CS225117B2 - The purification of insulin - Google Patents
The purification of insulin Download PDFInfo
- Publication number
- CS225117B2 CS225117B2 CS695548A CS554869A CS225117B2 CS 225117 B2 CS225117 B2 CS 225117B2 CS 695548 A CS695548 A CS 695548A CS 554869 A CS554869 A CS 554869A CS 225117 B2 CS225117 B2 CS 225117B2
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- insulin
- antibodies
- column
- collecting
- substance
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Jestliže se ze surového nebo komerčního vepřového nebo hovězího inzulínu odstraní pankreatické bílkoviny o molekulové hmotnosti vyšší než 6 000 a inzulínu podobné látky o přibližně stejné molekulové hmotnosti, jakou má inzulín, vyvolává takto získaný výsledný inzulín podstatně sníženou nebo vůbec nevyvolává tvorbu protilátek proti insulinu po jeho injekčním podání. Uvedené bílkoviny se odstraňují gelovou filtrací, přičemž se jímá frakce eluátu odpovídající střední hlavní části inzulínového maxima. Sloupcovou chromatografií na iontoměniči se odstraňují inzulínu podobné látky o přibližně stejné molekulové hmotnosti, jakou má inzillín, 2a jímání té frakce eluátu, která odpovídá střední hlavní Části inzulínového maxima. Inzulín se pak izoluje. Výhodně se provádí nejprve gelová filtnace a poté sloupcová chromatografie na iontoměniči.When pancreatic proteins of molecular weight greater than 6,000 and insulin-like substances of approximately the same molecular weight as insulin are removed from crude or commercial pig or bovine insulin, the resulting insulin thus produced results in substantially reduced or no formation of anti-insulin antibodies after insulin. injection. Said proteins are removed by gel filtration, collecting the eluate fraction corresponding to the central major portion of the insulin peak. Column chromatography on an ion exchanger removes insulin-like substances of approximately the same molecular weight as insulin, and collecting the fraction of the eluate that corresponds to the central major part of the insulin maximum. The insulin is then isolated. Preferably, first gel filtration and then column chromatography on the ion exchanger are carried out.
Vynález se týká způsobu jiátání inzulínu za účelem .vyloučení nebo snížení tvorby inzulínových protilátek po jeho injikování.The present invention relates to a method of taking insulin to eliminate or reduce the production of insulin antibodies upon injection.
Původně panoval názor, že vhodně překrystalovaoý inzulín ve formě ostrohraoných rhomboedrů spojených rovnými krystalovými plochami představuje čistou bílkovinu, inzulín, jehož konfigurace byla staAovena Sangerem a sppO., viz například Biochemical Journal 60 (1955), 556. Později však bylo shledáno, že tomu tak není. Vědecké analytické zkoumání UtázaXo, že krystalický inzulín obsahuje bílkoviny palnireatlckého původu s molekulovou hmoonnotí vyěší než u čistého inzulínu (asi 6 000) a mimoto inzulínu příbuzné lát^ky asi téže motekulové hmoonnosi jako u čistého inzulínu.Initially, it was believed that appropriately recrystallized insulin in the form of acute rhombohedrons linked by flat crystal surfaces is a pure protein, an insulin whose configuration was determined by Sanger et al., See, for example, Biochemical Journal 60 (1955), 556. However, it was later found to be so. it is not. Scientific Analytical Investigation of Crystalline Insulin Contains Protein of Protein Origin with Molecular Molarity Resembles Pure Insulin (about 6,000) and, moreover, insulin-related substances of about the same motecular hormone as pure insulin.
Tak bylo dokázáno, že krystalický inzulín rozpuštěný v . 1 M kyselině octové lze frakciooovat ve složky (a), (b) a popřípadě (c) gelovou filtrací ne koloně Sephadexu 0-50, což je dextran zesítěoý epichlorhydrOneo s limitem penetrace asi 10 000 (iiniiiání molekulová hmotnost vylučované látky), který je ve formě zrn (o průměru. 20 až 80 mikronů ů.Thus, it has been shown that crystalline insulin dissolved in. 1 M acetic acid can be fractionated in components (a), (b) and optionally (c) by gel filtration on a Sephadex 0-50 column, which is dextran crosslinked epichlorohydrin with a penetration limit of about 10,000 (different molecular weight of the excreted substance) which is in the form of grains (diameter 20 to 80 microns).
Tyto tři složky lze . izolovat z jejich roztoků obvyklými způsoby, například vysolením, vysrážením zinečnatou soží při neutrální reakci, lyoOilizecí atd. Jak složka (a) tak i složka . (b) obsahují bílkoviny pankreatického původu s molekulovou hmoonnosi nad 6 000.These three components can. isolated from their solutions by conventional means, for example by salting out, precipitating with zinc skin in a neutral reaction, lyophilizing, etc. Both component (a) and component. (b) contain proteins of pancreatic origin with a molecular weight greater than 6 000.
ΜιοΟ^νί složky (a) může činit 2 až 5 % hmot, krystatováného inzulínu a méně než 1 % hmot, překrystatověrného inzulínu. Mioossví složky (b) může být v obou případech 4 až 8 % hmot.The component (a) may comprise 2 to 5% by weight of the crystallized insulin and less than 1% by weight of the crystalline insulin. The moiety component (b) may in both cases be 4 to 8% by weight.
Složka (c) obsahuje hlavní frakci, která je pokládána za čistý inzulín a některé veddejší frakce látek příbuzných inzulínu, například ěe.8amiděOnoutíny a inzulínu příbuznou látku obsshhujcí více argininu než je oožssví přítomné v ootekule inzulínu a nazývá se tudíž argininový inzulín.Component (c) contains the main fraction, which is considered pure insulin, and some by-products of insulin-related substances, such as amides of oceans and insulin-related substances containing more arginine than the skin present in the insulin lens and is therefore called arginine insulin.
Frakce iooožěetmiděinoutíou ve složce (c) je variabilní a závisí oa původu inzulínu. Je to obvykle 3 až 10 % hmot, složky (x). Argioinový inzulín může představovat 2 až 3 % hmot, složky (c).The fraction of 10 minutes in component (c) is variable and depends on the origin of the insulin. It is usually 3 to 10% by weight of component (x). The argioin insulin may comprise 2 to 3% by weight of component (c).
Ačkotiv bylo shledáno, že krystalický inzulín obsahoval různé uvedené nečistoty, nebyla zkoušena výroba inzulínu izolovaného z pajOkeatických Žláz, které by byl prostý všech ne- > čistot nebo taoěř všech nečistot; nález. oečtatot, jejich vědecká ^akMonaice a taenti^kace většiny z nich, nejedly k pokusům o změnu složení inzulínu prt potMií v terapii cukrovky.Although it was found that the crystalline insulin contained the various impurities listed, the production of insulin isolated from pajoceatic glands free from all impurities or nearly all impurities was not tested; finding. oečtatot, refrigerati H at Hellenic d ^ ^ taenti akMonaice and cations of most of them, inedible to attempts to change the composition PRT potMií insulin therapy in diabetes.
Důvody prt nedbání přítomnooU nečistot v používaném inzulínu a důvody pro neměnění složení injekčních inzulOnových preparátů jsou pochhtptelné, když se uváží, jaké byly klinické znalossi před koncipováním tohoto vynálezu.The reasons for neglecting the presence of impurities in the insulin used and the reasons for not altering the composition of the injectable insulin preparations are obvious, considering the clinical knowledge prior to conceiving the present invention.
Přeectlivělost (alergie) proti dostupným inzulOtov^m preparátům prakticky zcela zmizela po obecném používáni.krystatovaného nebo překrystatoveného inzulínu. Jinak existovalo a stále ještě existuje mnoho vedlejších účinků způsobených tím, že v séru diabetických pacientů po léčbě' po dobu někotika měsíců bylo nalezeno, že obsahuje imuooglObuiioy, které se slučuj in vitro i in vivo s inzulOneo, což znamená, že inzulOnové preparáty vyvoOávaaí tvorbu inzulOnových protilátek. Jejich tvorba je považována z mooha důvodů za nežádoucí.Hypersensitivity (allergy) to available insulin preparations has virtually disappeared after general use of crystallized or recrystallized insulin. Otherwise, there have been and still are many side effects due to the fact that in serum of diabetic patients after treatment for several months it has been found to contain immunoglobulins that combine both in vitro and in vivo with insulinone, meaning that insulin preparations induce production insulin antibodies. Their creation is considered undesirable for many reasons.
1. Tvorba inzulOnových protilátek naznačuje stav trvalého antagonismu těla vůči základní- _mu hormonu, inzulínu. '1. The production of insulin antibodies indicates a state of sustained antagonism of the body against the hormone, insulin. '
2. Tento stav pravděpodobně škodí buňkám ' těla, například beta-btnkcái, které jsou u králíků ničeny imuOzací iozulOneo a pomocnými látkami. Bylo poddzřenO, že požární komppikace diabetů, například aingopaahie, se mohou zhoršovat*2. This condition is likely to be detrimental to the cells of the body, such as beta-cells, which are destroyed in rabbits by immunosuppression of iozulin and adjuvants. It was suspected that diabetic fire complications such as aingopaahia may worsen *
3. Bylo zjištěno, že vysoká hladina inzulínových protilátek někdy vede k insulinové rtsistenci, tj. nutnosti vysokých dávek a k nedostatku metebálické kontroly.3. High levels of insulin antibodies have sometimes been found to result in insulin resistance, ie the need for high doses and a lack of metebal control.
4. Odhaduje se, že skutečně nutná výše dávek u nemocných cukrovkou značně převyšuje požadavek, který by byl nutný, kdyby bylo možno zabránit tvorbě protilátek.4. It is estimated that the effective dose levels for diabetes patients are well above the requirement that would be required if antibody production could be avoided.
5. U některých pacientů vázají protilátky hovězí inzulín pevněji než vepřový inzulín, a byly popsány hypoglykemické stavy po změně druhového složení inzulínových preparátů..5. In some patients, antibodies bind bovine insulin more firmly than porcine insulin, and hypoglycaemic conditions have been reported following changes in the species composition of insulin preparations.
6. Nehromedí-ii se inzulínové protilátky u pacientů, nastává současné zvýšení končen- r trece cirkulujícího tiogenního sérového inzulínu, část sérového inzulínu se bude vázat na protilátky. Kooícnírace celkového a dokonce i volného inzulínu může dosáhnout hodnot, které jsou deseti- až stonásobkem normální fyziologické koncentrace. Tyto vysoké koncŘnnrace trnnou být škodlivé tkání.m. Mohou vyvooat etrtrsεklerózu a mohou poškozovat dosud existující beta-buňky. Bylo zjištěno, že vysoké koncentrace inzulínu mohou mít negativní účinek na sekreci beta-buněk.6. If insulin antibodies do not accumulate in patients, there is a concomitant increase in the circulating thiogenic serum insulin fraction, some of the serum insulin will bind to the antibodies. Co-administration of total and even free insulin can reach values that are ten to 100 times normal physiological concentration. These high concentrations of thorns are harmful to the tissue. They can induce etrtrsclerosis and can damage existing beta cells. It has been found that high insulin concentrations can have a negative effect on beta-cell secretion.
Nežádoucí tvorba inzulínových protilátek uvedená výše byla považována až do koncipování tohoto vynálezu ze nevyhnutelnou, protože bylo pokládáno za sk^teč^í^říit, že čistý inzulín je an^tn. Toto bylo podepřeno Deckrttem v disertační práci Insulin Annibodits (Kodaň 1964), která zahrnuje frakcionacl a izolaci některých nečistot nalezených v krystalickém vepřovém inzulínu, a biologické a chemické výzkumy ukazující, že nečistoty vyvooávají tvorbu protilátek odlišných od inzulínových protilátek, že tvorba inzulínových protilátek ' by však m^ohLa být usnadněna tehdy, když inzulínové preparáty jsou nečisté.The undesirable formation of the insulin antibodies mentioned above was considered inevitable until the present invention was conceived, since it was believed to be clear that pure insulin is non-existent. This was supported by Deckrtt's thesis Insulin Annibodits (Copenhagen 1964), which includes fractionation and isolation of some impurities found in crystalline pig insulin, and biological and chemical studies showing that impurities induce the production of antibodies different from insulin antibodies that the production of insulin antibodies would however, it can be facilitated when the insulin preparations are impure.
Imunologické pokusy prováděné na zvířatech a tvořící základ tohoto vynálezu ukázaly, že tvorbě inzulínových protilátek lze jestliže inzulín je prostý nejenom pankreatických bílkovin a rmSnístní vyěěí než 6 000, ale i anti-genních inzulínu příbuzných ' látek o téměř stejné moSelkλlooé hmoOnísti jako inzulín.Immunological experiments carried out on animals and underlying the present invention have shown that the production of insulin antibodies can be achieved when the insulin is free not only of pancreatic proteins and local proteins greater than 6,000, but also of antigen-related insulin related substances of almost the same molarity as insulin.
Je ekutečnootí, že nečistoty izolované z krystal^kého inzulínu, viz složky (a) a · (b) uváděné výše a do určité míry látky příbuzné inzulínu ve složce (c)5 ·jsou · v podstatě odpovědné za antigenní chování známých inzulínových preparátů, přičemž samotný čistý inzulín není antigenem.It is believed that the impurities isolated from the crystalline insulin, see components (a) and (b) above and to some extent the insulin-related substances in component (c) 5, are essentially responsible for the antigenic behavior of known insulin preparations, wherein pure insulin alone is not an antigen.
Účelem vynálezu je připravit inzulín, který by nevykazoval žádnou nebo podstatně sníženou tvorbu inzulínových protilátek při kli^ncd^f^m použití.It is an object of the present invention to provide insulin that exhibits no or substantially reduced production of insulin antibodies when used.
Toho se dosáhne způsobem čištění inzulínu pro vyloučení nebo snížení · tvorby inzuHnových protilátek po jeho iíjiksoáíí podle přítomného vynálezu. Jeho podsitata spočívá v tom, že se surového nebo komečního vepřového nebo hovězího inzulínu se odstraňují •pankreatické bílkoviny o ooOtkulooé rmoSnísSi vyšší než 6 000 golovou filtrací, přičemž se jímá frakce eluátu sdpooOd.íjící střední hlavní části inzuinnového maxima, sloupcovou chrsmo.ttornaií na ioítsoěr.iči se odstraňují inzulínu podobná _ látky o přibližně stejné ocOι.ekulové r!monísti, jakou má inzulín, za jímání frakce tluátu sdpooOάíeí.cícr střední hlavní části inzulínovéhs maxima a inzulín obsažený ve zjímané frakci se izoluje, přičemž se 3 výhodou provátí nejprve gelová filtrace a poté sloupcové crrsjsrosgafie na .ióntsoOnnči.This is achieved by a method of purifying insulin to eliminate or reduce the production of insulin antibodies after its use in accordance with the present invention. Its principle is that pancreatic proteins of greater than 6,000 gol filtration are removed from the crude or commercial porcine or bovine insulin, collecting a fraction of eluate having a central major portion of the inzuin peak, a columnar thyroid value. The insulin-like substances of approximately the same ocular level as the insulin are removed by collecting a fraction of the beacon having a central major part of the insulin maxima and recovering the insulin contained in the fraction to be isolated, preferably gel-first. filtration, and then column crrsjsrosgafie at .ióntsoOnnči.
S výhodou se př^om používá kationtoměniče a tlutntu s obsahem látky fja^ou je například močovina) zabraňující vytváření shluků · inzulínu se sebou samým nebo s přísomnýo:i nečiststaoi<>Preferably, a cation exchanger is used and a gluten containing substance (e.g. urea) is used to prevent the formation of clusters of insulin with itself or with a corresponding impurity.
Gelová ΓϊΙ^ί^ο inzulí^nu je jako taková o sobě známá, viz například J. Clin. Zavést.Gel insulin is known per se, see, for example, J. Clin. Implement.
sv. 42, č. 12 1069 až 1871 (1963) a 2, 461 až 464 (1963); není však známa koml^nace gtlové И^Ггс^^о s iontoměničovou· tUčního maxima obsahnuícího inzulín.St. 42, No. 12, 1069-1871 (1963) and 2, 461-464 (1963); however, it is not known to combine GTL with an ion exchange peak containing insulin.
Iontoměničová chromatografie krystalického inzulínu je rovněž o sobě známá, není vštC známa chromatooratie spojená s gelovou filtrací elučního maxima obsatuUícího inzulín.Ion-exchange chromatography of crystalline insulin is also known per se, but the chromatography associated with gel filtration of the elution maximum containing insulin is not known.
Komminace gelové fittaice s - iontoměničovou chromatooratií je tedy nová a poskytuje inzulín překvappjících vlfstnosSí.Thus, the gel filtration technique with ion-exchange chromatography is novel and provides insulin of surprising properties.
Gelové fití^ce se provádí s výhodou ve vodném prostředí, které může obsthovat nevodné ktpatiny smíístelné s vodou, gelovou- filtrecí lze vštk provádět rovněž v organický,ch rozpouštědlech obest^ících malé moossví vody, je-li to žádoucí. V příptdě, že se používá vodného prostředí, je výhodná hodnott pH v rozmezí 2 tž 4. Sta^i^t inzulínu při hodnotě pH nižší - než 2 t - otd hodnotu 9 je nízká, ttkže v rozmezí tohoto pH dochází během procesu ke tvorbě degrtdtčních produktů. Velmi nízké nebo velice vysoké pH je tudíž méně vhodné. Hodnoty pH v rozmezí 4 tž 9 lze pouužvat, jestliže se zvýší rozpustnost inzulínu, ^ppíC^U přidáním mc>ooviny, která má rovněž schopnost rozrušovat produkty tsocitce, které mohou vzniCtt mezi moUtkcltmi inzulínu a mezi molekultmi inzulínu a neδisOutami při ne^rdlní retkci. Prstcuj-li se při nízkém pH je výhodné pouští orgtnické kyseliny, oapříklad kyseliny octové k nastav-ní hodnoty pH, může vštk být rovněž pou^Oo siliých minerálních Cysee.in. Je výhodná 0,5 tž 4 M koncentrtce kyseliny octové.The gel filtration is preferably carried out in an aqueous medium which can withstand non-aqueous water-compatible liquids, but gel filtration can also be carried out in organic solvents surrounded by small water moieties, if desired. In the case of using an aqueous medium, a pH in the range of 2 to 4 is preferred. A pH of insulin at a pH of less than 2 t - an ot value of 9 is low, degradation products. A very low or very high pH is therefore less suitable. PH values in the range of 4 to 9 can be used if the solubility of insulin is increased by adding a urea which also has the ability to disrupt the products of the leader, which may arise between insulin molecules and between insulin molecules and non-insulinic retention. . When fed at low pH, it is preferable to use an organic acid, such as acetic acid, to adjust the pH, but may also be used with the mineral mineral Cysee. A 0.5 to 4 M acetic acid concentration is preferred.
Teplott- při gelové není rozhodu^cí t je limiUována pouze stabilitcu t rozpustnootí inzulínu. Je tudíž výhodné prtcovat přibližně při t-pldOě mstnooti, nepř^^d při 20 tž 25 °C. cteré se vymrvoaí před slohou obsa^u^í lozu!^ jsou odstrandvány. Ertkce·, které jsou prosté mattrálu o molekulové Umodnodti převyš^ící 6 000 se smísí t inzulín - lze izolovtí, napPíClaU odpařením, vysolením nebo vysrážením ionty - zinku.Only the stability of the insulin solubility is limited by the gel temperature. It is thus advantageous prtcovat at approximately t pldOě mstnooti, does ^^ d at 20 TZ 25 ° C. ct er E are voaí r y m p e of d ^ u style contained lozu ^ i! ^ are odstrandvány. Ertections that are devoid of maternal molecular molecular weights greater than 6,000 are admixed with insulin - they can be isolated, for example, by evaporation, salting, or precipitation of zinc ions.
Pokud se týká sloupcové iUroIníaovrβti- ot iooOdmёnnδi lze používat téměř všech komerčně Uos0cpnýcU iontoměničů UoooOujíiíiU penn-raci m^oelc^ly inzulínu zt př-UpoklaUc, že způsob podle vynálezu se provádí v prostředí, ve kterém mooekuly inzulínu netvoří spolu nebo s nečistotami tgregáty. .With respect to the column ion exchange resin, almost all commercially available ion exchange exchangers can be used, although the process according to the invention is carried out in an environment where the non-insulin aggregates or aggregates are present. .
Vhodné míaoeiály pro čištění inzulínu jsou udáoy níže v 1ι^1^, vit str. 5.Suitable insulin purification materials are set forth below in page 5.
Iontoměničový proces lze provádět ketoonoovým nebo miontovým měničem, zt pOL^žtí vodného prostředí - jtko elučního činidlt. Eluční činidlo může obsthovat mo^olou nebo jiné látky inzulínu v tvorbě tgregátů meei olasOnííi mooeJkultmi nebo s přítom^o^ýmL oečisMoooviou lze pouuívat v ttkovém mnnUitví, tby se zísCtly 4 tž 8 mooární, s výhodou tsi 7 mooární roztoky. Jestliže se pou^je roztoku moočoloy, oesmí obsthovat kymtlm-amonný, proOoie kymál^ové ionty by reagovaly s aminoskupiooc v inzulinové mooekule.The ion exchange process can be carried out with a ketoono or mionic exchanger, since the aqueous medium is not the eluent. The eluting agent may contain molasses or other insulin substances in the formation of tgregates, which may have a greater or lesser amount of moieties, or may be used in a fixed amount to obtain 4 to 8 molar solutions, preferably 7 molar solutions. If a solution of urea is used, cymyl-ammonium may be present, and the pro-cymal ions would react with the amino group in the insulin molecule.
Elučoí činidlo obsahuje vždy pufr zt účelem Coni^iroLy hodnoty pH lučního činidlt.The elution agent always contains a buffer for the pH value of the mucus reagent.
Je výhodné pucovat při Constmtní hodnotě pH. Poojivá-li se Catiootuvý mmnič, hodoott pH žlučního činidlt by mělt být cdrždvánt v rozmezí 3 tž 6,5, s výhodou 4 tž 6, t pooužíž-li se anidnOový m^ič, hodnott pH lučního činidlt by mělt být udržov^nt v rozmezí 5,5 tž 10, s výhodou 6 tž 9.It is preferred to bud at constant pH. If the Catriot Binder is to be bonded, the pH of the bile reagent should be maintained in the range of 3 to 6.5, preferably 4 to 6, if the anide meter is used, the pH of the beading agent should be maintained a range of 5.5 to 10, preferably 6 to 9.
Zíměoé hodnoty pH se ííPí skleněnou elektrodou otstavenoc obvyklým způsobem ot sOto^^ηί pufr.The pH values are mixed with a glass electrode in a conventional manner with a buffer solution.
Vhodné pufry lze ntlézt v dostupné lltetatuře.Suitable buffers can be found in the available literature.
Zásadní významná udržování Constmtní - teploty během iondoměničovéUo procesu. Teplotu lze vyvoolt v rozmezí od +10 do +40 0 C, s výhodou 0 tž 30 °C t v příj^ě kdy eluční čin.^o . obsahuje mc)oovonc, je ^leži^ utonovat spíše tá^ou teplot, овр?·^1^ 5 ^0. · • JaCo výchozí míaotiál se používá v čistícím stupni obvykle ^ι^^ηί inzulín, Oj. amoufníEssential significant maintenance of the constituent temperature during the ion-exchange process. The temperature can be induced in the range of + 10 ° C to + 40 ° C, preferably 0 to 30 ° C, in the event of the elution. It contains mc) of OV nc is ^ ^ utonovat lie with PI th ^ ou temperatures овр? · ^ 1 ^ 5 ^ 0th As a starting material, it is generally used in the purification stage, typically insulin, Oj. amoufní
2251 Π inzulín nebo krystalický inzulín, který může být i několikrát krystalován. Může však být použito i surového' inuzínu, například koláče solí, obsahnU^cího inzulín, který vzniká během izolace inzulínu z paincreatickýcO žláz e obsahuje obvykle 10 až 30 % hmot, inzulínu, avšak pro vysoký obsah nečistot je tento výchozí maateiál méně vhodný pro čištění podle vynálezu. Vhodnnjší výchozí maateiál lze získat tak, že roztok koláče solí se podrobí is^^^rickému srážen:! nastavením hodnoty pH roztoku na 5,5 a sraženina se izoluje odstředěním.2251 Π insulin or crystalline insulin, which can be crystallized several times. However, crude insulin, for example, insulin-containing salt cakes, formed during the isolation of insulin from the paincreatic glands, may typically contain 10-30% by weight of insulin, but due to the high impurity content this starting material is less suitable for purification according to the invention. A more suitable starting material can be obtained by subjecting the salt cake solution to isicidal precipitation. by adjusting the pH of the solution to 5.5 and collecting the precipitate by centrifugation.
Výsledkem čisticího stupně bude vždy iiětěná frakce inzulínového roztoku, ze které se inzulín získává obvyklým způsobem, například odpařením, vysolením nebo vysrážením v přítomno o ti iontů zinku. Je-'li to žádoucí, inzulín lze krystalovat a upravovat do injekčních inzulínových přípravků stejným způsobem, jak se to používá v oboru.The purification step will always result in a fractionated fraction of the insulin solution from which the insulin is recovered in the usual manner, for example by evaporation, salting out or precipitation in the presence of three zinc ions. If desired, insulin can be crystallized and formulated into injectable insulin preparations in the same manner as used in the art.
Známými analyticlými testy lze stanovit, že způsobem podle vynálezu se získává požadovaná · čistota inzulínu, čištěný inzulín musí vykazovat při gelové filtrací jediné maximum a v poc^s^ltatě jedinou látku, když se podrobí nisklntinuální elektrolýze na polyekrylamidovém gelu (DISC PAGE), jak je to popsáno B. J. Davisem a L. Ornsteinem v Ann. N. Y. Aced. Sci. 121, str. 321· až 349 a 404 až · 427 (1964).By known analytical assays, it can be determined that the desired insulin purity is obtained by the method of the invention, the purified insulin must exhibit a single maximum in gel filtration and, in general, a single substance when subjected to polycrylamide gel electrolysis (DISC PAGE) as this is described by BJ Davis and L. Ornstein in Ann. N. Y. Aced. Sci. 121, pp. 321-347 and 404-427 (1964).
Podle jednoho provedení způsobu podle vynálezu se inzulín podrobí nejprve gelové filtraci, jímají se frakce eluátu ldp□oidnaící střednímu hlavnímu dílu inzuinnovéOo maxima a izoluje se v nich obsažený inzulín, načež se izolovaný inzulín podrobí sloupcové iOrlmaaodraaii ne měnnči ketim^ a jímají se frakce eluátu odp^vídaící st^Í^f^(^nmu hlavnímu dílu inzuinnového maxima a izoluje se v nich obsažený inzulín.According to one embodiment of the method of the invention, the insulin is first subjected to gel filtration, collecting the fractions of the eluate 1dpfloid to the central main part of the insulin of maxima and isolating the insulin contained therein, then subjecting the isolated insulin to column irradiation and changing the eluate fractions. They see the major part of the insulin peak and isolate the insulin contained therein.
Následnuící·příklad ilustruje toto provedení.The following example illustrates this embodiment.
Příklad provedení kg Sephadexu E 50 jemného zrnění se nechá nabobtnat v 1 M kyselině octové a · nejjemnější částice se odstraní děkannací. Maatriálu se použije k naplnění kolony o průměru 15 cm a výšky 130 cm. Kolona se eCvilibruje 1 M kyselinou octovou.EXAMPLE kg Sephadex E 50 fine grain is swollen in 1 M acetic acid and the finest particles are removed by decanation. The material is used to fill a column with a diameter of 15 cm and a height of 130 cm. The column was equilibrated with 1 M acetic acid.
g inzulínu, který byl jednou krystalován z citrálové0l pufru, se rozpuutí ve směsi 390 ml 1 M kyseliny octové a 8 ml 1 N HCC. Tento roztok se nanese na kolonu. Vymývání se provádí 1 M kyselinou octovou rychlostí 1 ШгЛиП. Jímají se frakce po 200 ml.g of insulin, which was once crystallized from citrate buffer, was dissolved in a mixture of 390 ml of 1 M acetic acid and 8 ml of 1 N HCC. This solution is applied to the column. Elution is carried out with 1 M acetic acid at a rate of 1 µg / l. Fractions of 200 ml are collected.
Extinkce se měří při 276 nm a vyrážejí proti číslům frakcí. Frakce ldpooidnaicí střednímu hlavnímu dílu inzuinnového maxima (největší maximum) se spojí a inzulín se vysráží přidáním 200 g chloridu sodného na 1 litr spojených frakcí. Sraženina se izoluje odstředěním a podrobí izlelektricéému vysrážení a kr^f^lta^izaci ze urási aietln-iitráloiý piufr obvyklým způsobem. Výtěžek je 8 g kry.stalickéOo inzulínu prostého bílkovin pankreatického původu 3 mooelkiulární hmoOnj>ltí vyšší než asi 6 000.Extinctions are measured at 276 nm and run against fraction numbers. The fraction ldpooidna the central main part of the inzuin peak (maximum peak) was pooled and insulin was precipitated by adding 200 g of sodium chloride per liter of pooled fractions. The precipitate is recovered by centrifugation and subjected to iselectric precipitation and cross-linking from an acetonitrile buffer in the usual manner. The yield is 8 grams of crystalline insulin-free protein of pancreatic origin, with a molar electrolyte content greater than about 6000.
Krystalický čištěný inzulín, získaný výše uvedeným způsobem, se čistí déle iontoměničovou chromaaodraafí na kationoovém měnn-či iontů. Připraví se 7 M roztoky močoviny a deimizují se průchodem kolonami se směsí iontoměniilvé pryskyřice. Tato neiojizliαná mooovina se Dotom používá k přípravě pufru: 0,13 M fosforečnan·sodný - 7 M mooovina -·1% n-butanolu, ludnota pH 6,0 při teplotě 25 °C. Pufr se skladuje a používá při teplotě 4 °C. 1,5 kg Anbeexitu CE typu II, který je měničem katilntl na bázi kyseliny vé zesítěné d^^y^e^enem, která má · ihrombαografi.cCou kvaKtu se preparuje: 1. vodou, 2. acetonem, 3. vodou + hydroxidem sodným, 4. vodou, 5. vodou + kyselinou·chlorovodíkovou a 6. vodou. Promytá pryskyřice se potom rozmíchá s 5 litry pufru. Hodnota pH suspenze okaT^ž^ kleáá a · vždy během několika miraut se · přidávají přibližně 30 ml dávky 40% roztoku hydroxidu sodného J(hbolnílt/objeb), aby se udržovala hodnota pH asi na 6,00. Když hodnota pH suspenze zůstává po 15 minutách míchání na 6,00, áměs se míchá při teplotě 4 °C přes noc. Prysk^ice se ldnfltruje a promyje 30 litry pufru v průběhu 8 hodin. Hodnota pH konečného filtrátu by měla být stejná jako u přitékajícího pufru. Maatelálu se použije k naplnění kolony o průměru 7,5* cm a o ' výšce 80 cm. Kolona se ekvilibruje pomocí pUfru.The crystalline purified insulin obtained by the above method is purified for a longer time by ion-exchange chroma and blue ion cation exchange. 7 M urea solutions are prepared and deimized by passing through ion exchange resin columns. This unisolated urea is used to prepare the buffer: 0.13 M sodium phosphate - 7 M urea - 1% n-butanol, lud pH 6.0 at 25 ° C. The buffer is stored and used at 4 ° C. 1.5 kg of Anbeexite CE type II, which is a catalyzed transducer of acid-crosslinked diene, having the following characteristics: 1. water, 2. acetone, 3. water + hydroxide sodium, 4. water, 5. water + hydrochloric acid and 6. water. The washed resin is then mixed with 5 liters of buffer. The pH of the slurry is dropped and approximately 30 ml of a 40% sodium hydroxide solution (pH / volume) is added over a few minutes to maintain the pH at about 6.00. When the pH of the suspension remains at 6.00 after stirring for 15 minutes, the mixture is stirred at 4 ° C overnight. The resin was filtered and washed with 30 L of buffer for 8 hours. The pH of the final filtrate should be the same as that of the inflow buffer. The column is used to pack a column having a diameter of 7.5 cm and a height of 80 cm. Equilibrate the column with buffer.
g inzulínu čištěného výše uvedeným způsobem se nanese ne ’ kolonu ve formě 10% roztoku (hmotnost/objem) v pxUfru. Vyrvání se provádí pufrem při teplotě 4 °C rychlostí 200 ml/hod. Jímají se frakce po 100 ml.g of insulin purified as described above is loaded onto a column as a 10% w / v solution in pxUfr. Digestion is performed with a buffer at 4 ° C at a rate of 200 ml / h. Fractions of 100 ml are collected.
Extinkce se měří pí*! 276 nm a vynášeei prooi číslům frakcí. Sppoují se frakce odpovídající střednímu hlavnímu dílu inzulínového maxima (největší maximum) a inzulín se vysráží přidáním 2 litrů vody, 15 ml 4 N kyseliny chlorovodíkové a 600 g chloridu sodného na 1 . litr spojených frakcí. Sraženina se izoluje odstředěním a podrobí isoelektrccéému vysrážení a krystalizaci ze směti aceeon-cctrátový pufr obvyklým způsobem.Extinction is measured by pi *! 276 nm and plotting fraction numbers. Fractions corresponding to the central major part of the insulin maximum (maximum maximum) are started and the insulin is precipitated by the addition of 2 liters of water, 15 ml of 4 N hydrochloric acid and 600 g of sodium chloride per liter. liter of combined fractions. The precipitate is isolated by centrifugation and subjected to isoelectric precipitation and crystallization from the garbage and acee-acetate buffer in a conventional manner.
Výtěžek je 10 g krystal^kého inzulínu, který ' obsahuje pouzz 'jedinou složku, jestliže se podrobí. DISC .PAGE. Krystalický inzulín je, řečeno jinak pokládán za čistý inzulín.The yield is 10 g of crystalline insulin which contains only one ingredient when subjected to it. DISC .PAGE. Crystalline insulin is, in other words, considered pure insulin.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS78849A CS225134B2 (en) | 1969-08-11 | 1978-02-09 | The purification on unprocessed and commercial insulin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB38081/68A GB1285023A (en) | 1968-08-09 | 1968-08-09 | Improvements in or relating to injectable insulin preparations |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS225117B2 true CS225117B2 (en) | 1984-02-13 |
Family
ID=10401047
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS695548A CS225117B2 (en) | 1968-08-09 | 1969-08-11 | The purification of insulin |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS543931B1 (en) |
| AT (1) | AT354634B (en) |
| BE (1) | BE737257A (en) |
| BG (1) | BG25638A3 (en) |
| BR (1) | BR6911403D0 (en) |
| CA (1) | CA920946A (en) |
| CH (1) | CH526958A (en) |
| CS (1) | CS225117B2 (en) |
| CU (1) | CU33401A (en) |
| DE (1) | DE1940130C2 (en) |
| ES (1) | ES370345A1 (en) |
| FR (1) | FR2015369A1 (en) |
| GB (1) | GB1285023A (en) |
| HK (2) | HK51077A (en) |
| IE (1) | IE33239B1 (en) |
| IL (1) | IL32665A (en) |
| KE (2) | KE2774A (en) |
| MT (1) | MTP620B (en) |
| MY (1) | MY7800209A (en) |
| NL (1) | NL141377B (en) |
| PH (1) | PH12571A (en) |
| SE (1) | SE7901917L (en) |
| YU (2) | YU204569A (en) |
| ZM (1) | ZM12069A1 (en) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK140801B (en) * | 1975-01-15 | 1979-11-19 | Nordisk Insulinlab | Process for the preparation of a stable long-acting insulin preparation. |
| DE2505306C2 (en) * | 1975-02-07 | 1984-06-07 | Eli Lilly And Co., Indianapolis, Ind. | Process for purifying an alkali or ammonium insulin |
| NL7713966A (en) * | 1976-12-27 | 1978-06-29 | Univ Minnesota | METHOD OF TREATING INSULIN. |
| DK374579A (en) * | 1979-09-07 | 1981-03-08 | Nordisk Insulinlab | PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF AN INJUCABLE INSULIN PREPARATION |
| NL193099C (en) * | 1981-10-30 | 1998-11-03 | Novo Industri As | Stabilized insulin solution. |
| FI78616C (en) * | 1982-02-05 | 1989-09-11 | Novo Industri As | Process for preparing an infused stabilized insulin solution having an elevated zinc content |
| WO1995016708A1 (en) * | 1993-12-17 | 1995-06-22 | Novo Nordisk A/S | Proinsulin-like compounds |
| AR012894A1 (en) | 1997-06-13 | 2000-11-22 | Lilly Co Eli | FORMULATION OF INSULIN IN STABLE SOLUTION, ITS USE TO PREPARE A MEDICINAL PRODUCT AND PROCESS FOR THE PREPARATION OF THE SAME. |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE1940130U (en) | 1966-02-26 | 1966-06-08 | Heinrich Emil Budesheim | DEVICE FOR FILTERING LIQUID OR GAS MEDIA. |
| DE1966573U (en) | 1967-06-01 | 1967-08-17 | Rainer Sahli | CYLINDRICAL LOCK ON DOORS ETC. ROOM LOCKING BODIES. |
-
1968
- 1968-08-09 GB GB38081/68A patent/GB1285023A/en not_active Expired
-
1969
- 1969-07-21 IL IL32665A patent/IL32665A/en unknown
- 1969-07-21 IE IE1012/69A patent/IE33239B1/en unknown
- 1969-07-22 CA CA057646A patent/CA920946A/en not_active Expired
- 1969-07-24 ZM ZM120/69A patent/ZM12069A1/en unknown
- 1969-07-31 CU CU33401A patent/CU33401A/en unknown
- 1969-08-06 CH CH1195769A patent/CH526958A/en not_active IP Right Cessation
- 1969-08-06 BG BG012830A patent/BG25638A3/en unknown
- 1969-08-06 YU YU02045/69A patent/YU204569A/en unknown
- 1969-08-07 DE DE1940130A patent/DE1940130C2/en not_active Expired
- 1969-08-07 PH PH10600A patent/PH12571A/en unknown
- 1969-08-07 FR FR6927255A patent/FR2015369A1/fr not_active Withdrawn
- 1969-08-08 ES ES370345A patent/ES370345A1/en not_active Expired
- 1969-08-08 NL NL696912142A patent/NL141377B/en not_active IP Right Cessation
- 1969-08-08 BE BE737257D patent/BE737257A/xx not_active IP Right Cessation
- 1969-08-08 AT AT768769A patent/AT354634B/en not_active IP Right Cessation
- 1969-08-08 JP JP6283469A patent/JPS543931B1/ja active Pending
- 1969-08-08 MT MT620A patent/MTP620B/en unknown
- 1969-08-08 BR BR211403/69A patent/BR6911403D0/en unknown
- 1969-08-11 CS CS695548A patent/CS225117B2/en unknown
-
1977
- 1977-06-30 YU YU1622/77A patent/YU40003B/en unknown
- 1977-09-13 KE KE2774A patent/KE2774A/en unknown
- 1977-09-29 HK HK510/77A patent/HK51077A/en unknown
- 1977-11-28 KE KE2801A patent/KE2801A/en unknown
- 1977-12-15 HK HK619/77A patent/HK61977A/en unknown
-
1978
- 1978-12-31 MY MY1978209A patent/MY7800209A/en unknown
-
1979
- 1979-03-02 SE SE7901917A patent/SE7901917L/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IE33239L (en) | 1970-02-09 |
| IL32665A0 (en) | 1969-09-25 |
| FR2015369A1 (en) | 1970-04-24 |
| YU40003B (en) | 1985-06-30 |
| SE7901917L (en) | 1979-03-02 |
| DE1940130C2 (en) | 1983-12-08 |
| BE737257A (en) | 1970-02-09 |
| YU162277A (en) | 1982-05-31 |
| GB1285023A (en) | 1972-08-09 |
| KE2774A (en) | 1977-10-21 |
| DE1940130A1 (en) | 1970-02-12 |
| MTP620B (en) | 1970-01-31 |
| JPS543931B1 (en) | 1979-02-28 |
| MY7800209A (en) | 1978-12-31 |
| BR6911403D0 (en) | 1973-03-13 |
| BG25638A3 (en) | 1978-11-10 |
| ES370345A1 (en) | 1972-01-01 |
| CH526958A (en) | 1972-08-31 |
| YU204569A (en) | 1982-05-31 |
| NL141377B (en) | 1974-03-15 |
| KE2801A (en) | 1978-01-06 |
| ZM12069A1 (en) | 1970-02-16 |
| HK51077A (en) | 1977-10-07 |
| HK61977A (en) | 1977-12-23 |
| AT354634B (en) | 1979-01-25 |
| PH12571A (en) | 1979-06-20 |
| CA920946A (en) | 1973-02-13 |
| CU20627L (en) | 1971-08-06 |
| IE33239B1 (en) | 1974-05-01 |
| NL6912142A (en) | 1970-02-11 |
| IL32665A (en) | 1973-05-31 |
| CU33401A (en) | 1971-08-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US3950517A (en) | Insulin derivatives | |
| EP0471701B1 (en) | Novel tnf-inhibit proteins and their preparation | |
| US4183849A (en) | Therapeutic insulin preparation and a process for the production of a stable insulin preparation with protracted effect | |
| DE69127657T2 (en) | Protein purification method | |
| US3869437A (en) | Mono-, di, and N{HD A1{B , N{HU B1{B , N{HU B29{B -tri-acylated insulin | |
| Matsuzawa et al. | Crystallization of ornithine transaminase and its properties | |
| JPS61212598A (en) | Insulin compound | |
| US3907676A (en) | Process for purifying insulin | |
| FI77876B (en) | FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV HUMANINSULIN ELLER EN TREONINB30-ESTER AV HUMANINSULIN ELLER ETT SALT ELLER KOMPLEX DAERAV. | |
| US2174862A (en) | Process of producing crystalline insulin | |
| CS225117B2 (en) | The purification of insulin | |
| EP0011231B1 (en) | Process for the preparation of cold-insoluble globulin and medicament containing it | |
| US4624804A (en) | Process of preparing relaxin from milk | |
| US4033941A (en) | Process for purifying glucagon | |
| CA2506594A1 (en) | A method for the crystallization of human serum albumin | |
| EP0013826A1 (en) | Process for purifying insulin and insulin so prepared | |
| EP0966482B1 (en) | Crystallisation of proteins | |
| EP0089218B1 (en) | A process for purifying human chorionic gonadotropin | |
| US4617376A (en) | Process for recovering glucagon from pancreas glands | |
| US6770455B1 (en) | Metal-containing ribonucleotide polypeptides | |
| US4495096A (en) | Process for producing and obtaining anaphylatoxin-and cocytotaxin-containing leucotaxine preparations and of anaphylatoxin and cocytotaxin proteins in molecularly homogeneous, biologically active form | |
| FI73130C (en) | Process for the preparation of purified insulin suitable for the preparation of clinically useful injectable insulin preparations. | |
| US2974088A (en) | Method of preparing growth hormone | |
| EP0207727A2 (en) | A process for recovering glucagon from pancreas glands | |
| SU1523570A1 (en) | Method of obtaining carboxypeptidase a from swine pancreatic gland |