eksempel 4

Rensing av blodplateaggregasjonsinhibltoren fra Sistrurus milarus barbouri- venom

200 mg Sistrurus m. barbouri-venom (Miami Serpentarium Labs., Lot No. SM13SZ) ble løst opp i 7,0 ml 0,5 M eddiksyre og applisert på en Sephadex G-50 fine kolonne (Pharmacia, 2,5 x 100 cm) ekvilibrert og eluert med 0,5 M eddiksyre. Kolonnen ble kjørt ved en strømningshastighet på 26 ml/time, og 5 ml fraksjoner ble oppsamlet og analysert for antiblodplate-aggregasjonsaktivitet som tidligere beskrevet. Aktive fraksjoner (41-50) ble slått sammen og lyofillsert. Dette materiale ble på ny løst opp i 2,0 ml 0,5$ TFA, og applisert på den preparative C-18 HPLC-kolonnen som i eksempel 3 og eluert ved anvendelse av de samme gradientbetingelsene. 2/10-dels minutters fraksjoner fra kolonnen ble oppsamlet i polypropylenrør, konsentrert, lyofillsert og analysert for blodplateaggregasjonsinhibitorisk aktivitet.

Fig. 10 viser aktivitetsprofilen fra denne HPLC-kolonnen. De aktive fraksjonene ble utsatt for analytisk HPLC, som viste flere fraksjoner (45-47) som var mer enn 90$ homogene. Peptidet i fraksjon 46 (150 pg) ble renset til homogenitet på en analytisk C-18 kolonne med manual oppsamling av den symmetriske toppen, som vist i fig. 11. Aminosyreanalyse av dette materiale viste et peptid på 71-72 aminosyrer, inkludert 12 cysteinresidier, som vist i tabell 2.

Det rensede peptidet (150 pg) ble løst opp i 300 pl reaksjonsbuffer (6 M guanidin HC1, 0,25 M Tris-HCl, 20 mM

EDTA, 20 mM ditiotrei tol (DTT), pH 7,5) i 1,5 timer ved romtemperatur for å redusere peptidet. Dette ble etterfulgt av omsetning av 3 pl 4-vinylpyridin (Aldrich) ved romtemperatur i en ytterligere time. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 200 pl 1$ TFA og applisert på en analytisk C-18 HPLC-kolonne og eluert med en acetonitrilgradient i vann inneholdende 0,1$ TFA, begynnende ved 8$ acetonitril og løpende til 25$ acetonitril i 20 min., deretter til 60$ acetonitril i 10 min.

En del av dette pyridyletylerte materiale ble utsatt for N-terminal sekvensanalyse, som beskrevet ovenfor, og fullstendig proteolytisk spaltning av det reduserte og alkylerte peptidet ble utført ved anvendelse av endoproteinase-Lys-C og endoproteinase Asp-N med peptidfragmenter isolert på enten C-3 eller C-18 revers-fase HPLC-kolonne ved anvendelse av acetonitril/vann/TFA-graduenteluering. Aminosyresekvensen til N-terminusen av det intakte peptidet og isolerte proteolytiske fragmenter ble bestemt som beskrevet av Yarden, Y. et al., Nature (1986) 323:226, ved anvendelse av automatisert Edman-degradering på en gass-fasesekvensator.

Hele aminosyresekvensen til dette isolerte peptidet betegnet "barbourin" er vist i fig. 6, sammen med sekvensene for de proteolytiske fragmentene. En sammenligning av denne sekvensen med de fra andre slangevenom-adhesjonsinhibitorer er vist i fig. 12.

Eksempel 12

Rensing av PAI fra Lachesis mutas- venom

99 mg Lachesis mutas-venom (Miami Serpentarium Labs., Lot No. LM15FZ) ble løst opp 1 2,0 ml 0,5$ trifluoreddiksyre og ble avkjølt på is i 20 min., sentrifugert ved 14.000 rpm i 3 min.

for å fjerne uoppløselig materiale og applisert på en 3,9 mm x 30 cm, C-18 Delta Pak reversert-fase HPLC-kolonne (Waters) ekvilibrert med 5$ acetonitril inneholdende 0,1$ trifluoreddiksyre. En gradient fra 5$ til 15$ acetonitril over 5 min. og deretter til 30$ over 35 min. (2$/min.) og fortsatte til 60$ acetonitril over 20 min. hie kjørt. Strømnings-hastigheten ble opprettholdt ved 1,5 ml/min., og kolonneeluatet ble registrert ved 220 nm/3 AUFS. 2 minutters fraksjoner ble samlet opp, konsentrert ved Speed-Vac og lyofillsert. Fraksjonene ble analysert for blodplateaggregasjonsinhibitorisk aktivitet.

Fig. 13 viser de aktive fraksjonene som eluerte ved 18$ acetonitril. Disse fraksjonene ble kjørt på nytt, på C-18 kolonnen ved anvendelse av en grunnere gradient bestående av en 40 min. gradient fra 5-28$ acetonitril. Ett-minutters fraksjoner ble oppsamlet, konsentrert, lyofillsert og analysert for blodplateaggregasjonsinhibitorisk aktivitet, med resultatene vist i fig. 14. Disse aktive fraksjonene ble kjørt på en analytisk C-18 kolonne, og den eluerte midttopp-fraksjonen ble samlet manuelt. Det eluerte materiale som er i en enkelt symmetrisk topp, som vist i fig. 15, ble utsatt for aminosyreanalyse og viste et peptid på 72-73 aminosyrer inneholdende 12 cysteiner, som vist i tabell 2.

Hele aminosyresekvensen til denne PAI, betegnet "lachesin", er vist i fig. 6.

Eksempel 6

Rensing av PAI fra Crotalus viridis viridis- venom

47 mg Crotalus viridis viridis venom (Sigma Chemical Co., Lot No. 24F-0534 ) ble løst opp 1 1 ml 0,5$ trif luoreddiksyre, avkjølt på is i 20 min., sentrifugert ved 14.000 rpm i 3 min.

for å fjerne uoppløselig materiale, og applisert på en 3,9 mm x 30 cm C-18 Delta Pak revers-fase HPLC-kolonne (Waters) ekvilibrert med 5$ acetonitril inneholdende 0,1$ trifluoreddiksyre. En gradient fra 5$ til 15$ acetonitril over 5 min. (2$/min. ) etterfulgt av en gradient fra 15$ til 30$ acetonitril i 35 min. og deretter til 60$ acetonitril til 60 min. ble kjørt. En strømningshastighet på 1,5 ml/min. ble opprettholdt i løpet av gradienten, og kolonneeluatet ble oppsamlet I polypropylenrør i to-minutters fraksjoner. Kolonneeluatet ble registrert ved 220 nm/3,0 AUFS. Fraksjoner ble konsentrert, lyofillsert og analysert for blodplateaggregasjonsinhibitorisk aktivitet.

Aktive fraksjoner, vist i fig. 6 som 18-19$ acetonitril, ble kjørt på C-18 HPLC-kolonne ved anvendelse av en gradient på 8$-20$ acetonitril over 48 min. (0,25$/min.). Fraksjoner ble konsentrert og lyofillsert og testet for aktivitet; aktive fraksjoner ble kjørt på en C-18 kolonne ved anvendelse av 8-16$ acetonitril over 10. min., 16-20$ acetonitril over 15 min. og deretter til 60$ over 10 min. Eluatet ble registrert ved 220 nm med individuelle topper oppsamlet for hånd i poly-propylenrør. Ny analyse av den aktive toppen på analytisk HPLC ga resultatene vist i fig. 17. Aminosyreanalyse utført på denne toppen viste et 72-73 residiepeptid inneholdende 12 cysteiner som vist i tabell 2. Den fullstendige aminosyresekvensen til denne PAI betegnet "viridin" er vist i fig. 6 og blir sammenlignet med det andre PAI i fig. 12.

Eksempel 7

Sammenligning av renset PAI med echistatin

Peptidene renses som beskrevet i eksemplene 2 og 4, eristicophin og barbourin, ble sammenlignet med 49-residiepeptidet echistatin med inhibering av fibrinogenbinding til GP Ilb-Illa, som beskrevet i eksempel 1, paragraf A. Fig. 18 viser at disse rensede PAI er 2-3 ganger potente i denne analysen enn standard echistatin.

Peptider renset til homogenitet fra Echis carinatus, Sistrurus m. barbouri og Eristicophis macmahoni -venomer ble sammenlignet med echistatin i ADP-stimulert blodplateaggregasjonsanalysen. Økende konsentrasjoner av rensede slangevenompeptider ble tilsatt (uten preinkubering) ved de angitte konsentrasjonene (fig. 19). Slangevenompeptidene fra Eristicophis macmahoni og Sistrurus m. barbouri var minst to ganger mer potente enn echistatin, i samsvar med deres potenthetsrekkefølge observert for inhiberende fibrinogenbinding til GP Ilb-IIIa som angitt ovenfor.

Eksempel 8

Rensing av PAI fra Crotalus cerastes cerastes — venom

1 g Crotalus c. cerastes-venom (Miami Serpentarium Labs, Lot No. CE4SZ) ble oppløst i 7,0 ml eddiksyre og applisert på en Sephadex G-50 fine-kolonne (Pharmacia, 2,5 x 100 cm) ekvilibrert og eluert med 0,5 M eddiksyre. Kolonnen ble kjørt ved en strømningshastighet på 25 ml/time med 5 ml fraksjoner oppsamlet i polypropylenrør. Aliquoter av disse fraksjonene ble analysert for aggregasjonsaktivitetsinhibitorisk aktivitet som tidligere beskrevet. Aktive fraksjoner (71-80) ble slått sammen og lyofillsert. Det tørkede materiale ble re suspendert i 2,0 ml 0,5$ TFA, uoppløselig materiale ble fjernet ved sentrifugering og applisert på den preparative C-18 Waters HPLC-kolonnnnnnnen som beskrevet i eksempel 3 og eluert ved anvendelse av betingelsene for gradienteluering beskrevet i eksempel 3. Fraksjoner fra kolonnen ble slått sammen i polypropylenrør, konsentrert og analysert for blodplateaggregasjonsinhibitorisk aktivitet. Fig. 20 viser aktivitetsprofilen fra denne HPLC-fraksjoneringen.

Aktive fraksjoner med blodplateaggregasjonsinhibitorisk aktivitet ble slått sammen og lyofilisert og kjørt på nytt på den preparative C-18 HPLC-kolonnen eluert med samme gradient. Fraksjoner ble slått sammen pr. hånd i polypropylenrør og på ny analysert for blodplateaggregasjonsinhibitorisk aktivitet som før. Aktive fraksjoner ble analysert på en analytisk C-18 kolonne ved anvendelse av betingelsene beskrevet i eksempel 4, og homogene fraksjoner ble slått sammen og lyofillsert. Analytisk HPLC-analyse av dette materiale er vist i fig. 21.

Renset peptid ble utsatt for aminosyreanalyse som viste at det var et peptid på 73-74 aminosyrer inneholdende 12 cysteinresidier, som vist i tabell 3.

Renset peptid (450 jig) ble løst opp i 750 pl reaks jonsbuf f er (6 M guanidin-HCl, 0,25 M Tris-HCl), 20 mM EDTA, 20 mM ditio-treitol (DTT), pH 7,50) i 1,5 timer ved romtemperatur for fullstendig å redusere peptidet etterfulgt av omsetning ved romtemperatur i 1 time med overskudd iodacetamid (Fluka, 16 mg). Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 500 pl 1$ TFA og applisert på en analytisk C-18 HPLC-kolonne og eluert med en gradient av acetonitril fra 8$ til 25$ i 20 min., deretter til 60$ acetonitril i 10 min. Den UV-absorberende toppen ble samlet for hånd i 1,5 ml eppendorf-rlr og tørket.

En porsjon av dette karboksyamidometylerte peptidet ble utsatt for N-terminal sekvensanalyse. Fullstendig proteoly tisk spaltning av karboksyamidometylert peptid ble utført ved anvendelse av endoproteinase Lys-C og endoproteinase Asp-N-peptidfragmentene fra disse spaltningene ble isolert på enten C-3 eller C-18 revers-fase HPLC-kolonner ved anvendelse av acetonitril/vann/TFA-gradientelueringsbetingelser. Aminosyresekvensen ble bestemt som beskrevet i eksempel 4. Hele aminosyresekvensen bestemt for "cerastin" er vist i fig. 6, og er sammenlignet med den til andre PAI i fig. 12.

Eksempel 9

Rensing av PAI fra Crotalus ruber ruber venom

1 g Crotalus ruber ruber —venom (Miami Serpentarium Labs, Lot No. CF17SZ) ble løst opp 1 8 ml 0,5 M eddiksyre og applisert på en Sephadex G-50 fine-kolonne (Pharmacia, 2,5 x 100 cm) ekvilibrert ved romtemperatur og eluert med 0,5 eddiksyre. Kolonnen ble kjørt ved en strømnlngshastighet på 25 ml/time med 5 ml fraksjoner samlet i polypropylenrør. Aliquoter av fraksjoner ble analysert for blodplateaggregasjonslnhibitor-aktivitet som beskrevet. Aktive fraksjoner (61-70) ble slått sammen og lyofillsert. Det tørkede materialet ble resuspendert i 2,0 ml 0,5$ TFA. Uoppløselig materiale ble fjernet ved sentrifugering og applisert på en preparativ C-18 Water HPLC-kolonne som beskrevet og eluert ved anvendelse av gradientbetingelsene beskrevet 1 eksempel 3. Fraksjonene samlet i polypropylenrør ble konsentrert på en Speed-Vac konsentrator og analysert for blodplateaggregasjons-lnhlbltorisk aktivitet.

Fig. 22 viser aktivitetsprofilen etter denne HPLC-fraksjoneringen. Individuelle aktive fraksjoner ble lyofilisert. Fraksjonene 49 og 50 ble slått sammen og applisert på den analytiske C-18 reversfasekolonnen og eluert ved anvendelse av betingelsene beskrevet i eksempel 4 som besto av en acetonitrilgradient som ble kjørt fra 8$ acetonitril til 25$ i 20 min. etterfulgt i 10 min. til 69$ acetonitril for å tilveiebringe homogent peptid som vi har kalt "ruberin". Automatisert Edman-degradering av karboksyamidometylert peptid gir sekvensenen vist i fig. 6.

Eksempel 10

Rensing av PAI fra Crotalus atrox

1 g Crotalus atrox -venom (Miami Serpentarium Labs, Lot No. CX16AZ) ble løst opp i 10 ml 0,5 M eddiksyre og applisert på en Sephadex G-50 fine-kolonne (Pharmacia, 2,5 x 110 cm) ekvilibrert og kjørt ved romtemperatur med 0,5 M eddiksyre. Kolonnen ble kjørt ved en strømningshastighet på 25 ml/time med 5 ml fraksjoner samlet 1 polypropylenrøret. Aliquoter av fraksjonene ble analysert for blodplateaggregasjonsinhibitorisk aktivitet som tidligere beskrevet. Aktive fraksjoner (81-100) ble slått.sammen og lyofillsert. Det tørkede materiale ble løst opp i 2,0 ml 0,5$ TFA og applisert på den preparative C-18 HPLC-kolonnen og kjørt som beskrevet i eksempel 3. Fraksjonene fra kolonnen ble oppsamlet i poly-propylenrør, konsentrert på en Speed-Vac konsentrator og analysert for blodplateaggregasjonslnhibitorisk aktivitet som før. Aktive fraksjoner ble kjørt på nytt på den analytiske C-18 kolonnen for å tilveiebringe homogent peptid (fig. 23). Amlnosyreanalyse av dette materiale viste at peptidet inneholder 72 aminosyrer inkludert 12 cysteinresidier, som vist i tabell 3. Aminosyresekvensen til det isolerte peptidet, crotatroksin, er vist i fig. 6.

Eksempel 11

Rensing av PAI fra Bothrops cotiara

680 mg Bothrops cotiara —venom (Miami Serpentarium Labs, Lot nr. B05SZ) ble oppløst 1 10 ml 0,5 M eddiksyre og applisert på en Sephadex G-50 fine-kolonne (Pharmacia, 2,5 x 110 cm) ekvilibrert og eluert med 0,5 M eddiksyre. Kolonnen ble kjørt ved en strømningshastighet på 25 ml/time med 5 ml fraksjoner oppsamlet i polypropylenrør. Aliquoter av fraksjonene

ble analysert for blodplateaggregasjonsinhibitorisk aktivitet som tidligere beskrevet. Aktive fraksjoner (71-90) ble slått sammen og lyofillsert. Tørket materiale ble resuspendert i 2,0 ml 0,5$ TFA og applisert på Waters preparative C-18 revers-fasekolonnen. Kolonnen ble eluert ved anvendelse av betingelsene beskrevet i eksempel 3. Fraksjonene ble oppsamlet i polypropylenrør, konsentrert på en Speed-Vac konsentrator og analysert for blodplateaggregasjonsinhibitorisk aktivitet. Aktive fraksjoner ble individuelt lyofillsert. Flere toppf raks joner ble kjørt på nytt på den analytiske C-18 kolonnen som beskrevet i eksempel 4. Den analytiske HPLC-prof ilen til det homogene peptidet er vist i fig. 4. Aminosyreanalyse av dette materialet viser at dette peptidet inneholder 72 aminosyrer inkludert 12 cysteinresidier, som vist i tabell 3. Den fullstendige aminosyresekvensen til dette peptidet som er betegnet "cotiarin", er vist i figurene 6 og 12.

Renset peptid ble testet 1 reseptoranalysen beskrevet i eksempel 1. De opprinnelige bestemmelsene viste at lave konsentrasjoner av cotiarin (1-4 nM) selektivt inhiberer vitronektinbindlngen til vironektinreseptoren, mens de samme konsentrasjonene hadde signifikant lavere inhiberende aktivitet i binding av fibrinogen til GP Ilb-IIIa som vist i flg. 25, men påfølgende eksperimenter kunne ikke verifisere dette resultatet.

Eksempel 12

Rensing av PAI fra Crotalus viridis lutosus

A. lg Crotalus viridis lutosus -venom (Miami Serpentarium Labs, Lot No. CL18SZ) ble oppløst i 8 ml 0,5 M eddiksyre og applisert på en Sephadex C-50 fine-kolonne (Pharmacia, 2,5 x 110 cm) som ble ekvilibrert og eluert med 0,5 M eddiksyre. Kolonnen ble kjørt ved en strømningshastighet på 25 ml/time, og 5 ml fraksjoner ble oppsamlet i polypropylenrør. Aliquoter av fraksjonene ble analysert for blodplateaggregasjonsInhibitorisk aktivitet. Fraksjonene (71-100)ble slått sammen og lyofillsert. Tørket materiale ble resuspendert i 2,0 ml 0,5$ TFA. Uoppløselig materiale ble fjernet ved sentrifugering og applisert på preparativ C-18 Waters revers-fasekolonne og eluert ved anvendelse av gradienteluerings-betingelsene beskrevet i eksempel 3. Fraksjonene fra kolonnen ble oppsamlet i polypropylenrør, konsentrert på en Speed-Vac konsentrator og analysert for blodplateaggregasjonsinhibitorisk aktivitet. Aktive fraksjoner ble lyofillsert i deres individuelle rør. Fraksjoner med toppaktivitet ble kjørt på nytt på Waters analytiske C-18 kolonnen ved anvendelse av acetonitrilgradienten beskrevet I eksempel 4. Fraksjonene ble samlet pr. hånd i 1,5 ml Eppendorf-rør. homogene fraksjoner ble slått sammen og lyofillsert. Analytisk HPLC av dette materiale viste en enkelt symmetrisk topp. Hele aminosyresekvensen til dette peptidet som er betegnet "lutosin", er vist i figurene 6 og 12.

B. På en lignende måte som den som er beskrevet i paragraf A ble PAI fra B. jararacussu, C. basilicus, C. durissus durissus, Cv. oreganus, C. h. horridus, C v. helleri, C. durissus totonactus og fra C. m. molossus isolert og renset. Aminosyresammensetningene til flere av disse peptidene er vist i tabell 3. Aminosyresekvensene til PAI fra Ch. horridus, C. basilicus, Cm. molossus, Cv. oreganus og C. d. durissus, betegnet horridin, basilicin, molossin, oreganin og durissin, er vist i fig. 6. Reseptorbindingsdata for rensede peptider ifølge eksemplene 1-12 er vist i fig. 26.

I eksemplene 13-16 nedenfor ble peptidene syntetisert ved fast-faseteknikker på en Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer ved anvendelse av t-Boc aminosyrer aktivert som HOBt aktive estere i henhold til instruksjonene fra for-handleren, som i korthet er som følger for fremstilling av Boc-AAl AA(n-l)-AA(n)-0-PAM-polystyrenharpiks.

Halvt mmol av valgt Boc-AA(n)-0-PAM-polystyrenharpiks blir behandlet ifølge følgende skjema for inkorporering av Boc-AA(n-l)-0H: 1) TFA-avspaltning: 30$ TFA i DCD, 3 min., 50$ TFA i DCM, 16 min. 2) Vaskinger og nøytraliseringer: DCM-vaskinger (5X), 3 min., 5$ DIEA i DCM, 2 min., 5$ DIEA i NMP, 2 min. NMP vask (6X), 5 min. 3) Kobling: 4 ekvivalenter Boc-AA-HOBt-ester i NMP (preaktivert 55 min.), 38 min., DMSO for å danne 15$ DMS0/85$ NMP, 16 min., 3,8 ekv. DIEA, 5 min.

4) Vask og harpiksprøve: NMP vask, 3 min.

5) Capping: 10$ eddiksyreanhydrid, 5$ DIEA i NMP, 8 min.

6) DCM-vaskinger (6X) 4 min.

Eksempel 13

Fremstilling av analog nr. 1 TE28L 41C64 lbarbburin ( 28- 73) : E- C- A- D- G- L- C- C- D- Q- C- R- F- L- K- K- G- T- V- C- R- V- A- K- G- D- W- N- D- D-T- C- T- G- Q- S- C- D- C- P- R- N- G- L- Y- G

Halvt mmol PAM-Gly harpiks (0,6 mekv./g, Applied Biosystems, Foster City, CA) ble utsatt for fremgangsmåte A med de nød-vendige aminosyrene (introdusert i rekkefølge). Boe- beskyttede aminosyrer hadde følgende side-kjedebeskyttelse: Arg(Tos), Asp(OcHex), Cys(4-MeBzl), Glu(OcHex), Lys(Cl-Z), Thr(OBzl), Trp(CHO) og Tyr(Br-Z). Etter oppstilling av den fullstendige beskyttede peptid-harpikskjeden ble den aminoterminale Boc-gruppen fjernet med TFA og harpiksen tørket som denne TFA-saltform. Harpiksen (1,3 g) ble utsatt for "lav-høy" HF avspaltningsprotokoller etterfulgt av fjerning av HF "i vakuum". Den tørkede peptid-harpiksblandingen ble over-ført til en frittet trakt (grov) med etyleter og ble basket flere ganger med alternerende vaskinger med eter og kloroform for å fjerne det meste av de organiske beskyttelsesgruppene og midlene anvendt i avspaltningen.

Peptidblandingen ble overført til 2 L 0,4$ eddiksyre og pH justert til 7,99 med konsentrert NH40H. Harpiksen ble fil-trert fra denne oppløsningen, og oppløsningen ble latt stå ved 4°C uten omrøring i 20 timer. Dette ble etterfulgt av oppvarming av oppløsningen til romtemperatur og lagring i tre nye dager uten omrøring. Det precipiterte materiale ble fjernet ved filtrering, og supernatanten pH-justert til 3,0 med eddiksyre og lyofillsert.

Råmaterialet ble løst opp i 8,0 ml 0,5 M eddiksyre og applisert på en Sephadex G-50 fine-kolonne (2,5 x 100 cm) ekvilibrert med 0,5 M eddiksyre. Kolonnen ble kjørt ved 20 ml/t og fraksjonene (4 ml) ble oppsamlet i polypropylenrør. Aliquoter av fraksjonene ble tørket, resuspendert I vann og testet for blodplateaggregasjonsinhibitorisk aktivitet som tidligere beskrevet. Aktive fraksjoner (71-90) ble slått sammen og lyofillsert.

Tørket materiale (66 mg) ble løst opp på ny i 2,0 ml 0,1 M eddiksyre og applisert på Waters preparative C-18 kolonne ekvilibrert med 8$ acetonitril inneholdende 0,1$ TFA. En gradient fra 8$ acetonitril til 20$ i 10 min. etterfulgt av en sakte gradient til 30$ acetonitril i 40 min. ble utført. Kolonnen ble eluert ved 18 ml/min., og fraksjonene (12 sek.) ble oppsamlet i polypropylenrør. Fraksjonene ble konsentrert på en Speed-Vac konsentrator til 1,0 ml volum, og 10 pl aliquoter ble undersøkt i blodplateaggregasjonsanalysen.

Aktive fraksjoner (29-32) ble Individuelt lyofillsert og analysert på den analytiske C-18 HPLC-kolonnen med en 8-30$ acetonitrilgradient. Fraksjonene 29 og 30 ble slått sammen og applisert på den analytiske kolonnen i 1,0 ml 0,5$ TFA. Hovedtoppen ble samlet manuelt og lyofillsert for tilveie-bringelse av 1,6 mg rent peptid.

Aminosyreanalyse av dette materiale bekreftet identiteten til peptidet. Analyse av dette materialet for dets evne til å inhibere bindingen av fibrinogen til GP Ilb-IIIa og vitronektin til VnR er vist 1 figurene 26 og 27. Disse data demonstrerer den høye affiniteten til denne analogen for GP Ilb-IIIa og den relative mangelen på affinitet ved VnR for konsentrasjonene opptil 1 jjM.

Eksempel 14

Fremstilling av analog nr. 2.rK^^l eristicophin ( 4- 51): E- E-Y- C- T- G- K- S- C- D- C- P- R- N- P- W- N- G

Halvt mmol PAM-Gly harpiks (0,6 mekv./g, Applied Biosystems, Foster City, CA) ble utsatt for fremgangsmåte A med de nød-vendige aminosyrene (introdusert i rekkefølge). Boc-aminosyrer hadde følgende side-kjedebeskyttelse: Arg(Tos), Asp(OcHex), Cys(4-MeBzl), Glu(O-cHex), Lys(Cl-Z), Ser(OBzl), Thr(OBzl), Trp(CHO) og Tyr (Br-Z). Spaltning, refolding og rensning av dette peptidet var identisk med de tidligere eksemplene. Data for reseptorbinding for denne analogen er vist i figurene 26 og 28.

Eksempel 15

Fremstilling av analog nr. 3: G- C- G- K- G- D- W- P- C- A- NH2

Halvt mmol pMBHA-harpiks (0,72 mekv./g, Applied Biosystems, Foster City, CA) ble utsatt for fremgangsmåte A med de nød-vendige aminosyrene (innført i rekkefølge). Boc-beskyttede aminosyrer hadde følgende side-kjedebeskyttelse: Asp(0-cHex), Cys(4-MeBzl) og Lys(Cl-Z). Etter fullført oppstilling av den beskyttede peptid-harpiksen bleden aminoterminale Boc-gruppen fjernet med TFA, og harpiksen ble tørket som TFA-saltform. Harpiksen (1,54 g) ble behandlet med vannfri hydrogenfluorid (HF) inneholdende 10$ anisol, 2$ etylmetyl-sulfid i 30 min. ved -10°C og ytterligere 30 min. ved 0°C. HF ble fjernet i vakuum, og peptid/harpiksblandingen ble suspendert i dietyleter etterfulgt av alternerende vaskinger med kloroform og eter 3X. Etter en siste etervask ble peptidet ekstrahert fra harpiksen med 2,0 M eddiksyre, fortynnet med destillert vann og lyofilisert.

Råpeptidet (370 mg) ble løst opp i deoksygenert 10 mM NH4OAC, pH 8, til 0,5 mg/ml og oksydert ved dråpevis tilsetning av et lite overskudd 0,01 M kaliumf erricyanid (K3Fe( CN)(, )-oppløs-ning, omrørt i ytterligere 20 min. og justert ved pH med eddiksyre. Peptidoppløsningen ble behandlet med Dowex AG3x4 anion-bytteharpiks i 15 min. med omrøring, og harpiksen fil-trert, fortynnet med H20 og lyofilisert for å tilveiebringe det rå, cykliserte peptidet. Det rå, cykliserte peptidet (392 mg) ble renset ved avsaltning på Sephadex G-25F ved anvendelse av 0,5 M eddiksyre som elueringsmiddel, etterfulgt av ione-byttekromatografi på CM-Sepharose (Pharmacia) ved anvendelse av en elueringsgradient dannet ved tilsetning av 100 mM NH4OACtil en oppløsning av 10 mM NH40Ac, pH 4,5. Fraksjoner som hadde en minimum renhet på 90$ ved HPLC-analyse, ble slått sammen og lyofilisert fra H20 flere ganger for tilveiebrinelse av 175 mg. Den endelinge rensingen besto av preparativ HPLC-rensing på en Water C-18 revers-fasekolonne med en acetonitril/vann/TFA-gradient for tilveie-bringelse av det rensede peptidet. Data for reseptorbinding for denne analogen er vist i figurene 26, 29 og 30.

Eksempel 16

Fremstilling av ytterligere analoger

De følgende analogene ble fremstilt i de fleste tilfellene på en måte som ligner den som er beskrevet i eksempel 15. Analog 60, vist nedenfor, ble fremstilt i oppløsning via guanidering av sidekjeden til lysinresten til analog nr. 19 ved anvendelse av fremgangsmåten til Bajusz, S. et al., FEBS Letts

(1980) 110:85-87. 1 mg analog nr. 19 ble omsatt med 1 mg l-amidino-3,5-dimetylpyrazolnitrat (Aldrich) i 1 ml absolutt etanol i nærvær av diisopropyletylamin (DIEA) ved romtemperatur i 4 dager. Produktanalog 60 ble renset fra overskudd reagens og utgangsmaterialene ved revers-fase HPLC på en C-18 kolonne ved anvendelse av en gradient av acetonitril i 0,1$ trifluoreddiksyre. 900 pg av dette materialet ble isolert i renset form.

Vr

Nr * 4 G-C-K-G-D-W-P-C-A-NH2

5 C-G-K-G-D-W-P-C-NH2

6 G-C-G-K-G-D-W-C-A-NH2

7 G-C-K-G-D-W-C-A-NH2

8 Acetyl-C-K-G-D-C-NH2

9 Mpr-K-G-D-Pen-NH2

10 C-K-G-D-W-P-C-NH2

11 Acetyl-C-R-G-D-Pen-NH2

Nr

* 12 C-K-G-D-Y-P-C-NH2

13 C-K-G-D-F-P-C-NH2

19 Mpr-K-G-D-W-P-C-NH2

34 C-K-G-D-W-G-C-NH2

35 C-K-G-E-W-P-C-NH2

36 C-Orn-G-D-W-P-C-NH2

37: C-K-A-D-W-P-C-NH2

38: C-K-AT-D-W-P-C-NH2

39: C-K-G-D-W-(Sar)-C-NH2

40: C-K(Formyl)-G-D-W-P-C-NH241: C-K-G-D-I-P-C-NH2

42: C-K-G-D-(4-Cl-Phe)-P-NH243: C-K-(Sar)-D-W-P-C-NH2

44: C-K-G-D-(4-N02-Phe)-P-C-NH245: C-K-G-D-(NMePhe)-P-C-NH246: C-H-G-D-W-P-C-NH2

47: Acetyl-C-K-G-D-W-P-C-NH248: Mpr-K-G-D-W(Formyl)-P-C-NH249: Mvl-K-G-D-W-P-C-NH2

50: Mpr-K-G-D-WT-P-Pen-NH2

51: Mpr-K-G-D-W-P-Pen-NH2

52: Mpr-K-G-D-W-P-Penr-NH2

5543: :MMpprr--KK--GG--DD-rW-W--PPT--PP<eenn-->NNHH<2>2

55: Mpr-K-G-D-W-(Thz)-C-NH2

56: Mpr-K-G-D-H(2,4-DNP)-P-C-NH257: Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-Pen-NH258: Mvl-K-G-D-W-P-Pen-NH2

59: Mpr-K-G-D-W-(Pip)-Pen-NH260: Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH2

61: Mpr-K-G-D-W-P-C1-NH2

62: Mpr-(D-Lys)-G-D-W-P-Pen-NH263: Mpr-(Har)-G-D-W-P-Pen-NH264: Mpr-(Acetimidyl-Lys)-G-D-W-P-C-65: Mpr-(Acetimidyl-Lys)-G-D-W-P-Pe 6 6: Mpr-(N<G>,N<G>'-ethylene-Har)-G-D-W 67: Mpr-(N<G>,N<G>'-ethylene-Har)-G-D-W

Nr- 68: Mpr-Har-Sar-D-W-P-C-NH2

6 9: Mpr-(Acetimidy1-Lys)-G-D-W-P-Pen-NH

70: Mpr-(Phenylimidyl-Lys)-G-D-W-P-C-NH2

71: Mpr-Har-Sar-D-W-P-PenNH2<2>

72: Mpr-(Phenylimidyl-Lys)-G-D-W-p-PenNH

73: Mpr-Har-G-D-W-(3,4-dehydro P)-C-NH2

Eksempel 17

PAI- aktivitet til peptidene

Når analysert 1 den standard aggregasjonsinhibisjonsanalysen "beskrevet ovenfor, hadde analogene nr. 3-5 ICsQ-verdier på 5 jjM for evnen til å inhibere ADP-indusert human blodplateaggregasjon. Analog nr. 6 har derimot en IC5Qpå mer enn 200 pM og analog nr. 7, 100 jjM. ICsg-vrdiene for analogene ifølge oppfinnelsen i denne analysen er som følger:

Eksempel 18

Aktiviteten til lineære mot cykliske peptider

Når testet for inhibisjon av fibrogenbinding til GP Ilb-IIIa i plateanalysen, var lineær RGDW-NH2meget lik i aktivitet som cyklisk GCGRGDWPCA-NH2(fig. 29). I kontrast til dette var lineær KGDW-NH2mye mindre potent enn cyklisk GCGKGDWPCA-NH2(fig. 29). For KGDW-forbindelsene, men ikke RGDW-forbindelsene, resulterte cyklisering i en markert økning i evnen som peptidet hadde til å inhibere bindingen av fibrinogen til GP Ilb-IIIa.

Eksempel 19

Resultater av plateblndlngsanalyser for syntetiske peptider

Peptidene fremstilt i eksempel 17, i tillegg til å bli vurdert for deres evne til å inhibere blodplateaggregasjon direkte, ble også testet 1 blodplateanalysene ifølge oppfinnelsen som beskrevet ovenfor. Resultatene for analogene 4-8 er vist i fig. 30. Som angitt i figuren har disse analogene forskjellige evner, i varierende grad, når det gjelder inhibering av bindingen av fibrinogen til GP Ilb-IIIa sammenlignet med vitronektin til vitronektinreseptoren. Analog nr. 4 ser blant denne gruppen ut til å ha det høyeste differensialet. Analoger nr. 7 og nr. 5 på den annen side er også meget spesifikke, og har utmerkede blodplate-aggregasjonsinhibisjonsaktiviteter.

Eksempel 20

Virkninger av rensede peptider på celleadheslon

M21 melanomceller ble merket med<35>S-metionin og deretter tilsatt til vitronektin-belagte plater i nærvær av de angitte konsentrasjonene av de rensede slangevenompeptidene. Celle-koblIngen ble målt ved oppløsning av cellene gjenværende etter en inkubasjon og vask, som beskrevet i seksjon C, på side 40. Som vist i fig. 31 hadde hverken barbourin eller peptid 1 (forkortet barbourin) en signifikant virkning på celleadhesjonen til vitronektin, til tross for at begge er patente inhibitorer av blodplateaggregasjonen som vist i eksemplene 2 og 3. I kontrast til dette var cotiarin som er en potent inhibitor for vitronektinbinding til vitronektinreseptoren meget potent når det gjelder inhibering av cellekobling til vitronektin. I et lignende eksperiment ble peptid nr. 3, peptid nr. 3 med K erstattet av R (CGCRGDWPCA-NH2) og RGDS undersøkt på M21 cellekobling til vitronektin. Som vist i fig. 32 er RGDS og CGCRGDWPCA-NH2potente inhibitorer av cellekobling mens CGCRGDWPCA-NH2ikke var effektiv opp til 60 jjM.

Eksempel 21

Sammenlignings av analogene 60 og 10

Analogene 60 og 19 beskrevet ovenfor er peptider ifølge oppfinnelsen inneholdende sekvensen K<*>GDX og er identiske med unntagelse av innbefatningen av K<*>. Analog 60 har formelen: Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH2;

analog 19 har formelen:

Mpr-K-G-D-W-P-C-NH2.

Disse analogene ble testet ved standard blodplate-aggregasjonsinhibisjonsanalyser og anvendelse av celle-adhesjonsanalysen ifølge eksempel 20 ovenfor. Resultatene er vist i figurene 33 og 34. Som vist i fig. 33 er analog nr. 60 effektiv ved meget små konsentrasjoner når det gjelder inhibering av blodplateaggregasjon, og er relativt mindre effektiv når det gjelder forhindring av celleadhesjon til vitronektin. Fig. 34 viser at analog nr. 19 har god blodplateaggregasjonsinhibisjonsaktivitet samt spesifisitet, men er mindre aktiv i blodplateaggregasjonsinhibisjons-analysen enn analog nr. 60 motparten. Analog nr. 60 har en IC50for blodplateaggregasjon på omtrent 0,15 nM; analog nr.

19 har en IC5Qpå omtrent 1 nM.

Eksempel 22

Folfs modell for trombose i coronararterie fra hund

A. Initiering av cykliske strømningsreduks. loner ( CFRs) i åpen bryst hund. En stopper plassert på venstre anterior-gående (LAD) koronararterie til en 20 kg hund ble utført som tidligere beskrevet. Faslske og gjennomsnittlige blod-strømninger målt av en elektromagnetisk (EM) utstrømnings-probe og Doppler-strømningsprobe er vist i fig. 35.

B. Virkning av cvkllsk CGCRGDWPCA- NH2 ( analog nr. 3) på CFR i åpen bryst hund. En dose på 10 mg av dette peptidet ble infusert inn i perifervenen i hunden. Blodstrømnings-mønstrene i LAD som beskrevet ovenfor, er vist i fig. 36. Den delvise ablasjon av CFR som vist i den reduserte stigningen av strømningsreduksjonene bør legges merke til. Det er også å bemerke at strømningen ikke er redusert i samme grad som i kontroll (A). C. En andre infusjon av 40 mg analog nr. 3 ble gitt inn i en perifervene. Som vist i fig. 37 indikerer den fullstendige ablasjon av CFR at fullstendig strømning er blitt gjenopprettet i LAD.

Eksempel 23

Konstruksjon av ekspresjonsvektorer for barbourinpeptider

Et gen kodende for full lengde [L<41>] barbourinpeptid (1-73) ble oppstilt fra syntetiske oligonukleotider som vist i fig. 38, som ble kinasebehandlet, sammensmeltet og ligert inn i ECoRI-Hindlll-spaltet M13mpl8 ved anvendelse av standard prosedyrer. Det bakterielle alkaliske fosfatasegen (phoA)-signalsekvensen (Watson, M.E., Nucleic Acids Research (1984) 12:5145) ble tilsatt til barbourinkonstruksjonen ved ligering av syntetiske oligonukleotider inn i EcoRI/Ncol-setene til [L<41>] barbourin (1-73)-konstruksjonen som vist i fig. 39. Nukleotidsekvensene til alle konstruksjoner ble verifisert ved Sanger-dideoksykjedetermineringsmetoden.

En forkortet versjon av dette peptidet ble også konstruert fra syntetiske oligonukleotider som bare koder for aminosyrene 28-73 av fullengdemolekylet. To endringer, Q<28>tilE2<8>ogA<64>til C^<4>, ble introdusert ved anvendelse av sete-rettet mutagenese som beskrevet av Kunkel et al., Meth. Enzymol. (1987) 154:367. phoA-signalsekvensen ble tilsatt til den forkortede versjonen som beskrevet ovenfor (fig. 40). I tillegg ble signalsekvensen for E. coli varme-stabil enterotoksin II (Picken, R. W. et al., Infect. Immun. (1983) 42:269) tilsatt til den forkortede versjon ved anvendelse av syntetiske oligonukleorlder med EcoRI og Ncoi kompatible ender. Alle bakterielle sekresjonskonstruksjoner ble sub-klonet inn i den bakterielle ekspresjonsvektoren pPROK-1 (Brosius, J., Gene (1984) 27:151, ibid:161), tilgjengelig kommersielt fra CLONTECH Lab., Inc., ved anvendelse av EcoRI og Hindlll restriksjonsendonukleaser.

Et gen kodende for tamdemgjentagelser av det ønskede tittel-peptidet ble fremstilt ved anvendelse av polymerasekjede-reaksjonen (PCR) for å fremstille multimeriseringsenheten fra full-lengde barbourinpeptid 1-73 inneholdende L41 og C64.

Fig. 41 viser oligonukleotidene anvndt for PCR-syntesen. PCR-reaksjonen ble utført ifølge fremgangsmåten til Saiki, R.K. et al., Science (1988) 239:487. Den resulterende polymergrensen inneholder metioniner ved hvilke som helst ende av sekvensen som vist i fig. 42 og tilveiebringer ønskelige restriksjonsseter for konstruksjonen.

Tandem-gjentagelser blir utført fra de individuelle multimer-dannende komponentene ved f.eks. ligerlng av et EcoRI-BamHI fragment til et Bglll/Hindlll fragment i en M13mpl8 vektor spaltet med EcoRI/Eindlll for å danne en dimer. Den resulterende dimeren blir spaltet ut med EcoRI BamHI og ligert til et Bglll/Hindlll fragment for å fremstille en trimer, og videre helt til den ønskede størrelsen blir oppnådd. Denne konstruksjonen er vist i diagrammet i fig. 43.

Multimeren ble deretter ligert inn i E. coil vektor pKK233-2, Amann, E. et al., Gene (1985) 40:183, tilgjengelig fra Clontech, ved spaltning av vektoren med Ncol/Hindlll og ligering av et monomersubfragment av NcoI/BamHI og multimer-subfragmenter av Bglll/Eindlll.

For ekspresjon som et fusjonsprotein ble ovennevnte spaltede vektor anvendt sammen med et NcoI/EcoRI-subfragment inneholdende en noe modifisert amino-terminal del (aminosyrene 1-'72) av kloramfenikolacetyltransferasegenet (Chang, C.N. et al., Gene (1987) 55:189) og EcoRI/Hinglll-subfragmenter av multimerkonstruksjoner.

Eksempel 24

Ekspresjon av rekombinante gener

Proteinekspresjon fra alle de rekombinante plasmidene beskrevet ovenfor blir innført ifølge Kanamari et al., Gene

(1988) 66:295 etter transfeksjon inn i hensiktsmessige E. coli-vertstammer. Produktene blirkarakterisert vednatrium-dodecylsulfatpolyakrylamidgel-elektroforese og ved deres evne til å inhibere ADP-indusert blodplateaggregasjon i plate-rikt plasma. Etter rensing blir multimeriske proteiner omdannet til monomerenheter med cyanogenbromidspaltning og produktene analysert som ovenfor.

Claims

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av en terapeutisk aktiv spesifikk blodplateaggregasjonsinhibitor (PAI) peptid med evne til å inhibere bindingen av Fg eller vWF, GP Ilb-IIIa med vesentlig mer, det vil si at enten er prosent inhibisjon minst to ganger høyere ved en gitt konsentrasjon av PAI eller at konsentrasjonen av PAI som forårsaker 50$ inhibisjon, er minst to ganger mindre for Fg eller vWF/GP Ilb-IIIa-bindingsinhibisjonen enn for alternativ ligand/-reseptorbinding, dvs. potenthet enn inhibering av bindingen av vitronektin til vitronektinreseptoren eller fibronektin til fibronektinreseptoren, der PAI har formelen:

hvori K<*>er et lysylresidie med formelen: R<i>gNfCHg)4CHNHC0- , hvori hver R<1>er uavhengig H, alkyl (1-6C) eller optll en R<1>er R<2->C=NR<3>, hvori R<2>er H, alkyl (1-6C) eller er en substituert eller usubstituert fenyl eller benzylrest, eller NR<4>2der hver R<4>er uavhengig H eller alkyl (1-6C), og R<3>er H, alkyl (1-6C), fenyl eller benzyl, ellerR<2->C=NR<3>er en rest valgt fra gruppen bestående av:

hvor m er et tall på 2-3, og hver R<5>er uavhengig H eller alkyl (1-6C); og der en eller to (CH2) kan bli erstattet med 0 eller S forutsatt at nevnte 0 eller S ikke er ved siden av et annet heteroatom; AAi er en liten, nøytral (polar eller upolar) aminosyre, og ni er et tall på 0-3; AA2er en nøytral, upolar, stor (aromatisk eller uaromatisk) eller en polar aromatisk aminosyre, og n2 er et tall på 0-3; AA3er et prolinresidie eller et modifisert prolinresidie og n3 er et tall på 0-1; AA4er en nøytral, liten aminosyre eller den N-acylerte form derav, og n4 er et tall på 0-3; hver av X^og X2er uavhengig en residie som kan danne en binding mellom X^og X2for å oppnå en cyklisk forbindelse som vist; hver av og Y2er uavhengig en ikke-interfererende substituent, eller kan være fraværende; hvor en eller flere peptidbindinger eventuelt kan bli erstattet av en binding valgt fra gruppen bestående av —CH2NH—, -CH2S-, CH2CH2-, -CH=CH- (cis og trans), -C0CH2-, -CH(0H)CH2- og -CH2S0-; forutsatt at dersom n3 er 0; er enten: 1) summen av n2 og n4 minst 2; eller 2) K<*>må være forskjellig fra Har eller K; eller 3) X2må være forskjellige fra Cys (C), penicillamin (Pen), eller 2-amino-3,3-cyklopentanmetylen-3-merkaptopropionsyre (APmp); eller 4) en eller flere peptidbindinger er erstattet med nevnte alternerende binding,karakterisert vedat den omfatter: begynne syntesen fra den karboksy-terminale enden av nevnte peptid ved anvendelse av en aminosyre som har en alfa-aminobeskyttende gruppe, i det nevnte aminosyre er bundet til en harpiskbærer, fullføre oppstillingen av en beskyttet peptid-harpikskjede, fjerning av nevnte beskyttelsesgruppe, spaltning av nevnte peptid fra nevnte harpiks, syklisering av nevnte peptid og eventuelt rensing av nevnte peptid.

2. Analogifremgangsmåte ifølge krav 1, hvor er H, acyl eller en peptidrest eller derivatisert form derav eller er fraværende og/eller Y2er OH, NH2eller en peptidrest eller en derivatisert form derav eller er fraværende; og/eller hvori Xi og X2blir valgt fra gruppen bestående av cystein (C), merkaptopropionyl (Mpr) og penicillamin (Pen); og/eller hvori AA^er G og n^er 0 eller 1; og/eller hvori AA2velges fra gruppen bestående av gruppen W, F, L, Y og V; og/eller hvori AA2er W; og/eller hvori K<*>er K, Har, acetimidyl-Lys eller fenylimidyl-Lys; og/eller hvori forbindelsen med formel 1 velges fra gruppen bestående av

eller sykliske former derav,karakterisert vedat det anvendes samme substituerte utgangsmateriale.

3. Analogifremgangsmåte ifølge krav 2, hvor blodplateaggrega-sjonsinhibitoren er Mpr-K-G-D-W-P-C-NH2?karakterisert vedat det anvendes samme substituerte utgangsmateriale.

4. Analogifremgangsmåte ifølge krav 2, hvor blodplateaggrega-sjonsinhibitoren er Mpr-K-G-D-W(formyl)-P-C-NH2,karakterisertved at det anvendes samme substituerte utgangsmateriale.

5. Analogifremgangsmåte ifølge krav 2, hvor blodplateaggrega-sjonsinhibitoren er Mvl-K-G-D-W-P-C-NHg >karakterisert vedat det anvendes samme substituerte utgangsmateriale.

6. Analogifremgangsmåte ifølge krav 2, hvor blodplateaggrega-sjonsinhibitoren er Mpr-K-G-D-W-P-Pen-NH2,karakterisert vedat det anvendes samme substituerte utgangsmateriale.

7. Analogifremgangsmåte ifølge krav 2, hvor blodplateaggrega-sjonsinhibitoren er Mpr-(Har )-G-D-W-P-C-NH2'karakterisertved at det anvendes samme substituerte utgangsmateriale.

8. Analogifremgangsmåte ifølge krav 2, hvor blodplateaggrega-sjonsinhibitoren er Mpr-K-G-D-W-(Pip)-Pen-NH2»karakterisertved at det anvendes samme substituerte utgangsmateriale.

9. Analogifremgangsmåte ifølge krav 2, hvor blodplateaggrega-sjonsinhibitoren er Mpr-(Har )-G-D-W-P-Pen-NH2,karakterisertved at det anvendes samme substituerte utgangsmateriale.

10. Analogifremgangsmåte ifølge krav 2, hvor blodplateaggrega-sjonsinhibitoren er Mpr-(acetimidyl-Lys)-G-D-W-P-C-NH2,karakterisert vedat det anvendes samme substituerte utgangsmateriale.

11. Analogifremgangsmåte ifølge krav 2, hvor blodplateaggrega-sjonsinhibitoren er Mpr-(acetimidyl-Lys)-G-D-W-P-Pen-NH2»karakterisert vedat det anvendes samme substituerte utgangsmateriale.

12. Analogifremgangsmåte ifølge krav 2, hvor blodplateaggrega-sjonsinhibitoren er Mpr-(fenylimidyl-Lys)-G-D-W-P-C-NH2'karakterisert vedat det anvendes samme substituerte utgangsmateriale.

13. Analogifremgangsmåte ifølge krav 2, hvor blodplateaggrega-sjonsinhibitoren er Mpr-Har-G-D-W-(3,4-dehydro-Pro)-C-NH2,karakterisert vedat det anvendes samme substituerte utgangsmateriale.