ES2097150T5

ES2097150T5 - Inhibidores de agregacion plaquetaria.

Info

Publication number: ES2097150T5
Application number: ES90911002T
Authority: ES
Inventors: Robert M. Scarborough; David Lawrence Wolf; Israel F. Charo
Original assignee: Millennium Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Millennium Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1989-06-16
Filing date: 1990-06-15
Publication date: 2006-06-16
Anticipated expiration: 2010-06-15
Also published as: DE19975072I1; AU636159B2; US5318899A; LU90488I2; CA2059124A1; US5958732A; KR920702627A; NO982249L; NL990043I2; JPH05500750A; EP0751219A1; RU2156468C2; AU6036990A; CA2388770A1; FI104364B; DE69029579T3; DE19975072I2; ES2097150T3; NO914962D0; EP0477295A1

Abstract

SE DESCRIBE UNA PRUEBA PARA FILTRAR VENENO DE SERPIENTE POR LA PRESENCIA O AUSENCIA DE INHIBIDORES DE ASOCIACION DE PLAQUETAS (PAIS) BASADA EN UN AGLUTINADOR RECEPTOR ESPECIFICO. UTILIZANDO ESTA PRUEBA, SE LOGRO LA IDENTIFICACION Y CARACTERIZACION DEL PAIS EN UNA GAMA AMPLIA DE MUESTRAS DE VENENO DE SERPIENTE. SE DESCRIBE Y CARACTERIZA EL PAIS AISLADO Y PURIFICADO DE VARIOS DE ESTOS VENENOS ACTIVOS DE SERPIENTE. ADEMAS, EL PAIS SIN LA SECUENCIA DE ADHESION ARG-GLI-ASP(RGD) PERO QUE CONTIENE K* -(G/SAR)-D DONDE K* ES UN RESIDUO LISIL MODIFICADO DE LA FORMULA R1/2 N(CH SUB 2) SUB 4CHNHCO1 ES INDEPENDIENTEMENTE H, ALKIL (1-6C) O AL MENOS UN R ELEVADO 1 ES R (AL CUADRADO) -C=NR ELEVADO 3 DONDE R (AL CUADRADO) ES H, ALKIL (1-6C), FENIL O BENZIL, O R (AL CUADRADO) -C=NR ELEVADO 3 ES UN RADICAL SELECCIONADO DEL GRUPO QUE CONSTA DE (A), (B), (C) Y (D) DONDE M ES UN ENTERO DE 2-3, Y CADA R ELEVADO 5 ES INDEPENDIENTEMENTE H O ALKIL (1-6C); Y DONDE UNO O DOS (CH SUB 2) PUEDEN SER SUSTITUIDOS POR O O SSIEMPRE QUE DICHA O O S NO SEAN ADYACENTES A ESTOS ATOMOS, SE PREPARAN Y MUESTRAN PARA INHIBIR ESPECIFICAMENTE LA UNION DEL FIBRINOGENO O EL FACTOR DE VON WILLEBRAND AL GP IIB-IIIA.

Description

Inhibidores de agregación plaquetaria.

Esta invención se relaciona con un grupo de péptidos que son, o están relacionados con inhibidores de agregación plaquetaria aislados y purificados a partir de diferentes venenos de serpiente. Estos péptidos son útiles como agentes terapéuticos para el tratamiento de, y prevención de, desordenes isquémicos asociados con las plaquetas. Más específicamente, la invención tiene que ver con los péptidos que bloquean a los receptores específicos para las proteínas adhesivas involucradas en la adherencia y agregación plaquetaria. Además, esta invención describe métodos para detectar y purificar a dichos polipéptidos hasta una homogeneidad sustancial a partir de los venenos de serpiente, así como procesos para utilizar las secuencias primarias de aminoácidos de estos polipéptidos para preparar péptidos activos tanto en forma sintética como a través del uso de métodos de ADN recombinante.

La enfermedad cardiaca es la primera causa de muerte en la mayoría de las sociedades occidentales. La muerte por enfermedad cardiaca es a menudo inducida por síndromes isquémicos dependientes de las plaquetas que se inician por aterosclerosis y arteriosclerosis, e incluyen, pero no se limitan a, infarto agudo del miocardio, angina crónica inestable, ataques isquémicos transitorios y ataques súbitos, enfermedad vascular periférica, trombosis arterial, preeclampsia, embolia, reestenosis y/o trombosis siguiente a una angioplastia, endarterectomía de carótida, anastomosis de injertos vasculares, y dispositivos cardiovasculares crónicos (por ejemplo, catéteres permanentes o derivaciones de "dispositivos de circulación extracorporal"). Estos síndromes representan una variedad de desordenes vasculares estenóticos y oclusivos que se piensa que se inician por activación plaquetaria ya sea sobre las paredes de las venas o dentro del lumen por medio de los mediadores transportados por la sangre pero que se manifiestan por medio d agregados plaquetarios que forman trombos que restringen el flujo de la sangre.

Numerosos estudios han contribuido a la comprensión del mecanismo de agregación plaquetaria y la formación de trombos. Las plaquetas responden a una variedad de lesiones en los vasos sanguíneos, tales como el estrechamiento del lumen, la formación de placa, y la presencia de cuerpos extraños (por ejemplo, catéteres) y similares. La respuesta de las plaquetas a estas lesiones es una secuencia de eventos que incluyen adherencia y activación plaquetaria, y la liberación de componentes granulares plaquetarios, incluidos los potentes factores mitogénicos celulares. Los agregados plaquetarios activados inducen la formación de fibrina, la cual además estabiliza a los trombos.

Mucho se sabe ahora acerca de los mecanismos que regulan estas respuestas. Aunque las plaquetas no estimuladas contienen receptores para diferentes proteínas adhesivas que incluyen laminina (VLA 2, VLA 6) y colágeno (VLA 2, GPIV, otros), la unión inicial de las plaquetas al subendotelio, se cree que es mediada por el enlazamiento de glicoproteína de la membrana plaquetaria (GP) Ib al factor inmovilizado de von Willebrand. La activación plaquetaria subsiguiente pude ser iniciada por uno o más de los agonistas fisiológicos conocidos que incluyen: ADP, epinefrina, trombina, colágeno, y tromboxano A2.

La agregación plaquetaria es mediada por el complejo GP IIb-IIIa sobre la superficie de la membrana plaquetaria. El GP IIb-IIIa existe sobre la superficie de las plaquetas no estimuladas en forma inactiva. Cuando se activan las plaquetas por adhesión y los agonistas fisiológicos, el GP IIb-IIIa también se hace activo de tal manera que se convierte en receptor para fibrinógeno (Fg), para el Factor de von Willebrand (vWF), y para fibronectina (Fn) (ver Phillips y colaboradores, Blood (1988) 71:831-843); sin embargo, se cree que el enlazamiento de fibrinógeno y/o del factor de von Willebrand son los principales responsables de la agregación plaquetaria y de la formación de trombos in vivo. Por lo tanto, las sustancias que inhiben específicamente el enlazamiento de fibrinógeno o del factor de von Willebrand al GP IIb-IIIa, inhiben la agregación plaquetaria y podrían ser candidatas para inhibir la formación de trombos
in vivo.

Se sabe ahora que el GP IIb-IIIa plaquetario es un miembro de una superfamilia de receptores de proteína adhesiva relacionados estructuralmente, conocidos colectivamente como las "integrinas". Al igual que el GP IIb-IIIa, todas las integrinas conocidas hasta la fecha son dos subunidades de moléculas con una subunidad alfa mayor (por ejemplo, GP IIb) y una subunidad beta menor (por ejemplo, GP IIIa). Existe un alto grado de homología entre las secuencias conocidas de las subunidades de integrina que indican que las integrinas evolucionaron a partir de un precursor común. Las integrinas funcionan en una variedad de adhesiones celulares y han sido encontradas en leucocitos, células endoteliales, células de músculo liso y en otras células en la vasculatura. Ya que las integrinas están ampliamente distribuidas, mientras que el GP IIb-IIIa está restringido a las plaquetas, un agente antiagregante preferido inhibiría selectivamente al GP IIb-IIIa en forma opuesta a otras integrinas.

Se han revelado diferentes clases de péptidos que bloquean el enlazamiento de proteínas adhesivas a las plaquetas activadas y que inhiben la agregación plaquetaria (ver Hawiger y colaboradores, patentes US 4.661.471; y Rouslahti y colaboradores, patentes US 4.614.517; 4.578.079; 4.792.525; y la solicitud en el Reino Unido GB 2.207.922A). En una clase de péptidos, la secuencia RGD es crítica, y las secuencias tetrapéptidas RGDS, RGDT, RGDC han sido usadas específicamente. La secuencia añadida amino RGDX se encuentra en una variedad de proteínas adhesivas que incluyen Fg, Vn, vWF y Fn. Se ha demostrado que esta secuencia juega un papel importante en la interacción de las proteínas adhesivas con los receptores de las proteínas adhesivas debido a que los péptidos contienen esta secuencia bloquean el enlazamiento de las proteínas adhesivas. Ver, por ejemplo, a Pierschbacher, M. D., y colaboradores, J. Biol. Chem. (1987) 262: 17294-17298; Ruggeri y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) (1986) 86:5708-5712; y Rouslahti y colaboradores, Cell (1986) 44:517-518. Una revisión de los procesos de adhesión que incluye una revisión de las proteínas adhesivas que contienen al tripéptido RGD como sus sitios de reconocimiento celular, puede encontrarse en Rouslahti y colaboradores, Science (1987) 238:491-491. Los tetrapéptidos que contienen esta secuencia se revelan en EP-A-319.506. Los pentapéptidos con base en homoarginina que contienen homoarginina en vez de arginina en las secuencias de RGD, son revelados en la solicitud PCT WO 89/07609. Los péptidos cortos que contienen una lisina o una glutamina así como una arginina en la secuencia RGD, se ha reportado que tienen actividad como antagonistas del factor de necrosis tumoral (WO 90/06943).

Las variaciones estructurales permitidas en los péptidos que contienen RGD, han sido exploradas por Pierschbacher, M. D. y colaboradores, J. Biol. Che. (supra). En estos estudios, se encontró que la manipulación de la secuencia que contiene RGD no solo afectó la actividad relacionada con la inhibición del enlazamiento de fibronectina o vitronectina al sustrato, sino que podría afectar también la diferenciación entre el enlazamiento de los dos ligandos. La secuencia GRGDSPC del péptido que fue tomada del dominio de fibronectina unido a la célula, fue utilizada como péptido modelo. Ciertas sustituciones, tales como el reemplazo de L-Arg con D-Arg, parece no tener efecto sobre el enlazamiento de cualquiera de los dos ligandos, pero la sustitución de D-Ala por Gly, o de D-Asp por L-Asp, destruyó la actividad de inhibición. Mientras que la sustitución de D-Ser por L-Ser redujo la inhibición de la interacción de vitronectina con el receptor de vitronectina, hubo poco efecto sobre la interacción de la fibronectina con el receptor de fibronectina; la sustitución de Asn por Ser resultó en un péptido que había mejorado la inhibición del enlazamiento de fibronectina, y un efecto menor sobre el enlazamiento de vitronectina. Las sustituciones alternas por Ser tuvieron otros efectos. La treonina sustituida por Ser produjo un péptido con una inhibición mayor de enlazamiento al receptor de vitronectina; la sustitución de L-Pro condujo a un péptido inactivo. Se preparó también un péptido cíclico con la secuencia Gly-Pen-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys-Ala, en donde "Pen" es penicilamina y se formó un puente disulfuro entre Pen y Cys. Desde el punto de vista de los autores, la penicilamina tenía la función de incrementar las restricciones conformacionales sobre el anillo mientras que el Gly N-terminal y Ala carboxi-terminal fueron añadidos para distanciar a los grupos amino y carboxilo del anillo. El péptido cíclico fue capaz de inhibir el enlazamiento de vitronectina más fuertemente que el mismo péptido antes de la ciclización, pero fue ineficaz para inhibir el enlazamiento de fibronectina.

Recientemente, un péptido antitrombótico con una modificación de la secuencia RGD que tiene al residuo alquilado "R", fue reportado por Samanen, J. y colaboradores, J Cell Biochem. (1990) Suplemento 14A:A229. Una revisión de las relaciones de estructura/actividad en los péptidos que contienen RGD, ha sido publicada por Ali, F. E. y colaboradores, en Proc. 11th Am. Peptide Symp. Marshall y colaboradores, ed. EXCMO. Leiden 1990.

EP-A-341.915 revela dos grupos de péptidos, uno lineal y el otro cíclico, que se dice que se enlazan al receptor del GP IIb-IIIa plaquetario y de esta manera inhiben su habilidad para enlazar vWF, fibronectina y fibrinógeno-fibrina. No se proporcionan datos con relación a la especificidad de enlazamiento de estos péptidos. El grupo de péptidos cíclicos incluye modificaciones de la secuencia RGD en donde el R se sustituye por homoarginina D o L, dimetil o dietil arginina, lisina, o un derivado alfa-alquilado de estos residuos. Las estructuras cíclicas mínimas comprenden simplemente la secuencia "R" GD unidas entre los dos residuos que forman el puente disulfuro.

Una clase separada de péptidos inhibidores utiliza secuencias de péptidos modeladas sobre la secuencia carboxi terminal derivada de la cadena gama de fibrinógeno, el dodecapéptido HHLGGAQKAGDV (Kloczewiak y colaboradores, Biochemistry (1989) 28:2915-2919; Timmons y colaboradores, (ibid), 2919-2923 patente US 4.661.471 (supra); EP-A-298.820). Aunque esta secuencia inhibe el enlazamiento de Fg y de vWF a GP IIb-IIIa y la posterior agregación plaquetaria, la utilidad de este péptido es limitada debido a que tiene baja afinidad de interacción con los receptores plaquetarios (IC_{50}=10-100 \muM).

Recientemente, varios grupos han aislado y caracterizado una nueva clase de factores de polipéptidos de bajo peso molecular de venenos de serpiente que tienen una afinidad extremadamente alta por el complejo GP IIb-IIIa. Huang, T.-F. Y colaboradores, J. Biol. Chem. (1987) 262:16157-16163; Huang, T-F, y colaboradores, Biochemistry (1989) 28:661-666) reportaron la estructura primaria de la tigramina, un péptido de 72 aminoácidos que contiene RGD y 6 puentes disulfuro aislados de Trimeresurus gramineus. Gan, Z.-R. y colaboradores, J. Biol. Chem. (1988) 263:19827-19832, reportan las propiedades y estructura de la echistatina, un péptido de 49 aminoácidos que también contiene RGD y 4 puentes disulfuro putativos que se aíslan de Echis carinatus. Williams, J. A., y colaboradores, FASEB Journal (1989) 3:A310, Abstr. No. 487m, reportan la secuencia y las propiedades de los péptidos relacionados elegantina, albolabrina, y flavoviridina. Además, la caracterización de la bitistatina fue reportada por Shebuski, R. J. y colaboradores, J. Biol. Chem. (1989) 264:21550-21556; y el PAI de Agkistrodon piscivorus piscivorus fue reportado por Chao, B. H., y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:8050-8054. La secuencia y la actividad de una PAI de Agkistrodon rhodostoma, kistrina, y diferentes variantes del péptido kistrina de ocurrencia natural, son revelados en WO 90/15072. La relación entre diferentes antagonistas de GP IIb-IIIa de los venenos de serpiente fue discutida por Dennis, M. S., y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 87:2471-2475.

Incluidos en este grupo de péptidos inhibitorios de venenos de serpiente, están la alboabrina aislada de Trimeresurus albolabris, la elegantina aislada de T. elegans, la flavoviridina aislada de T. flavoviridis, la batroxostatina aislada de Bothrops atrox, la bitistatina aislada de Bitis arietans reportada por Niewiarowski, S., y colaboradores, Thromb. Haemostas. (1989) 62:319 (Abstr. SY-XIV-5). Además, la applaggina ha ido purificada de Agkistrodon p. piscivorus y reportada por Chao, B., colaboradores, Thromb. Haemostas. (1989) 62:50 (Abstr. 120) y la halysina, purificada de Agkistrodon halys que fue reportada por Huang, T.F. y colaboradores, Thromb. haemostas. (1989) 62:48 (Abstr. 112). Todos estos péptidos muestran un alto grado de homología de secuencia. Además, todos los péptidos reportados hasta la fecha de los venenos de serpiente, que inhiben el enlazamiento de proteínas adhesivas a los receptores de integrina, contienen la secuencia RGD.

Aunque estos factores reportados d veneno de serpiente son potentes inhibidores de agregación plaquetaria in vitro, estos péptidos también se enlazan con alta afinidad a otros miembros de los receptores de proteína adhesiva tales como los receptores de vitronectina y de fibronectina (Knudsen, K.A., y colaboradores, Exp. Cell Res. (1988) 179:42-49; Rucinski, B., y colaboradores, Thromb. Haemostas. (1989) 62:50 (Abstr. 120). Esta carencia de especificidad de los factores del veneno de serpiente por el GP IIb-IIIa es una característica indeseable de sus usos terapéuticos como inhibidores de la formación de trombos, debido a que ellos tienen el potencial de afectar las propiedades adhesivas de otras células en la vasculatura, particularmente de aquellas adhesiones medidas por integrinas.

Otras aproximaciones desarrolladas para la generación de inhibidores de agregación de plaquetaria, ha sido el uso de anticuerpos monoclonales anti-GP IIb-IIIa de murino, que bloquean el enlazamiento de las proteínas adhesivas a las plaquetas estimuladas. Estos anticuerpos monoclonales han sido utilizados para prevenir la reoclusión de la arteria coronaria después de reperfusión con un activador plasminógeno de tejido en perros (Yasuda, T y colaboradores, J. Clin. Invest. (1988) 81:1284-1291) y para prevenir la reducción cíclica del flujo en las arterias coronarias caninas lesionadas, con un alto grado de estenosis. Los efectos secundarios potenciales del uso de tales anticuerpos monoclonales en humanos, pueden resultar de sus efectos de larga duración y de su inmunogenicidad potencial.

Claramente, se necesitan los regímenes adicionales de tratamiento terapéutico para prevenir, a al menos para mitigar la formación indeseable de trombos. En particular, los agentes terapéuticos capaces de bloquear o inhibir la formación de trombos en ubicaciones específicas sin hemostasis comprometedora y sin afectar otras adhesiones celulares, proveerían mayores beneficios terapéuticos. Idealmente, estos agentes serían potentes, específicos para GP IIb-IIIa, e inmunogénicos para la mayoría de los pacientes; ellos serían también fáciles de administrar, estables y económicos de producir. Además, estos agentes deben actuar en forma transciente y ser capaces de funcionar en las primeras etapas de la formación de los trombos, sin interferir con la hemostasis de largo plazo. Estos problemas técnicos son resueltos por la presente invención como se reseña en las reivindicaciones.

Por medio de un simple procedimiento de muestreo es posible identificar polipéptidos PAI que inhiben específicamente la formación de trombos mediados por agregación plaquetaria. Este procedimiento toma ventaja de comprender que la agregación plaquetaria se efectúa en primer lugar a través del enlazamiento de fibrinógeno y/o de vWF al GP IIb-IIIa en la superficie de las plaquetas, cuando estas son tratadas con estímulos apropiados, tales como ADP. Utilizando estos criterios, esto es, la inhibición del enlazamiento de fibrinógeno y/o vWF para el receptor aislado y criterios análogos relacionados con la inhibición del enlazamiento de fibronectina (Fn) al receptor de fibronectina (enlazamiento de Fn/FnR) y de vitronectina al receptor de vitronectina (enlazamiento de Vn/VnR), así como el enlazamiento de otros factores, tales como Fn y Vn al Gp IIb-IIIa, puede obtenerse fácil y convenientemente un perfil de especificidad para el inhibidor de agregación plaquetaria (PAI). Esta aproximación ha sido utilizada para hacer un muestreo y caracterizar una amplia lista de venenos de serpiente para la presencia o la ausencia de PAI, para caracterizar la especificidad del PAI identificado a partir de esta lista para su especificidad en la inhibición de enlazamiento al GP IIb-IIIa en forma opuesta para inhibir otras integrinas, y para identificar péptidos activos que se derivan de estos PAI.

El método de muestreo apara la presencia o la ausencia de PAI en un fluido biológico comprende poner en contacto al fluido con el GP IIb-IIIa aislado en una reacción de prueba en presencia de fibrinógeno, y comparar la cantidad de fibrinógeno enlazado al GP IIb-IIIa en esta reacción de prueba con la cantidad de fibrinógeno enlazado al GP IIb-IIIa en una reacción de control. El método puede incluir además reacciones de ensayo y de control que involucran poner en contacto al Fn con el receptor de Fn, al Vn con el receptor de Vn, al Fn con el GP IIb-IIIa, o a vWF con GP IIb-IIIa para caracterizar la especificidad del PAI.

El PAI puede aislarse de Echis colorate. Eristicofis macmahonii; A. hypnale. A. acutus. A. piscivorous leucostoma. A. piscivorus conanti; Bothrops asper; Bothrops cotiara, B. jararaca. B. jararacussu. B. lansbergi, B. medusa. B. nasuta. B. neuwiedi. B. pradoi. B. schlegli; Crotalus atrox, C. basilicus, C. cerastes cerastes, C. durissus durissus, C. durissus totonatacus. C. horridus horridus C. molossus molossus. C. ruber ruber. C. viridis cereberus. Crotalus v. helleri. Crotalus v. lutosus. Crotalus v. oreganus. Crotalus v. viridis; Lachesis mutas Sistrurus catenatus tergeminus, y Sistrurus milarus barbouri.

La presente invención se relaciona con los polipéptidos inhibidores de agregación plaquetaria, con la composición farmacéutica y el uso como el reivindicado en las reivindicaciones 1 a 13.

Por lo tanto, la invención se relaciona con polipéptidos inhibidores de agregación plaquetaria capaces de inhibir el enlazamiento de Fg o vWF al GP IIb-IIIa más que el enlazamiento de vitronectina al receptor de vitronectina o de fibronectina al receptor de fibronectina, en donde, o el porcentaje de inhibición es al menos dos veces mayor para la inhibición de enlazamiento de fibrinógeno (Fg) o del Factor de von Willebrand (vWF) al GP IIb-IIIa, que para la inhibición de enlazamiento de vitronectina al receptor de vitronectina o de fibronectina al receptor de fibronectina a una concentración dada de PAI, o la concentración de PAI que causa 50% de inhibición , es al menos dos veces menor para la inhibición de enlazamiento de Fg o vWF/GP IIb-IIIa que para la inhibición de enlazamiento de vitronectina al receptor de vitronectina o de fibronectina al receptor de fibronectina, dicho inhibidor de agregación plaquetaria tiene la fórmula general

1

en donde K* es un grupo lisilo de fórmula general

2

en donde cada R^{1} es independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1} a C_{6} o a lo sumo un R^{1} es R^{2}-C=NR^{3},

en donde R^{2} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1} a C_{6}, un grupo fenilo o un grupo bencilo o un grupo fenilo o bencilo sustituido con un grupo alquilo o fenilo, o es NR^{4}_{2} en el cual cada R^{4} es independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1} a C_{6}, y

R^{3} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1} a C_{6}, un grupo fenilo o bencilo, o

R^{2}-C=NR^{3} es un grupo seleccionado de:

3

en donde m es un entero de 2-3 y cada R^{5} es independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1} a C_{6};

y en donde uno o dos -CH_{2}- pueden ser reemplazados por O o S siempre que dicho O o S no sea adyacente a otro heteroátomo;

AA_{1} es un grupo aminoácido neutro, polar o no polar que contiene de 1 a 4 átomos de carbono y n1 es cero o un entero de 1-3;

AA_{2} es un grupo aminoácido neutro, no polar, grande, aromático o no aromático o aromático polar y n2 es cero o un entero de 1-3;

AA_{3} es un residuo de prolina o un residuo de prolina modificada de fórmula general

4

en donde uno o dos de los grupos metileno pueden ser reemplazados por NR, S o O y en donde cualquier nitrógeno del anillo pude ser opcionalmente sustituido por un sustituyente que no interfiera, y R es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo,

y n3 es cero o 1;

AA_{4} es un grupo aminoácido neutro que contiene de 1 a 4 átomos de carbono o la forma N-alquilada del mismo, y n4 es cero o un entero de 1-3;

\newpage

cada uno entre X_{1} y X_{2} es independientemente un residuo capaz de formar un enlace entre X_{1} y X_{2} para obtener un compuesto cíclico como el mostrado; y

cada uno entre Y_{1} y Y_{2} es independientemente un sustituyente que no interfiere o que puede estar ausente;

en donde uno o más de los enlazamientos de péptidos pueden opcionalmente ser reemplazados por una fracción de enlazamiento alternativa seleccionada de -CH_{2}NH-, -CH_{2}S-, -CH_{2}CH_{2}-, -CH=CH- (cis o trans), -COCH_{2}-, -CH(OH)CH_{2}- O -CH_{2}SO-;

con la condición de que si n3 es 0; o:

1): la suma de n2 y n4 debe ser al menos 2; o

2): K* debe ser diferente de Har (homoarginina) o K (lisina); o

3): Uno o más de los enlazamientos de péptidos es reemplazado por dicha fracción alternativa de enlazamiento.

Además, la invención se relaciona con un polipéptido inhibidor de agregación plaquetaria que se selecciona de

PAI 1: E-C-A-D-G-L-C-C-D-Q-C-R-F-L-K-K-G-T-V-C-R-V-A-K-G-D-W-N-D-D-T-C-T-G-0-S-C-D-C-P-R-N-G-L-YG

PAI 2: E-E-P-CA-T-G-P-C-C-R-R-C-K-F-K-R-A-G-K-V-C-R-V-A-K-G-D-W-N-N-D-Y-C-T-G-K-S-C-D-C-P-R-NP-W-N-G

PAI 3: G-C-G-K-G-D-W-P-C-A-NH_{2};

PAI 4: G-C-K-G-D-W-P-C-A-NH_{2}

PAI 5: C-G-K-G-D-W-P-C-NH_{2}

PAI 7: C-K-G-D-W-C-A-NH_{2};

PAI 10: C-K-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 12: C-K-G-D-Y-P-C- NH_{2}

PAI 13: C-K-G-D-F-P-C- NH_{2}

PAI 14: C-K-G-D-L-P-C- NH_{2}

PAI 15: C-K-G-D-V P-C- NH_{2}

PAI 16: C-K-G-D-Y(OMe)-P-C- NH_{2}

PAI 17: CK-G-D-(2-Nal)-P-C- NH_{2}

PAI 18: C-K-G-D-(Cha)-P-C- NH_{2}

PAI 19: Mpr-K-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 20: Mpr-K-G-D-Y P-C- NH_{2}

PAI 21: Mpr-K-G-D-F-P-C- NH_{2}

PAI 22: Mpr-K-G-D-L-P-C- NH_{2}

PAI 23: Mpr-K-G-D-V-P-C- NH_{2}

PAI 24: Mpr-K-G-D-Y(OMe)-P-C- NH_{2}

PAI 25: Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-C- NH_{2}

PAI 26: Mpr-K-G-D-(Cha)-P-C- NH_{2}

PAI 27: ciclo(G-K-G-D-W-P)

PAI 28: ciclo(A-K-G-D-W-P)

PAI 29: ciclo(D-Ala-K-G-D-W-P)

PAI 30: ciclo(F-K-G-D-W-P)

PAI 31: ciclo(beta-Ala-K-G-D-W-P)

PAI 32: ciclo(gama-Abu-K-G-D-W-P)

PAI 33: ciclo(R-K-G-D-W-P)

PAI 34: C-K-G-D-W-G-C- NH_{2}

PAI 39: C-K-G-D-W-(Sar)-C- NH_{2}

PAI 41: C-K-G-D-I-P-C-NH2

PAI 42: C-K-G-D-(4-CI-Phe)-P- NH_{2}

PAI 43: C-K-(Sar)-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 44: G-K-G-D-(4-NO2-Phe)-P-C- NH_{2}

PAI 47: Acetyl-C-K-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 48: Mpr-K-G-D-W(Formil)-P-C- NH_{2}

PAI 49: Mvl-K-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 51: Mpr-K-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

PAI 52: Mpr-K-G-D-W P-Pen\dagger- NH_{2}

PAI 54: Mpr-K-G-D\dagger-W-P-Pen- NH_{2}

PAI 55: Mpr-K-G-D-W-(Thz)-C- NH_{2}

PAI 57: Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-Pen- NH_{2}

PAI 58: MvI-K-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

PAI 59: Mpr-K-G-D-W-(Pip)-Pen- NH_{2}

PAI 60: Mpr-(Har)-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 61: Mpr-K-G-D-W-P-C\dagger- NH_{2}

PAI 62: Mpr-K\dagger-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

PAI 63: Wpr-(Har)-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

PAI 64: Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 65: Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

PAI 66: Mpr-(NG,NG'-etilén-Har)-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 67: Mpr-(NG,NG'-etilén-Har)-G-C-W-P-Pen- NH_{2}

PAI 68: Mpr-Har-Sar-D-W-P-C NH_{2}

PAI 69: Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-P-Pen-NH2

PAI 70: Mpr-(Fenilimidil-Lys)-G-D-W-P-C-NH2

PAI 71: Mpr-Har-Sar-D-W-P-PenNH2

PAI 72: Mpr-(Fenilimidil-Lys)-G-D-W-P-PenNH2

PAI 73: Mpr-Har-G-D-W-(3.4.dehydro-Pro)-C-NH2

PAI 75: Mpr-(Fenilimidil -Lys)-G-D-Pen-NH2

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la inhibición del enlazamiento del fibrinógeno al GP IIb-IIIa por medio de los venenos de serpiente parcialmente purificados.

Las Figuras 2A, 2B y 2C muestran la inhibición de la adhesión como respuesta a la dosis de los ultrafiltrados de Centricon-10 de venenos crudos tanto en los ensayos del receptor fibrinógeno/GP IIb-IIIa como de vitronectina/vitronectina. Se muestra la selectividad de los péptidos del veneno de serpiente en los ensayos de enlazamiento del receptor GP IIb-IIIa y de vitronectina. El veneno de Sistrurus m. barbouri es usado en la Figura 2A. El veneno de Crotalus ruber es usado es usado en la Figura 2B. El veneno de Crotalus basilicus es usado en la Figura 2C.

La Figura 3 muestra el perfil de HPLC del PAI crudo del veneno de Eristicofis macmahoni. El entramado del área contiene las fracciones biológicamente activas.

La Figura 4 muestra el perfil de HPLC de gradiente lento de las fracciones PAI de la Figura 3. El entramado del área contiene a las fracciones bioactivas.

La Figura 5 muestra el perfil de HPLC analítico de las fracciones PAI de la Figura 4 para demostrar al PAI purificado a partir del veneno de Eristicofis macmahoni.

La Figura 6 muestra las secuencias completas de aminoácidos de eristicofina, barbourina, tergeminina, cerastina, ruberina, fachesina, cotiarina, crotatroxina, horridina, lutosina, viridina, molossina, basilicina, durissina, jaracina, cereberina, y oreganina, y fragmentos de digestión de la enzima determinados por degradación automatizada de Edman.

La Figura 7 describe el perfil de HPLC de PAI obtenido a partir de las fracciones G-50 del veneno crudo de Sisturus. C. tergeminus. El entramado del área contiene las fracciones bioactivas.

La Figura 8 describe el perfil de HPLC de las fracciones pAI de la Figura 7 para mostrar el PAI purificado del veneno de Sistrurus calenatus tergeminus.

La Figura 9 muestra la actividad de la targeminina PAI purificada de la Figura 8 en la inhibición de enlazamiento en diferentes ensayos de receptor.

La Figura 10 describe el perfil de HPLC del inhibidor de agregación plaquetaria obtenido a partir de fracciones G-50 del veneno crudo de Sistrurus m. barbouri. Las áreas entramadas contienen las fracciones bioactivas.

La Figura 11 describe el perfil de HPLC de las fracciones activas PAI de la Figura 10 para mostrar el PAI purificado del veneno de Sistrurus milarus barbouri.

La Figura 12 compara las secuencias de aminoácidos de una cantidad de los PAI de venenos de serpiente con aquel de la barbourina.

La Figura 13 describe el perfil de HPLC de PAI crudo del veneno de Lachesis mutas. Las áreas entramadas contienen las fracciones biológicamente activas.

La Figura 14 describe el perfil de HPLC de gradiente lento de las fracciones activas PAI de la Figura 13. Las áreas entramadas contienen las fracciones biológicamente activas.

La Figura 15 describe el perfil de HPLC analítico de las fracciones PAI de la Figura 14 de Lachesis mutas para mostrar PAI purificado del veneno de Lachesis mutas.

La Figura 16 describe el perfil de HPLC de PAI crudo de veneno de Crotalus viridis viridis. Las áreas entramadas contienen las fracciones biológicamente activas.

La Figura 17 describe el perfil de HPLC de las fracciones PAI de la Figura 16 para mostrar PAI purificado del veneno de Crotalus viridis viridis.

La Figura 18 muestra los efectos de repuesta a la dosis de péptidos de veneno de serpiente purificado para inhibir el enlazamiento de fibrinógeno/GP IIb-IIIa, comparado con la echistatina.

Las Figuras 19A, 19B y 19C muestran los efectos de respuesta a la dosis de péptidos de veneno de serpiente purificado para inhibir al ADP (4 \muM) inducido de agregación plaquetaria humana en plasma rico en plaquetas (PRP), comparado con la echistatina. La Figura 19A muestra el efecto de barbourina PAI de Sistrorus m. barbouri. La Figura 19B muestra el efecto de eristocopina PAI de Eristicophus macmahoni.

La Figura 19C muestra el efecto de echistatina PAI de Echis carnitus.

La Figura 20 muestra el perfil de actividad del fraccionamiento por HPLC del veneno de C. c. cerastes. El área entramada contiene las fracciones biológicamente activas.

La Figura 21 muestra los resultados de análisis de HPLC de las fracciones activas de la Figura 20 para mostrar PAI purificado de veneno de Crotalus c. cerastes.

La Figura 22 muestra el perfil de actividad del fraccionamiento por HPLC de PAI de C. ruber ruber. El área entramada contiene las fracciones biológicamente activas.

La Figura 23 muestra el perfil de actividad de una columna analítica C-18 sobre el péptido homogéneo obtenido de C. atrox.

La Figura 24 muestra el perfil por HPLC analítico del péptido homogéneo aislado de Bothrops cotiara.

La Figura 25 muestra los efectos de respuesta a la dosis de cotiarina purificada sobre la inhibición del enlazamiento de fibrinógeno al GP IIb-IIIa y la inhibición del enlazamiento de vitronectina al receptor de vitronectina.

La Figura 26 muestra los efectos de los péptidos purificados del veneno de serpiente sobre el enlazamiento de fibrinógeno al GP IIb-IIIa y de vitronectina al receptor de vitronectina. Los valores indican la concentración de péptido purificado que inhibe el enlazamiento de fibrinógeno al GP IIb-IIIa o de la vitronectina al receptor de vitronectina en un 50% (IC_{50}). El símbolo ">" indica que el IC_{50} es mayor que este valor, que es la concentración más alta examinada hasta la fecha. Nótese que la sustitución de la arginina en la secuencia "RGDW" en eristicofina con una lisina (KGDW) imparte especificidad para inhibición del enlazamiento de fibrinógeno el GP IIb-IIIa versus la vitronectina al receptor de vitronectina.

La Figura 27 muestra los resultados de la actividad de enlazamiento por el análogo #1, [E^{28}L^{41}C^{64}]barbourina (28-73), con relación al receptor GP IIb-IIIa y al receptor de vitronectina.

La Figura 28 muestra la capacidad del análogo sintético de eristicofina [K^{29}]- eristicofina (4-51) para inhibir el enlazamiento de fibrinógeno el GP IIb-IIIa y la inhabilidad para inhibir el enlazamiento de vitronectina al receptor de vitronectina.

Las Figuras 29A y 29B muestran la capacidad de los compuestos lineales y cíclicos RGDW y los compuestos lineales y cíclicos KGDW para inhibir el enlazamiento de fibrinógeno al GP IIb-IIIa.

Las Figuras 30A, 30B, 30C, 30D y 30E muestran la capacidad de diferentes análogos KGDW para inhibir el enlazamiento de fibrinógeno al GP IIb-IIIa e inhibir el enlazamiento de vitronectina al receptor de vitronectina. La Figura 30A representa al Análogo #7. la Figura 30B representa al Análogo #8. Figura 30C al Análogo #4. La Figura 30D representa al Análogo #5. la Figura 30E representa al Análogo #6.

La Figura 31 muestra la capacidad de diferentes inhibidores sintéticos de agregación plaquetaria para inhibir la unión de células melanoma M21a la vitronectina.

La Figura 32 muestra la capacidad de RGDS y de un compuesto RGD cíclico para inhibir la unión de células de melanoma M21 a la vitronectina y la carencia de capacidad de un análogo KGDW cíclico para inhibir la unión de células de melanoma M21 a la vitronectina.

La Figura 33 muestra la actividad del número análogo 60, Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH_{2}, en la inhibición de la agregación de plaquetas y la adhesión celular a la vitronectina.

La Figura 34 muestra las actividades de la Figura 33 por el análogo 19, Mpr-K-G-D-P-C-NH_{2}.

La Figura 35 muestra la iniciación de reducciones cíclicas de flujo (CFR) en un modelo de trombosis de pecho abierto de perro (Modelo de Folts).

La Figura 36 muestra los efectos de la administración de una dosis de píldora de 10 mg sobre los CFR, iniciados en el modelo de trombosis de pecho abierto de perro (Modelo de Folts).

La Figura 37 muestra los efectos de la administración de una dosis de píldora de 40 mg sobre los CFR, iniciados en el modelo de trombosis de pecho abierto de perro (Modelo de Folts).

La Figura 38 muestra la secuencia de ADN de longitud completa que codifica la secuencia de aminoácidos de la barbourina (1-73).

La Figura 39 muestra la secuencia de ADN que codifica la [M^{1}, M^{41}]barbourina(1-73) ligada a una secuencia líder PhoA.

La Figura 40 muestra la secuencia de ADN que codifica al análogo #1 [E^{28}, L^{41}, C^{64}]barbourina(23-78) enlazada a una secuencia líder PhoA para la expresión en una bacteria.

Las Figuras 41 A y 41 B muestran a los oligonucleótidos utilizados en una reacción PCR para obtener ADN que codifica al análogo #1. Los aminoácidos incluidos en el análogo per se, se muestran en negrilla.

La Figura 42 muestra la secuencia de unión de repeticiones en tándem del ADN que codifica al análogo #1.

Las Figuras 43A y 43B muestran un diagrama del gen truncado de barbourina como repeticiones en tándem.

Formas de llevar a cabo la invención

La invención provee inhibidores de agregación plaquetaria (compuestos PAI) que pueden sintetizarse usando técnicas estándar in vitro, tales como la síntesis de péptidos en fase sólida, o la utilización de métodos recombinantes, o combinaciones de éstos. Algunos de estos inhibidores son únicamente específicos para inhibición de agregación plaquetaria y no inhiben el enlazamiento alterno dentro de la familia de las integrinas. Otros tienen diferentes rangos de especificidad. Las secciones más abajo describen el aislamiento de los compuestos PAI de ocurrencia natural del veneno de serpiente; el diseño de los inhibidores que son de una potencia sustancialmente alta en la inhibición de la agregación plaquetaria que en la inhibición, por ejemplo, de la interacción del receptor vitronectina/vitronectina por medio de la incorporación de una secuencia K*GD de preferencia al RGD; métodos de sintetizar estos péptidos; métodos de producción recombinante; antibióticos surgidos contra los péptidos de la invención; el método de ensayo que permite la identificación de los venenos de serpiente que contienen PAI; y la utilidad de los compuestos PAI de la invención como compuestos farmacéuticos.

Por PAI se entiende un factor que es capaz de prevenir la agregación de plaquetas estimuladas en ensayos estándar, por ejemplo aquellos descritos por Gan, Z-R., y colaboradores, y Huang, T.-F., y colaboradores, (supra). En estos ensayos, las plaquetas lavadas se combinaron con fibrinógeno, Ca^{+2} y el material que va a ser ensayado. Las plaquetas se estimularon con ADP (o de otros estimuladores conocidos o combinaciones de los mismos) y la agregación (o carencia de la misma) se observó usando, por ejemplo, un agregómetro disponible comercialmente.

Algunos de los PAI de la invención se identifican como específicos para la inhibición de enlazamiento de fibrinógeno y/o vWF al GP IIb-IIIa. Se entiende que la especificidad es materia de grado; por lo tanto, un compuesto PAI específico para la inhibición de enlazamiento de Fg o vWF al GP IIb-IIIa, inhibe este enlazamiento sustancialmente más de lo que inhibe el enlazamiento de Fn a FnR, o de Vn a VnR. Por "más sustancialmente" se entiende que o el % de inhibición es al menos dos veces mayor a una concentración dada de PAI o que la concentración de PAI que causa 50% de inhibición es al menos dos veces menor para la inhibición de enlazamiento de Fg o de vWF/GP IIb-IIIa que para el enlazamiento del ligando/receptor.

PAI Nativo Aislado y Métodos de Purificación

Los inhibidores de agregación plaquetaria reivindicados (PAI) incluyen péptidos de bajo peso molecular que pueden prepararse en forma aislada, como se describe más adelante, a partir de veneno de serpiente que ha sido identificado como "activo", esto es, se ha encontrado que contiene PAI, utilizando el método que se describe aquí más adelante.

Este método permite una identificación y caracterización fácil de la presencia de un PAI efectivo en veneno de serpiente (mientras que tales PAI son cubiertos por las reivindicaciones) que inhiben selectivamente el enlazamiento a GP IIb-IIIa en forma opuesta a otras integrinas como, por ejemplo, el receptor de vitronectina y el receptor de fibronectina. A partir de tal identificación, y, de la caracterización opcional y óptima, los PAI pueden aislarse y purificarse utilizando una variedad de técnicas estándar ilustradas aquí y reveladas en le estado del arte. Por ejemplo, puede utilizarse una combinación de separación con base en el peso molecular (típicamente recuperación de sustancias <10kd), cromatografía de intercambio iónico, y HPLC en fase reversa. Pueden emplearse también otras técnicas, pero un procedimiento factible, aplicable a los PAI de cualquier veneno activo de serpiente es el siguiente:

Se disuelven alrededor de 10-1000 mg de veneno en ácido acético diluido y se lo aplica a una columna de repartición por tamaño, tal como una Sephadex G-50, y se eluye en el mismo solvente. Las fracciones se ensayan por su actividad utilizando la prueba de enlazamiento de Fg/GP IIb-IIIa de la invención, un ensayo de agregación plaquetaria estándar (PAA) o cualquier ensayo similar confiable sobre la actividad de enlazamiento de la proteína adhesiva de GP IIb-IIIa. Alternativamente, fracción <10kd de la fracción del veneno, puede ser recuperada utilizando ultrafiltración y analizada asimismo.

La fracción de bajo peso molecular aislada por cualquiera de los dos procedimientos es introducida luego en una columna preparativa de HPLC C-18, tal como una columna de HPLC de fase reversa Delta Pak C-18, disponible con Waters, preequilibrada en ácido trifluoroacético al 0,1% (TFA)/acetonitrilo al 8%. El PAI absorbido es luego eluido usando un gradiente de acetonitrilo de 8%-60% en TFA al 0,1%. La pendiente del gradiente y la velocidad de flujo se optimizan usando procedimientos de rutina. Las fracciones activas se determinan por PAA o por medio del método de enlazamiento del receptor de la invención. Las fracciones activas se recolectan entonces, se concentran y se ensayan por homogeneidad usando HPLC analítico o SDS-PAGE. Se aplica más purificación por gradiente en HPLC fase reversa hasta que el PAI sea homogéneo.

Los PAI purificados pueden secuenciarse utilizando procedimientos estándar, permitiendo así la síntesis usando técnicas estándar en fase sólida (en particular para las formas cortas de los PAI) o producción recombinante. Por ejemplo, puede utilizare un Applied Biosystems Sequenator, seguido por carboxamido metilación o piridiletilación del péptido como lo describen Huang y colaboradores, J. Biol. Chem. (1987) 262: 16157-16163, seguido por desalinización de la muestra sobre una columna Delta Pak C-18, usando TFA al 0, 1% y acetonitrilo.

Se entiende que el PAI aislado de una secuencia determinada puede, cuando se la sintetiza in vitro, ser modificado por medio de alteraciones en la secuencia que no destruyen su actividad. En general, estas formas modificadas diferirán de las formas nativas por 1-10, preferiblemente 1-4, sustituciones de aminoácidos, o serán formas truncadas. Además, uno o más enlaces de péptidos pueden ser remplazados por fracciones alternativas de enlazamiento como se describe aquí más adelante. Una sustitución particularmente preferida es el reemplazo de RGD por K*GD para conferir especificidad al GP IIb-IIIa como se describe más adelante.

El PAI de Sistrurus m. barbouri ha sido purificado hasta homogeneidad y secuenciado, y llamado "barbourina". A diferencia de las proteínas adhesivas para GP IIb-IIIa hasta ahora identificadas, y de los péptidos de venenos de serpiente que bloquean la función del GP IIb-IIIa, la barbourina no contiene la secuencia estándar Arg-Gly-Asp de las proteínas adhesivas conocidas en el arte. La secuencia aparente de enlazamiento en la barbourina es Lys-Gly-Asp-(Trp). La presencia de la secuencia KGD en la región de enlazamiento aparente de este péptido es especialmente sorprendente en vista de la observación de que el reemplazo de Lys por Arg en los péptidos sintéticos pequeños con base en la secuencia RGDX, disminuye grandemente la capacidad de estos péptidos para enlazar a los receptores de integrina (Pierschbacher y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. (Estados Unidos) (1984) 81: 5985-5988; Williams y colaboradores, Thromb. Res. (1987) 46: 457-471); Huang y colaboradores, J. Biol. Chem. (1987) 262: 16157-16163. Se piensa que esta sustitución puede en parte ser la responsable de la especificidad del péptido barbourina para inhibir el enlazamiento de Fg y vWF al GP IIb-IIIa, versus, por ejemplo, la inhibición del enlazamiento de vitronectina al receptor de vitronectina.

Péptidos que Contienen K*GDX

El péptido "barbourina" ha mostrado tener la secuencia de enlazamiento KGDX, en contraste con el RGDX encontrado en los compuestos PAI del arte previo. La presencia de la KGDX en esta secuencia PAI, parece estar asociada con una afinidad preferencial por el GP IIb-IIIa en forma opuesta a los receptores de vitronectina o fibronectina. El efecto de la sustitución de un residuo de lisil por un residuo de arginina en la secuencia parece estar asociado con un incremento de la longitud de la cadena lateral junto con la basicidad retenida del nitrógeno como se describe aquí más adelante. Sorprendentemente, parece que no es el residuo de lisil por sí mismo el que cuenta para la actividad mejorada y la especificidad, si no el espaciamiento proveído por esta extensión homóloga del residuo de arginina reemplazado. Por lo tanto, los péptidos de la presente invención que contienen K*GDX en la secuencia de enlazamiento, son sustancialmente más potentes para inhibir en el enlazamiento de Fg o vWF al GP IIb-IIIa en comparación con su capacidad para inhibir el enlazamiento de la vitronectina al receptor de vitronectina, y el enlazamiento de fibronectina al receptor de fibronectina. Como se estableció antes, por "sustancialmente más" potente para inhibir el enlazamiento preferido, quiere decir que el porcentaje de inhibición es al menos dos veces mayor a una concentración dada de inhibidor, o que la concentración de PAI que causa el 50% de la inhibición es al menos dos veces menor para el enlazamiento de Fg o vWF al GP IIb-IIIa, que para el enlazamiento de ligandos alternativos a otras integrinas.

Como se lo usa aquí, K* se refiere a un residuo de lisil que no está sustituido, o que contiene sustituciones para los hidrógenos sobre el grupo epsilon amino. Los sustituyentes deben ser suficientemente electro donadores para mantener la basicidad del átomo de nitrógeno al cual ellos se unen. Por lo tanto, K* se define como un residuo de lisil de fórmula general (R^{1})_{2} N(CH_{2})_{4}-CH(NH-)CO-

en donde cada R^{1} es independientemente H, alquilo (1-6) o al menos un R^{1} es R^{2}-C=NR^{3},

en donde R^{2} es H, alquilo (1-6C), o es un residuo fenilo o bencilo sustituido o no sustituido, o es NR^{4}_{2} en el cual cada R^{4} es independientemente H o alquilo (1-6C), y

R^{3} es H, alquilo (1-6C), fenilo o bencilo, o

R^{2}-C=NR^{3} es un grupo seleccionado de

5

en donde m es un número entero de 2-3, y cada R^{5} es independientemente H o alquilo (1-6C);

y en donde uno o dos (CH_{2}) pueden ser reemplazados por O o S en tanto que dichos O o S no estén adyacentes a otro heteroátomo.

"Alquilo" se define convencionalmente como una cadena recta o ramificada o como un residuo de hidrocarburo cíclico del número indicado de átomos de carbono tal como metilo, etilo, isopropilo, N-hexilo, 2-metilbutilo, ciclohexilo y similares.

Los residuos bencilo y fenilo representador por R^{2} pueden ser no sustituidos, o pueden estar sustituidos por sustituyentes que no interfieren. Los patrones de sustitución preferidos son aquellos en donde solamente un sustituyente está enlazado al núcleo aromático, preferiblemente en la posición 4. Los sustituyentes preferidos son aquellos que donan electrones, tales como alquilo, especialmente etilo o metilo, o fenilo.

Las modalidades preferidas de K* incluyen a los residuos de lisina, homoarginina, formilhomoarginina, ornitina, acetimidil lisina, N^{G}N^{G} etilen-homoarginina, y fenilimidil lisina. El residuo fenilimidil lisina, por ejemplo, tiene la fórmula:

Fenil-C(=NH)-NH(CH_{2})_{4}CH(NH-)CO-.

Como el rasgo esencial de la inhibición de enlazamiento parece residir en la sustitución de K* para R de RGDX, una clase de péptidos o de compuestos relacionados con péptidos de la presente invención comprende la ocurrencia natural de los inhibidores de agregación plaquetaria que ordinariamente contienen RGDX en la secuencia de enlazamiento por lo cual estas formas se modifican por la sustitución de K* por R en esta secuencia. Incluidos dentro de la invención se encuentran los péptidos nativos que tienen esta sustitución, así como sus fragmentos de longitud suficiente para ser efectivos en la inhibición selectiva del enlazamiento de las proteínas adhesivas al GP IIb-IIIa y a los fragmentos o a los péptidos de longitud completa que tienen sustituciones irrelevantes en posiciones del péptido que no destruyen esta actividad. Para la mayor parte, los fragmentos contendrán residuos correspondientes a la longitud de una cadena peptídica de al menos 7 aminoácidos si la conformación está controlada por, por ejemplo, ciclización, y son de mayor longitud si no existe tal control conformacional. En general, a parte de la secuencia requerida de K*GDX, pueden haber 1-10, preferiblemente 1-4, y más preferiblemente 1-3 sustituciones de aminoácidos en la porción no K*GDX de los péptidos. Los PAI descritos en este párrafo se incluyen solamente en la invención mientras que tales PAI estén cubiertos por las reivindicaciones.

Adicionalmente el G de RGDX o de K*GDX, puede ser reemplazado por un residuo de sarcosina.

Además uno o más de los enlaces peptídicos, puede ser opcionalmente reemplazado por fracciones alternativas de enlazamiento tales como aquellas obtenidas por reducción o eliminación. Por lo tanto, uno o más de los enlazamientos peptídicos -CONH- puede ser reemplazado con otros tipos de fracciones tales como -CH_{2}NH-, -CH_{2}S-, -CH_{2}CH_{2}-, -CH=CH- (cis y trans), -COCH_{2}-, -CH(OH)CH2- y -CH_{2}SO-, por métodos conocidos en el estado del arte. Las siguientes referencias describen la preparación de análogos de péptido que incluyen esas fracciones alternativas de enlazamiento: Spatola, A. F., Vega Data (Marzo 1983), Vol. 1. Publicación 3, "Peptide Backbone Modifications" (revisión general); Spatola, A. F. en "Chemistry and Biochemistry of Amino Acids. Peptides and Proteins," B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, pág. 267 (1983) (revisión general); Morley, J. S., Trends Pharm Sci. (1980) págs. 463-468 (revisión general); Hudson, D. y colaboradores, Int. J. Pept. Prot. Res. (1979) 14:177-185 (-CH_{2}NH-, CH_{2}CH_{2}-); Spatola, A. F. y colaboradores, Life Sci. (1986) 38:1243-1249 (-CH_{2}-S); Hann, M. M., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I (1982) 307-314 (-CH-CH-, cis y trans); Almquist, R.G., y colaboradores, J.Med.Chem.(1980) 23:1392-1398 (-COCH_{2}-); Jennings-White, C. y colaboradores, Tetrahedron Lett. (1982) 23:2533 (-COCH_{2}-); Szelke, M., y colaboradores, EP-A-45665 CA 97:39405 (1982) (-CH(OH)CH_{2}-); Holladay, M. W. y colaboradores. Tetrahedron Lett.(1983) 24:4401-4404 (-C(OH)CH_{2}-); y Hruby, V. J. Life Sci. (1982) 31:189-199 (-CH_{2}-S-). Se prefiere particularmente -CH_{2}NH-.

Ejemplos de fragmentos y/o de formas modificadas del veneno de serpiente de ocurrencia natural incluyen PAI [E^{28},L^{41},C^{64}]barbourina(28-73) de la secuencia

6

y [K^{29}] eristicofina (4-51) de la secuencia

7

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En esta numeración escrita, el tamaño del fragmento se anota entre paréntesis después del nombre por medio de los números de los aminoácidos que están incluidos en el fragmento, y las letras y los números del prefijo entre paréntesis indican las sustituciones de aminoácidos en las posiciones numeradas en el péptido nativo de longitud completa. Por lo tanto para el fragmento anterior de barbourina, la longitud del fragmento de los tramos de los residuos 28-73, inclusive de la secuencia nativa y de los aminoácidos originalmente en las posiciones 28, 41 y 64 de la secuencia nativa numerada, han sido reemplazados por Glu (E), Leu (L), y Cys (C), respectivamente.

Como ejemplos adicionales, la arginina de la secuencia RGD que aparece en la trigramina, elegantina, albolabrina, crotatroxina, flavoviridina, echistatina, bitistatina, viridina, molossina, lutosina, basilicina, applagina, halisina, horridina, tergeminina, lachesina, cotiarina, cereberina, jararacina, kistrina, eristicofina, bitan-a, y ruberina/oreganina, pueden ser reemplazados por un residuo K* para proveer PAI específicamente activos con una afinidad preferencial por GP IIb-IIIa. Además, las formas acortadas de estos péptidos, contienen al menos 20, preferiblemente al menos 30, y más preferiblemente al menos 40, aminoácidos, pueden prepararse a partir del péptido nativo o en esta forma modificada. Además, o en la forma alternativa, 1-10, preferiblemente 1-4, los aminoácidos irrelevantes para la secuencia RGD/K*GD pueden ser sustituidos o modificados, preferiblemente con sustituciones moderadas de aminoácidos. Por sustituciones moderadas de aminoácidos se entiende, por ejemplo una sustitución de un residuo aminoácido ácido por un residuo aminoácido ácido, neutro por neutro, básico por básico, etc., como se describe aquí más adelante. Los PAI y los fragmentos de los mismos descritos en este párrafo se incluyen solamente en la invención mientras que tales PAI o fragmentos estén cubiertos por las reivindicaciones.

Aún otro grupo adicional de ejemplos incluye aquellos en donde el residuo de glicilo de RGD o K*GD puede ser reemplazado por un residuo de sarcosilo con retención de la actividad. Por lo tanto, los PAI activos que se aíslan y/o se modifican en otras formas como se describió antes pueden además ser modificados por medio de esta sustitución de los PAI y los fragmentos de los mismos descritos en este párrafo, se incluyen solamente en la invención mientras que tales PAI o fragmentos estén cubiertos por las reivindicaciones.

Mientras que los fragmentos y/o los PAI modificados del veneno de serpiente, en la medida en que estén cubiertos por las reivindicaciones son compuestos específicos de enlazamiento Fg/vWF/GP IIb-IIIa de la invención por reemplazo de RGD por K*GD, en modalidades adicionales de la invención de péptidos específicamente activos se basan en extensiones compatibles de la secuencia K*GD mientras que estén cubiertos por las reivindicaciones. En este sentido, los compuestos relacionados con los péptidos de la invención son péptidos cíclicos de fórmula general:

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8

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en donde K* es un grupo lisilo sustituido o no sustituido como se define en la reivindicación 10;

AA_{1} es un aminoácido pequeño, neutro, (polar o no polar) y n1 es cero o un entero de 1-3;

AA_{2} es un aminoácido neutro, no polar grande (aromático o no aromático) o aromático polar y n2 es cero o un entero de 1-3; el residuo o la prolina modificada se lee como se define en la reivindicación 10 y n3 es cero o 1;

AA_{3} es un residuo de prolina o un residuo de prolina modificado como se define en la reivindicación 10 y n3 es cero o 1;

AA_{4} es un aminoácido neutro, pequeño o la forma N-alquilada del mismo, y n4 es cero o un entero de 1-3;

en donde uno o más enlazamientos de péptidos pueden opcionalmente ser reemplazados por una fracción de enlazamiento alternativa seleccionada de -CH_{2}NH-, -CH_{2}S-, -CH_{2}CH_{2}-, -CH=CH- (cis o trans), -COCH_{2}-, -CH(OH)CH_{2}- O -CH_{2}SO-;

con la condición de que si n3 es 0; o:

1): la suma de n2 y n4 debe ser al menos 2; o

2): K* debe ser diferente de Har o K;o

Y_{1} y Y_{2} pueden ser extensiones de péptidos de residuos de 0-25 aminoácidos y pueden estar en forma derivada. La extensión N-terminal Y_{1} puede, por ejemplo ser acetilada o de lo contrario acilada; la extensión C-terminal Y_{2} puede estar amidada con NH_{2} o con una amina primaria o secundaria de fórmula R-NH_{2} o R_{2}NH en donde cada R es independientemente un alquilo menor de 1-4C tal como metilo, n-butilo, o t-butilo. Y_{1} puede ser también (H) o acilo; Y_{2} puede ser (OH), NH_{2} o una amina como más arriba. En donde el compuesto de fórmula (1) es un péptido cíclico simple, Y_{1} y Y_{2} están ausentes.

X_{1} y X_{2} son típicamente residuos aminoácidos capaces de cristalización tales como, por ejemplo y más preferiblemente residuos de cisteína capaces de formar un anillo disulfuro. Sin embargo, pueden ser usados otros residuos capaces de formar enlaces disulfuro o de otro tipo, por ejemplo, el residuo Pen (penicilamina) descrito por Pierschbadier y colaboradores (supra) o el residuo Mpr (mercapto propionilo) o el residuo Mvl (mercapto valerilo). Otros tipos previstos de enlaces covalentes para ciclización incluyen los enlaces de péptidos, como por ejemplo, una amida formada entre el grupo amino de la cadena lateral de un residuo lisilo con un grupo carboxilo de cadena lateral de un residuo glutamilo y enlaces éster, como se formarían entre el alcohol de cadena lateral de un residuo de treonina con un carboxilo de cadena lateral de un residuo de aspartilo. Puede usarse cualquier residuo compatible capaz de formar enlaces peptídicos con el resto de la cadena (o enlaces peptídicos modificados como se describió entes) y capaces de la formación de un enlace covalente para efectuar la ciclización. Esto incluye, por ejemplo, péptidos cíclicos simples, en donde un enlace peptídico se forma directamente entre el NH_{2} en el N-terminal y el COOH en el
C-terminal.

Como se describió antes, uno o más de los enlaces peptídicos indicados puede ser reemplazado por un enlazamiento sustituto tal como -CH_{2}NH-, -CH_{2}S-, -CH_{2}CH_{2}-, CH=CH- (cis y trans), -COCH_{2}-, -CH(OH)CH_{2}- y -CH_{2}SO-.

En la designación de los residuos aminoácidos anteriores AA_{1}-AA_{4}, la descripción se ha hecho con base en el método de clasificación, en donde los residuos de aminoácidos pueden ser subclasificados generalmente en cuatro subclases principales. Esta clasificación es mostrada también diagramáticamente más adelante.

Ácido: El residuo tiene una carga negativa debido a la perdida del ión H a pH fisiológico, y el residuo es atraído por una solución acuosa para buscar las posiciones en la superficie en la conformación de un péptido en el cual está contenido cuando el péptido está en medio acuoso a pH fisiológico.

Básico: El residuo tiene una carga positiva debido a la asociación con el ión H a pH fisiológico, y el residuo es atraído por una solución acuosa para buscar las posiciones en la superficie en la conformación de un péptido en el cual está contenido cuando el péptido está en medio acuoso a pH fisiológico.

Neutro/no polar: Los residuos no están cargados a pH fisiológico, y el residuo es repelido por la solución acuosa para buscar las posiciones interiores en la conformación de un péptido en el cual esta contenido, cuando el péptido está en medio acuoso. Estos residuos se designan también aquí como "hidrófobos".

Neutro/polar: Los residuos no están cargados a pH fisiológico, pero el residuo es atraído por la solución acuosa para buscar las posiciones exteriores en la conformación de un péptido en el cual esta contenido, cuando el péptido está en medio acuoso.

Se entiende, desde luego, que en una colección estadística de residuos individuales, algunas moléculas estarán cargadas, y otras no, y existirá una atracción por, o una repulsión desde un medio acuoso en un grado mayor o menor. Para adaptar la definición de "cargado", un porcentaje significativo (aproximadamente al menos el 25%) de las moléculas individuales están cargadas a pH fisiológico. El grado de atracción o de repulsión requerido para clasificar como polar o no polar es arbitrario, y, por lo tanto, los aminoácidos específicamente contemplados por la invención han sido específicamente clasificados de una u otra manera. La mayoría de los aminoácidos no nombrados específicamente pueden ser clasificados sobre la base de un comportamiento conocido.

Los residuos de aminoácidos pueden ser subclasificados además como cíclicos o no cíclicos, y como aromáticos o no aromáticos, clasificaciones en sí mismas explicatorias con respecto a los grupos sustituyentes en la cadena lateral de los residuos, y como pequeños o grandes. El residuo es considerado pequeño si contiene un total de 4 átomos de carbono o menos, incluido el carbono carboxílico. Los residuos pequeños son, desde luego no aromático siem-
pre.

Para los aminoácidos de las proteínas de ocurrencia natural la subclasificación de acuerdo con el esquema anterior es como sigue (ver también el diagrama más adelante).

Ácido: Ácido Aspártico y ácido Glutámico;

Básico / no cíclico: Arginina, Lisina;

Básico / cíclico: Histidina;

Neutro / polar / pequeño: Glicina, Serina y Cisteína;

Neutro / polar / grande / no aromático: Treonina, Asparagina, Glutamina;

Neutro / polar / grande / aromático: Tirosina;

Neutro / no polar / pequeño: Alanina;

Neutro / no polar / grande / no aromático: Isoleucina, Leucina, Metionina;

Neutro / no polar /grande / aromático: Fenilalanina; y Triptófano.

El aminoácido prolina, aunque técnicamente dentro del grupo neutro/no polar/grande/cíclico y no aromático, es un caso especial debido a sus efectos conocidos sobre la conformación secundaria de las cadenas peptídicas, y no está, por lo tanto, incluido en este grupo definido, sino que se clasifica separadamente. AA_{3} se designa como un residuo de prolina o un "residuo modificado de prolina". La prolina, como es conocida, es un heterociclo de cinco miembros de nitrógeno con un grupo carboxilo en la posición dos. Los residuos modificados de prolina son todos heterociclos que contienen cinco miembros de nitrógeno con grupos carboxilo en los residuos que incluyen residuos de ácido pipecólico (2-carboxipiperidina, abreviada Pip) y tiazolidina (Thz). Por lo tanto, los residuos de prolina o de prolina modificada son de fórmula general

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en donde uno o dos de los grupos metileno puede ser reemplazado por NR, S u O y donde cualquier nitrógeno repetido puede opcionalmente ser sustituido con un sustituyente que no interfiera, y R es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo.

Ciertos aminoácidos comúnmente encontrados, que no son codificados por el código genético, incluyen, por ejemplo, beta-alanina (beta-ala), u otros omega-aminoácidos, tales como el ácido 3-amino propiónico, el ácido 4-amino butírico y de más, ácido alfa-aminoisobutírico (Aib), sarcosina (Sar), ornitina (Orn), citrulina (Cit), homoarginina (Har), t-butilalanina (t-BuA), t-butilglicina (t-BuG), N-metilisoleucina (N-Melle), fenilglicina (Phg), y ciclohexilalanina (Cha), norleucina (Nle), ácido cistéico (Cya); ácido pipecólico (Pip), tiazolidina (Thz), 2-naftil alanina (2-Nal) y sulfóxido de metionina (MSO). Estos también caen convenientemente en categorías particulares.

Con base en la definición anterior,

Sar y beta-ala son neutros/no polares/pequeños;

t-BuA, t-BuG, N-Melle, Nle y Cha son neutros/no polares/grandes/no aromáticos;

Har y Orn son básicos/no cíclicos;

Cya es ácido;

Cit, Acetil Lys, y MSO son neutros/polares/grandes/no aromáticos;

2-Nal y Phg son neutros/no polares/grandes/aromáticos; y

Pip y Thz son residuos de prolina modificada.

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Los anteriores pueden mostrarse diagramáticamente como sigue:

Esquema de Clasificación de Aminoácidos

Ácidos: Glu (E), Asp (D); Cistéico (Cya)

10

Los diferentes omega-aminoácidos se clasifican de acuerdo al tamaño como neutros/no polares/pequeños (beta-ala, esto es, 3-aminopropiónico, 4-aminobutírico) o grandes (todos los otros).

Otras sustituciones de aminoácidos por aquellos genéticamente modificados puede ser también incluida en los compuestos peptídicos dentro del alcance de la invención, y pueden clasificarse dentro de este esquema general.

En las fórmulas que representan a las modalidades específicas seleccionadas de la presente invención, los grupos amino y carboxiterminales, aunque a menudo no se muestran específicamente, se entenderá que están en la forma que asumirían a valores de pH fisiológico, a menos que se especifique otra cosa. Por lo tanto el amino terminal y el carboxi terminal a pH fisiológico, están cargados y se entiende que están presentes aunque no necesariamente especificados y mostrados, ya sea en los ejemplos específicos o en las fórmulas genéricas. Por supuesto las sales de adición básica y ácida incluidas aquellas que se forma a valores de pH no fisiológico, también están incluidas en los compuestos de la invención a menos que se observe otra cosa, los residuos están en la forma L; en las fórmulas genéricas, los residuos especificados pueden ser ya sea L o D. Generalmente, los péptidos de la invención tienen 0,1, ó 2 residuos D incluidos, preferiblemente 0 ó 1, más preferiblemente 0. En los péptidos mostrados, cada residuo codificado se representa donde es apropiado por medio de la designación con una letra única, que corresponde al nombre trivial del aminoácido de acuerdo con el siguiente listado convencional:

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Aminoácido	Símbolo de una letra
Alanina	A
Arginina	R
Asparagina	N
Ácido Aspártico	D
Cisteína	C
Glutamina	Q
Ácido Glutámico	E
Glicina	G
Histidina	H
Isoleucina	I
Leucina	L
Lisina	K
Metionina	M
Fenilalanina	F
Prolina	P
Serina	S
Treonina	T
Triptófano	W
Tirosina	Y
Valina	V
Ácido Piroglutámico	Z

Los aminoácidos no codificados genéticamente se abrevian como se indicó antes.

En los péptidos específicos mostrados en la presente aplicación, la forma L de cualquier residuo aminoácido que tiene un isómero óptico, esta marcado, a menos que se indique expresamente lo contrario, por medio de una cruz sobrescrita (^{\dagger}). Mientras que los residuos de los péptidos de la invención están normalmente en la forma natural de un isómero óptico L, uno o dos, preferiblemente un aminoácido, puede ser reemplazado con la forma D del isómero óptico.

Los grupos funcionales libres, incluidos aquellos en los carboxi o amino-terminales, pueden ser modificados también por amidación, acilación u otra sustitución, la cual puede, por ejemplo, cambiar la solubilidad de los compuestos sin afectar su actividad.

En la formación de los péptidos amidados de la presente invención, los compuestos análogos pueden sintetizarse directamente, por ejemplo utilizando Boc-AA_{x}-pMBHA-Resina o Boc-AA_{x}-BHA-Resina, en donde AA_{x} es el aminoácido carboxi terminal seleccionado del péptido deseado como se describe más adelante con más detalle. Alternativamente, los péptidos de la presente invención pueden ser posteriormente química o enzimáticamente amidados posteriormente a la síntesis del péptido utilizando medios bien conocidos en el estado del arte, o preparados por medio de protocolos estándar para síntesis de péptidos en fase de solución.

Se prefieren ciertas modalidades de los péptidos de novo de la invención. En la secuencia K*(G/Sar)D, G/Sar es preferiblemente G. AA_{1} y AA_{4} son preferiblemente Gly, Ala o Ser; n1 es preferiblemente 0-2, n4 es preferiblemente 1-2. Los aminoácidos preferidos para AA_{2} son neutros/no polares/aromáticos, especialmente triptófano, fenilalanina, leucina, tirosina o valina, particularmente triptófano; n_{2} es preferiblemente 1. X_{1} y X_{2} son preferiblemente residuos de Cys, Mpr, o Pen (penicilamina). Y_{1} es preferiblemente H, acetilo, o Gly; Y_{2} es preferiblemente -NH_{2}- o -A-NH_{2}-. También se prefieren generalmente las formas amidadas C-terminales de Y_{2}.

Por lo tanto, los análogos PAI preferidos de la invención son péptidos de las fórmulas siguientes. Aunque todas ellas son capaces de provisión en forma cíclica a través de la formación de enlazamientos de disulfuro, estos enlazamientos no se muestran específicamente; Otras formas cíclicas se denotan como "ciclo".

Péptidos Preferidos

PAI 1: E-C-A-D-G-L-C-C-D-Q-C-R-F-L-K-K-G-T-V-C-R-V-A-K-G-D-W-N-D-D-T-C-T-G-0-S-C-D-C-P-R-N-G-LY-G

PAI 2: E-E-P-CA-T-G-P-C-C-R-R-C-K-F-K-R-A-G-K-V-C-R-V-A-K-G-D-W-N-N-D-Y-C-T-G-K-S-C-D-C-P-R-N-PW-N-G

PAI 3: G-C-G-K-G-D-W-P-C-A-NH_{2};

PAI 4: G-C-K-G-D-W-P-C-A- NH_{2}

PAI 5: C-G-K-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 7: C-K-G-D-W-C-A- NH_{2};

PAI 10: C-K-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 12: C-K-G-D-Y-P-C- NH_{2}

PAI 13: C-K-G-D-F-P-C- NH_{2}

PAI 14: C-K-G-D-L-P-C- NH_{2}

PAI 15: C-K-G-D-V P-C- NH_{2}

PAI 16: C-K-G-D-Y(OMe)-P-C- NH_{2}

PAI 17: CK-G-D-(2-Nal)-P-C- NH_{2}

PAI 18: C-K-G-D-(Cha)-P-C- NH_{2}

PAI 19: Mpr-K-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 20: Mpr-K-G-D-Y P-C- NH_{2}

PAI 21: Mpr-K-G-D-F-P-C- NH_{2}

PAI 22: Mpr-K-G-D-L-P-C- NH_{2}

PAI 23: Mpr-K-G-D-V-P-C- NH_{2}

PAI 24: Mpr-K-G-D-Y(OMe)-P-C- NH_{2}

PAI 25: Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-C- NH_{2}

PAI 26: Mpr-K-G-D-(Cha)-P-C- NH_{2}

PAI 27: ciclo(G-K-G-D-W-P)

PAI 28: ciclo(A-K-G-D-W-P)

PAI 29: ciclo(D-Ala-K-G-D-W-P)

PAI 30: ciclo(F-K-G-D-W-P)

PAI 31: ciclo(beta-Ala-K-G-D-W-P)

PAI 32: ciclo(gama-Abu-K-G-D-W-P)

PAI 33: ciclo(R-K-G-D-W-P)

PAI 34: C-K-G-D-W-G-C- NH_{2}

PAI 39: C-K-G-D-W-(Sar)-C- NH_{2}

PAI 41: C-K-G-D-I-P-C- NH_{2}

PAI 42: C-K-G-D-(4-CI-Fenil)-P- NH_{2}

PAI 43: C-K-(Sar)-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 44: G-K-G-D-(4-NO_{2}-Fenil)-P-C- NH_{2}

PAI 47: Acetil-C-K-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 48: Mpr-K-G-D-W(Formil)-P-C- NH_{2}

PAI 49: Mil-K-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 51: Mpr-K-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

PAI 52: Mpr-K-G-D-W P-Pen\dagger- NH_{2}

PAI 54: Mpr-K-G-D\dagger-W-P-Pen- NH_{2}

PAI 55: Mpr-K-G-D-W-(Thz)-C- NH_{2}

PAI 57: Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-Pen- NH_{2}

PAI 58: MiI-K-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

PAI 59: Mpr-K-G-D-W-(Pip)-Pen- NH_{2}

PAI 60: Mpr-(Har)-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 61: Mpr-K-G-D-W-P-C\dagger- NH_{2}

PAI 62: Mpr-K\dagger-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

PAI 63: Wpr-(Har)-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

PAI 64: Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 65: Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

PAI 66: Mpr-(NG,NG'-etilen-Har)-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 67: Mpr-(NG,NG'-etilen-Har)-G-C-W-P-Pen- NH_{2}

PAI 68: Mpr-Har-Sar-D-W-P-C NH_{2}

PAI 69: Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

PAI 70: Mpr-(Fenilimidil-Lys)-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 71: Mpr-Har-Sar-D-W-P-Pen NH_{2}

PAI 72: Mpr-(Fenilimidil-Lys)-G-D-W-P-Pen NH_{2}

PAI 73: Mpr-Har-G-D-W-(3.4.deshidro-Pro)-C- NH_{2}

PAI 75: Mpr-(Fenilimidil-Lys)-G-D-Pen- NH_{2}

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Se prefieren particularmente los péptidos de las fórmulas

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PAI 3: G-C-G-K-G-D-W-P-C-A- NH_{2};

PAI 4: G-C-K-G-D-W-P-C-A- NH_{2};

PAI 5: C-G-K-G-D-W-P-C- NH_{2};

PAI 10: C-K-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 12: C-K-G-D-Y-P-C- NH_{2}

PAI 13: C-K-G-D-F-P-C- NH_{2}

PAI 19: Mpr-K-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 25: Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-C- NH_{2}

PAI 39: C-K-G-D-W-(Sar)-C- NH_{2}

PAI 42: C-K-G-D-(4-Cl-Fenil)-P- NH_{2}

PAI 43: C-K-(Sar)-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 44: C-K-G-D-(4-NO2-Fenil)-P-C NH_{2}

PAI 47: Acetil-C-K-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 48: Mpr-K-G-D-W(Formil)-P-C- NH_{2}

PAI 49: Mil-K-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 51: Mpr-K-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

PAI 52: Mpr-K-G-D-W-P-(D-Pen)- NH_{2}

PAI 55: Mpr-K-G-D-W-(Thz)-C- NH_{2}

PAI 57: Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-Pen- NH_{2}

PAI 58: Mil-K-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

PAI 59: Mpr-K-G-D-W-(Pip)-Pen- NH_{2}

PAI 60: Mpr-(Har)-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 61: Mpr-K-CrD-W-P-C\dagger- NH_{2}

PAI 62: Mpr-K\dagger-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

PAI 63: Mpr-(Har)-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

PAI 64: Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 65: Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

PAI 66: Mpr (NG,NG'-etilen-Har)-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 67: Mpr (NG,NG'-etilen-Har)-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

PAI 68: Mpr-Har-Sar-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 69: Mpr-(Acetimidil-Lys)-C-D-W-P-Pen- NH_{2}

PAI 70: Mpr-(Fenilimidil-Lys)-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 71: Mpr-Har-Sar-D-W-P-Pen NH_{2}

PAI 72: Mpr-(Fenilimidil-Lys)-G-D-W-P-Pen NH_{2}

PAI 73: Mpr-Har-G-D-W-(3.4-deshidro-Pro)-C- NH_{2}

Síntesis Química de los Péptidos de la Invención

Los compuestos dentro del alcance de la presente invención pueden sintetizarse químicamente por medios bien conocidos en el estado de la técnica tales como, por ejemplo, síntesis de péptidos en fase sólida. La síntesis se comienza a partir del extremo carboxi-terminal del péptido, utilizando un aminoácido alfa-aminoprotegido. Los grupos protectores t-Butilaucicarbonilo (Boc) pueden utilizarse para todos los grupos amino aunque otros grupos protectores, tales como fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), son adecuados. Por ejemplo, Boc-Gly-OH, Boc-Ala-OH, Boc-His (Tos)-OH, (esto es, aminoácidos carboxi-terminal seleccionados) pueden ser esterificados como soportes de resina de poliestireno clorometilado, p-metil benzhidritamina (pMBHA) o resinas PAM. El soporte de resina de poliestireno es preferiblemente un copolímero de estireno con alrededor de 0,5 a 2% de divinil benceno como agente entre cruzamiento que causa que el polímero de poliestireno sea completamente insoluble en ciertos solventes orgánicos. Ver Stewart y colaboradores, Solid-Phase Peptide Synthesis (1969) W. H. Freeman Co., San Francisco y Merrifield, J. Am. Chem. Soc. (1963) 85: 2149-2154. Estos y otros métodos de síntesis de péptidos también son ejemplificados por las patentes US Nos. 3.862.925, 3.842.067, 3.972.859 y 4.105.602.

La síntesis puede hacer uso de técnicas manuales de síntesis, o automáticas, por ejemplo, un Sintetizador de péptidos 430A o 431A de Applied Bio-Systems (Foster City, California) siguiendo las instrucciones suministradas en el manual de instrucciones del fabricante. La escisión de los péptidos de la resina, puede llevarse a cabo los protocolos de desprotección HF "bajo-alto" como lo describen Lu, G.-S., y colaboradores, Int. J. Peptide & Protein Res. (1987) 29: 545-557. El replegamiento de los PAI análogos del veneno de serpiente puede llevarse a cabo utilizando los procedimientos reseñados en Garsky, V., y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86: 4022-4026 que describe la síntesis en fase sólida de la echistatina.

Los péptidos cíclicos de esta invención que no tienen enlaces disulfuro, pueden prepararse convenientemente por medio de una combinación de síntesis en fase sólida y la formación de una estructura de anillo cíclico en solución, utilizando los métodos generales que se reseñan en la patente US No 4.612.366. Por lo tanto los péptidos lineales preparados sobre una resina estándar Merrifield, pueden escindirse de la resina con hidrazina, seguido de la ciclización de la azida correspondiente para formar los péptidos cíclicos.

Producción Recombinante de los Péptidos de la Invención

Alternativamente, los compuestos seleccionados de la presente invención pueden ser producidos por expresión de construcciones de ADN recombinante preparadas de acuerdo con métodos bien conocidos. Tal producción puede ser deseable para proveer grandes cantidades de las modalidades alternativas de tales compuestos. Ya que las secuencias de los péptidos son relativamente cortas, se facilita la producción recombinante; sin embargo, la producción por medios recombinantes es particularmente preferida sobre la síntesis estándar de péptidos en fase sólida para péptidos de al menos 8 residuos aminoácidos.

El ADN que codifica la secuencia del PAI, se prepara preferiblemente utilizando métodos de síntesis de ácido nucleico comercialmente disponibles. Los métodos para construir los sistemas de expresión para la producción de PAI en huéspedes, también son generalmente conocidos en el estado del arte.

La expresión puede efectuare ya sea en huéspedes procariotas o eucariotas. Los procariotas están representados más frecuentemente por diferentes cepas de E. coli. Sin embargo, también pueden utilizarse otras cepas microbianas, tales como bacilos, por ejemplo Bacillus subtilis, diferentes especies de Pseudomonas, u otras cepas bacterianas. En tales sistemas procariotas, se utilizan los vectores del plásmido que contienen los sitios de replicación y las secuencias de control derivadas de una especie compatible con el huésped. Por ejemplo, un vector de distribución para E. coli es pBR322 y sus derivados. Las secuencias procariotas de control usadas comúnmente, que contienen promotores para iniciación de la transcripción, opcionalmente con un operador, junto con las secuencias de enlazamiento al ribosoma, incluye a los promotores usados comúnmente tales como los sistemas promotores beta-lactamasa (penicilinasa) y lactosa (lac), el sistema promotor de triptófano (trp) y el promotor P_{L} lambda-derivado y el sitio de enlazamiento al ribosoma del N-gen. Sin embargo, cualquier sistema promotor disponible compatible con procariotas puede ser utilizado.

Los sistemas de expresión útiles en los huéspedes eucariotas comprenden promotores derivados de los genes eucariotas apropiados. Una clase de promotores útiles en levaduras, por ejemplo, incluye promotores para síntesis de enzimas glicolíticas, por ejemplo, aquellas 3-fosfoglicerato quinasa. Otros promotores para levadura incluyen aquellas del gen enolasa o el gen Leu2 obtenido a partir de YEp13.

Los promotores apropiados de mamífero incluyen a los promotores tempranos y tardíos de SV40 u otros promotores virales tales como aquellos derivados de polioma, adenovirus II, virus de papiloma bovino o virus de sarcoma aviar. Los mejoradores adecuados virales y de mamífero son citados más arriba. En el caso de que las células de las plantas sean usadas como sistemas de expresión, el promotor de la síntesis de nopalina por ejemplo, es apropiado.

Los sistemas de expresión se construyen utilizando técnicas bien conocidas de restricción y de ligación, y se transforman en huéspedes apropiados.

La transformación se hace utilizando técnicas estándar apropiadas para tales células. Las células que contienen a los sistemas de expresión se cultivan bajo condiciones apropiadas para la producción del PAI, y luego se lo recupera y purifica.

Anticuerpos

La disponibilidad del PAI purificado de la invención, permite también la producción de anticuerpos específicamente inmunorreactivos con estas formas del péptido activo.

Las composiciones que contienen PAI purificado aislado de veneno de serpiente o que se sintetizan de otra manera, pueden utilizarse para estimular la producción de anticuerpos que reaccionan en forma inmune con el péptido PAI. Los protocolos estándar de inmunización que involucran la administración de PAI a diferentes vertebrados, tales como conejos, ratas, ratones, ovejas y pollos resultan en antisueros que son inmunorreactivos con el péptido purificado. El PAI puede conjugarse convenientemente a un portador neutro antigénicamente adecuado, tal como suero de albumina apropiado o hemocianina de lapa Keyhole, con el propósito de mejorar la inmunogenicidad. Además, el péptido libre puede inyectarse con BSA metilado como una alternativa a la conjugación. Además, las células que secretan anticuerpos del mamífero inmunizado, pueden ser inmortalizadas para generar paneles de anticuerpo monoclonal que pueden muestrearse por su reactividad con PAI.

Las preparaciones resultantes de anticuerpo policlonal o monoclonal son útiles en los ensayos para los niveles del PAI correspondiente en las muestras biológicas, utilizando procedimientos estándar de inmunoensayo.

El Ensayo de enlazamiento del fibrinógeno al complejo GP IIb-IIIa in vitro

La identificación del veneno de serpiente arrancando con material que contiene al PAI activo, el cual tiene especificidad conocida, se hace posible por medio del ensayo descrito aquí. El ensayo descansa en la observación de que los compuestos que bloquean el enlazamiento de fibrinógeno al complejo GP IIb-IIIa in vitro, también son capaces de inhibir a la trombina o la agregación inducida de ADP de plaquetas humanas, y la formación de trombos plaquetarios in vivo. Esta observación proporciona las bases para obtener un PAI potente por evaluación de la capacidad de los materiales del ensayo para romper las interacciones fibrinógeno-GP IIb-IIIa.

En el ensayo, GP IIb-IIIa, preparado en forma purificada, por ejemplo como lo describen Fitzgerlad, LA., y colaboradores, Anal. Biochem. (1985) 151: 169-177, se coloca sobre un soporte sólido tal como cuentas, tubos de ensayo, o placas de microtitulación. El soporte recubierto es luego puesto en contacto con fibrinógeno y con el material del ensayo, e incubado durante un tiempos suficiente para permitir máximo enlazamiento del fibrinógeno al GP IIb-IIIa inmovilizado. El fibrinógeno es proveído típicamente a una concentración de alrededor de 5-50 nM, y el material del ensayo puede, si se desea, ser añadido en una serie de diluciones. Las incubaciones típicas son de 2-4 horas a 35ºC, siendo interdependientes el tiempo y la temperatura.

Después de la incubación, la solución que contiene al fibrinógeno y al material del ensayo, se remueve y el nivel de enlazamiento del fibrinógeno se mide por medio de la cuantificación del fibrinógeno enlazado al GP IIb-IIIa. Cualquier medio adecuado de detección puede ser usado, pero es conveniente emplear fibrinógeno marcado, por ejemplo utilizando marcadores radioactivos, fluorescentes o biotinilados. Tales métodos son bien conocidos y no necesitan ser elaborados aquí.

La evaluación de los resultados se apoya en el empleo de una muestra de control, usualmente idéntica a la muestra del ensayo, excepto porque la sustancia del análisis está ausente. En este caso, el porcentaje de inhibición puede calcularse utilizando la cantidad de Fg enlazada en el control, representando al elemento principal, así que

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% \ inhibición = \frac{control - ensayo}{control} \ x 100

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También pueden utilizarse otras mediciones de la efectividad de inhibición, tal como IC_{50}.

Los sistemas de ensayo descritos aquí incluyen además la caracterización de la especificidad del PAI por medio de ensayos de inhibición de enlazamiento idénticos al anterior, pero sustituyendo otras proteínas adhesivas por Fg y otros receptores por GP IIb-IIIa. En particular, puede evaluarse la inhibición del enlazamiento de la vitronectina al receptor de vitronectina; de la fibronectina al receptor de fibronectina; de la fibronectina a GP IIb-IIIa y del fibrinógeno y/o del vWF al GP IIb-IIIa. La proteína adhesiva y los receptores para estos ensayos, se encuentran disponibles en el estado del arte.

Otros Ensayos

Además de los ensayos en placa descritos aquí, también se encuentran disponibles otros ensayos de actividad de inhibición de agregación plaquetaria y actividades relacionadas, como se expone más arriba. En resumen, una lista de ensayos empleados comúnmente es la siguiente:

1.: Los ensayos en placa que utilizan receptores específicos descritos en los párrafos anteriores;

2.: Ensayos estándar aplicados directamente a la agregación plaquetaria, tales como aquellos descritos por Gann, Z.-R., y colaboradores, J. Biol. Chem. (1988) 263: 19827-19832; Huang, T. F., y colaboradores, J. Biol. Chem. (1987) 262: 16157-16163; Biochemistry (1989) 28: 661-666, citados antes e incorporados aquí por referencia;

3.: Un modelo de trombosis in vivo en perros como el descrito aquí más adelante en el Ejemplo 1, y por Folts, J.D, y colaboradores, Circulación (1976) 54: 365; y

4.: Efecto sobre la adhesión celular usando células marcadas con metionina S35 como se describe más adelante en el Ejemplo 19.

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Los PAI de la invención son terapéuticamente útiles para prevenir la formación de trombos. Las indicaciones apropiadas para tal tratamiento incluyen, sin limitación, aterosclerosis y arteriosclerosis, infarto agudo del miocardio, angina crónica inestable, ataques isquémicos transitorios y ataques súbitos, enfermedad vascular periférica, trombosis arterial, preeclampsia, embolia, reestenosis y/o trombosis siguiente a una angioplastia, endarterectomía de carótida, anastomosis de injertos vasculares, y dispositivos cardiovasculares crónicos (por ejemplo, catéteres permanentes o derivaciones de "dispositivos de circulación extracorporal"). Estos síndromes representan una variedad de desordenes vasculares estenóticos y oclusivos que se piensa que se inician por activación plaquetaria sobre las paredes de las venas.

Los PAI pueden ser utilizados para la prevención o el aborto en la formación de trombos arteriales, en la angina inestable y en embolias arteriales o trombosis, así como el tratamiento o prevención del infarto del miocardio (MI) y la formación mural de trombos post MI. Para los desordenes relacionados con el cerebro, se incluye el tratamiento o prevención del ataque isquémico transciente y el tratamiento del ataque trombótico súbito o de un ataque súbito en evolución.

Los PAI pueden ser utilizados también para la prevención de la agregación plaquetaria, embolización, o la destrucción en circulaciones extracorpóreas, incluido la mejora en la diálisis renal, las derivaciones cardiopulmonares, hemoperfusiones, y plasmaféresis.

Los PAI previenen la agregación plaquetaria, embolización, o la destrucción asociada con los dispositivos intravasculares, y los resultados de la administración en el servicio mejorado de las bombas intraaórticas de balón, dispositivos de asistencia ventricular, y catéteres arteriales.

Los PAI serán también útiles en el tratamiento o la prevención de trombosis venosas así como en las trombosis venosas profundas, IVC, trombosis de la vena renal o de la vena porta, y trombosis pulmonar venosa.

Los diferentes desórdenes que involucran desordenes plaquetarios, tales como la púrpura trombocitopénica trombótica, también son tratables.

Además, los PAI de la presente invención pueden ser utilizados en numerosas aplicaciones donde se desea la inhibición de la agregación plaquetaria. Por ejemplo, el almacenamiento mejorado de plaquetas y de sangre entera, puede obtenerse por medio de la adición de cantidades suficientes de los péptidos, cuya cantidad variará dependiendo del período de almacenamiento propuesto, de las condiciones de almacenamiento, el uso final del material almacenado, etc.

La dosis de PAI puede fluctuar en un rango amplio dependiendo del efecto deseado y del marco terapéutico. Típicamente, las dosis estarán entre alrededor de 0,01 y 10 mg/kg, preferiblemente entre alrededor de 0,01 a 0,1 mg/kg, de peso corporal. La administración es preferiblemente parenteral, tal como intravenosa sobre una base diaria hasta por una semana o hasta por uno o dos meses o más, todo lo cual variará con el tamaño del péptido. Si los péptidos son suficientemente pequeños (por ejemplo, menores de 8-10 residuos aminoácidos) pueden utilizarse otras rutas de administración, tales como intranasal, sublingual, o similares.

Las composiciones farmacéuticas inyectables pueden prepararse en formas convencionales, ya sea como soluciones líquidas o como suspensiones, en formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en un líquido antes de ser inyectados, o como emulsiones. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, manitol, lactosa, lecitina, albúmina, glutamato de sodio, clorhidrato de cisteína o similares. Además, si se desea las composiciones farmacéuticas inyectables pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes de humectación, agentes buffer de pH, y similares. Si se desea, pueden utilizarse preparaciones que mejoran la absorción (por ejemplo, liposomas).

Las modalidades en los siguientes Ejemplos que no están cubiertos por las reivindicaciones, se dan para efectos de comparación únicamente.

Ejemplo 1 Ensayo para los Inhibidores de Adhesión Plaquetaria de Veneno de Serpiente A. Descripción de los Análisis sobre Placa

El receptor GP IIb-IIIa plaquetario purificado se preparó como lo describen Fitzgerald, LA, y colaboradores, Anal. Biochem. (1985) 151: 169-117. El receptor de vitronectina se preparó como lo describe Smith, J. W., J. Biol. Chem. (1988) 263: 18726-18731. Después de la purificación, se almacenaron los receptores en Tritón X-100 al 0,1% a 0,1-1,0 mg/ml.

Los receptores fueron colocados para recubrir los pozos de placas de ELISA de 96 pozos de fondo plano (placa de microtitulación Unbro EIA-Plus. Flow Laboratories) después de dilución 1:200 con una solución de Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 1 mM, pH 7,4, para reducir la concentración de Tritón X-100 por debajo de su concentración micelar crítica y añadir una alícuota de 100 \mul a cada pozo. Se permitió a todos los pozos ser incubador durante la noche a 4ºC y luego aspirados hasta sequedad. Los sitios adicionales fueron bloqueados por medio de la adición de albúmina de suero bovino (BSA) de 35 mg/ml en el anterior buffer por 2 h a 30ºC, para prevenir el enlazamiento no específico. Los pozos fueron lavados entonces una vez con buffer de enlazamiento (Tris-HCl 50 nM, NaCl 100 mM, CaCl_{2} 2 mM, 1 mg/ml de BSA).

Los ligandos correspondientes (fibrinógeno, Factor de von Willebrand, o vitronectina) fueron marcados con ^{125}I o conjugados a biotina utilizando reactivos comercialmente disponibles y protocolos estándar. Los ligandos marcados fueron añadidos a los pozos recubiertos con receptor hasta una concentración final de 10 nM (100 \mul/pozo) e incubados durante 3 horas a 30ºC, en presencia o en ausencia de las muestras de ensayo. Después de la incubación, los pozos se aspiran hasta sequedad y se cuantifican los ligandos enlazados.

Para los ligandos marcados con ^{125}I, la proteína se solubiliza con 250 \mul de SDS. Para los ligandos biotinilados, la proteína enlazada se detecta por medio de la adición de conjugado de anticuerpo antibiotina a fosfatasa alcalina, seguido por la adición de sustrato (p-nitrofenil fosfato), y la determinación de la densidad óptica de cada pozo a 405 nm. La disminución en el desarrollo de color o la disminución en el contenido de ^{125}I, se observa en los pozos incubados con muestras de ensayo que inhiben el enlazamiento del ligando al receptor.

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B. Determinación de la Inhibición de Adhesión en Veneno Crudo

Sesenta y ocho venenos de serpiente crudos, biofilizados obtenidos ya sea con Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) o Miami Serpentarium Labs (Salt Lake City, UT) fueron disueltos hasta 1 mg/ml en buffer (Tris 50 mM, NaCl 100 mM, azida al 0,02%, CaCl_{2} 2 mM). Alícuotas de un ml de las soluciones fueron sometidas a ultrafiltración a través de microconcentradores Centrocon 10 (membrana YM) (Amicon, Danverse, MA). Los filtrados fueron utilizados como muestras de análisis en el ensayo receptor/ligando del párrafo A, utilizando el sistema GP II-IIIa/fibrinógeno, y detectando el enlazamiento utilizando fibrinógeno biotinilado. Los resultados se muestran en la
Tabla 1.

Se observa que la actividad está presente en algunas, pero no en todas, las especies de Viperinae, pero ausente en todas las especies analizadas de Elapidae.

La Figura 1 muestra los resultados a diferentes diluciones del filtrado para cuatro especies. Aún a las diluciones más grandes, 25 \mul/0,5 ml, los tres venenos activos mostraron inhibición máxima.

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C. Determinación de la Actividad de los Péptidos en un Modelo de Trombosis in vivo

Los péptidos purificados fueron analizados por su habilidad para prevenir la formación de trombos en arterias coronarias de perro en el modelo descrito por Folts (Folts J.D., y colaboradores, Circulation (1976) 54: 365. En este modelo las reducciones de flujo en una arteria coronaria constreñida, se ha mostrado que son debidas a la formación de agregados plaquetarios, y se ha mostrado que los agentes que bloquean el enlazamiento del fibrinógeno al GP IIb-IIIa, previenen estas reducciones de flujo (Coller, B. S., y colaboradores, Blood (1986) 68:783. Los péptidos fueron disueltos en solución salina normal, y administrados dentro de una vena periférica como una píldora gruesa
única.

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TABLA 1

Venenos purificados a través de centrocon R10 muestreados en el ensayo cobre placa con IIb-IIIa
Elápidos	Actividad
Austrelaps superba (Australian Copperhead)	-
Acanthopis antarcticus (Death Adder)	-
Dendroaspis jamesonii (Jameson's Mamba)	-
Notechis scutatus (Mainland Tiger)	-
Pseudechis colleti guttatus (Blue-bellied)	-
Pseudechis textillis textillis (Common Brown)	-
oxyuranus scutellatus (Papuan Taipan)	-

TABLA 1 (continuación)

viperinae (True Vipers)	Actividad
Atheris squanigera (Creen Bush Viper)	-
Bitis nasicornus (River Jack)	-
Causus rhombeatus (Rhombic Night Adder)	-
Cerastes carastes (Desert Horned Viper)	-
Cerastes vipera (Sahara Horned Viper)	-
Echis carinatus (Saw-scaled Viper)	+
Echis colorata (Carpet viper)	+
Eristicofis macmahonii (Macmahons Viper)	++
Pseudocarastes fieldi (Persian Horned Viper)	-
Vipera xanthina xanthina (Ottomans Viper)	-
Vipera ammodytas (Long-nosed Viper)	-
Vipera r. russelli (Russells Viper)	-
Vipera r. siamensis	-
Vipera palaestinae (Palestine Viper)	-
Crotolinae (Pit Vipers)	Actividad
Agkistrodon rhodostoma (Malayan Pit Viper)	+
Agkistrodon halys blomhoffi (Mamushi)	+
Agkistrodon hypnale (Hump-nosed Viper)	+
Agkistrodon acutus (Sharp-nosed Viper)	++
Agkistrodon bilineatus (Mexican Moccasin)	-
Agkistrodon contortrix contortrix	-
Agkistrodon c. laticinctus	-
Agkistrodon c. pictigaster	-
Agkistrodon contortrix mokasen (Northern Copperhead)	-
Agkistrodon piscivorous piscivorous (Eastern Cottonmouth)	-
Agkistrodon piscivorus leucostoma (Western Cottonmouth)	+
Agkistrodon piscivorous conanti	+
Bothrops asper	+
Bothrops nummifer (Jumping Viper)	-
Bothrops cotiara (Cotiara)	+
Bothrops jararacussu (Jararacussu)	+
Bothrops jararaca (Jararaca)	+
Bothrops lansbergi	+
Bothrops alternata (Urutu)	-
Bothrops medusa	+
Bothrops neuwiedi	+
Bothrops nasuta	+
Bothrops pradoi	+
Bothrops schlegli (Schlegels Viper)	-
Trimeresurus gramineus (Formosan Green Habu)	-
Trimeresurus flavoviridis (Okinawa Habu)	-
Trimeresurus wagleri	-
Lachesis mutas (Bushmaster)	-
Crotalus durrisus terrificus (Tropical Rattlesnake)	-
Crotalus durissus totenatacus	-
Crotalus durissus durissus	-
Crotalus scutalacus (Mojave rattlesnake)	-
Cortalus horridus horridus (Timber Rattlesnake)	-
Crotalus horridus atricaudatus (Canebrake RS)	-
Crotalus atrox (western Diamondback)	-
Crotalus adasantous (Eastern Diamondback)	-

TABLA 1 (continuación)

Crotolinae (Pit Vipers)	Actividad
Crotalus basilicus (Mexican West-coast RS)	+
Crotalus molossus molossus (Black-tailed RS)	+
Crotalus ruber ruber (Red diamondback RS)	-
Crotalus carastes carastes (Mojave sidewinder)	-
Crotalus viridis viridis (Prairie Rattlesnake)	+
Crotalus v. helleri (Southern pacific RS)	+
Crotalus v. oreganus (Northern pacific RS)	+
Crotalus v. cerebarus (Arizona black RS)	-
Crotalus v. lutosus (Grest Basin RS)	+
Crotalus v. concolor (Midget-faded RS)	-
Sistrurus catanatus targeminus (Western massasauga)	+
Sistrurus milarius barbouri (Southeastern Pigmy Rattiesnake)	-

D. Efectos de los Péptidos Purificados de Veneno de Serpiente sobre la Unión de las Células a las Proteínas Adhesivas

Las células de melanoma M21, que expresan altos niveles del receptor de vitronectina, fueron marcados metabólicamente con ^{35}S-metionina, y luego añadidas a placas de cultivo de tejido de 24 pozos, recubiertas con vitronectina. Se permitió un período de incubación de 1 hora a 37ºC para la unión de las células y esto fue seguido por un lavado para remover las células no adherentes. Después del lavado, las células adherentes fueron solubilizadas, y los sobrenadantes colocados en un contador de centelleo para líquidos. La fracción de células adherentes remanentes se calculó dividiendo el cpm en los sobrenadantes solubilizados por el cpm en el número total de células añadido a cada pozo. Los efectos de los péptidos purificados de veneno de serpiente y de los péptidos cíclicos sintéticos sobre la adhesión celular, se determinaron incluyéndolos con las células M21 durante el período de incubación.

E. Especificidad de la Inhibición de Adhesión

Los ultrafintrados de las tres especies de veneno de serpiente, Sistrurus m. barbouri, Crotalus ruber rubal, y Crotalus basilicus, fueron analizados tanto en el ensayo de fibrinógeno/GP IIb-IIIa como en el de vitronectina/receptor de vitronectina del párrafo A. Los resultados se evaluaron a diferentes diluciones. Como se muestra en la Figura 2A, en veneno de Sistrurus m. barbouri inhibe preferencialmente el enlazamiento de fibrinógeno al GP IIb-IIIa; el veneno de Crotalus ruber rubal inhibe el enlazamiento en ambos sistemas aproximadamente igual a como se muestra en la Figura 2B; y el veneno de Crotalus basilicus inhibe preferencialmente el enlazamiento de la vitronectina/receptor de vitronectina como se muestra en la Figura 2C.

En las purificaciones descritas en los Ejemplos 2-6 y 8-12, la actividad de PAI fue ensayada utilizando una inhibición directa de la agregación plaquetaria. El plasma rico en plaquetas (PRP) se obtuvo de un voluntario humano sano. La agregación fue inducida por medio de la adición de 4 \muM de ADP a 0,5 ml de PRP en un agregómetro (Chrono-log Corp.)

Una tabla que muestra los resultados del análisis de la composición de aminoácidos de los PAI purificados de los Ejemplos 2-6, se encontrará después del Ejemplo 6; aquella que muestra los resultados para los Ejemplos 8-11, se muestra después del Ejemplo 8.

Este análisis fue obtenido por hidrólisis de péptidos utilizando HCl 6 N y analizando el hidrolizado utilizando un equipo analizador Beckman 121 HC equipado con un sistema de datos Modelo 126. El ácido cistéico fue determinado de acuerdo al método de Moore, J. Biol. Chem, (1969) 230: 235-237. El triptófano no fue determinado.

Ejemplo 2 Purificación del Inhibidor de Agregación Plaquetaria (PAI) a partir de Veneno de Eristocophis macmahoni

Una solución de 45 mg de veneno de Eristocophis macmahoni (Miami Serpentarium Labs, Lote # EM23SZ) en 1,0 ml de ácido trifluoroacético al 0,5% (TFA), fue enfriada sobre hielo durante 20 min, giró a 14.000 rpm durante 3 min para remover el material insoluble y cargarlo sobre una columna de HPLC en fase reversa de 3,9 mm por 30 cm, Delta Pack^{R} C-18 (Waters, Milford, MA) equilibrada con acetonitrilo al 5% que contiene TFA al 1%. Un gradiente de corrimiento de acetonitrilo desde 5% hasta 15% durante 5 min (2%/min) seguido por un gradiente de acetonitrilo desde el 15% hasta el 30% durante 35 min, y luego hasta 50% de acetonitrilo durante 20 min, fue llevado a cabo utilizando un cromatógrafo líquido Waters 600E. Se mantuvo una velocidad de flujo de 1,5 ml/min a través del gradiente, y se recolecto el efluente de la columna en fracciones de 2 min dentro de tubos de polipropileno.

El efluente de la columna fue monitoreado a 220 nm/2,5 unidades de absorbancia de escala completa (AUFS).

Las fracciones fueron concentradas hasta la mitad de su volumen original utilizando un concentrados Speed-Vac^{R} (Savant) seguido por una liofilización. Las muestras fueron reconstituidas entonces en 1 ml de agua destilada y se ensayaron alícuotas (10-50 \mul) en cuanto a su habilidad para inhibir la agregación plaquetaria human en plasma rico en plaquetas, inducido por ADP 20 \muM, utilizando una agregómetro para sangre entera (Chrono-log Corp., Havertown, PA).

Como se muestra en la Figura 3 se encontró actividad en las fracciones que eluyeron a una concentración de acetonitrilo de 21-25%. Estas fracciones fueron luego liofilizadas y corrieron nuevamente sobre la columna C18 de HPLC utilizando un gradiente de acetonitrilo más superficial, como sigue: las condiciones iniciales consistieron de acetonitrilo al 8% seguido por un gradiente de acetonitrilo al 25% durante 68 min (0,25%/min), luego hasta acetonitrilo al 60% en 10 min. Se recolectaron fracciones al cabo de 1 min, se la secó y se las ensayó nuevamente por su actividad inhibidora en la agregación plaquetaria de plaquetas humanas como se hizo más arriba.

Como se muestra en la Figura 4, la actividad eluyó con acetonitrilo al 24%. Las fracciones activas fueron sometidas entonces a HTLC analítico con detección a 220 nm y eluyó como un componente simétrico bioactivo único, como se muestra en la Figura 5. El análisis de aminoácido del material purificado por TLC mostró que el péptido contenía 49 residuos incluidas 7-8 cisteínas, como se expone en la Tabla 2.

Los intentos de degradación automatizada de Edman del péptido carboxiamidometilado no produjo ninguna secuencia detectable. Por lo tanto, la digestión de este material se llevó a cabo con Lys-C y con Asp-N endoproteinasas para producir fragmentos que fueron secuenciados y se muestran en la Figura 6. Este análisis reveló una secuencia de 48 residuos. Sin embargo, ya que 2 residuos de triptófano se manifiestan a partir de este análisis de secuencia, que no fueron determinados en la composición de aminoácidos el péptido intacto contiene 51residuos de aminoácidos. Por lo tanto, dos residuos de Glx y uno de Arg perdidos a partir de la secuencia determinada, estuvieron presumiblemente presentes en el amino-terminal bloqueado del péptido. Ya que fue muy probablemente que uno de los residuos GLX, fuera un residuo piroglutamilo en el amino-terminal el que condujera a la naturaleza bloqueada del péptido intacto, nosotros removimos este grupo del péptido carboxiamidometilado intacto con la enzima piroglutamil aminopeptidasa (hidrolasa del péptido L-piroglutamilo, EC 3.4.11.8, Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianápolis, IN). Fueron utilizados los protocolos descritos por Podell y Abraham, Biochem. Biophys. Res. Común. (1978) 81: 176-185. La digestión de 100 \mug de péptido con la peptidasa en una proporción de sustrato a enzima de 100:1, seguido por una purificación por HPLC en fase reversa de la mezcla sobre una columna analítica C-18 de Waters, Produjo el material adecuado para la degradación automatizada de Edman. Los resultados de este análisis y la asignación de la secuencia entera de este péptido que fue llamado "eristicofina", se muestra en la Figura 6.

La secuencia completa de aminoácidos de este PAI, se muestra en la Figura 6. Este péptido tiene RGD en la región de enlazamiento y muestra una considerable homología con la echistatina.

Ejemplo 3 Purificación del PAI del Veneno de Sistrurus catenatus tergeminus

Trescientos sesenta mg del veneno de Sistrurus c. tergeminus (Miami Serpentarium Labs, Lote # ST6SZ) fueron disueltos en 7,5 ml de ácido acético 0,5 M y se aplicaron a una columna fina de Sephadex^{R} G-50 (Pharmacia, 2,5 x 100 cm) equilibrada y eluida con ácido acético 0,5 M. Se corrió la columna con una velocidad de flujo aproximadamente de 25 ml/h y se recolectaron fracciones de 5 ml. Veinticinco \mul de cada fracción fueron reunidos en grupos de 10 fracciones (esto es, fracciones 1-10, 11-20, etc.) y se los liofilizó para el análisis. Las fracciones recolectadas secas fueron redisueltas en agua y las alícuotas ensayadas por su actividad inhibidora en la agregación estimulada por ADP de plaquetas humanas. Las fracciones activas (31-40) fueron reunidas y liofilizadas.

Este material fue disuelto en 2 ml de TFA al 0,5% cargado sobre una columna de HPLC de fase reversa Delta Pak^{R} C-18 de 19 mm x 30 cm (Waters) equilibrada con acetonitrilo al 8% que contenía TFA al 0,1%. Se corrió a un gradiente entre 8% a 30% de concentración de acetonitrilo durante 30 min, y luego con 60% de acetonitrilo durante veinte min, a una velocidad de flujo de 18 ml/min. Se recolecto el efluente de la columna en tubos de polipropileno en fracciones a 0,2 min y se monitoreó a 220 nm/2,2 AUFS. Se concentraron las fracciones sobre un concentrador Speed-Vac^{R} (Savant), se liofilizaron y se analizaron para su actividad de antiagregación con plaquetas humanas como se describió previamente.

La Figura 7 muestra que la fracción que contiene PAI eluye a una concentración de 24-25% de acetonitrilo. El análisis de estas fracciones activas utilizando HPLC con detección a 220 nm, mostró un componente bioactivo simétrico, como se muestra en la Figura 8. El análisis de aminoácidos de este material mostró un péptido de 71-72 residuos, incluidas 12 cisteínas, como se muestra en la Tabla 2.

Una porción del péptido purificado se redujo y se la alquiló con iodoacetamida y se la purificó sobre una columna de HPLC en fase reversa C-18. El análisis de la secuencia N-terminal de este material reveló las siguiente secuencia de aminoácidos para 23 ciclos de degradación de Edman: Glu-Ala-Gly-Glu-Glu-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-PJa-Asn-Pro-Cys-Cys-Asp-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-Leu.

La secuencia completa de aminoácidos para este PAI, que fue llamado "tergeminina", se muestra en la Figura 6.

El péptido purificado fue analizado en el ensayo con base en el receptor, descrito en el Ejemplo 1, párrafo A. Las concentraciones de péptido puro al menos de 100 nM inhibieron el enlazamiento de Fg y de vWF al GP IIb-IIIa y de Vn y vWF al receptor de vitronectina, como se muestra en la Figura 9.

Ejemplo 4 Purificación del Inhibidor de Agregación Plaquetaria a partir del Veneno de Sistrurus milarus barbouri

Doscientos mg del veneno de Sistrurus m, barbouri (Miami Serpentarium Labs, Lote # SM13SZ) fueron disueltos en 7,0 ml de ácido acético 0,5 M y se aplicaron a una columna fina de Sephadex^{R} G-50 (Pharmacia, 2,5 x 100 cm) equilibrada y eluida con ácido acético 0,5 M. Se corrió la columna con una velocidad de flujo de 26 ml/h y se recolectaron fracciones de 5 ml y se analizó su actividad de agregación antiplaquetaria como se describió previamente. Se reunieron las fracciones activas (41-50) y se liofilizaron. Este material fue redisuelto en 2,0 ml de TFA al 0,5% y cargado en una columna preparativa de HPLC C-18 como en el Ejemplo 3 y se eluyó empleando las mismas condiciones de gradiente. Se recolectaron las fracciones de dos decimos de minuto de la columna en tubos de polipropileno, se las concentró, liofilizó y analizó su actividad inhibidora de agregación plaquetaria.

La Figura 10 muestra el perfil de actividad de esta columna de HPLC. Las fracciones activas fueron sometidas a HPLC analítico, que mostró diferentes fracciones (45-47) que fueron homogéneas en más de un 90%. Se purificó el péptido de la fracción 46 (150 \mug) hasta homogeneidad sobre una columna analítica C-18 con recolección manual de los picos simétricos, como se muestra en la Figura 11. El análisis de los aminoácidos de este material mostró un péptido de 71-72 aminoácidos, que incluye 12 residuos de cisteína, como se expone en la Tabla 2.

El péptido purificado (150 \mug) fue disuelto en 300 \mul del buffer de reacción (Clorhidrato de guanidina 6 M, Tris-HCl 0,25 M, EDTA 20 mM, ditiotreitol 20 mM (DTT), pH 7.5) durante 1,5 horas a temperatura ambiente para reducir al péptido. Esto fue seguido por la reacción de 3 \mul de 4-vinilpiridina (Aldrich) a temperatura ambiente por una hora adicional. La reacción fue detenida por medio de la adición de 200 \mul de TFA al 1% y cargada sobre una columna analítica d HPLC C-18 y eluida con un gradiente de acetonitrilo en agua que contenía TFA al 0,1%, partiendo de acetonitrilo al 8% y corriendo hasta acetonitrilo al 25% en 20 minutos, luego acetonitrilo al 60% en 10
minutos.

Una porción de este material piridiletilado fue sometido a análisis de secuencia N-terminal, como se describió antes, y se llevó a cabo una escisión proteolítica exhaustiva del péptido reducido y alquilado, utilizando endoproteinasa Lys-C y endoproteinasa Asp-N con fragmentos de péptido aislados sobre cualquiera de las columnas de HPLC en fase reversa C-3 o C-18 utilizando un gradiente de elución de acetonitrilo/agua/TFA. La secuencia de aminoácidos del N-terminal del péptido intacto y de los fragmentos proteolíticos aislados fue determinada como lo describen Yarden, Y., y colaboradores, Nature (1986) 323: 226, utilizando degradación automatizada de Edman sobre un secuenciador en fase gaseosa.

La secuencia completa de aminoácidos de este péptido aislado, designado como "barbourina", se muestra en la Figura 6, junto con las secuencias para los fragmentos del proteolíticos. Una comparación de esta secuencia con aquella de los otros inhibidores de adhesión de veneno de serpiente, se muestra en la Figura 12.

Ejemplo 5 Purificación de PAI a partir de Lachesis mutas venom

99 mg del veneno de Lachesis mutas (Miami Serpentarium Labs, Lote # LM15FZ) fueron disueltos en 2,0 ml de ácido trifluoroacético 0,596 M, se enfriaron sobre hielo durante 20 min y giró a 14.000 rpm durante 3 min para remover el material insoluble y cargarlo sobre una columna de HPLC en fase reversa de 3,9 mm por 30 cm, Delta Pack^{R} C-18 (Waters) equilibrada con acetonitrilo al 5% que contiene TFA al 0,1%. Se corrió a un gradiente de acetonitrilo desde 5% hasta 15% durante 5 min y luego al 30% durante 35 min (2%/min), y se continuó hasta 60% de acetonitrilo durante 20 min. Se mantuvo una velocidad de flujo de 1,5 ml/min a través del gradiente, y se monitoreó el efluente de la columna a 220 nm/3.0 AUFS. Se recolectaron las fracciones a los 2 minutos, se las concentró por medio de Speed-Vac y se liofilizaron. Se ensayó la actividad inhibidora de agregación plaquetaria de las fracciones.

La Figura 13 muestra las fracciones activas que eluyen con acetonitrilo al 18%. Se corrieron nuevamente estas fracciones sobre la columna C-18 utilizando un gradiente más superficial que consiste de un gradiente durante 40 min entre 5-28% de acetonitrilo. Se recolectaron las fracciones a 1 minuto, se las concentro, se las liofilizó y se las ensayó por su actividad de inhibición de agregación plaquetaria, con los resultados mostrados en la Figura 14. Se corrieron estas fracciones activas sobre una columna analítica C18 y se recolectaron manualmente las fracciones que eluyeron en el pico central. El material eluido, que es un pico simétrico único como se muestra en la Figura 15 fue sometido a análisis de aminoácidos y mostró un péptido de 72-73 aminoácidos que contenía 12 cisteínas, como se muestra en la Tabla 2.

La secuencia completa de aminoácidos de este PAI, llamado "lachesina", se muestra en la Figura 6.

Ejemplo 6 Purificación del PAI del veneno de Crotalus viridis viridis

47 mg del veneno de Crotalus viridis viridis (Sigma Chemical Co., Lote # 24F-0534) fue disuelto en 1,0 ml de ácido trifluoroacético 0,5%, se enfrió sobre hielo durante 20 min y giró a 14.000 rpm durante 3 min para remover el material insoluble y cargarlo sobre una columna de HPLC en fase reversa de 3,9 mm por 30 cm, Delta Pack^{R} C-18 (Waters) equilibrada con acetonitrilo al 5% que contiene TFA al 0,1%. Se corrió a un gradiente de acetonitrilo desde 5% hasta 15% durante 5 min (2%/min) seguido por un gradiente de acetonitrilo de 15 al 30% durante 35 min, y luego hasta 60% de acetonitrilo durante 60 min. Se mantuvo una velocidad de flujo de 1,5 ml/min a través del gradiente, y el efluente de la columna se recolecto en tubos de polipropileno en fracciones de 2 min. El efluente de la columna se monitoreo a 220 nm/3.0 AUFS. Las fracciones se concentraron, se liofilizaron y se ensayó su actividad inhibidora de agregación plaquetaria.

Las fracciones activas, mostradas en la Figura 16 como acetonitrilo al 18-19%, se corrieron sobre la columna de HPLC C-18 utilizando un gradiente de acetonitrilo de 8%-20% durante 48 min. (0,25%/min). Las fracciones se concentraron y se liofilizaron, y se probó su actividad; las fracciones activas se corrieron sobre una columna C-18 utilizando acetonitrilo al 8-16% durante 10 min., acetonitrilo al 16-20% durante 15 min. y luego al 60% durante 10 min. Se monitoreó el efluente a 220 nm con los picos individuales recolectados a mano en tubos de polipropileno. El nuevo análisis del pico activo sobre HPLC analítico produjo los resultados mostrados en la Figura 17. El análisis de los aminoácidos realizado sobre este pico mostró un péptido de 72-73 residuos que contenían 12 cisteínas, como se expone en la Tabla 2. La secuencia completa de aminoácidos de este PAI, llamado "viridina" es mostrada en la Figura 6 y se compara con el otro PAI en la Figura 12.

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TABLA 2

Composiciones de Aminoácidos de Péptidos Purificados
Aminoácido	Sistrurus m.	Sistrurus c.	Lachesis mutas	Crotalus v.	Eristicofis
	barbouri	tergeminus		viridis	macmahoni
Lys	4	3	4	3-4	4
His	0	0	0-1	1	0
Arg	4	5	7	5	7
Asx	11	11	10	11	7
Thr	4	4	2	4	2
Ser	2	2	1	2	1
Glx	6-7	5-6	7	6	4
Pro	4	4	5	6	5
Gly	9	9	9	10	5
Ala	7	8	9	7	3
Cys	12	12	12	12	7
Val	2	2	0	1	2
Met	1	1	0	0	0
Ile	0	0	2	1	0
Leu	3	3	2	3	0
Tyr	1	1	1	1	1
Phe	1	1	1	1	1
	71-72	71-72	72-73	74-75	49

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Ejemplo 7 Comparación del PAI Purificado con Echistatina

Los péptidos purificados como se describe en los Ejemplos 2 y 4, eristicofina y barbourina, se compararon con el péptido de 49 residuos de echistatina en la inhibición del enlazamiento de fibrinógeno al GP IIb-IIIa, como se describió en el Ejemplo 1, párrafo A. La Figura 18 muestra que estos PAI purificados son 2-3 veces más potentes en este ensayo que la echistatina estándar. Los péptidos purificados hasta homogeneidad de los venenos de Echis carinatus, Sistrurus m. barbouri, y Eristicofis macmahoni fueron comparados con la echistatina en los ensayos de agregación plaquetaria estimulada por ADP. Se añadieron concentraciones crecientes de péptidos de veneno de serpiente purificado (sin preincubación) a las concentraciones indicadas (Figuras 19A, 19B y 19C). Los péptido de veneno de serpiente de Eristicofis macmahoni y Sistrurus m. barbouri fueron al menos dos veces más potentes que los de la echistatina, de acuerdo con su orden de potencia observado para la inhibición del enlazamiento de fibrinógeno al GP IIb-IIIa como se presentó más arriba.

Ejemplo 8 Purificación del PAI a partir del veneno de Crotalus cerastes cerastes

Un gramo de veneno de Crotalus c. cerastes (Miami Serpentarium Labs, Lote # CE4SZ) fue disuelto en 7,0 ml de ácido acético 0,5 M y se aplicó a una columna fina de Sephadex^{R} G-50 (Pharmacia, 2,5 x 100 cm) equilibrada y eluida con ácido acético 0,5 M. Se corrió la columna con una velocidad de flujo de 25 ml/h con fracciones de 5 ml recolectadas dentro de tubos de polipropileno. Se ensayaron las alícuotas de estas fracciones para la actividad inhibidora de la actividad de agregación como se describió previamente. Se reunieron las fracciones activas (71-80) y se liofilizaron. El material seco se resuspendió en 2,0 ml de TFA al 0,5% el material insoluble se removió por centrifugación y se cargó sobre una columna preparativa de HPLC C-18 de Waters como se describió en el Ejemplo 3 y se eluyó empleando las condiciones de elución por gradiente descritas en el Ejemplo 3. Las fracciones de la columna fueron recolectadas en tubos de polipropileno, se concentraron y se analizó su actividad inhibidora de agregación plaquetaria. La Figura 20 muestra el perfil de actividad de este fraccionamiento por HPLC.

Las fracciones activas con actividad inhibidora de agregación plaquetaria fueron reunidas y liofilizadas y se corrieron nuevamente sobre la columna preparativa de HPLC C-18, eluida con el mismo gradiente. Las fracciones se recolectaron a mano en tubos de polipropileno y nuevamente se ensayó su actividad inhibidora de agregación plaquetaria como antes. Las fracciones activas fueron analizadas sobre una columna analítica C-18 usando las condiciones descritas en el ejemplo 4, y las fracciones homogéneas fueron reunidas y liofilizadas. Los análisis por HPLC analítico de este material se muestran en la Figuro 21.

El péptido purificado fue sometido a análisis de aminoácidos revelando que era un péptido de 73-74 aminoácidos que contenía 12 residuos cisteína, como se expone en la Tabla 3.

El péptido purificado (450 \mug) se disolvió en 750 \mul de buffer de reacción (Clorhidrato de guanidina 6 M, Tris-HCl 0,25 M, EDTA 20 mM, ditiotreitol 20 mM (DTT), pH 7.50) durante 1,5 horas a temperatura ambiente hasta reducir completamente al péptido, seguido por reacción a temperatura ambiente durante una hora con exceso de iodoacetamida (Fluka, 16 mg). Se detuvo la reacción por medio de la adición de 500 \mul de TFA al 1%, y se cargo sobre una columna analítica de HPLC C-18 y se eluyó con un gradiente de acetonitrilo desde 8% hasta 25% en 20 min., luego hasta 60% de acetonitrilo en 10 min. Se recolectó manualmente el pico de absorción UV en tubos Eppendorf de 1,5 ml y se
secó.

Una porción de este péptido carboxiamidometilado fue sometida a un análisis de secuencia N-terminal. La escisión proteolítica exhaustiva del péptido carboxiamidometilado se llevó acabo utilizando endoproteinasa Lys-C y endoproteinasa Asp-N. Los fragmentos del péptido de estas digestiones fueron aislados sobre cualquiera de las columnas de HPLC en fase reversa C-3 o C-18, utilizando condiciones de gradiente de elusión de acetonitrilo/
agua/TFA. Se determinó la secuencia de aminoácidos como se describe en el Ejemplo 4. La secuencia completa de aminoácidos determinada para la "cerastina", se muestra en la Figura 6, y se compara con aquella de otra PAI en la Figura 12.

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TABLA 3

Composiciones de Aminoácidos
Aminoácido	Crotalus c.	Crotalus	Crotalus d.	Crotalus d.	Crotalus h.	Bothrops
	cerastes	atrox	durissus	totonatacus	horridus	cotiara
Lys	3	3	3	3	4	3
His	0	0	0	0	0-1	0
Arg	5	5	5	5	4	8
Asx	11	10	12	12	10	10
Thr	5	4	4	4	3	2
Ser	1	2	2	2	2	1
Glx	7	6	5-6	5-6	6	8
Pro	5	6-7	4-5	5	7	6
Gly	9	8	10	10	8	8
Ala	7	6	8	8	8	9

TABLA 3 (continuación)

Aminoácido	Crotalus c.	Crotalus	Crotalus d.	Crotalus d.	Crotalus h.	Bothrops
	cerastes	atrox	durissus	totonatacus	horridus	cotiara
Cys	12	12	12	12	10	12
Val	2	2	1	1	3	0
Met	1	0	0	0	1	0
Ile	0	1	1	1	0	1
Leu	3	3	3	3	2-3	2
Tyr	1	1	1	1	1	0
Phe	1	1	1	1	1	2
Trp	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.
	73-74	70-71	72-74	73-74	70-72	72

Ejemplo 9 Purificación del PAI a partir del veneno de Crotalus ruber ruber

Un gramo de veneno de Crotalus ruber ruber (Miami Serpentarium Labs, Lote # CF17SZ) fue disuelto en 8 ml de ácido acético 0,5 M y se aplicó a una columna fina de Sephadex^{R} G-50 (Pharmacia, 2,5 x 100 cm) equilibrada y eluida con ácido acético 0,5 M. Se corrió la columna con una velocidad de flujo de 25 ml/h con fracciones de 5 ml recolectadas dentro de tubos de polipropileno. Se ensayó la actividad inhibidora de agregación de las alícuotas de estas fracciones como se describió previamente. Se reunieron las fracciones activas (61-70) y se liofilizaron. El material seco se resuspendió en 2,0 ml de TFA al 0,5%. El material insoluble se removió por centrifugación y se cargó sobre una columna preparativa de HPLC C-18 de Waters como se describió, y se eluyó empleando las condiciones de gradiente descritas en el Ejemplo 3. Las fracciones recolectadas en tubos de polipropileno se concentraron en un concentrador Speed-Vac y se analizó su actividad inhibidora de agregación plaquetaria.

La Figura 22 muestra el perfil de actividad de este fraccionamiento por HPLC. Las fracciones activas individuales se liofilizaron. Las fracciones 49 y 50 se reunieron y se cargaron en una columna analítica C-18 de fase reversa y se eluyó utilizando las condiciones descritas en el Ejemplo 4 que consistieron en un gradiente de acetonitrilo corriendo desde 8% de acetonitrilo hasta 25% en veinte minutos, seguido de diez minutos de acetonitrilo al 69% para producir un péptido homogéneo que hemos llamado "ruberina". La degradación automática de Edman del péptido carboxiamidometilado produjo la secuencia mostrada en la Figura 6.

Ejemplo 10 Purificación del PAI a partir de Crotalus atrox

Un gramo de veneno de Crotalus atrox (Miami Serpentarium Labs, Lote # CX16AZ) fue disuelto en 10 ml de ácido acético 0,5 M y aplicado a una columna fina de Sephadex^{R} G-50 (Pharmacia, 2,5 x 100 cm) equilibrada y utilizada a temperatura ambiente con ácido acético 0,5 M. Se corrió la columna con una velocidad de flujo de 25 ml/h con fracciones de 5 ml recolectadas dentro de tubos de polipropileno. Se ensayó la actividad inhibidora de agregación plaquetaria de las alícuotas de estas fracciones como se describió previamente. Se reunieron las fracciones activas (81-100) y se liofilizaron. El material seco se disolvió en 2,0 ml de TFA al 0,5% y se cargó sobre una columna preparativa C-18 de HPLC y se operó como se describe en el Ejemplo 3. Se recolectaron las fracciones de la columna en tubos de polipropileno, se concentraron en un concentrador Speed-Vac y se ensayó su actividad inhibidora de agregación plaquetaria como antes. Las fracciones activas se corrieron sobre la columna analítica C-18 para producir un péptido homogéneo (Figura 23). El análisis de aminoácidos de este material reveló que el péptido contiene 72 aminoácidos incluidos los 12 residuos de cisteína, como se muestra en la Tabla 3. La secuencia de aminoácidos del péptido aislado, crotatroxina, se muestra en la Figura 6.

Ejemplo 11 Purificación del PAI a partir de Bothrops cotiara

Seiscientos ochenta miligramos de veneno de Bothrops cotiara (Miami Serpentarium Labs, Lote # BO5SZ) fueron disueltos en 10 ml de ácido acético 0,5 M y se cargaron sobre una columna fina de Sephadex^{R} G-50 (Pharmacia, 2,5 x 100 cm) equilibrada y eluida con ácido acético 0,5 M. Se corrió la columna con una velocidad de flujo de 25 ml/h con fracciones de 5 ml recolectadas dentro de tubos de polipropileno. Se ensayó la actividad inhibidora de agregación plaquetaria de las alícuotas de estas fracciones como se describió previamente. Se reunieron las fracciones activas (71-90) y se liofilizaron. El material seco se resuspendió en 2,0 ml de TFA al 0,5% y se cargó sobre una columna preparativa C-18 en fase reversa de Waters. Se eluyó la columna utilizando las condiciones descritas en el Ejemplo 3. Se recolectaron las fracciones en tubos de polipropileno, se concentraron en un concentrador Speed-Vac^{R} y se ensayó su actividad inhibidora de agregación plaquetaria. Las fracciones activas se liofilizaron individualmente. Se corrieron nuevamente varias fracciones de picos sobre la columna analítica C-18 como se describe en el Ejemplo 4. El perfil analítico por HPLC del péptido homogéneo se muestra en la Figura 24. El análisis de aminoácidos de este material revela que el péptido contiene 72 aminoácidos incluidos los 12 residuos de cisteína, como se muestra en la Tabla 3. La secuencia completa de aminoácidos de este péptido que ha sido llamado "cotiarina" se muestra en las Figuras 6 y 12.

El péptido purificado se probó en los ensayos del receptor descritos en el Ejemplo 1. Las determinaciones iniciales mostraron que las bajas concentraciones de cotiarina (1-4 nM) inhibieron selectivamente el enlazamiento de vitronectina al receptor de vitronectina mientras que las mismas concentraciones habían disminuido significativamente la actividad de inhibición en el enlazamiento de fibrinógeno al GP IIb-IIIa como se muestra en la Figura 25; sin embargo, experimentos posteriores fallaron en la verificación de este resultado.

Ejemplo 12 Purificación del PAI a partir de Crotalus viridis lutosus

A.: Un gramo de veneno de Crotalus viridis lutosus (Miami Serpentarium Labs, Lote # CL18SZ) fue disuelto en 8 ml de ácido acético 0,5 M y se aplicó a una columna fina de Sephadex^{R} G-50 (Pharmacia, 2,5 x 100 cm) que fue equilibrada y eluida con ácido acético 0,5 M. Se corrió la columna a una velocidad de flujo de 25 ml/h con fracciones de 5 ml recolectadas en tubos de polipropileno. Se ensayó la actividad inhibidora de agregación plaquetaria de las alícuotas de estas fracciones. Se reunieron las fracciones (71-100) y se liofilizaron. El material seco se resuspendió en 2,0 ml de TFA al 0,5%. El material insoluble se removió por centrifugación y se cargó sobre una columna preparativa C-18 en fase reversa de Waters y se eluyó utilizando las condiciones de elución por gradiente descritas en el Ejemplo 3. Se recolectaron las fracciones de la columna en tubos de polipropileno, se concentraron sobre un concentrador Speed-Vac^{R} y se analizó su actividad inhibidora de agregación plaquetaria. Las fracciones activas se liofilizaron en sus tubos individuales. Se corrieron nuevamente las fracciones con actividad de pico sobre la columna analítica C-18 de Waters utilizando el gradiente de acetonitrilo descrito en el Ejemplo 4. Se recolectaron las fracciones manualmente en tubos Eppendorf de 1,5 ml. Las fracciones homogéneas se reunieron y se liofilizaron. El HPLC analítico de este material mostró un pico asimétrico único. La secuencia completa de aminoácidos de este péptido que ha sido llamado "lutosin" se muestra en las Figuras 6 y 12.

B.: De forma similar a aquella expuesta en el párrafo A, los PAI de B. jararacussu, C. basilicus, C. durissus durissus, C. v. oreganus, C. h. horridus, C. v. helleri, C. durissus totonactus y de C. m. molossus, fueron aislados y purificados. Las composiciones de aminoácidos para varios de estos péptidos se muestran en la Tabla 3. Las secuencias de aminoácidos de los PAI de C. h. horridus, C. basilicus, C. m. molossus, C. v. oreganus, y C. d. durissus, designados como horridina, basilicina, molossina, oreganina, y durissina, respectivamente, se muestran en la Figura 6. Los datos de enlazamiento al receptor para los péptidos purificados de los Ejemplos 1-12, se muestran en la Figura 26.

En los Ejemplos 13-16 más abajo, los péptidos fueron sintetizados por medios de técnicas en fase sólida sobre un Sintetizador de Péptidos 431A de Applied Biosystems utilizando los aminoácidos t-Boc activados como ésteres activos HOBt de acuerdo con las instrucciones del fabricante, que se resumen como sigue, para la preparación de Boc-AA1........AA(n-1)-AA(n)-O-PAM-resina de poliestireno.

La mitad de los mmoles de la Boc-AA(n)-O-PAM-resina de poliestireno seleccionada, se trató de acuerdo con el siguiente programa para la incorporación del Boc-AA(n-1)-OH:

1) Desprotección con TFA: TFA al 30% en DCM, 3 min, TFA al 50% en DCM, 16 min.

2) Lavados y neutralizaciones: lavados con DCM (5X), 3 min, DIEA al 5% en DCM, 2 min, DIEA al 5% en NMP, 2 min. Lavado con NMP (6X), 5 min.

3) Acoplamiento: 4 equivalentes del éster Boc-AA-HOBt en NMP (preactivar 55 min), 38 min, DMSO para hacer 15% DMSO/85% NMP, 16 min, 3.8 equivalentes de DIEA, 5 min.

4) Lavado y muestra de resina: lavar con NMP , 3 min.

5) Bloqueo: anhídrido acético al 10%, DIEA al 5% en NMP, 8 min.

6) Lavados: lavados con DCM (6X) 4 min.

Ejemplo 13 Preparación del Análogo #1 [E^{28}L^{41}C^{64}]barbourina (28-73): E-C-A-D-G-L-C-C-D-Q-C-R-F-L-K-K-G-T-V-C-R-V-A-K-G-D-W-N-D-D-T-C-T-G-Q-S-C-D-C-P-R-N-G-L-Y-G

La mitad de los mmoles de la resina PAM-Gly (0,6 meq/g, Applied Biosystems, Foster City, CA) se sometió al Procedimiento A con los aminoácidos requeridos (introducidos en orden). Los aminoácidos protegidos con Boc tenía la siguiente cadena lateral de protección: Arg(Tos), Asp(OcHex), Cys(4-MeBzl), Glu(OcHex), Lys(Cl-Z), Thr(Obzl), Trp(CHO) y Tyr(Br-Z). Siguiendo con el ensamblaje de la cadena péptido-resina protegida completa, el grupo amino-terminal Boc fue removido con TFA, y se secó la resina hasta su forma de sal de TFA. La resina (1,3 g) fue sometida a protocolos de desprotección HF "bajo-alto" seguido por la remoción de HF "al vacío". La mezcla péptido-resina seca se transfirió a un embudo con frita (gruesa) con éter etílico y se lavó varias veces con lavados alternos de éter y cloroformo para remover la mayoría de los grupos orgánicos de protección y limpiadores usados en la desprotección.

La mezcla del péptido se transfirió a 2 L de ácido acético al 0,4%, y se ajustó el pH a 7,99 con NH_{4}OH concentrado. Se filtró la resina a partir de esta solución y se le permitió a ésta asentarse a 4ºC sin agitación durante 20 horas. Esto fue seguido por calentamiento de la solución hasta temperatura ambiente y almacenamiento durante 3 días nuevamente sin agitación. El material precipitado se removió por filtración y el pH del sobrenadante se ajustó a 0,3 con ácido acético y se liofilizó.

El material seco (66 mg) se disolvió nuevamente en 2,0 ml de ácido acético y se cargó sobre la columna preparativa C-18 de Waters equilibrada con acetonitrilo al 8% que contenía TFA al 0,1%. Se llevó a cabo un corrimiento con un gradiente desde acetonitrilo al 8% hasta el 20% en 10 min, seguido por un gradiente lento hasta acetonitrilo al 30% en 40 min. Se eluyó la columna a 18 ml/min y se recolectaron las fracciones (12 segundos) en tubos de polipropileno. Se concentraron las fracciones sobre un concentrados Speed-Vac hasta un volumen de 1,0 ml y se analizaron alícuotas de 10 \mul en el ensayo de agregación plaquetaria.

Las fracciones activas (29-32) fueron liofilizadas individualmente y analizadas sobre la columna analítica C-18 de HPLC con un gradiente de acetonitrilo entre 8-30%. Las fracciones 29 y 30 fueron reunidas y cargadas sobre la columna analítica en 1,0 ml de TFA al 0,5%. Se recolecto manualmente el pico principal y se lo liofilizó para producir 1,6 mg del péptido puro.

El análisis de los aminoácidos de este material confirmó la identidad del péptido. Los ensayos de este material por su habilidad para inhibir el enlazamiento de fibrinógeno al GP IIb-IIIa, y de vitronectina al VnR se muestran en las Figuras 26 y 27. Estos datos demuestran la alta afinidad de este análogo por el GP IIb-IIIa y la carencia relativa de afinidad por VnR en concentraciones hasta de 1 \muM.

Ejemplo 14 Preparación del Análogo #2. [K^{29}] eristicofina (4-51): E-E-P-C-A-T-G-P-C-C-R-R-C-K-F-K-R-A-G-K-V-C-R-V-A-K-G-D-W-N-N-D-Y-C-F-G-K-S-C-D-C-P-R-N-P-W-N-G

La mitad de los mmoles de la resina PAM-Gly (0,6 meq/g, Applied Biosystems, Foster City, CA) se sometió al Procedimiento A con los aminoácidos requeridos (introducidos en orden). Los aminoácidos protegidos con Boc tenía la siguiente cadena lateral de protección: Arg(Tos), Asp(OcHex), Cys(4-MeBzl), Glu(OcHex), Lys(Cl-Z), Ser(Obzl), Thr(Obzl), Trp(CHO) y Tyr(Br-Z). La escisión, replegamiento y purificación de este péptido fueron idénticas a las de los ejemplo anteriores. Los datos de enlazamiento al receptor para este análogo se muestran en las Figuras 26 y 28.

Ejemplo 15 Preparación del Análogo #3: G-C-G-K-G-D-W-P-C-A-NH_{2}

La mitad de los mmoles de la resina pMBHA (0,72 meq/g, Applied Biosystems, Foster City, CA) se sometió al Procedimiento A con los aminoácidos requeridos (introducidos en orden). Los aminoácidos protegidos con Boc tenían la siguiente cadena lateral de protección: Asp(OcHex), Cys(4-MeBzl), y Lys(Cl-Z). Después de completarse el ensamblaje de la péptido-resina protegido, el grupo amino-terminal Boc se removió con TFA y se secó la resina hasta su forma de sal de TFA. La resina (1,54 g) fue tratada con fluoruro de hidrógeno anhídro (HF) que contenía anisol al 10%, etil metil sulfuro al 2% por 30 min a -10ºC, y 30 minutos adicionales a 0ºC. El HF fue removido al vacío y la mezcla péptido/resina fue suspendida en éter dietílico seguido por un lavado alternado con cloroformo y éter 3X. Después de un lavado final con éter, se extrajo el péptido de la resina con ácido acético 2,0 M, se diluyó con agua destilada y se liofilizó.

El péptido crudo (370 mg) se disolvió en NH_{4}OAc desoxigenado 10 mM, pH 8, hasta 0,5 mg/ml, y se permitió la oxidación por medio de la oxidación gota a gota de un ligero exceso de solución de ferrocianuro de potasio 0,01 M (K_{3}Fe(CN)_{6}), se agitó por otros 20 min, y se ajustó el pH a 5 con ácido acético. La solución del péptido fue tratada con una resina de intercambio aniónico DOWEX^{R} AG3x4 durante 15 min con agitación y se filtró la resina, se diluyó con H_{2}O y se liofilizó para producir el péptido crudo ciclizado. El péptido crudo ciclizado (392 mg) se purificó por medio de desalinización sobre Sephadex^{R} G-25F usando ácido acético 0,5 M como eluyente, seguido por cromatografía de intercambio iónico sobre CM-Sepharose^{R} (Pharmacia) usando un gradiente de elución generado por la adición de NH_{4}OAc 100 mM a una solución de NH_{4}OAc 10 mM, pH 4,5. Las fracciones que tenían una pureza mínima del 90% por medio del análisis con HPLC, se reunieron y liofilizaron a partir de H_{2}O varias veces para producir 175 mg. La purificación final consistió de una purificación con HPLC preparativa sobre una columna C-18 en fase reversa de Waters con un gradiente de acetonitrilo/agua/TFA para producir el péptido purificado. Los datos de enlazamiento al receptor para este análogo se muestran en las Figuras 26, 29B y 30.

Ejemplo 16 Preparación de Análogos Adicionales

Se sintetizaron los siguientes análogos; en la mayoría de los casos en forma similar a aquella expuesta en el Ejemplo 15. Sin embargo, el análogo 60, mostrado más abajo, fue preparado en solución a través de la guanidación de la cadena lateral del residuo de lisina del análogo #19 utilizando el procedimiento de Bajusz, S., y colaboradores, FEBS Letts. (1980) 110: 85-87.

Un miligramo del análogo # 19 reaccionó con 1 mg del nitrato 1-amidino-3,5-dimetilpirazol (Aldrich) en 1 ml de etanol absoluto en presencia de diisopropiletilamina (DIEA) a temperatura ambiente durante 4 días. El producto del análogo 60 fue purificado a partir de un exceso de reactivo y de materiales de partida por medio de HPLC en fase reversa sobre una columna C-18, usando un gradiente de acetonitrilo en ácido trifluoroacético al 0,1%. Novecientos \mug de este material fueron aislados en forma pura.

#4 G-C-K-G-D-W-P-C-A-NH2

#5 C-G-K-G-D-W-P-C-NH_{2}

#6 G-C-G-K-G-D-W-C-A- NH_{2}

#7 G-C-K-G-D-W-C-A- NH_{2}

#8 Acetil-C-K-G-D-C- NH_{2}

#9 Mpr-K-G-D-Pen- NH_{2}

#10 C-K-G-D-W-P-C- NH_{2}

#11 Acetil-C-R-G-D-Pen- NH_{2}

#12 C-K-G-D-Y-P-C- NH_{2}

#13 C-K-G-D-F-P-C- NH_{2}

#19 Mpr-K-G-D-W-P-C- NH_{2}

#34 C-K-G-D-W-G-C- NH_{2}

#35 C-K-G-E-W-P-C- NH_{2}

#36 C-Orn-G-D-W-P-C- NH_{2}

#37: C-K-A-D-W-P-C- NH_{2}

#38: C-K-A\dagger-D-W-P-C- NH_{2}

#39: C-K-G-D-W-(Sar)-C- NH_{2}

#40: C-K(Formil)-G-D-W-P-C- NH_{2}

#41: C-K-G-D-I-P-C- NH_{2}

#42: C-K-G-D-(4-Cl-Fenil)-P- NH_{2}

#43: C-K-(Sar)-D-W-P-C- NH_{2}

#44: C-K-G-D-(4-NO2-Fenil)-P-C- NH_{2}

#45: C-K-G-D-(NMeFenil)-P-C- NH_{2}

#46: C-H-G-D-W-P-C- NH_{2}

#47: Acetyl-C-K-G-D-W-P-C- NH_{2}

#48: Mpr-K-G-D-W(Formil)-P-C- NH_{2}

#49: Mvl-K-G-D-W-P-C- NH_{2}

#50: Mpr-K-G-D-W\dagger-P-Pen- NH_{2}

#51: Mpr-K-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

#52: Mpr-K-G-D-W-P-Pen\dagger- NH_{2}

#53: Mpr-K-G-D-W-P\dagger-Pen- NH_{2}

#54: Mpr-K-G-D\dagger-W-P-Pen- NH_{2}

#55: Mpr-K-G-D-W-(Thz)-C- NH_{2}

#56: Mpr-K-G-D-H(2,4-DNP)-P-C- NH_{2}

#57: Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-Pen- NH_{2}

#58: Mvl-K-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

#59: Mpr-K-G-D-W-(Pip)-Pen- NH_{2}

#60: Mpr-(Har)-G-D-W-P-C- NH_{2}

#61: Mpr-K-G-D-W-P-C\dagger- NH_{2}

#62: Mpr-(D-Lys)-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

#63: Mpr-(Har)-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

#64: Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-P-C- NH_{2}

#65: Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

#66: Mpr-(NG,NG'-etilen-Har)-G-D-W-P-C- NH_{2}

#67: Mpr-(NG,NG'-etilene-Har)-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

#68: Mpr-Har-Sar-D-W-P-C- NH_{2}

#69: Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

#70: Mpr-(Fenilimidil-Lys)-G-D-W-P-C- NH_{2}

#71: Mpr-Har-Sar-D-W-P-Pen NH_{2}

#72: Mpr-(Fenilimidil-Lys)-G-D-W-P-Pen NH_{2}

#73: Mpr-Har-G-D-W-(3,4-deshidro P)-C- NH_{2}

Ejemplo 17 Actividad PAI de los Péptidos

Cuando se analizó en los ensayos estándar de inhibición de agregación descritos antes, los análogos #3-5 tenían valores de IC_{50} de 5 \muM por la capacidad para inhibir la agregación plaquetaria humana inducida por ADP. Sin embargo, el análogo #6 tiene un IC_{50} de más de 200 \muM, y el análogo #7, de 100 \muM. Los valores IC_{50} para los análogos de la invención en este ensayo son como sigue:

\newpage

Análogo	Secuencia	Aprox. IC_{50}(\muM)
#3	G-C-G-K-G-D-W-P-C-A- NH_{2}	5
#4	G-C-K-G-D-W-P-C-A- NH_{2}	5
#5	C-G-K-G-D-W-P-C- NH_{2}	5
#6	G-C-G-K-G-D-W-C-A- NH_{2}	>200
#7	G-C-K-G-D-W-C-A- NH_{2}	100
#8	Acetil-C-K-G-D-C- NH_{2}	200
#9	Mpr-K-G-D-Pen- NH_{2}	25
#10	C-K-G-D-W-P-C- NH_{2}	5
#11	Acetil-C-R-G-D-Pen- NH_{2}	5
#12	C-K-G-D-Y-P-C- NH_{2}	12
#13	C-K-G-D-F-P-C- NH_{2}	20
#19	Mpr-K-G-D-W-P-C- NH_{2}	1
#34	C-K-G-D-W-G-C- NH_{2}	100
#35	C-K-G-E-W-P-C- NH_{2}	>300
#36	C-Orn-G-D-W-P-C- NH_{2}	150-200
#37	C-K-A-D-W-P-C- NH_{2}	100
#38	C-K-A\dagger-D-W-P-C- NH_{2}	>200
#39	C-K-G-D-W-(Sar)-C- NH_{2}	5
#40	C-K(Formil)-G-D-W-P-C- NH_{2}	>200
#41	C-K-G-D-I-P-C- NH_{2}	100
#42	C-K-G-D-(4-Cl-Fenil)-P- NH_{2}	20
#43	C-K-(Sar)-D-W-P-C- NH_{2}	50
#44	C-K-G-D-(4-NO2-Fenil)-P-C- NH_{2}	75
#45	C-K-G-D-(NMeFenil)-P-C- NH_{2}	>200
#46	C-H-G-D-W-P-C- NH_{2}	200
#47	Acetyl-C-K-G-D-W-P-C- NH_{2}	2.5
#48	Mpr-K-G-D-W(Formil)-P-C- NH_{2}	1
#49	Mvl-K-G-D-W-P-C- NH_{2}	1.5
#50	Mpr-K-G-D-W\dagger-P-Pen- NH_{2}	>200
#51	Mpr-K-G-D-W-P-Pen- NH_{2}	0.75
#52	Mpr-K-G-D-W-P-Pen\dagger- NH_{2}	5
#53	Mpr-K-G-D-W-P\dagger- Pen- NH_{2}	>200
#54	Mpr-K-G-D\dagger-W-P-Pen- NH_{2}	>100
#55	Mpr-K-G-D-W-(Thz)-C- NH_{2}	2
#56	Mpr-K-G-D-H(2,4-DNP)-P-C- NH_{2}	5
#57	Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-Pen- NH_{2}	1
#58	Mvl-K-G-D-W-P-Pen- NH_{2}	1
#59	Mpr-K-G-D-W-(Pip)-Pen- NH_{2}	1
#60	Mpr-(Har)-G-D-W-P-C- NH_{2}	0.15
#61	Mpr-K-G-D-W-P-C\dagger- NH_{2}	15
#62	Mpr-K\dagger-G-D-W-P-Pen- NH_{2}	2.5
#63	Mpr-(Har)-G-D-W-P-Pen- NH_{2}	0.10
#64	Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-P-C- NH_{2}	0.25
#68	Mpr-Har-Sar-D-W-p-C- NH_{2}	3.0
#69	Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-P-Pen- NH_{2}	0.5
#70	Mpr-(Fenilimidil-Lys)-G-D-W-P-C- NH_{2}	0.5
#71:	Mpr-Har-Sar-D-W-P-Pen NH_{2}	2.5
#72:	Mpr-(Fenilimidil-Lys)-G-D-W-P-Pen	0.5
#54	NH_{2}Mpr-K-G-D\dagger-W-P-Pen- NH_{2}	>100
#55	Mpr-K-G-D-W-(Thz)-C- NH_{2}	2
#56	Mpr-K-G-D-H(2,4-DNP)-P-C- NH_{2}	5
#57	Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-Pen- NH_{2}	1
#58	Mvl-K-G-D-W-P-Pen- NH_{2}	1
#59	Mpr-K-G-D-W-(Pip)-Pen- NH_{2}	1

(Continuación)

Análogo	Secuencia	Aprox. IC_{50}(\muM)
#60	Mpr-(Har)-G-D-W-P-C- NH_{2}	0.15
#61	Mpr-K-G-D-W-P-C\dagger- NH_{2}	15
#62	Mpr-K\dagger-G-D-W-P-Pen- NH_{2}	2.5
#63	Mpr-(Har)-G-D-W-P-Pen- NH_{2}	0.10
#64	Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-P-C- NH_{2}	0.25
#68	Mpr-Har-Sar-D-W-p-C- NH_{2}	3.0
#69	Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-P-Pen- NH_{2}	0.5
#70	Mpr-(Fenilimidil-Lys)-G-D-W-P-C- NH_{2}	0.5
#71:	Mpr-Har-Sar-D-W-P-Pen NH_{2}	2.5
#72:	Mpr-(Fenilimidil-Lys)-G-D-W-P-Pen NH_{2}	0.5

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 18 Actividad de los Péptidos Lineales versus los péptidos Cíclicos

Cuando se analizó la inhibición del enlazamiento del fibrinógeno al GP IIb-IIIa en el ensayo en placa, el RGDW-NH_{2} lineal fue muy similar en actividad al GCGRGDWPCA-NH_{2} cíclico (Figura 29A). En contraste, el KGDW-NH_{2} lineal fue mucho menos potente que el GCGKGDWPCA-NH_{2} cíclico (Figura 29B). Para los compuestos KGDW, pero no para los compuestos RGDW, la ciclización resultó en un marcado incremento en la capacidad del péptido para inhibir el enlazamiento del fibrinógeno al GP IIb-IIIa.

Ejemplo 19 Resultados de los Ensayos de Enlazamiento en Placa para los Péptidos Sintéticos

Los péptidos sintetizados en el Ejemplo 17, además de ser evaluados por su capacidad para inhibir directamente la agregación plaquetaria, fueron analizados también en los ensayos en placa de la invención como se describió antes. Los resultados para los análogos 4 a 8 se muestran en la Figuras 30C, 30D, 30E, 30A, y 30B, respectivamente. Como se indica en la figura, estos análogos son capaces diferencialmente de variar los grados de inhibición del enlazamiento de fibrinógeno al GP IIb-IIIa, en comparación con la fibronectina al receptor de fibronectina. El análogo #4 parece, entre este grupo tener el diferencial más alto. Los análogos #7 y #5, por otro lado, son también muy específicos y tienen actividades de inhibición de agregación plaquetaria excelentes.

Ejemplo 20 Efectos de los Péptidos Purificados sobre la Adhesión Celular

Las células del melanoma M21 fueron marcadas con ^{35}S-metionina, y luego añadidas a las placas recubiertas con vitronectina en presencia de las concentraciones indicadas de los péptidos purificados de veneno de serpiente. La unión de las células fue medida por medio de la solubilización de las células restantes después de incubación y lavado, como se describe en la Sección C, en la página 40. Como se muestra en la Figura 31, ni la barbourina ni el Péptido 1 (barbourina truncada) tuvieron un efecto significativo sobre la adhesión celular a la vitronectina, aunque ambas son potentes inhibidores de agregación plaquetaria como se muestra en los Ejemplo 2 y 3. En contraste, la cotiarina, que es un inhibidor potente del enlazamiento de vitronectina al receptor de vitronectina, fue muy potente en inhibir la unión de las células a la vitronectina. En un experimento similar el Péptido #3, el Péptido #3 con K reemplazado por R (GCGRGDWPCA-NH_{2}) y RGDS, fueron examinados sobre las células M21 unidas a la vitronectina. Como se muestra en la Figura 32 RGDS y GCGRGDWPCA-NH_{2} son potentes inhibidores de la unión de las células mientras que GCGKGDWPCA-NH_{2} fue inefectivo hasta 60 \muM.

Ejemplo 21 Comparación de los Análogos 60 y 19

Los análogos 60 y 19 descritos más arriba, son péptidos de la invención que contiene la secuencia K*GDX y son idénticos excepto por la modalidad de K*. El análogo 60 es de fórmula

\vskip1.000000\baselineskip

Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH_{2};

\newpage

El análogo 19 de fórmula:

\vskip1.000000\baselineskip

Mpr-K-G-D-W-P-C-NH_{2}

Estos análogos fueron analizados por medio de ensayos estándar de inhibición de agregación plaquetaria y utilizando los ensayos de adhesión celular del Ejemplo 20 más arriba. Los resultados se muestran en la Figuras 33 y 34.Como se muestra en la Figura 33, el análogo #60 es eficiente en concentraciones pequeñas que se desvanecen, en la inhibición de la agregación plaquetaria, y es relativamente menos efectivo en la prevención de la adhesión celular a la vitronectina. La Figura 34 muestra que el análogo #19 tiene actividad de inhibición de agregación plaquetaria así como especificidad; sin embargo, es menos activo en el ensayo de inhibición de agregación plaquetaria que su contraparte, el análogo #60. El análogo #60 tiene un IC_{50} en agregación plaquetaria de aproximadamente 0,15 \muM; el análogo #19 tiene un IC_{50} de aproximadamente 1 \muM.

Ejemplo 22 Modelo de Folt de Trombosis en Arteria Coronaria Canina

A.: Iniciación de las reducciones de flujo cíclico (CFR) en el pecho abierto de un perro. Se llevó a cabo la colocación de un oclusor sobre la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) de un perro de 20 kg, como se describió previamente. El flujo fásico y medio de sangre como se lo midió por medio de una sonda de flujo electromagnética (EM), y una sonda de flujo Doppler, se muestran en la Figura 35.

B.: Efecto del GCGKGDWPCA-NH_{2} Cíclico (Análogo #3) sobre los CFR en el pecho abierto de un perro. Se hizo la infusión de una dosis de 10 mg de este péptido dentro de una vena periférica del perro. En la Figura 36 se muestran los patrones de flujo de la sangre en la LAD, como se describió antes. Nótese la ablación parcial de los CFR, como se observa en la pendiente de creciente de las reducciones de flujo. Obsérvese también que el flujo no se reduce hasta el mismo lado como en el control (A).

C.: Se hizo una segunda infusión de 40 mg del Análogo #3 dentro de una vena periférica. Como se muestra en la Figura 37, la ablación completa de los CFR indica que se ha reestablecido completamente el flujo en la LAD.

Ejemplo 23 Construcción de los Vectores de Expresión para Péptidos de Barbourina

Un gen que codifica la longitud completa [L^{41}] del péptido barbourina (1-73) fue ensamblado a partir de oligonucleótidos sintéticos como se muestra en la Figura 38, que fueron fosforilados por tratamiento con quinasa, acoplados y ligados dentro de M13mp18 digerido con EcoRI-HindIII utilizando procedimientos estándar. La secuencia de señal del gen bacterial de fosfatasa alcalina (phoA) (Watson, M.E.E., Nucleic Acids Research (1984) 12: 5145) fue añadida a la construcción de barbourina por medio de la ligación de los oligonucleótidos sintéticos dentro de los sitios EcoRI-Ncol de la construcción de [L^{41}]barbourina (1-73) como se muestra en la Figura 39. Las secuencias de nucleotidos de todas las construcciones fueron verificadas por medio del método de terminación de cadena dideoxi de Sanger.

Una versión truncada de este péptido fue construida también a partir de nucleotidos sintéticos de codificarían solamente los aminoácidos 28-73 de la molécula completa. Se introdujeron dos alteraciones, Q^{28} a E^{28} y A^{64} a C^{64} utilizando mutagénesis dirigida al sitio como lo describen Kunkel y colaboradores, Meth. Enzymol. (1987) 154: 367. Se añadió la secuencia de señal phoA a la versión truncada como se describió antes (Figura 40). Además, se añadió la secuencia de señal para la enterotoxina II estable al calor de E. coli (Picken, R.W., y colaboradores, Infect. Immun. (1983) 42: 269) a la versión truncada utilizando oligonucleótidos sintéticos con extremos compatibles EcoRI y Ncol. Todas las construcciones de secreción bacterial fueron subclonadas dentro del vector de expresión bacterial pPROK-1 (Broslus, J., Gene (1984) 27: 151, ibid: 161), disponible comercialmente con CLONTECH Lab, Inc, utilizando endonucleasas de restricción EcoRI y HindIII.

Se preparó un gen que codifica repeticiones en tándem del péptido de título deseado, utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para producir la unidad de multimerización a partir del péptido de barbourina completo 1-73 que contiene L41 y C64.

Las Figura 41A y 41B muestran a los oligonucleótidos utilizados para la síntesis por PCR. La reacción PCR fue realizada de acuerdo al método de Sariki, R.K., y colaboradores, Science (1988) 239: 487. La unión del polímero resultante contiene metioninas en cada uno de los extremos de la secuencia como se muestra en la Figura 42, y proporciona sitios de restricción deseables para la construcción.

Las repeticiones en tándem se forman a partir de los componentes individuales que forman el multímero, por medio, por ejemplo, de ligación de un fragmento EcoRI/BamHI al fragmento BgIII/HindIII en un vector M13mp18 cortado con EcoRI/HindIII para formar un dímero. El dímero resultante es extirpado con EcoRI y BamHI, y ligado nuevamente al fragmento BgIII/HindIII para producir un trímero, y continuar así hasta obtener el tamaño deseado. Esta construcción se encuentra diagramada en las Figuras 43A y 43B.

El multímero fue ligado entonces dentro del vector pKK233-2 de E. coli, Amann, E., y colaboradores, Gene (1985) 40: 183, disponible con Clontech, por digestión del vector con Ncol/HindIII y ligación de un subfragmento monómero de Ncol/BamHI y subfragmentos multímeros de BgIII/HindIII.

Para la expresión como una proteína de fusión el vector anteriormente digerido fue utilizado junto con un subfragmento Ncol-EcoRI que contenía una porción amino-terminal ligeramente modificada (aminoácidos 1 a 72) del gen de cloramfenicol acetiltransferasa (Chang, C.N. y colaboradores, Gene (1987) 55: 189) y subfragmentos EcoRI-HindIII de las construcciones multímeras.

Ejemplo 24 Expresión de Genes Recombinantes

La expresión de proteína a partir de todos los plásmidos recombinantes descritos anteriormente se induce de acuerdo con Kanamari y colaboradores, Gene (1988) 66: 295 después de transfección dentro de las cepas apropiadas del huésped E. coli. Los productos se caracterizan por medio de electroforesis sobre gel de poliacrilamida sodio dodecil sulfato, y por medio de su capacidad para inhibir la agregación plaquetaria inducida por ADP en plasma rico en plaquetas. Después de la purificación las proteínas multiméricas se concierten a unidades monoméricas por escisión con bromuro de cianógeno y se ensayan los productos como anteriormente.

Claims

1. Un polipéptido inhibidores de agregación plaquetaria capaz de inhibir el enlazamiento de Fg o vWF al GP IIb-IIIa más que el enlazamiento de vitronectina al receptor de vitronectina o de fibronectina al receptor de fibronectina, en donde, o el porcentaje de inhibición es al menos dos veces mayor para la inhibición de enlazamiento de fibrinógeno (Fg) o del Factor de von Willebrand (vWF) al GP IIb-IIIa, que para la inhibición de enlazamiento de vitronectina al receptor de vitronectina o de fibronectina al receptor de fibronectina a una concentración dada de PAI, o la concentración de PAI que causa 50% de inhibición, es al menos dos veces menor para la inhibición de enlazamiento de Fg o vWF/GP IIb-IIIa que para la inhibición de enlazamiento de vitronectina al receptor de vitronectina o de fibronectina al receptor de fibronectina, dicho inhibidor de agregación plaquetaria tiene la fórmula general

11

en donde K* es un grupo lisilo de fórmula general

12

R^{2}-C=NR^{3} es un grupo seleccionado de:

13

14

en donde uno o dos de los grupos metileno pueden ser reemplazados por NR, S o O y en donde cualquier nitrógeno del anillo pude ser opcionalmente sustituido por un sustituyente que no interfiera, y R es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo, y n3 es cero o 1;

en donde uno o más de los enlazamientos de péptidos pueden opcionalmente ser reemplazados por una fracción de enlazamiento alternativa seleccionada de -CH_{2}NH-, -CH_{2}S-, -CH_{2}CH_{2}-, -CH=CH- (cis o trans), -COCH_{2}-, -CH(OH)CH_{2}- O -CH_{2}SO-; con la condición de que si n3 es 0; o:

1): la suma de n2 y n4 debe ser al menos 2; o

2): K* debe ser diferente de Har (homoarginina) o K (lisina); o

2. El polipéptido inhibidores de agregación plaquetaria de la Reivindicación 1 donde Y_{1} es un átomo de hidrógeno, un grupo acilo o un residuo de péptido o derivados del mismo o esta ausente y Y_{2} es OH, NH_{2}, o un residuo de péptido o derivados del mismo o está ausente.

3. El polipéptido inhibidores de agregación plaquetaria de la Reivindicación 2 donde Y_{2} es -NH_{2}-, -A-NH_{2} o está ausente.

4. El polipéptido inhibidores de agregación plaquetaria de la Reivindicación 2 donde Y_{1} es un átomo de hidrógeno, un grupo acetilo, glicina (G) o está ausente.

5. El polipéptido inhibidores de agregación plaquetaria de la Reivindicación 1 donde X_{1} y X_{2} son grupos cisteína (C), mercaptopropionilo (Mpr) o penicilamina (Pen).

6. El polipéptido inhibidores de agregación plaquetaria de la Reivindicación 1 donde AA_{1} es glicina (G) y n_{1} es 0 ó 1.

7. El polipéptido inhibidores de agregación plaquetaria de la Reivindicación 1 donde AA_{2} se selecciona de triptófano (W), fenilalanina (F), leucina (L), tirosina (Y), o valina (V).

8. El polipéptido inhibidores de agregación plaquetaria de la Reivindicación 7 donde AA_{2} es triptófano (W).

9. El polipéptido inhibidores de agregación plaquetaria de la Reivindicación 1 donde K* es lisina (K), homoarginina (Har), acetimidil-Lys o fenilimidil-Lys.

10. Un polipéptido de agregación plaquetaria que es seleccionada de

PAI 1: -C-A-D-G-L-C-C.D.Q.C.R-F-L-K-K-G-T-V-C-R-V-A-KG-

D-W-N-D-D-T-C-T-G-0-S-C-D-C-P-R-N-G-L-Y-G

PAI 2: E-E-P-C-A-TG-P-C-C-R-Ft-C-K-F-K-R-A-<3-K-V-C-R-VA-

K-G-D-W-N-N-D-Y C-T-G-K-S-C-D-C-P-R-N-P-W-N-G

PAI 3: G-C-G-K-G-D-W-P-C-A-NH_{2};

PAI 4: G-C-K-G-D-W-P.C-A- NH_{2}

PAI 5: C-G-K-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 7: C-K-G-D-W-C-A- NH_{2}

PAI 10: C-K-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 12: C-K-G-D-Y-P-C- NH_{2}

PAI 13: C-K-G-D-F-P-C- NH_{2}

PAI 14: C-K-C-D-L-P-C- NH_{2}

PAI 15: C-K-G-D-V-P-C- NH_{2}

PAI 16: C-K-G-D-Y(Ome)-P-C- NH_{2}

PAI 17: C-K-G-D-(2-Nal)-P-C- NH_{2}

PAI 18: C-K-G-D-(Cha)-P-C- NH_{2}

PAI 19: Mpr-K-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 20: Mpr-K-G-D-Y-P-C- NH_{2}

PAI 21: Mpr-K-G-D-F-P-C- NH_{2}

PAI 22: Mpr-K-G-D-L-P-C- NH_{2}

PAI 23: Mpr-K-G-D-V-P-C- NH_{2}

PAI 24: Mpr-K-G-D-Y(OMe)-P-C- NH_{2}

PAI 25: Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-C- NH_{2}

PAI 26: Mpr-K-G-D-(Cha)-P-C- NH_{2}

PAI 27: ciclo(G-K-G-D-W-P)

PAI 28: ciclo(A-K-G-D-W-P)

PAI 29: ciclo(A\dagger-K-G-D-W-P)

PAI 30: ciclo(F-K-G-D-W-P)

PAI 31: ciclo(beta-Ala-K-G-D-W-P)

PAI 32: ciclo(gama-Abu-K-G-D-W-P)

PAI 33: ciclo(R-K-G-D-W-P)

PAI 34: C-K-G-D-W-G-C- NH_{2}

PAI 39: C-K-G-D-W-(Sar)-C- NH_{2}

PAI 41: C-K-G-D-I-P-C- NH_{2}

PAI 42: C-K-G-D-(4-Cl-Fenil)-P- NH_{2}

PAI 43: C-K-(Sar)-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 44: C-K-G-D-(4-NO2-Fenil)-P-C- NH_{2}

PAI 47: Acetil-C-K-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 48: Mpr-K-G-D-W(Formil)-P-C- NH_{2}

PAI 49: Mil-K-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 51: Mpr-K-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

PAI 52: Mpr-K-G-D-W-P-Pen\dagger- NH_{2}

PAI 54: Mpr-K-G-D\dagger-W-P-Pen- NH_{2}

PAI 55: Mpr-K-G-D-W-(Thz)-C- NH_{2}

PAI 57: Mpr-K-G-D-(2-Nal)-P-Pen- NH_{2}

PAI 58: Mil-K-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

PAI 59: Mpr-K-G-D-W-(Pip)-Pen- NH_{2}

PAI 60: Mpr-(Har)-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 61: Mpr-K-G-D-W-P-C\dagger- NH_{2}

PAI 62: Mpr-K\dagger-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

PAI 63: Mpr-(Har)-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

PAI 64: Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 65: Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

PAI 66: Mpr (NG, NG'-etilen-Har)-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 67: Mpr (NG, NG'-etilen-Har)-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

PAI 68: Mpr-Har-Sar-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 69: Mpr-(Acetimidil-Lys)-G-D-W-P-Pen- NH_{2}

PAI 70: Mpr-(Fenilimidil-Lys)-G-D-W-P-C- NH_{2}

PAI 71: Mpr-Har-Sar-D-W-P-Pen NH_{2}

PAI 72: Mpr-(Fenilimidil -Lys)-G-D-W-P-Pen NH_{2}

PAI 73: Mpr-Har-G-D-W-(3,4-dehidro-Pro)-C- NH_{2} o

PAI 75: Mpr-(Fenilimidil -Lys)-G-D-Pen- NH_{2}.

11. El polipéptido de la Reivindicación 1, en donde dicho polipéptido contiene menos de 10 aminoácidos.

12. Una composición farmacéutica que compromete un polipéptido inhibidor de agregación plaquetaria de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 11.

13. El uso de un polipéptido inhibidor de agregación plaquetaria de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 11 para la fabricación de un medicamento adecuado para inhibir la agregación plaquetaria y el tratamiento o prevención de los desordenes isquémicos asociados con las plaquetas.