FI73130C - Process for the preparation of purified insulin suitable for the preparation of clinically useful injectable insulin preparations. - Google Patents
Process for the preparation of purified insulin suitable for the preparation of clinically useful injectable insulin preparations. Download PDFInfo
- Publication number
- FI73130C FI73130C FI793110A FI793110A FI73130C FI 73130 C FI73130 C FI 73130C FI 793110 A FI793110 A FI 793110A FI 793110 A FI793110 A FI 793110A FI 73130 C FI73130 C FI 73130C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- insulin
- preparation
- preparations
- purified
- antibodies
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
[775£^7| KUULUTUSJULKAISU n- [Β^ 11> UTLÄGGN,NGSSKRIFT 30 C Patentti nyöm.etty l4>Sgiy '45* Patent r:.oJ :el-it 10 00 U07 (51) Kv.lk4/lnt.CI.4 A 61 K 37/26, C 07 K 7/*+0[775 ^ £ 7 | ANNOUNCEMENT n- [Β ^ 11> UTLÄGGN, NGSSKRIFT 30 C Patent printed l4> Sgiy '45 * Patent r: .oJ: el-it 10 00 U07 (51) Kv.lk4 / lnt.CI.4 A 61 K 37/26, C 07 K 7 / * + 0
S UOMI-FI N LAN DSUOMI FINLAND
(H) (21) Patenttihakemus - Patentansökning 793110 (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 08.10.79(H) (21) Patent application - Patentansökning 793110 (22) Application date - Ansökningsdag 08.10.79
Patentti-ja rekisterihallitus (23) Alkupäivä-Giltighetsdag 31.07.69National Board of Patents and Registration (23) Start date-Giltighetsdag 31.07.69
Patent- och registarstyrelsen (41) TuNut julkiseksi - Biivit offentiig 08.10.79 (44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. - 29.05.87Patent- och registarstyrelsen (41) Announced to the public - Biivit offentiig 08.10.79 (44) Date of publication and date of publication. - 29.05.87
Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad (86) Kv. hakemus-int. ansökan (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus - Begärd prioritet 09.08.68 Iso-Britannia-Storbritannien(GB) 38081 /68 (71) Novo Terapeutisk Laboratorium A/S , Fug 1 ebakkeve j 115, KeSbenhavn, Tanska-Danma rk(DK) (72) Jörgen Sohi ichtkru 1 1 , Br«5nsh^j, Tanska-Danmark(DK) (7*0 Oy Kolster Ab (5*0 Menetelmä kliiniseen käyttöön soveltuvien, injektoitavien insuliini-valmisteiden valmistukseen soveltuvan puhdistetun insuliinin valmistamiseksi - Förfarande för framstä11 ning av renat insulin lämpat för beredning av för kliniskt bruk användbara injicerbara insu1inbered-n i ngar (62) Jakamalla erotettu hakemuksesta 2276/69 -Avdelad fran ansökan 2276/69 Tämä keksintö koskee menetelmää kliiniseen käyttöön soveltuvien, injektoitavien insuliinivalmisteiden valmistukseen soveltuvan puhdistetun insuliinin valmistamiseksi, jolloin lähdetään kaupallisesta tai raa'asta härän ja/tai sian insuliinista, joita insuliinivalmisteita annettaessa ei muodostu insuliinin vasta-ainei-: ta tai tällaisia esiintyy hyvin vähäisessä määrin, ja jotka insu- liinivalmisteet epäjatkuvan polyakryyliamidigeelielektroforeesi-analyysin (DISC PAGE) mukaan ovat oleellisesti yksikomponenttisia.Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad (86) Kv. Application-int. ansökan (32) (33) (31) Privilege claimed - Begärd priority 09.08.68 United Kingdom-Great Britain (GB) 38081/68 (71) Novo Therapeutic Laboratory A / S, Fug 1 ebakkeve j 115, KeSbenhavn, Denmark-Denmark rk (DK) (72) Jörgen Sohi ichtkru 1 1, Br «5nsh ^ j, Denmark-Danmark (DK) (7 * 0 Oy Kolster Ab (5 * 0 Method for the preparation of purified insulin suitable for clinical use, for the preparation of injectable insulin preparations The present invention relates to a process for the preparation of injectables for clinical use, which are suitable for clinical use and to the manufacture of injectable injectables for clinical use. for the production of purified insulin starting from commercial or crude bovine and / or porcine insulin, which do not produce insulin antibodies or are highly present when insulin preparations are administered. and which insulin preparations are substantially one-component by discontinuous polyacrylamide gel electrophoresis analysis (DISC PAGE).
Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että sian ja/tai härän haimakudoksesta saatua kaupallista tai raakaa : insuliinia puhdistetaan poistamalla siitä sekä haimasta peräisin olevat proteiinit, joiden molekyvlipaino on yli 6000, että antigeeniset insuliinia muistuttavat aineet, joiden molekyylipaino 2 73130 on noin 6000, edullisesti geelisuodattamaila ja pylväskromatcgra-foimalla ioninvaihtajän avulla, jolloin kerätään ne jakeet, jotka vastaavat insuliinihuipun keskeistä, suurinta osaa.The method according to the invention is characterized in that commercial or crude: insulin obtained from porcine and / or bovine pancreatic tissue is purified by removing both pancreatic proteins having a molecular weight greater than 6000 and antigenic insulin-like substances having a molecular weight of about 2,73130, preferably gel filtrates. and column chromatography with an ion exchanger to collect those fractions that correspond to the major part of the insulin peak.
Insuliiniterapian ensimmäisten vuosien aikana, jolloin käytettiin amorfisen insuliinin injektoitavia liuoksia, olivat allergiset ihoreaktiot yleisiä. Otettaessa käytäntöön kiteisen insuliinin injektoitavat liuokset, vähenivät ihoreaktioiden lukuisuus ja vaikeus ja ne eliminoituivat käytännöllisesti katsoen, kun potilaat siirtyivät käyttämään uudelleenkiteytetyn insuliinin liuoksia. Nykyään kaikki kliiniseen käyttöön tarkoitetut kaupalliset insuliini-valmisteet valmistetaan kiteisestä insuliinista.During the first years of insulin therapy, when injectable solutions of amorphous insulin were used, allergic skin reactions were common. With the introduction of crystalline insulin injectable solutions, the number and severity of skin reactions were reduced and virtually eliminated when patients switched to recrystallized insulin solutions. Today, all commercial insulin preparations for clinical use are made from crystalline insulin.
Edellämainitun ihon allergisuuden aiheutti todennäköisesti haimasta peräisin oleva proteiinimateriaali, jota on läsnä epäpuhtauksina huomattavia määriä amorfisessa insuliinissa, pienemmässä määrässä kiteytetyssä insuliinissa ja vain mitättömiä määriä, jos lainkaan, uudelleenkiteytetyssä insuliinissa.The aforementioned skin allergy was most likely caused by pancreatic protein material present as impurities in significant amounts in amorphous insulin, to a lesser extent in crystallized insulin, and only insignificant amounts, if any, in recrystallized insulin.
Muita sivuvaikutuksia, kuin ne, jotka selitetään johtuvaksi itse insuliinimolekyylin luonteesta ei ole luettu nykyaikaisten in-suliinivalmisteiden, jotka sisältävät uudelleen kiteytettyä insuliinia, syyksi. Muutamien kuukausien hoidon jälkeen on sokeritautisen potilaan seerumin todettu sisältävän immunoglobuliineja, jotka yhdistyvät insuliinin kanssa in vitro ja in vivo. (Tällaisia insuliinilla käsitellyistä marsuista saatuja seerumeja käytetään nykyään tavanomaisesti insuliinin immunologiseen määritykseen.) Tämä sivuvaikutus on ei-toivottava useista syistä: 1. Insuliinin vasta-aineiden muodostuminen osoittaa kehon jatkuvan antagonistisen tilan oleellista hormoonia, insuliinia vastaan.Side effects other than those explained due to the nature of the insulin molecule itself have not been attributed to modern insulin preparations containing recrystallized insulin. After a few months of treatment, the serum of a diabetic patient has been found to contain immunoglobulins that combine with insulin in vitro and in vivo. (Such sera from insulin-treated guinea pigs are now routinely used for the immunoassay of insulin.) This side effect is undesirable for several reasons: 1. The formation of insulin antibodies indicates a persistent antagonistic state of the body against the essential hormone, insulin.
2. Tämä tila on todennäköisesti haitallinen kehon soluille, esim. ^'.'-soluille, jotka ovat tuhoutuneet kaniineissa immunisoitaessa insuliinilla ja apuaineella. Otaksutaan, että myöhemmät dia-beettiset komplikaatiot, kuten veritauti voivat tulla pahoiksi.2. This condition is likely to be detrimental to cells in the body, e.g., ^ '.' Cells that have been destroyed in rabbits when immunized with insulin and an excipient. It is hypothesized that subsequent diabetic complications such as hemorrhoids may become severe.
3. On todettu, että insuliinin vasta-aineiden korkea määrä aiheuttaa toisinaan insuliinin vastustuskykyä, so. korkean annostar-peen ja metabolisen kontrollin puuttumisen.3. It has been found that high levels of insulin antibodies sometimes cause insulin resistance, i. high dose requirements and lack of metabolic control.
4. On arvioitu, että sokeritautia sairastavan väestön varsinainen annostarve ylittää paljon sen tarpeen, mikä olisi välttämä- 3 731 30 töntä, että vasta-aineen muodostuminen voitaisiin välttää.4. It has been estimated that the actual dosage requirement of the diabetic population far exceeds the need that would be necessary to avoid the formation of an antibody.
5. Eräissä potilaissa sitovat vasta-aineet naudasta valmistettua insuliinia paljon voimakkaammin kuin siasta valmistettua insuliinia ja on todettu verensokeriniukkuustapauksia sen jälkeen kun on vaihdettu insuliinivalmisteiden laatukoostumusta.5. In some patients, antibodies bind bovine insulin much more strongly than porcine insulin and cases of hypoglycaemia have been reported following a change in the quality composition of insulin products.
6. Kun insuliinin vasta-aineita alkaa muodostua potilaassa, tapahtuu samanaikaisesti suurenemista kiertävän eksogeenisen seerumi-insuliinin konsentraatiossa. Osa seerumi-insuliinista sitoutuu vasta-aineisiin. Kokonaisinsuliinin ja vieläpä vapaan insuliinin konsentraatiot voivat saavuttaa arvoja, jotka ovat 10 - 100 kertaa suuremmat kuin normaali fysiologinen konsentraatio. Nämä korkeat määrät ovat haitallisia kudoksille. Ne voivat edistää valtimon hau-rauskovetustautia ja ne voivat vahingoittaa vielä elossa olevia fi-soluja. On osoitettu, että korkeilla insuliinin konsentraatioilla voi olla ehkäisevä vaikutus /4-solun sekredaatioon.6. When insulin antibodies begin to form in a patient, there is a concomitant increase in circulating exogenous serum insulin concentration. Some serum insulin binds to antibodies. Concentrations of total insulin and even free insulin can reach values that are 10 to 100 times higher than normal physiological concentrations. These high amounts are harmful to tissues. They can contribute to arterial sclerosis and can damage surviving fi cells. It has been shown that high insulin concentrations can have a inhibitory effect on / 4-cell secretion.
Insuliinin vasta-aineiden kehittymisen takana olevaa mekanismia ja näiden aineiden ominaisuuksia on tutkittu kasvavalla kiinnostuksella viimeisten 5-10 vuoden ajan. On huomattu, että insuliinin laji näyttää olevan määräävä tekijä vasta-aineiden kehittymisessä. Naudasta saatu insuliini, joka eroaa (3 aminohappoasemaa) ihmisessä muodostuneesta insuliinista enemmän kuin siasta saatu insuliini (1 aminohappoasema), on kuten voidaan odottaa, enemmän antigeeninen kuin siasta saatu insuliini. Toisaalta siasta saatu insuliini aiheuttaa siasta saatua insuliinia vastaan vaikuttavien vasta-aineiden muodostumisen myöskin sioissa. Mitään selitystä ei tälle viimemainitulle huomiolle ole löydetty, joskin on kokeeksi oletettu, että epänormaalin korkeat siasta saadun insuliinin konsentraatiot injektiomuodossa voivat yllyttää siassa olevaa immunologista "apparaattia" tuottamaan vasta-aineita sen omaa insuliinia vastaan.The mechanism behind the development of insulin antibodies and the properties of these agents have been studied with increasing interest over the past 5-10 years. It has been found that the type of insulin appears to be a determining factor in the development of antibodies. Bovine insulin, which differs (3 amino acid positions) from human insulin more than porcine insulin (1 amino acid position), is, as might be expected, more antigenic than porcine insulin. On the other hand, insulin from pigs also causes the formation of antibodies against porcine insulin in pigs. No explanation has been found for this latter consideration, although it has been hypothesized that abnormally high concentrations of porcine insulin in injection form may induce an immunological "apparatus" in porcine to produce antibodies against its own insulin.
Aikaisemmin oli alan asiantuntijan käsitys se, että insuliini sinänsä, vereen injektoituna, aiheutti insuliinivasta-aineiden muodostumisen. Nyt on kuitenkin yllättäen havaittu, että puhdistamalla insuliini erittäin huolellisesti voidaan valmistaa insuliinia, joka vereen injektoituna ei aiheuta lainkaan tai ei ainakaan merkitsevää insuliinivasta-aineiden muodostumista. Näin puhdasta sian ja härän insuliinia (eli MC-insuliinia) ei ole aikaisemmin valmistettu.In the past, it was understood by one skilled in the art that insulin itself, when injected into the blood, caused the formation of insulin antibodies. However, it has now surprisingly been found that by very careful purification of insulin, insulin can be prepared which, when injected into the blood, does not cause any or at least no significant formation of insulin antibodies. Such pure porcine and bovine insulin (i.e., MC insulin) has not been previously prepared.
Siten keksinnön mukaisesti valmistettu insuliini on puhdas, ja on yllättävää, että se on erittäin vähäisessä määrin tai ei lainkaan antigeeninen.Thus, the insulin prepared according to the invention is pure, and it is surprising that it has very little or no antigenicity.
4 731 304,731 30
Julkaisuista Biochem. 4 (1965) 1044 ja Biochem. J. 106 (1968) 531 tunnetaan kalan insuliini, joka on aivan eri aine kuin sian tai härän insuliini. Kalan insuliini ei ole puhdistettu siten, että tuloksena olisi monokomponenttinen tuote. Julkaisusta ei ilmene, onko kalan insuliini vailla antigeenisyyttä.From Biochem. 4 (1965) 1044 and Biochem. J. 106 (1968) 531 discloses fish insulin, which is a completely different substance from porcine or bovine insulin. Fish insulin has not been purified to result in a monocomponent product. It is not clear from the publication whether fish insulin is devoid of antigenicity.
Julkaisussa J. Biol. Chem. 235 (1960) 2294 on selitetty menetelmä insuliinin valmistamiseksi. Tämäkään insuliini ei ole monokomponenttinen .In J. Biol. Chem. 235 (1960) 2294 describes a process for the preparation of insulin. This insulin is also not monocomponent.
GB-patentin 871 541 ja US-patentin 3 069 323 mukaisilla menetelmillä ei myöskään voida valmistaa monokomponenttista insuliinia. GB-patentissa on vain yksi insuliinia koskeva esimerkki (n:o 14). Insuliinin antigeenisyyttä ei ole esitetty, eikä myöskään ole mainittu, miten saadaan monokomponenttista insuliinia.The methods of GB Patent 871,541 and U.S. Patent 3,069,323 also do not allow the production of monocomponent insulin. The GB patent contains only one example of insulin (No. 14). The antigenicity of insulin has not been shown, nor has it been mentioned how to obtain monocomponent insulin.
GB-patentin 1 054 523 ja FI-patentin 30 528 mukaisilla menetelmillä ei myöskään saada monokomponenttista insuliinia.The methods of GB patent 1,054,523 and FI patent 30,528 also do not produce monocomponent insulin.
Esillä oleva keksintö tarjoaa ratkaisun probleemaan, jonka muodostaa kehon vastustuskyvyttömyys tunnettuja insuliinivalmistei-ta vastaan. Keksinnön mukaisesti valmistettu insuliini ei aiheuta kehon antagonistista reaktiota, eli ei muodostu insuliinin vasta-aineita, tai tällaisia muodostuu hyvin vähäisessä määrässä, koska uusi insuliinivalmiste on vapaa määrätyistä aineista, joita on aina ollut läsnä tunnetuntyyppisissä insuliinivalmisteissa, mainittujen aineiden molekyylipainon ollessa korkeampi kuin insuliinin. Aikaisemmin otaksuttiin, että itse insuliini aikaansai insuliinin vasta-aineet, mutta nyt on siis yllättäen ilmennyt, että syynä ei ole insuliini-molekyyli vaan mainitut epäpuhtaudet, joiden aineiden molekyyli-painot ovat korkeammat kuin insuliinin.The present invention provides a solution to the problem of the body's resistance to known insulin preparations. The insulin according to the invention does not cause an antagonistic reaction in the body, i.e. no or very little insulin antibodies are formed, because the new insulin preparation is free of certain substances which have always been present in known insulin preparations, higher molecular weight than insulin. In the past, it was assumed that insulin itself produced insulin antibodies, but it has now surprisingly been found that the cause is not the insulin molecule but the said impurities, which have higher molecular weights than insulin.
Keksinnön mukaisesti valmistettu insuliini ei myöskään sisällä sellaisia insuliinia muistuttavia aineita, joiden molekyylipai-no on kutakuinkin sama kuin insuliinin, mutta jotka hiukan eroavat insuliinista kemiallisen koostumuksensa puolesta, esimerkiksi mono-desamidoinsuliinia ja ainetta, joka näyttää olevan! insuliinin arginii-nijohdannaista, joilla aineilla on jonkinasteista antigeenisyyttä. Uuden insuliinivalmisteen pH:n tulee edullisesti olla noin 7 mono-desamidoinsuliinin muodostumisen pysyttämiseksi minimissään varastoinnin aikana.Insulin prepared according to the invention also does not contain insulin-like substances which have a molecular weight approximately equal to that of insulin but which differ slightly from insulin in terms of their chemical composition, for example insulin mono-desamido and a substance which appears to be! insulin arginine derivative, which substances have some degree of antigenicity. The pH of the new insulin preparation should preferably be about 7 to keep the formation of mono-desamido insulin to a minimum during storage.
5 731 305,731 30
Eräs tunnettu menetelmä kooltaan erilaisten proteiinimolekyy-lien erottamiseksi on liuottaa proteiiniseos liuottimeen, johon molekyylit dissosioituvat ja johtaa liuos molekyyliseulan läpi, esim. sellaisen orgaanisen aineen muodostaman pylvään läpi, joka on ristisidottu kolmiulotteiseksi verkoksi, jolla on määrätty huokossuuruus. On osoitettu, että kiteinen insuliini, joka on liuotettu 1-m etikkahappoon, voidaan fraktioida Sephadex ® G-50-pylvään avulla vastaavasti komponenteiksi a), b) ja c). Nämä komponentit voidaan erottaa liuoksistaan tavanomaisten menetelmien avulla, esim. suolaamalla pois liuoksesta, saostamalla reaktioltaan neutraalilla sinkkisuolalla, kuivaamalla jäähdyttäen jne. Komponentin a) määrä voi olla 2-5 paino-% kiteytetystä insuliinista ja vähemmän kuin 1 paino-% uudelleen kiteytetystä insuliinista. Komponentin b) määrä voi olla kummassakin tapauksessa 4 - 8 %. Komponentti b) voidaan edelleen hajottaa useiksi proteiineiksi, joilla on likimain sama molekyylikoko, mutta jotka eroavat varauksensa puolesta^ Tämä on osoitettu käyttämällä anioninvaihtoainetta DEAE Sephadex k-'A 50 ja komponentin b) (härkä) liuosta 7-m virtsa-aineliuoksessa, joka on puskuroitu 0,04-m TRIS:illä (tris(hydroksimetyyli)-aminometaani) pH-arvoon 7,7, NaCl-gradientti 0 - 0,2-m, ks. kuvio 1, jossa huiput numero 4, 6 ja 7 vastaavat tunnettuja aineita: vastaavasti proinsu-liinia, välituotetta ja dimeeriä. Muita aineita ei ole vielä identifioitu. Nämä aineet voidaan kaikki erottaa liuoksistaan tunnettu-jen menetelmien avulla.One known method for separating protein molecules of different sizes is to dissolve the protein mixture in a solvent in which the molecules dissociate and pass the solution through a molecular sieve, e.g. a column of organic matter cross-linked into a three-dimensional network of defined pore size. It has been shown that crystalline insulin dissolved in 1 m acetic acid can be fractionated on components a), b) and c) using a Sephadex ® G-50 column, respectively. These components can be separated from their solutions by conventional methods, e.g. by salting out of solution, precipitating with a neutral zinc salt, drying by cooling, etc. The amount of component a) can be 2-5% by weight of crystallized insulin and less than 1% by weight of recrystallized insulin. The amount of component b) can in each case be from 4 to 8%. Component b) can be further broken down into several proteins of approximately the same molecular size but different in charge ^ This has been demonstrated using the anion exchanger DEAE Sephadex k-'A 50 and a solution of component b) (bull) in a 7-m urea solution which is buffered with 0.04 m TRIS (tris (hydroxymethyl) aminomethane) to pH 7.7, NaCl gradient 0-0.2 m, cf. Figure 1, where peaks number 4, 6 and 7 correspond to known substances: proinsulin, intermediate and dimer, respectively. No other substances have been identified yet. These substances can all be separated from their solutions by known methods.
: Komponentti c) voidaan- hajottaa ioninvaihtokromatografiän avulla. Se sisältää pääfraktion, joka on puhdasta insuliinia, mono-desamido-insuliinia sekä fraktion, jota tässä kutsutaan "arginiini-insuliiniksi", koska se sisältää enemmän arginiinia kuin insulii-nimolekyylissä läsnäolevan määrän. Mono-desamidoinsuliinin fraktio komponentissa c) vaihtelee ja on riippuvainen insuliinin "alkuperästä". Komponenttia c) on yleensä 3-10 paino-%. Arginiini-insu-liinia voi olla 2-3 paino-% komponentista c).: Component c) can be decomposed by ion exchange chromatography. It contains the major fraction, which is pure insulin, mono-desamido insulin, and a fraction referred to herein as "arginine insulin" because it contains more arginine than the amount present in the insulin molecule. The fraction of mono-desamido insulin in component c) varies and depends on the "origin" of the insulin. Component c) is generally from 3 to 10% by weight. Arginine-insulin may be 2-3% by weight of component c).
* Kuvioissa 2a ja 2b on esitetty tulokset fraktioista, jolloin : kuvio 2a esittää graafisesti uudelleen kiteytetylle insuliinille ; suoritettua geelisuodatusta: Sephadex® G 50, 1-m etikkahappo; abs- kissalla on tilavuus, ja ordinaatalla absorptio. Kuvio 2b esittää : graafisesti kuvion 2a fraktiolle C anioninvaihtajaa käyttäen suo- • ritettua kromatografiaa; abskissalla on tilavuus ja ordinaatalla absorptio.* Figures 2a and 2b show the results of the fractions, where: Figure 2a shows graphically for recrystallized insulin; gel filtration performed: Sephadex® G 50, 1-m-acetic acid; the abscissa has volume, and the ordinate has absorption. Figure 2b shows: graphically the chromatography of fraction C of Figure 2a using an anion exchanger; the abscissa has volume and the ordinate has absorption.
7313073130
Kuviossa 2c on esitetty fraktioiden komponentit sellaisina kuin ne on saatu polyakryyliamidigeeli-elektroforeesin (PAGE) avulla, joka on suoritettu levymenetelmän mukaan, jonka ovat kuvanneet Ornstein ja Davis, käyttäen 7,5 % polyakryyliamidia ja pH-arvoa 8,9.Figure 2c shows the components of the fractions as obtained by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) performed according to the plate method described by Ornstein and Davis using 7.5% polyacrylamide and pH 8.9.
On todettu, että organismi sietää uusia insuliinivalmisteita yllättäen paremmin kuin tunnettuja insuliinivalmisteita. Selitys tähän on siinä, että tunnetuissa insuliinivalmisteissa läsnäolevat komponentit a) ja b) sisältävät ei-odotetusti voimakkaasti antigeenisiä ja ilmeisesti diabetogeenisiä aineita, kun taas uudet insu-liinivalmisteet ovat yllättäen ei-antigeenisiä.It has been found that new insulin preparations are surprisingly better tolerated by the body than known insulin preparations. The explanation for this is that components a) and b) present in known insulin preparations unexpectedly contain highly antigenic and apparently diabetogenic substances, while the new insulin preparations are surprisingly non-antigenic.
Suoritetuissa myrkyllisyyskokeissa käytettiin koe-eläiminä kaniineja, koska ne osoittavat samantyyppistä seerumin vasta-aine-reaktiota kuin ihmiset, kun niitä käsitellään tunnetuilla insulii-nivalmisteilla, so. samanlaisia vasta-aineen ominaisuuksia insuliinin sitomiskapasiteettiin ja insuliiniin kohdistuvaan affiniteettiin nähden. (Marsut tuottaisivat vasta-aineita, joilla on paljon suurempi aktiviteetti ja kapasiteetti. Kaniineissa muodostunut insuliini eroaa ihmisessä muodostuneesta insuliinista vain B 30-asemassa, joka on seriini kaniineilla ja treoniini ihmisillä. Marsu-insuliini eroaa toisaalta ihmis-insuliinista 18-asemassa).In the toxicity studies performed, rabbits were used as experimental animals because they show the same type of serum antibody response as humans when treated with known insulin preparations, i. similar antibody properties with respect to insulin binding capacity and insulin affinity. (Guinea pigs would produce antibodies with much higher activity and capacity. Insulin produced in rabbits differs from human insulin only at position B 30, which is serine in rabbits and threonine in humans. Guinea pig insulin, on the other hand, differs from human insulin at position 18).
Kaniineihin ruiskutettiin kolmesti viikossa vakio proteiini-annos, 40 μq liuotettuna 1 ml:ssa 0,04-m natriumfosfaattipuskuri-liuosta pH-arvossa 7,4. Kysymyksen ollessa insuliinista, tämä määrä vastaa noin 0,5 kansainvälistä yksikköä kiloa kohti, mikä on likimain keskimääräinen annossuuruus sokeritaudin hoidossa. Seerumin vasta-ainemäärät tutkittiin säännöllisin väliajoin tavanomaisia me- 1 25 netelmiä käyttäen. Määrä ilmaistaan sinä %-määränä lisätystä I-insuliinista (nauta), joka on sitoutunut näytteessä oleviin vasta-aineisiin. Eräitä tuloksia on esitetty kuviossa 3.Rabbits were injected three times a week with a constant dose of protein, 40 μq dissolved in 1 ml of 0.04 M sodium phosphate buffer solution at pH 7.4. In the case of insulin, this amount corresponds to about 0.5 international units per kilogram, which is approximately the average dose for the treatment of diabetes. Serum antibody levels were examined at regular intervals using standard methods. The amount is expressed as the% of insulin I (bovine) added that is bound to the antibodies in the sample. Some results are shown in Figure 3.
Abskissalla päivien lukumäärä, ordinaatalla % sitoutunutta 125 I-insuliinia (nauta). Käyrä 1: komponentti a) (nauta), käyrä 2: komponentin b) fraktio 3 (kuvio 1, nauta), käyrä 3: dimeeri (nauta), käyrä 4: proinsuliini (nauta), käyrä 5: uudelleen kiteytetty insuliini (nauta), käyrä 6: puhdas insuliini (nauta).Abscissa number of days, ordinate% bound 125 I insulin (cattle). Curve 1: component a) (cattle), curve 2: fraction 3 of component b) (Figure 1, cattle), curve 3: dimer (cattle), curve 4: proinsulin (cattle), curve 5: recrystallized insulin (cattle) , curve 6: pure insulin (bovine).
7 731 307,731 30
Tuloksista on kaksi erittäin yllättäviä ja odotusten vastaisia : 1. Insuliinivalmiste, joka käsittää uuden puhtaan insuliinin, ei aikaansaa vasta-aineita insuliinia vastaan.Two of the results are very surprising and unexpected: 1. An insulin preparation comprising a new pure insulin does not produce antibodies against insulin.
2. Komponentti a), joka ei ole insuliinia, aiheuttaa tavattoman runsaan vasta-aineen muodostuksen insuliinia vastaan. Todennäköisin selitys tähän on se, että se sisältää jotain, joka on toistaiseksi tuntemattomalla tavalla kemiallisesti sukua insuliinille.2. Component a), which is not insulin, causes the formation of an abundant amount of antibody against insulin. The most likely explanation for this is that it contains something that is chemically unrelated to insulin in a hitherto unknown way.
3. Tavallinen erittäin puhdas insuliini, so. uudelleen kiteytetty insuliini synnyttää vasta-aineita kuten se tekee ihmisissäkin.3. Ordinary very pure insulin, i.e. recrystallized insulin generates antibodies as it does in humans.
4. Aineet, jotka kuuluvat komponenttiin b), nimittäin n:o 3 (katso kuviota 1), dimeeri ja proinsuliini, ovat antigeenisiä aiheuttaen vasta-aineiden muodostumisen insuliinia vastaan.4. The substances belonging to component b), namely No. 3 (see Figure 1), dimer and proinsulin, are antigenic, causing the formation of antibodies against insulin.
Kuviossa ei ole esitetty sitä havaintoa, että komponentin c) "arginiini-insuliini" tuotti vähäisen, mutta merkittävän määrän vasta-ainetta 45 päivän jälkeen.The figure does not show the finding that the "arginine-insulin" of component c) produced a small but significant amount of antibody after 45 days.
Sietokokeen kuluessa ilmeni eräissä kaniineissa pyrkimystä kohonneiden verisokeriarvojen muodostumiseen, nimittäin niissä kaniineissa, joihin oli ruiskutettu komponenttia b), ja erityisesti niissä kaniineissa, jotka olivat saaneet yhtä komponentin b) frak-tioista, nimittäin dimeeriä. Dimeeri ei aikaansaa suurinta vasta--· aineiden määrää, mutta tuntemattomista syistä olivat verensokeriar- vot näissä eläimissä korkeimmat. Tätä komponentin b) ja dimeerin vaikutusta voidaan kutsua diabetogeeniseksi tai anti-insuliinin tapaiseksi, sillä itse asiassa näyttää siltä, että eläimet ovat tulleet vastustuskykyisiksi insuliinia vastaan, kuten kuviossa 4 on esitetty. Abskissalla minuutit insuliini-injektion antamisen jälkeen, ordinaatalla seerumin glukoosi mg/100 ml. Käyrä 1: dimeeri (nauta), käyrä 2: puhdas insuliini (nauta).In the course of the tolerance test, some rabbits showed a tendency to form elevated blood glucose levels, namely in those rabbits injected with component b), and in particular in those rabbits which had received one of the fractions of component b), namely dimer. The dimer does not produce the greatest amount of antibodies, but for unknown reasons, blood glucose levels were highest in these animals. This effect of component b) and the dimer can be called diabetogenic or anti-insulin-like, because in fact it seems that the animals have become resistant to insulin, as shown in Figure 4. Abscess minutes after insulin injection, ordinate serum glucose mg / 100 ml. Curve 1: dimer (bovine), curve 2: pure insulin (bovine).
14 viikkoa kestäneen dimeerillä käsittelyn (nauta, 40 ^g kolmessa viikossa) jälkeen kaniinit paastosivat 16 tuntia ja sen jäl-; keen niille annettiin suonensisäisesti insuliinia (0,5 kansainvälis tä yksikköä kiloa kohti). Kaniinien vertailuryhmää oli käsitelty valmisteella, joka sisälsi puhdasta insuliinia. Kuviossa 4 esitetyistä seerumi-glukoosikäyristä käy ilmi, että vertailukaniinit rea-: goivat insuliiniin odotetulla tavalla, kun taas komponentista b) saadulla dimeerillä käsitellyt kaniinit olivat vastustuskykyisiä insuliinia vastaan. Vastustuskyky voi selittää veren sokeriarvojen 8 73130 kohoamisen, mutta itse ilmiötä ei ole vielä selvitetty. Se näyttää olevan samanlainen kuin vastustuskyky, joka kehittyy eräissä potilaissa käsittelyn aikana hoidettaessa heitä tunnetuilla insuliini-valmisteilla. Otaksutaan, että kliininen vastustuskyky voidaan välttää käyttämällä insuliinivalmisteita, jotka ovat vapaat komponentista b) ja dimeeristä.After 14 weeks of dimer treatment (cattle, 40 μg in three weeks), the rabbits fasted for 16 hours and after; they were given intravenous insulin (0.5 international units per kilogram). The control group of rabbits had been treated with a preparation containing pure insulin. The serum-glucose curves shown in Figure 4 show that the control rabbits reacted to insulin as expected, while the rabbits treated with the dimer from component b) were resistant to insulin. Resistance may explain the rise in blood sugar levels of 8,731,130, but the phenomenon itself has not yet been elucidated. It appears to be similar to the resistance that develops in some patients during treatment when treated with known insulin preparations. It is believed that clinical resistance can be avoided by using insulin preparations that are free of component b) and dimer.
Edellä esitettyjen havaintojen hyväksikäyttämiseksi, jotka koskevat kaupallisessa insuliinissa läsnäolevien epäpuhtauksien biologisia ominaisuuksia, insuliini puhdistetaan määrässä, jota ei ole toistaiseksi käytetty kaupallisessa mittakaavassa. Välttämätön puhdistaminen voidaan suorittaa periaatteessa hyvin monenlaisten menetelmien avulla, joilla proteiinit voidaan puhdistaa; suositeltava menetelmä on puhdistaminen geelisuodattamalla ja pylväskromato-grafoimalla.To take advantage of the above findings regarding the biological properties of impurities present in commercial insulin, insulin is purified in an amount not yet used on a commercial scale. The necessary purification can in principle be carried out by a wide variety of methods by which proteins can be purified; the preferred method is purification by gel filtration and column chromatography.
Lähtöaineena käytetyn insuliinin sisältämien haimasta peräisin olevien proteiinien, joiden molekyylipaino on yli noin 6000, poistaminen voidaan aikaansaada suorittamalla insuliinille geelisuo-datus. On edullista suorittaa geelisuodatus vesipitoisessa väliaineessa, joka voi sisältää veden kanssa sekoittuvia ei-vesimäisiä nesteitä, mutta haluttaessa on myöskin mahdollista suorittaa geeli-suodatus orgaanisissa liuottimissa, jotka sisältävät jonkin verran vettä. Vesipitoista väliainetta käytettäessä on suositeltava pH-alue 2-4. Insuliinin stabiliteetti pH-arvon 2 alapuolella ja pH-arvon 9 yläpuolella on heikko, joten insuliinin degradaatiotuottei-ta muodostuu prosessin aikana näillä pH-alueilla. Hyvin alhainen tai hyvin korkea pH on tämän vuoksi vähemmän sopiva. pH-aluetta 4 -9 voidaan käyttää, jos insuliinin liukoisuutta parannetaan, esim. lisäämällä virtsa-ainetta, jolla myöskin on kyky hajoittaa assosi-aatiotuotteita, joita voi muodostua insuliinimolekyylien välillä ja insuliinimolekyylien ja epäpuhtauksien välillä neutraalin reaktion vaiheilla. Työskenneltäessä alhaisessa pH-arvossa on orgaanisen hapon/ kuten etikkahapon käyttäminen suositeltavaa pH:n säätämiseksi, mutta voidaan myös käyttää väkeviä mineraalihappoja, 0,5 - 4-m etikkahapon konsentraatio on edullinen.Removal of pancreatic proteins with a molecular weight greater than about 6000 contained in the starting insulin can be accomplished by subjecting the insulin to gel filtration. It is preferred to perform gel filtration in an aqueous medium which may contain water-miscible non-aqueous liquids, but if desired, it is also possible to perform gel filtration in organic solvents containing some water. When using an aqueous medium, a pH range of 2-4 is recommended. The stability of insulin below pH 2 and above pH 9 is poor, so insulin degradation products are formed during the process in these pH ranges. Very low or very high pH is therefore less suitable. The pH range of 4-9 can be used if the solubility of insulin is improved, e.g. by adding a urea which also has the ability to degrade the association products that may form between insulin molecules and between insulin molecules and impurities during the neutral reaction steps. When working at low pH, the use of an organic acid / such as acetic acid is recommended to adjust the pH, but concentrated mineral acids may also be used, with a concentration of 0.5 to 4 m acetic acid being preferred.
9 73130 Lämpötila ei ole kriittinen geelisuodatukselle ja sitä rajoittavat pääasiallisesti insuliinin stabiliteetti ja liukoisuus. Tällöin on edullista työskennellä suunnilleen huoneen lämpötilassa, esim. välillä 20 - 25°C. Fraktiot, jotka eluoituvat ennen insuliinia sisältävää komponenttia c), heitetään pois. Komponentin c) fraktiot, jotka ovat vapaat aineesta, jonka molekyylipaino on suurempi kuin 6000, yhdistetään ja insuliini voidaan ottaa talteen, esim. haihduttamalla, suolaamalla pois liuoksesta tai saostamalla sinkki-ioneilla. Insuliinia voidaan käyttää sellaisenaan tai kiteytyksen jälkeen farmaseuttisten insuliinivalmisteiden valmistukseen.9,73130 Temperature is not critical to gel filtration and is primarily limited by insulin stability and solubility. In this case, it is advantageous to work at approximately room temperature, e.g. between 20 and 25 ° C. Fractions eluting before insulin-containing component c) are discarded. Fractions of component c) which are free of a substance with a molecular weight greater than 6000 are combined and insulin can be recovered, e.g. by evaporation, salting out of solution or precipitation with zinc ions. Insulin can be used as such or after crystallization for the preparation of insulin pharmaceutical preparations.
Keksinnön mukaisesti poistetaan myös insuliinia muistuttavat aineet, joilla on miltei sama molekyylipaino kuin insuliinilla, mutta jotka hiukan eroavat insuliinista kemiallisen koostumuksensa puolesta, esimerkiksi mono-desamido-insuliini, ja aine, joka näyttää olevan insuliinin arginiinijohdannainen. Suositeltava menetelmä ar-giniinijohdannaisen ja deamidoituneen insuliinin poistamiseksi on pylväskromatografia ioninvaihtoainetta käyttäen. Melkein kaikkia kaupasta saatavia ioninvaihtajia, jotka sallivat insuliinimolekyylin läpitunkeutumisen, voidaan käyttää edellyttäen, että menetelmä suoritetaan väliaineessa, jossa insuliinimolekyylit eivät muodosta aggregaatteja keskenään tai epäpuhtauksien kanssa.According to the invention, insulin-like substances which have almost the same molecular weight as insulin but which differ slightly from insulin in terms of their chemical composition, for example mono-desamido insulin, and a substance which appears to be an arginine derivative of insulin are also removed. The preferred method for removing the arginine derivative and deamidated insulin is column chromatography using an ion exchanger. Almost all commercially available ion exchangers that allow the penetration of an insulin molecule can be used, provided that the method is performed in a medium in which the insulin molecules do not form aggregates with each other or with impurities.
Seuraavassa taulukossa on esitetty esimerkkejä sopivista aineista insuliinin puhdistamiseksi.The following table provides examples of suitable agents for purifying insulin.
10 731 3 010 731 3 0
Pylvään täytteet insuliinin kromatograafista puhdistamista vartenColumn packings for chromatographic purification of insulin
Aineet Sideaineet Synteettiset Johdetut luonnon yhdisteistäSubstances Binders Synthetic Derived from natural compounds
Polyak- Poly- Poly- Dekst- Sellu- Algiini- ryyli- sty- akryy- raani, loosa happo amidi reeni lihap- risti- po kytket tyPolyac- Poly- Poly- Dexst- Cellulose- Algine- ryl- sty-acrylic, loose acid amide rhenium meat press-type
Geelisuodatus- Bio-Gel Sephadex aineet P-10 G 50Gel filtration- Bio-Gel Sephadex substances P-10 G 50
Bio-Gel Sephadex P-30 G 75Bio-Gel Sephadex P-30 G 75
Anioninvaihta- jalajit Dowex 1 QAE-Anion exchanger species Dowex 1 QAE
SephadexSephadex
Voimakkaasti emäksisiä ryhmiäStrongly basic groups
Heikosti DEAEWeakly DEAE
emäksisiä Bio-Gel DEAE- sellu- ryhmiä DM Sephadex loosabasic Bio-Gel DEAE pulp groups DM Sephadex loosa
Ratio- Voiirak- Dowex SE- Fosfory- nin kaasti 50 W Sephadex loitu vaihta- happamia sellu- jala- ryhmiä loosa j itRatio- Butter- Dowex SE- Phosphorin Dew 50 W Sephadex Found Exchangeable Acid Pulp Groups Loose
Heikosti Bio-Gel Amber- CM- CM-sel- Algiini- happamia CM lite Sephadex luloosa happo ryhmiä CG 50Weakly Bio-Gel Amber- CM- CM-sel- Alginic acid CM lite Sephadex Lulose acid groups CG 50
Ioninvaihtoprosessi voidaan suorittaa vettä sisältävällä orgaanisella liuotineluentilla ja on edullista, että orgaaninen liuotin on veden kanssa sekoittuva. Esimerkkejä tällaisista liuottimista ovat tetrametyylivirtsa-aine, dimetyyliformamidi, dioksaani, veden kanssa sekoittuvat ketonit, kuten asetoni, sekä alemmat alkoholit, kuten metanoli, etanoli ja propanolit. Edullisia ovat alkoholit, joita voidaan käyttää konsentraatiossa 30-80 % (til./til.), edullisesti konsentraatioissa 50 - 70 % (til./til.).The ion exchange process can be performed with an aqueous organic solvent eluent, and it is preferred that the organic solvent be miscible with water. Examples of such solvents are tetramethyl urea, dimethylformamide, dioxane, water-miscible ketones such as acetone, and lower alcohols such as methanol, ethanol and propanols. Preferred are alcohols which can be used in a concentration of 30-80% (v / v), preferably in concentrations of 50-70% (v / v).
„ 73130„73130
Kun eluentti sisältää vähemmän kuin 50 % (til./til.) veden kanssa sekoittuvaa orgaanista liuotinta, voidaan sitä kutsua vesipitoiseksi väliaineeksi ja sellaisissa tapauksissa orgaaninen liuotin voidaan korvata virtsa-aineella käytettynä sellaisessa määrässä, että saadaan 4 - 8-molaarisia, edullisesti noin 7-molaarisia liuoksia. Käytettäessä virtsa-aineen liuosta on sen oltava vapaa ammo-niumsyanaatista, koska syanaatti-ioni reagoi insuliinimolekvylissä olevan aminoryhmän kanssa.When the eluent contains less than 50% (v / v) of a water-miscible organic solvent, it may be referred to as an aqueous medium, in which case the organic solvent may be replaced by urea used in an amount to give 4 to 8 molar, preferably about 7 -molar solutions. When a urea solution is used, it must be free of ammonium cyanate because the cyanate ion reacts with the amino group in the insulin molecule.
Eluentti sisältää aina puskuriainetta eluentin pH-arvon säätämiseksi. On edullista työskennellä vakio pH-arvossa. Käytettäessä kationinvaihtajaa on eluentin pH-arvon oltava välillä 3 - 6,5, edullisesti välillä 4-6, ja käytettäessä anioninvaihtajaa on eluentin pH-arvon oltava välillä 5,5 - 10, edullisesti välillä 6-9.The eluent always contains a buffering agent to adjust the pH of the eluent. It is preferable to work at a constant pH. When a cation exchanger is used, the pH of the eluent must be between 3 and 6.5, preferably between 4 and 6, and when an anion exchanger is used, the pH of the eluent must be between 5.5 and 10, preferably between 6 and 9.
Mainitut pH-arvot mitataan lasielektrodilla, joka on tavalliseen tapaan säädetty standardipuskuriliuokseen nähden.Said pH values are measured with a glass electrode adjusted in the usual way relative to the standard buffer solution.
Sopivia puskuriaineita voidaan löytää käytettävissä olevasta kirjallisuudesta.Suitable buffers can be found in the available literature.
On edullista, että lämpötila on verraten vakio ioninvaihto-operation aikana. Lämpötila voidaan valita väliltä -10 - 40°C, edullisesti väliltä 0 - 30°C, paitsi silloin kun eluentti on virtsa-aineen vesiliuos, jolloin on edullista pitää lämpötila 5°C:n alapuolella.It is preferred that the temperature be relatively constant during the ion exchange operation. The temperature may be selected from -10 to 40 ° C, preferably from 0 to 30 ° C, except when the eluent is an aqueous solution of the urea, in which case it is preferable to keep the temperature below 5 ° C.
Puhdistusprosessissa käytetään insuliinilähtöaineena yleensä kaupallista insuliinia, so. amorfista insuliinia tai kiteistä insuliinia, joka on voitu kiteyttää useita kertoja. Voidaan myös käyttää raakaa insuliinia, kuten insuliinia sisältävää suolakakkua, jota muodostuu otettaessa insuliinia talteen haimarauhasista ja joka yleensä sisältää 10-30 paino-% insuliinia, mutta suuret epäpuhtaus-pitoisuudet tekevät tämän lähtöaineen vähemmän sopivaksi keksinnön mukaiseen puhdistukseen. Parempaa lähtöainetta voidaan saada suorittamalla suolakakun liuokselle isoelektrinen saostus säätämällä liuoksen pH arvoon 5,5 ja erottamalla sakka sentrifugoimalla.In the purification process, commercial insulin is generally used as the insulin starting material, i.e. amorphous insulin or crystalline insulin that may have been crystallized several times. Crude insulin can also be used, such as insulin-containing salt cake, which is formed upon recovery of insulin from the pancreas and which generally contains 10-30% by weight of insulin, but high impurity concentrations make this starting material less suitable for purification according to the invention. A better starting material can be obtained by subjecting the salt cake solution to isoelectric precipitation by adjusting the pH of the solution to 5.5 and separating the precipitate by centrifugation.
Puhdistusvaiheiden tuloksena on aina sellainen puhdistettu insuliiniliuosfraktio, josta insuliini voidaan ottaa talteen tavalliseen tapaan, esim. haihduttamalla, suolaamalla pois liuoksesta tai saostamalla sinkki-ionien läsnäollessa. Insuliini voidaan haluttaessa kiteyttää ja siitä voidaan valmistaa injektoitavia insuliinival-misteita kuten alalla on tunnettua.The purification steps always result in a purified insulin solution fraction from which the insulin can be recovered in the usual way, e.g. by evaporation, salting out of solution or precipitation in the presence of zinc ions. If desired, insulin can be crystallized and prepared into injectable insulin preparations as is known in the art.
,2 731 30, 2,731 30
Keksinnön mukaista insuliinin puhdistusta selostetaan ~au-raavien esimerkkien avulla.The purification of insulin according to the invention is described by means of the following examples.
Esimerkki 1a 5 kg hienolaatuista Sephadex® G 50 (valmistaja PHARMACIA, Upsala, Ruotsi) turvotetaan 1-m etikkahapossa ja hienoimmat osaset poistetaan dekantoimalla. Ainetta käytetään pylvään pakkaamiseen, jonka halkaisija on 15 cm ja korkeus 130 cm. Pylväs tasapainoite-taan 1-m etikkahapolla.Example 1a 5 kg of fine quality Sephadex® G 50 (manufactured by PHARMACIA, Uppsala, Sweden) are swollen in 1 m acetic acid and the finest particles are removed by decantation. The substance is used for packing a column with a diameter of 15 cm and a height of 130 cm. The column is equilibrated with 1 M acetic acid.
10 g sian insuliinia, joka on kiteytetty kertaalleen sitraat-tipuskuriliuoksesta, liuotetaan seokseen, jossa on 390 ml 1-m etik-kahappoa ja 8 ml 1-n hydrokloridia. Tämä liuos kaadetaan pylvääseen. Eluointi suoritetaan 1-m etikkahapolla nopeudella 1 litra/tunti.10 g of porcine insulin, crystallized once from the citrate-drop buffer solution, are dissolved in a mixture of 390 ml of 1-acetic acid and 8 ml of 1-n hydrochloride. This solution is poured onto a column. Elution is performed with 1 M acetic acid at a rate of 1 liter / hour.
200 ml:n suuruiset fraktiot kootaan.Collect 200 ml fractions.
Ekstinktiot arvolla 276 nm mitataan ja esitetään graafisesti, jolloin fraktionumerot ovat abskissalla. Fraktiot, jotka vastaavat insuliinihuipun (korkeimman huipun) keskeistä pääosaa, yhdistetään ja insuliini saostetaan lisäämällä 200 g natriumkloridia yhtä litraa kohti nestettä. Sakka erotetaan sentrifugoimalla ja sille suoritetaan tunnettuun tapaan isoelektrinen saostus ja kiteytys asetaat-tia sisältävästä sitraattipuskuriliuoksesta. Saanto on 8 g kiteistä insuliinia, joka on vapaa haima-alkuperää olevista proteiineista, joiden molekyylipaino on yli noin 6000.Extinctions at 276 nm are measured and plotted with fraction numbers on the abscissa. The fractions corresponding to the major part of the insulin peak (highest peak) are combined and the insulin is precipitated by adding 200 g of sodium chloride per liter of liquid. The precipitate is separated by centrifugation and subjected to isoelectric precipitation and crystallization from a citrate buffer solution containing acetate in a known manner. The yield is 8 g of crystalline insulin, which is free of proteins of pancreatic origin with a molecular weight of more than about 6000.
Esimerkki 1bExample 1b
Kiteinen puhdistettu insuliini, joka on saatu esimerkissä la kuvatulla tavalla, puhdistetaan edelleen ioninvaihtokromatografiän avulla käyttäen Amberlite-ioninvaihtohartsia. Valmistetaan virtsa-aineen 7-m liuoksia ja ne deionisoidaan johtamalla ne sekakerros-ioninvaihtohartsia (Amberlite MB-1) sisältävien pylväiden läpi. Tätä deionisoitua virtsa-ainetta käytetään sen jälkeen puskuriliuoksen valmistukseen: 0,13-m natriumfosfaatti - 7-m virtsa-aine - 1 % n-butanoli, pH 6,00 25°C:ssa. Puskuriliuos säilytetään ja käytetään 4,0°C:ssa, 1,5 kg Amberlite CG 50 Type II käsitellään seuraavilla aineilla: 1) vesi; 2) asetoni; 3) vesi + natriumhydroksidi; 4) vesi; 5) vesi + hydrokloridi ja 6) vesi. Pestyä hartsia suspendoidaan 5 litraan puskuriliuosta. Suspension pH laskee välittömästi ja aina muutaman minuutin päästä lisätään noin 30 ml:n suuruiset annokset 40-% (paino/til.) hydrokloridia pH:n pitämiseksi arvossa noin 6,0.The crystalline purified insulin obtained as described in Example 1a is further purified by ion exchange chromatography using Amberlite ion exchange resin. 7-m solutions of urea are prepared and deionized by passing them through columns containing a mixed layer of ion exchange resin (Amberlite MB-1). This deionized urea is then used to prepare a buffer solution: 0.13-m sodium phosphate - 7-m urea - 1% n-butanol, pH 6.00 at 25 ° C. The buffer solution is stored and used at 4.0 ° C, 1.5 kg of Amberlite CG 50 Type II is treated with the following substances: 1) water; 2) acetone; 3) water + sodium hydroxide; 4) water; 5) water + hydrochloride and 6) water. The washed resin is suspended in 5 liters of buffer solution. The pH of the suspension decreases immediately and after every few minutes about 30 ml portions of 40% (w / v) hydrochloride are added to maintain the pH at about 6.0.
13 731 3013,731 30
Kun suspension pH pysyy arvossa 6,00 15 minuutin hämmentämisen jälkeen, hämmennetään seosta yli yön 4°C:ssa. Hartsi suodatetaan ja pestään 30 litralla puskuriliuosta 8 tunnin ajan. Lopullisen suo-doksen pH-arvon tulee olla sama kuin sisäänvirtaavan puskuriliuoksen. Tätä materiaalia käytetään pylvään täyttämiseksi, jonka halkaisija on 7,5 cm ja korkeus 80 cm. Pylväs tasapainotetaan puskuri-liuoksen avulla.When the pH of the suspension remains at 6.00 after stirring for 15 minutes, the mixture is stirred overnight at 4 ° C. The resin is filtered and washed with 30 liters of buffer solution for 8 hours. The pH of the final filtrate should be the same as that of the inflowing buffer solution. This material is used to fill a column with a diameter of 7.5 cm and a height of 80 cm. The column is equilibrated with buffer solution.
15 g insuliinia, joka on valmistettu esimerkissä 1a kuvatun menetelmän avulla, pannaan pylvääseen 10-% (paino/til.) liuoksena puskuriliuoksessa. Eluointi suoritetaan puskuriliuoksella 4°C:n lämpötilassa ja nopeudella 200 ml/tunti. 100 ml:n suuruiset fraktiot kootaan.15 g of insulin prepared by the method described in Example 1a are applied to the column as a 10% (w / v) solution in a buffer solution. Elution is performed with a buffer solution at a temperature of 4 ° C and a rate of 200 ml / hour. Collect 100 ml fractions.
Ekstinktiot arvolla 276 nm mitataan ja esitetään graafisesti, jolloin fraktionumerot ovat abskissalla. Fraktiot, jotka vastaavat insuliinihuipun (korkeimman huipun) keskeistä pääosaa, yhdistetään ja insuliini saostetaan lisäämällä 2 litraa vettä, 15 ml 4-n hydrokloridia ja 600 g natriumkloridia litraa kohti nestettä. Sakka erotetaan sentrifugoimalla ja sille suoritetaan tunnettuun tapaan isoelektrinen saostus ja kiteytys asetonia sisältävästä sitraattipuskuriliuoksesta.Extinctions at 276 nm are measured and plotted with fraction numbers on the abscissa. The fractions corresponding to the major part of the insulin peak (highest peak) are combined and the insulin is precipitated by adding 2 liters of water, 15 ml of 4-n hydrochloride and 600 g of sodium chloride per liter of liquid. The precipitate is separated by centrifugation and subjected in a known manner to isoelectric precipitation and crystallization from a citrate buffer solution containing acetone.
Saanto on 10 g kiteistä insuliinia, joka sisältää vain yhtä komponenttia suoritettaessa sille polyakryyliamidigeelielektrofo-reesi. Kiteinen insuliini on toisin sanoen katsottava puhtaaksi insuliiniksi.The yield is 10 g of crystalline insulin containing only one component when subjected to polyacrylamide gel electrophoresis. In other words, crystalline insulin must be considered as pure insulin.
Claims (2)
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB3808168 | 1968-08-09 | ||
GB38081/68A GB1285023A (en) | 1968-08-09 | 1968-08-09 | Improvements in or relating to injectable insulin preparations |
FI227669 | 1969-07-31 | ||
FI227669 | 1969-07-31 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI793110A FI793110A (en) | 1979-10-08 |
FI73130B FI73130B (en) | 1987-05-29 |
FI73130C true FI73130C (en) | 1987-09-10 |
Family
ID=26156582
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI750290A FI52522C (en) | 1968-08-09 | 1975-02-03 | FOERFARANDE FOER RENING AV INSULIN |
FI793110A FI73130C (en) | 1968-08-09 | 1979-10-08 | Process for the preparation of purified insulin suitable for the preparation of clinically useful injectable insulin preparations. |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI750290A FI52522C (en) | 1968-08-09 | 1975-02-03 | FOERFARANDE FOER RENING AV INSULIN |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
FI (2) | FI52522C (en) |
-
1975
- 1975-02-03 FI FI750290A patent/FI52522C/en not_active IP Right Cessation
-
1979
- 1979-10-08 FI FI793110A patent/FI73130C/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FI750290A (en) | 1975-02-03 |
FI52522C (en) | 1979-05-15 |
FI52522B (en) | 1977-06-30 |
FI73130B (en) | 1987-05-29 |
FI793110A (en) | 1979-10-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FI66751C (en) | FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV ETT STABILT INSULINPREPARATMED LAONGTIDSVERKAN | |
DE69519454T2 (en) | Protein that induces interferon gamma production and monoclonal antibodies against it | |
FR2501692A1 (en) | NEW ERYTHROPOIETIN PRODUCT AND PROCESS FOR PREPARING THE SAME | |
JPH11506739A (en) | Method for reducing gelation of fatty acid acylated proteins | |
EP0061138B1 (en) | Angiotropins of leukocytes and inflamed tissue: a new class of natural chemotropic protein mitogens for specific induction of directional growth of blood vessels, neovascularization of tissues and morphogenesis of blood vessel patterns, process for their biotechnical preparation and pharmaceutical compositions | |
DE3922089A1 (en) | NEW PROTEINS AND THEIR PRODUCTION | |
EP1781697A2 (en) | Novel carbamylated epo and method for its production | |
NO304190B1 (en) | Pure parathyroid hormone, process for its preparation as well as pharmaceutical composition containing it | |
JPS6222799A (en) | Novel polypeptide having blood anticoagulant action | |
KR930003665B1 (en) | Protein purification | |
US3907676A (en) | Process for purifying insulin | |
IE912444A1 (en) | Growth hormone crystals and a process for production of these GH-crystals | |
EP1012191B1 (en) | Method for obtaining high-purity vwf or factor viii/vwf complex | |
JP2002511484A (en) | Novel protein separation method using eluent containing Ca ++ | |
JPH0381290A (en) | Manufacture of refined albumin solution | |
EP1008603B1 (en) | Soluble polypeptides consisting on the first coiled coil domain of human and mouse epimorphin. | |
JP2566919B2 (en) | Method for producing α-interferon | |
FI73130C (en) | Process for the preparation of purified insulin suitable for the preparation of clinically useful injectable insulin preparations. | |
EP0013826A1 (en) | Process for purifying insulin and insulin so prepared | |
EP0301374A2 (en) | Process for the purification of the placenta tissue protein PP4 | |
JPS6042336A (en) | Production of immunoglobulin | |
CS225117B2 (en) | The purification of insulin | |
JPH02115196A (en) | Purification of erythropoetin | |
KR100730902B1 (en) | Process for the separation of glycosylated and non-glycosylated proteins | |
DE3421731A1 (en) | Human tumour necrosis factor |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM | Patent lapsed |
Owner name: NOVO TERAPEUTISK LABORATORIUM A/S |