ES2292927T3 - Biocatalizadores inmovilizados utilizables para la produccion de nucleosidos naturales y de analogos modificados a traves de reacciones enzimaticas de transglicosilacion. - Google Patents

Abstract

Biocatalizador utilizable para las reacciones de transglicosilación, que contiene una matriz sólida funcionalizada con grupos epoxi y las enzimas uridina fosforilasa y purina nucleósido fosforilasa, caracterizado en que las enzimas uridina fosforilasa y purina nucleósido fosforilasa están coinmovilizadas en la matriz sólida mediante la formación de enlaces covalentes.

Description

Biocatalizadores inmovilizados utilizables para la producción de nucleósidos naturales y de análogos modificados a través de reacciones enzimáticas de transglicosilación.

La presente invención se refiere a la preparación de biocatalizadores nuevos utilizables en procesos industriales para la producción de nucleósidos naturales y de análogos modificados que se pueden utilizar en el campo farmacéutico como intermediarios o como productos finales, en el campo de las drogas antitumorales o antivirales, así como en la preparación de intermediarios para la síntesis de oligonucleótidos de interés terapéutico.

Se pueden producir nucleósidos naturales, compuestos análogos de nucleósidos y sus derivados, modificados de diversos modos bien con respecto al grupo ribofuranosilo o bien con respecto a la base heterocíclica unida al azúcar, mediante métodos de síntesis química convencional que, particularmente para los derivados de purina, presentan problemas relacionados con rendimientos insatisfactorios y/o estereoselectividad incompleta de la posición anomérica correcta y/o con la necesidad de utilizar reacciones para la protección/desprotección de grupos químicos lábiles y/o con el uso de métodos de purificación complejos.

A partir de la bibliografía científica y de patentes se conocen aproximaciones alternativas para la preparación de nucleósidos y análogos, que se basan en el uso de enzimas y que pueden salvar los problemas de preparación por síntesis química.

En este campo, una clase de enzimas conocidas como nucleósido fosforilasas es particularmente interesante; estas catalizan tanto la reacciones de fosforólisis (que consisten en una separación del azúcar de un nucleósido para dar el correspondiente azúcar-1-fosfato) como las reacciones inversas (que consisten en la condensación del azúcar-1-fosfato a la base de purina o pirimidina o a un aceptor heterocíclico nitrado) para formar un nuevo nucleósido. La combinación de las dos reacciones, catalizadas por dos fosforilasas con especificidades de sustrato diferentes, permite que se lleve a cabo una así llamada reacción de transglicosilación; en presencia de iones fosfato, esta consiste en la transferencia del grupo ribofuranosilo o del ribofuranosilo modificado de un nucleósido adecuado que tiene la función de un donante de azúcar a una base heterocíclica adecuada que se comporta como un aceptor de azúcar, produciendo la formación de un nucleósido nuevo según un equilibrio de reacción que depende de las características químicas/físicas de los diferentes sustratos, de sus concentraciones relativas, y de las condiciones de operativas utilizadas, tales como pH y temperatura. [Otto J.L., Werkman C.H. Coupled nucleoside phosphorylase reactions in Escherichia coli. Arch. Biochem. Biophys. 69, 264-276, 1957; Doskocil J., Holy A. Specificity of purine nucleoside phosphorylase from Escherichia coli. Collect. Czech. Chem. Commun. 42, 370-382, 1977; Utagawa T. et al., Mechanism of purine arabinoside synthesis by bacterial transarabinosylation reactions. 49 (8), 2425-2430, 1985].

En particular, se han utilizado en combinación las enzimas uridina fosforilasa o UdP (E.C. 2.4.2.3) y purina nucleósido fosforilasa o PNP (E.C. 2.4.2.1) para la preparación de nucleósidos naturales o modificados en reacciones de transglicosilación que utilizan diversos nucleósidos de pirimidina tales como, por ejemplo, uridina, 2'-deoxiuridina, 2'-3'-dideoxiuridina, o arabinofuranosil uracilo como donantes de azúcar y una variedad tanto de bases de purinas naturales o modificadas como compuestos heterocíclicos nitrados, que actúan como aceptores de azúcar. [Hutchinson D.W. New approaches to the synthesis of antiviral nucleosides. Trends Biotechnol. 8, 348-353, 1990; Hanrahan J.R. Hutchinson D.W. The enzymatic synthesis of antiviral agents. J. Biotechnol. 23, 193-2120, 1992].

El aislamiento y el estudio de UdP y PNP de diferentes especies ha mostrado que las enzimas derivadas de microorganismos procariotas tienen una especificidad de sustrato más amplia y mayor estabilidad térmica en comparación, por ejemplo, con las enzimas correspondientes aisladas de mamíferos, y son por lo tanto preferibles como catalizadores para uso industrial. [Mao C. et al., The crystal structure of E. coli purine nucleoside phosphorylase. A comparison with the human enzyme reveals a conserved topology. Structure 5, 1373-1383, 1997; Browska A. et al., Properties of purine nucleoside phosphorylase of mammalian and bacterial origin. Z. Naturforsch. 45c, 59-70, 1989].

Se han utilizado UdP y PNP aisladas de microorganismos procariotas en forma de enzimas solubles como catalizadores en reacciones de transglicosilación en fase homogénea; sin embargo, esta aproximación no es muy eficiente y está generalmente limitada a la escala del laboratorio ya que requiere el uso de enzimas purificadas que no se pueden reutilizar para ciclos de reacción sucesivos, no permite operar a temperaturas por encima de 37-40ºC, y particularmente requiere tiempos de reacción largos [Krenitsky T.A. et al., Enzymatic synthesis of purine arabinonucleosides. EP-0002192, 1979; Krenitsky T.A. et al., Purine nucleoside synthesis, an efficient method employing nucleoside phosphorylase. Biochemistry 20, 3615-3621, 1981; Krenitsky T.A. et al., An enzymic synthesis of purine D-arabinonucleosides. Carbohydrate Res. 97, 139-146, 1981; Krenitsky T.A. et al., Imidazo[4,5-c]pyridines (3-deaza purines) and their nucleosides as immunosuppressive and anti-inflammatory agents. J. Med. Chem. 29, 138-143,
1986].

El descubrimiento de que las enzimas UdP y PNP están presentes simultáneamente en el citoplasma de numerosas cepas salvajes de microorganismos pertenecientes a varios géneros, en proporciones compatibles con la función de catalizar reacciones de transglicosilación, ha sugerido su uso directo, esto es, en forma de preparaciones de células enteras, como biocatalizadores en la preparación de nucleósidos y de análogos modificados. Las ventajas de esta aproximación están representadas por la posibilidad de evitar la extracción y purificación de UdP y PNP, así como por la estabilidad de la actividad enzimática citoplásmica que permite que las reacciones de transglicosilación se lleven a cabo a temperaturas de hasta alrededor de 60ºC, favoreciendo de este modo la solubilización de los sustratos y aumentando la velocidad de reacción.

Muchos trabajos han documentado ya la aplicabilidad de las reacciones de transglicosilación catalizadas por células enteras de microorganismos que pertenecen a varias especies tales como, por ejemplo, Enterobacter aerogenes, Erwinia herbicola, Brevibacterium acetylicum, Escherichia coli, tanto a nivel de laboratorio como a escala de producción. [Utagawa et al., Properties of nucleoside phosphorylase from Enterobacter aerogenes. Agric. Biol. Chem. 49, 3239-3246, 1985; Utagawa T. Enzymatic preparation of nucleoside antibiotics. J. Molec. Catalysis B: Enzymatic 6 (3-4), 215-222, 1999; Cotticelli G. et al., Production of nucleosides by large-scale bioconversion. Nucleosides Nucleotides 18 (4-5), 1135-1136, 1999; Yokozeki K., Tsuji T. A novel enzymatic method for the production of purine-2'-deoxynucleosides. J. Molec. Catalysis B: Enzymatic, 10, 207-213, 2000].

El uso de células bacterianas enteras, que permite que las reacciones se lleven a cabo en fase heterogénea, también permite potencialmente que se recuperen las células para reciclar en sucesivas reacciones, aunque es necesario tener en cuenta la posibilidad de contaminación resultante de una lisis celular más o menos extensa y el hecho de que la recuperación de las células complica el proceso de producción, que requiere pasos adicionales de filtración y/o ultrafiltración o centrifugación. También se han descrito aproximaciones en las que el reciclado de las células utilizadas como biocatalizadores se realizó con el uso de las células preagregadas con glutaraldehído [Zinchenko A.I. et al., Synthesis of 9-(\beta-D-arabinofuranosyl) guanine using whole cells of Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 32, 658-661, 1990; Barai V.N. et al., A universal biocatalyst for the preparation of base- and sugar-modified nucleosides via an enzymatic transglycosylation. Helv. Chim. Acta 85, 1901-1907, 2002], mediante encapsulación de las células en matrices hidrofílicas [Votruba I. et al., Synthesis of 2-deoxy-\beta-D-ribonucleosides and 2-3-dideoxy-\beta-D-pentofuranosides on immobilized bacterial cells. Collect. Czech. Chem. Commun. 59, 2302-2330, 1994], o mediante incorporación de las células en resinas poliméricas hidrofóbicas [Yokozeki K. et al., Production of adenine arabinoside by gel-entrapped cells of Enterobacter aerogenes in water-organic cosolvent system. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 14, 225-231, 1982].

Finalmente, la construcción de cepas de bacterias genéticamente modificadas que pueden expresar niveles altos de formas recombinantes de las enzimas UdP y PNP, tanto por separado en células diferentes como simultáneamente en la misma célula [Bestetti G. et al., Recombinant bacterial strains for the production of natural nucleosides and modified analogues thereof. WO 00/39307, 1999] ha permitido que se obtengan microorganismos que se pueden utilizar de forma provechosa tanto para la producción de UdP y PNP [Esipov R.S. et al., Overexpression of Escherichia coli genes encoding nucleoside phosphorylases in the pET/Bl21 (DE3) system yields active recombinant enzymes. Protein Express. Purif. 24, 56-60, 2002] como para el uso de células enteras como biocatalizadores en la producción de nucleósidos naturales y análogos mediante reacciones de transglicosilación [Spoldi E. et al., Recombinant bacterial cells as efficient biocatalysts for the production of nucleosides. Nucleosides Nucleotides 20 (4-7), 977-979, 2001].

Sin embargo, generalmente se acepta que las enzimas inmovilizadas en un sustrato sólido constituyen la forma física con más ventajas para producir un biocatalizador industrial ya que permitan que las reacciones se lleven a cabo en fase heterogénea, minimizando o eliminando el problema de la contaminación por material biológico, se pueden preparar en una forma física que se puede separar fácilmente de la mezcla de reacción para su posible reutilización, facilitan el proceso para la purificación de la mezcla de reacción, y simplifican el proceso de producción ya que son compatibles con cualquier configuración del reactor para realizar reacciones tanto continuas como discontinuas. Dado que las formas enzimáticamente activas de UdP y PNP están constituidas por complejos homohexaméricos, su inmovilización en un sustrato sólido presenta una serie de problemas porque el proceso de inmovilización debe ser compatible con el mantenimiento de la configuración oligomérica activa [Pugmire M.J., Ealick S.E. Structural analyses reveal two distinct families of nucleoside phosphorylase. Biochem. J. 361, 1-25, 2002]. Se ha descrito que, en comparación con los métodos para inmovilización mediante la formación de enlaces covalentes, los métodos de inmovilización mediante adsorción no covalente típicamente alteran mucho menos las características estructurales de las enzimas y por consiguiente facilitan el mantenimiento de la enzima inmovilizada en una configuración comparable a la configuración activa natural que está presente en solución [Bailey J.E., Ollas D.F. (a cura di). Biochemical engineering fundamentals. 2ª edición, McGraw-Hill, Nueva York, 1986, pag. 157].

De acuerdo con estas indicaciones, la única forma de coinmovilización de las enzimas UdP y PNP de origen procariótico que se conoce hasta ahora se basa en adsorción mediante interacciones no covalentes de preparaciones purificadas de las enzimas en resina de DEAE celulosa básica débil. Sin embargo, esta aproximación tiene limitaciones desde el punto de vista de la aplicación industrial ya que la preparación del catalizador requiere la purificación separada de las dos enzimas antes del proceso de adsorción a la resina para eliminar la presencia de otras enzimas extrañas que serían coadsorbidas e interferirían en la reacción de transglicosilación posterior; además, la reutilización de la enzima inmovilizada está limitada a unos pocos ciclos de reacción [Averett D.R. et al., 6-Methoxypurine arabinoside as a selective and potent inhibitor of varicella-zoster virus. Antimicrob. Agents Chemother. 35 (5), 851-857, 1991; Mahmoudian M. Biocatalytic production of chiral pharmaceutical intermediates. Biocatalysis Biotransform. 18, 105-118, 2000].

Se ha encontrado ahora de forma inesperada, y constituye el principal objeto de la presente invención, que la coinmovilización de ambas enzimas UdP y PNP mediante la formación de enlaces covalentes con una matriz sólida funcionalizada con grupos epoxi permite que se produzcan biocatalizadores con actividad específica alta, estabilidad térmica excelente, y compatibilidad con concentraciones altas de solvente. Dado que estos catalizadores inmovilizados nuevos se separan fácilmente de la mezcla de reacción y se pueden reutilizar para numerosos y sucesivos ciclos de reacción, son particularmente adecuados para uso industrial y resuelven los problemas que se habían asociado hasta ahora con la producción industrial de nucleósidos mediante reacciones de transglicosilación.

Un objeto adicional de la presente invención está representado por la posibilidad de utilizar, en el proceso de coinmovilización, no solo las enzimas aisladas, sino también las fracciones solubles no procesadas de las enzimas UdP y PNP producidas a partir de cultivos celulares (donde esta expresión significa la fracción que, después de la lisis celular y de centrifugar, se recupera como sobrenadante líquido -constituido por el tampón de lisis que contiene los componentes celulares, incluyendo las enzimas que son solubles en el tampón- que se separa del precipitado insoluble constituido por los residuos de pared celular y células no lisadas o solo parcialmente lisadas); de hecho se ha encontrado de forma inesperada que todas las actividades enzimáticas contaminantes se pueden inactivar completamente antes del proceso de coinmovilización sometiendo a las células de los microorganismos que producen las enzimas a un tratamiento por calor a una temperatura de 50-65ºC y preferiblemente a una temperatura de 60ºC, llevado a cabo durante un período variable desde 10 minutos hasta 120 minutos y preferiblemente durante un período de 30 minutos, sin que el tratamiento de calor perjudique la actividad enzimática de UdP y PNP.

Según una forma de realización de la presente invención, los mejores resultados para la coinmovilización de UdP y PNP se han alcanzado mediante la formación de enlaces covalentes con una matriz sólida funcionalizada con grupos oxiránicos (grupos epoxi) por medio de una reacción que implica principalmente los grupos amino laterales de los residuos de lisina que están presentes en las cadenas polipeptídicas de las enzimas, conforme a un proceso que no requiere condiciones drásticas de reacción tales como, por ejemplo, exposición a temperaturas altas o intervalos amplios de pH, o el uso de concentraciones elevadas de agentes caotrópicos. También se ha encontrado de provecho utilizar, como sustratos de inmovilización, resinas epoxi comercialmente disponibles de las que se conocen y están garantizadas algunas características tecnológicas que son importantes para el uso industrial, tales como, por ejemplo, tamaño de partícula, su alta densidad y porosidad, su resistencia a la compresión, su resistencia al ataque microbiano etc.

Según una forma de realización adicional de la presente invención, las enzimas UdP y PNP se coinmovilizan mediante la formación de enlaces covalentes en sustratos sólidos tales como, por ejemplo, gel de agarosa, gel de sílice, polímeros basados en metacrilamida/bisacrilamida o polímeros de polimetacrilato funcionalizados con grupos epoxi. Entre los diferentes sustratos sólidos que están disponibles comercialmente y que son utilizables para la coinmovilización de UdP y PNP según se describe en la presente invención, se pueden mencionar, entre otros, los siguientes materiales: Sepharose® activada con epoxi; Fractogel®, TSK AF-Epoxy; Eupergit® C y Eupergit® C250L; Sepabeads® EC-EP/M y Sepabeads® EC-EP.

Aunque todos los materiales reseñados anteriormente se pueden utilizar como sustratos para la coinmovilización de las enzimas UdP y PNP mediante la formación de enlaces covalentes, se han encontrado particularmente adecuados los sustratos sólidos constituidos por polímeros metacrílicos funcionalizados con grupos oxiránicos (grupos epoxi) que están presentes a una concentración de no menos de 50 \mumoles/gramo de resina húmeda y preferiblemente a una concentración de alrededor de 100 \mumoles/gramo de resina húmeda, para la preparación de un catalizador utilizable industrialmente para la producción de nucleósidos. La resina Sepabeads EC-EP/M o resinas equivalentes que se caracterizan por tener un tamaño de partícula variable entre alrededor de 200 y 600 micrómetros y una concentración de grupos epoxi activos igual o mayor de 100 \mumoles/gramo de resina húmeda se utilizan preferiblemente para la coinmovilización de las enzimas UdP y PNP según los métodos operativos descritos en la presente invención.

Estas resinas se pueden obtener comercialmente en forma preactivada, esto es, que llevan los grupos epoxi en una estado de alta reactividad capaces de formar rápidamente enlaces covalentes mediante reacción preferiblemente con el grupo \varepsilon-amino de los residuos de lisina que están presentes en las cadenas polipeptídicas de las enzimas que van a ser inmovilizadas, conforme al siguiente esquema de reacción:

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Se investigó la coinmovilización de las enzimas UdP y PNP en resinas epoxi Sepabeads o en resinas equivalentes mediante agitación de la mezcla enzimática sin procesar con el sustrato de inmovilización en presencia de un tampón con un pH de alrededor de 7-7.5 durante un período de hasta 72 horas.

Se establecieron las condiciones finales para la lisis celular y la coinmovilización investigando los siguientes parámetros operativos (las condiciones óptimas seleccionadas para cada uno de los parámetros investigados se dan entre paréntesis):

a)

lisis de la biomasa celular e inmovilización en tampón fosfato 0.5 M, 1M, y 1.5 M (condición seleccionada: tampón fosfato 1 M)

b)

temperatura de inmovilización alrededor de 20ºC (temperatura ambiente) y 50ºC (condición seleccionada: temperatura ambiente)

c)

tiempo de contacto entre la mezcla de los lisados celulares no procesados y la resina de 12 horas, 24 horas, 48 horas y 72 horas (condición seleccionada: 48 horas)

d)

proporción entre la actividad enzimática de UdP y la actividad enzimática de PNP en la mezcla de los lisados celulares no procesados: UdP/PNP = 0.5; UdP/PNP = 1; UdP/PNP = 2; UdP/PNP = 3 (condición seleccionada: proporción de actividad enzimática = 1)

e)

proporción entre la actividad catalítica de transglicosilación (expresada en unidades \cdot ml^{-1} según se define en el Ejemplo 3c) de la mezcla de lisado celular sin procesar y la cantidad de resina: 90 unidades por 2 gramos de resina húmeda; 90 unidades por 3 gramos de resina húmeda; 90 unidades por 4 gramos de resina húmeda (condición seleccionada: aproximadamente 90 unidades/3 gramos de resina húmeda, que corresponde a alrededor de 30 unidades/gramo de resina húmeda)

f)

concentración de la actividad catalítica de transglicosilación (expresada en unidades \cdot ml^{-1} según se define en el Ejemplo 3c) en la mezcla de lisados celulares no procesados de 2 unidades \cdot ml^{-1}, 6 unidades \cdot ml^{-1}, y 10 unidades \cdot ml^{-1} (condición seleccionada: alrededor de 6 unidades \cdot ml^{-1})

g)

tratamiento post-inmovilización del catalizador inmovilizado; sin tratamiento adicional, acondicionamiento en tampón fosfato pH 8.5, acondicionamiento en tampón fosfato-glicina (condición seleccionada: sin tratamiento adicional).

En base a los resultados obtenidos en estos ensayos, la preparación del catalizador inmovilizado, según una de las aplicaciones preferidas de la presente invención, comprende los siguientes pasos operativos:

a) Las enzimas UdP y PNP se producen mediante fermentación separada de cepas recombinantes de Escherichia coli transformadas con el gen udp de E. coli que codifica la enzima UdP y con el gen deoD de E. coli que codifica la enzima PNP, respectivamente. Las cepas recombinantes utilizables para la producción de las enzimas UdP y PNP son similares, por ejemplo, respectivamente, a la cepa DH5\alpha/pGM708 (a la que se refiere como NP23/3 en la presente patente) y a la cepa DH5\alpha/pGM707 (a la que se refiere como NP24/3 en la presente patente) que se describen en WO 00/39307, que se incorpora aquí mediante referencia; las características de estas cepas se dan en la Tabla 1. Conforme a las instrucciones recientemente emitidas por las autoridades reguladoras internacionales y para eliminar cualquier riesgo de contaminación por agentes causales de encefalopatía espongiforme bovina, las cepas recombinantes NP23/3 y NP24/3 se reclonaron sin utilizar materiales de origen animal; la preparación y conservación de los bancos de células y la fermentación de las cepas recombinantes se levaron a cabo similarmente sin utilizar materiales de origen animal [EMEA. Nota de orientación sobre la minimización de riesgo de transmisión de agentes de encefalopatía espongiforme animal a través de productos médicos humanos y veterinarios. 2001].

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TABLA 1 Características de las cepas recombinantes de Escherichia coli que son productoras de UdP y PNP

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b) Después del tratamiento térmico a 60ºC durante 30 minutos para inactivar las actividades enzimáticas contaminantes, las biomasas obtenidas en las dos fermentaciones se someten a lisis mecánica (o alternativamente a lisis por sonicación y a lisis química y/o enzimática) y se centrifugan para separar las fracciones solubles no procesadas; la mezcla de las dos fracciones solubles se utiliza entonces directamente para la inmovilización sin pasos adicionales de purificación.

c) Los lisados celulares no procesados que contienen UdP y PNP se mezclan de modo que se obtengan proporciones de actividad enzimática UdP:PNP variables desde 1:0.5 hasta 1:3 (y preferiblemente una proporción de alrededor de 1:1) y se ponen en contacto con el sustrato de inmovilización.

d) El sustrato de inmovilización está constituido por una resina acrílica funcionalizada con grupos epoxi, y preferiblemente por la resina Sepabeads EC-EP/M, y se utiliza en una proporción de alrededor de 2-3 kg de resina húmeda para inmovilizar 10 litros de mezcla de lisados celulares no procesados que tienen una actividad catalítica de transglicosilación de alrededor de 6 unidades \cdot ml^{-1}.

Como alternativa al método dado anteriormente, los lisados celulares no procesados que contienen las enzimas UdP y PNP se pueden inmovilizar por separado utilizando un método similar al método descrito para la coinmovilización de las dos enzimas y después mezclarlas para su uso como catalizadores de las reacciones de transglicosilación.

El uso de cepas recombinantes para la producción de las enzimas UdP y PNP permite que se obtengan grandes cantidades de biomasa celular y permite que los lisados celulares se extraigan con un titulo de enzima alto, como se muestra en las Tablas 2 y 3 a continuación.

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TABLA 2 Producción de UdP mediante fermentación de la cepa recombinante NP23/3

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TABLA 3 Producción de PNP mediante fermentación de la cepa recombinante NP24/3

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En el método de coinmovilización, los lisados celulares no procesados que contienen UdP y PNP se pueden mezclar en diferentes proporciones de modo que se obtiene un catalizador que se optimiza para cada reacción de transglicosilación de interés. Por ejemplo, se ha encontrado que, empezando con mezclas de lisados con proporciones de actividad enzimática UdP:PNP variables desde 2:1 hasta 1:2, se obtienen catalizadores inmovilizados que son óptimos para utilizar en la mayoría de las reacciones de transglicosilación que utilizan como donantes de azúcar ribofuranosil uracilo, 2'-deoxiribofuranosil uracilo, 2'-3'-dideoxiribofuranosil uracilo y arabinofuranosil uracilo.

En las condiciones operativas descritas, se obtiene un catalizador que tiene las características analíticas dadas en la Tabla 4 con un rendimiento de los procesos de coinmovilización, calculado como la actividad catalítica de transglicosilación, de alrededor del 50-70%.

TABLA 4 Características analíticas del catalizador obtenido por coinmovilización de las enzimas UdP y PNP mediante la formación de enlaces covalentes en una resina funcionalizada con grupos epoxi

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La preparación de enzima inmovilizada se conserva a 4ºC como resina húmeda en tampón fosfato potásico 100 mM - isopropanol al 20% - pH 7 - p-hidroxi benzoato de etilo 500 ppm. En estas condiciones, se ha confirmado el mantenimiento completo de la actividad catalítica de transglicosilación en un estudio de estabilidad llevado a cabo por un tiempo de hasta 6 meses.

El método de la presente invención para la coinmovilización covalente de las enzimas UdP y PNP permite la preparación de una forma nueva de catalizadores inmovilizados que es estable hasta temperaturas de 60-70ºC, es compatible con la presencia de concentraciones altas de solventes miscibles con agua, tales como, por ejemplo, alcoholes, etilen- y polietilenglicoles, dimetil sulfóxido, y tetrahidrofurano, y que mantiene una actividad enzimática buena dentro de un intervalo de pH desde 6 hasta 9.

Según una aplicación adicional de la presente invención, las enzimas UdP y PNP, inmovilizadas en un sustrato sólido funcionalizado con grupos epoxi mediante la formación de enlaces covalentes, son utilizables de forma ventajosa para la preparación industrial de nucleósidos naturales y análogos modificados mediante reacciones de transglicosilación empezando con un nucleósido donante de azúcar y una base aceptora de azúcar. El catalizador inmovilizado de la presente invención tiene características de eficacia enzimática y estabilidad y propiedades mecánicas tales como permitir que las reacciones de transglicosilación se lleven a cabo alrededor de 50-60ºC, permitir que la mezcla de reacción se separe con facilidad del catalizador tras completar la reacción (por ejemplo, mediante filtración directa en una partición porosa soldada al recipiente de reacción) y permite que el mismo catalizador se reutilice para ciclos de reacción sucesivos según se describe con mayor detalle en los ejemplos que se dan posteriormente.

De este modo, por ejemplo, en un ciclo de 12 reacciones sucesivas llevadas a cabo a 60ºC durante 2.5 horas para la preparación de \beta-D-arabinofuranosil 2,6 diaminopurina (Ara-DAMP) en el que, en cada reacción, se reutilizó como catalizador la resina recuperada en la reacción anterior, se encontró que la resina recuperada después del último ciclo (durante un período total de uso operativo a 60ºC de 30 horas) había retenido más del 85% de su actividad catalítica inicial. La estabilidad del catalizador se investigó además a 60ºC, 50ºC y 40ºC durante períodos operativos continuos de hasta 240 horas (10 días); los resultados obtenidos indican un pérdida media de la eficacia catalítica del 8% por 24 horas de uso operativo a una temperatura de 60ºC, y del 5% por 24 horas de uso operativo a una temperatura de 50ºC mientras que, a una temperatura de 40ºC, la pérdida media de eficacia catalítica por 24 horas de uso operativo fue de menos del 0.5%.

Según una aplicación adicional de la presente invención, el catalizador inmovilizado también es utilizable en reacciones que utilizan sustratos que son poco solubles en tampones acuosos, como es el caso con la preparación de fludarabina desfosfatada que se describe en uno de los ejemplos que se dan posteriormente en el que la presencia de dimetil sulfóxido al 40% en la mezcla de reacción, que se calentó a una temperatura de 60ºC, no modificó la actividad del catalizador inmovilizado.

Según una aplicación adicional de la presente invención, el catalizador inmovilizado se puede utilizar en reacciones de transglicosilación llevadas a cabo en un reactor continuo. El reactor puede estar constituido de forma conveniente por una columna controlada termostáticamente; la mezcla de reacción, que contiene el nucleósido donante de azúcar, la base aceptora, y el tampón fosfato según se describe en uno de los ejemplos que se dan posteriormente, que se refiere a la preparación de 2'-deoxiadenosina, se pasa a través de la columna por gravedad o, preferiblemente, por medio de una bomba de flujo calibrado. Ajustando el flujo de la mezcla de reacción a través del lecho del catalizador en relación a la velocidad de la reacción de transglicosilación (en las condiciones utilizadas para la producción de 2'-deoxiadenosina, el flujo óptimo fue de 1/5 del volumen de la columna/minuto) la reacción enzimática alcanza el equilibrio en el tiempo que lleva pasar a través del catalizador y se puede utilizar el eluido de la columna directamente para la purificación de los nucleósidos nuevos formados en la reacción.

Los siguientes ejemplos se proponen para ilustrar la presente invención sin constituir una limitación de su campo de aplicación.

Ejemplo No. 1

Fermentación de cepas recombinantes que son productoras de UdP y PNP

Las cepas recombinantes NP23/3 y NP24/3 que expresan las enzimas UdP y PNP, respectivamente, se fermentaron por separado en condiciones de semicontinuas con el uso de fermentadores con un volumen útil de fermentación de 10 litros, que contenían 8 litros de medio de cultivo a pH 6.8-7.0 con la siguiente composición (por litro): KH_{2}PO_{4}, 13.3 g; (NH_{4})_{2}HPO_{4}, 4.0 g; ácido cítrico, 1.7 g; soitona, 1.25 g; glicerol 2.5 g; extracto de levadura, 0.125 g; MgSO_{4}.7H_{2}O, 1.5 g; CaCl_{2}, 0.08 g; FeSO_{4}.7H_{2}O, 0.08 g; MnSO_{4}.H_{2}O, 0.02 g; ZnSO_{4}.7H_{2}O, 0.03 g; H_{3}BO_{3}, 0.003 g; CuSO_{4}.5H_{2}O, 0.006 g; CoCl_{2}.6H_{2}O, 0.008 g; NaMoO_{4}.2H_{2}O, 0.004 g; tiamina.HCl, 0.010 g; tetraciclina 0.0125 g. El fermentador se inoculó a un valor inicial de OD_{600} de 0.4 con alrededor de 300 ml de suspensión bacteriana crecida previamente durante alrededor de 20 horas a 30ºC. La fermentación se llevó a cabo con el uso de los siguientes parámetros operativos: temperatura 30ºC; flujo de aire de 1 volumen/volumen de medio de cultivo/minuto; agitación inicial de 150 revoluciones/minuto aumentada automáticamente para mantener el valor de pO_{2} al 20% de la concentración de saturación durante 10 horas (fase por lotes) y después al 10% de la concentración de saturación; pH mantenido a 7.0 \pm 0.1 mediante adición automática de una solución de NH_{4}OH al 12.5% o una solución de H_{3}PO_{4} al 25%. Durante la fase semicontinua (a partir de 10 horas después del inicio de la fermentación y hasta alrededor de 50 horas), se añadieron automáticamente al fermentador 2 litros de una solución que tenía la siguiente composición (por litro): glicerol, 400 g; soitona, 200g; extracto de levadura, 20g; MgSO_{4}.7H_{2}O, 3 g; tetraciclina, 0.0125 g. Después de la conclusión de la fermentación (que se completó en alrededor de 51-52 horas) la biomasa celular se recogió mediante centrifugación, se lavó en tampón fosfato 30 mM - pH 7, se recentrifugó, y se mantuvo como biomasa celular húmeda a una temperatura de -20ºC.

Ejemplo No. 2

Lisis celular

a) Se resuspendieron 400 g de pasta celular húmeda, separada mediante centrifugación o mediante microfiltración de un medio de cultivo de la cepa recombinante NP23/3 que expresa la enzima UdP, para dar un volumen de 1.5 litros con tampón fosfato 1 M - pH 7.5 y se calentó con agitación a 56-60ºC durante 30 minutos. Después de enfriar hasta alrededor de 4ºC, la suspensión se lisó por medio de tres pasos consecutivos a una presión de alrededor de 600 bar en un homogenizador mecánico Manton-Gaulin manteniendo la temperatura a alrededor de 10ºC. La suspensión se clarificó mediante centrifugación a 12000 x g, produciendo alrededor de 2 litros de solución que contenía las proteínas solubles totales.

b) Se resuspendieron 1600 g de pasta celular húmeda, separada mediante centrifugación de un medio de cultivo de la cepa recombinante NP24/3 que expresa la enzima PNP, para dar un volumen de 8 litros con tampón fosfato 1 M - pH 7.5 y se calentó con agitación a 56-60ºC durante 30 minutos. Después de enfriar hasta alrededor de 4ºC, la suspensión se lisó por medio de tres pasos consecutivos a una presión de alrededor de 600 bar en un homogenizador mecánico Manton-Gaulin manteniendo la temperatura a alrededor de 10ºC. La suspensión se clarificó mediante centrifugación a 12000 x g, produciendo alrededor de 8 litros de solución que contenía las proteínas solubles totales.

Ejemplo No. 3

Determinación de las actividades enzimáticas a) Determinación de la actividad enzimática de UdP

Se añadió un volumen medido (de 100 a 200 microlitros) de lisado centrifugado, diluido 1:100 v/v, extraído de la pasta celular que expresaba UdP, a 800 microlitros de una solución de uridina 75 mM en tampón fosfato potásico 100 mM - pH 7, preincubada a 30ºC. Después de 5 minutos, la reacción de fosforólisis uridina \rightarrow uracilo se paró mediante la adición de 1 ml de HCl 1 N. Se analizó una alícuota de la mezcla de reacción mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC) con el uso de una columna de 250 x 4.6 mm, esferas de 5 \mum, Capcell-Pack (Shisheido) C-18 eluída con una solución de fosfato amónico monobásico 30 mM - pH 4.5 - metanol al 9%. La actividad enzimática del lisado celular se expresó como unidades \cdot ml^{-1} (\mumoles de uracilo \cdot min^{-1} \cdot ml^{-1}) y se calculó relativa a una solución estándar de uracilo eluída en las mismas condiciones.

b) Determinación de la actividad enzimática de PNP

Se añadió un volumen medido (variable desde 100 a 200 microlitros) de lisado centrifugado diluido 1:100 v/v, extraído de la pasta celular de la cepa que expresa PNP, a 800 microlitros de una solución de inosina 62.5 mM en tampón fosfato potásico 100 mM - pH 7, preincubado a 30ºC. Después de 10 minutos, la reacción de fosforólisis inosina \rightarrow hipoxantina se paró mediante la adición de 1 ml de HCl 1 N. Se analizó una alícuota de la mezcla de reacción mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC) con el uso de una columna de 250 x 4.6 mm, esferas de 5 \mum, Capcell-Pack (Shisheido) C-18 eluída con una solución de fosfato amónico monobásico 30 mM - pH 4.5 - metanol al 9%. La actividad enzimática del lisado celular se expresó como unidades \cdot ml^{-1} (\mumoles de hipoxantina \cdot min^{-1} \cdot ml^{-1}) y se calculó relativa a una solución estándar de hipoxantina eluída en las mismas condiciones.

c) Determinación de la actividad catalítica de transglicosilación

La actividad catalítica de transglicosilación de la mezcla de lisados celulares que contenían UdP y PNP o de las enzimas UdP y PNP coinmovilizadas en un sustrato sólido se determinó en una reacción de transglicosilación llevada a cabo a escala analítica en condiciones estándar.

Se añadieron 250 \mul de la mezcla de lisados celulares o 100 mg (peso húmedo) de catalizador UdP-PNP inmovilizado a 10 ml de una solución que contenía la siguiente composición: \beta-D-arabinofuranosil uracilo (Ara-U) 40 mM; adenina, 40 mM; tampón fosfato potásico 30 mM - pH 7, controlada termostáticamente a 60ºC. Después de 1.5 horas a 60ºC, la reacción se paró mediante dilución de la mezcla 1:50 y enfriando en hielo. El porcentaje de bioconversión de adenina a \beta-D-arabinofuranosil adenina (Ara-A) se determinó analizando una alícuota de la mezcla de reacción mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC) con el uso de una columna de 250 x 4.6 mm, esferas de 5 \mum, Capcell-Pack (Shisheido) C-18 eluída con una solución de fosfato amónico monobásico 30 mM - pH 4.5 - metanol al 9%. La actividad catalítica de transglicosilación se expresó como unidades \cdot ml^{-1} (\mumoles de Ara-A formados en 1.5 horas \cdot ml^{-1} de mezcla de lisados celulares) o en unidades \cdot g^{-1} de resina húmeda (\mumoles de Ara-A formados en 1.5 horas \cdot g^{-1} de resina húmeda) y se calculó relativa a una solución estándar de Ara-A eluída mediante HPLC en las mismas condiciones.

Ejemplo No. 4

Preparación del catalizador mediante coinmovilización de UdP y PNP

La coinmovilización de las enzimas UdP y PNP se llevó a cabo empezando con una mezcla de lisados preparadas de modo que tuviera una proporción variable de la actividad de UdP y PNP en un intervalo de desde 1:0.5 hasta 1:4. En este ejemplo, se describe la inmovilización empezando con una mezcla de lisados en la que la proporción de actividad UdP:PNP fue de 1:1.

Se añadieron 2.6 kg (peso húmedo, con alrededor del 40-50% de H_{2}O) de resina epoxi Sepabeads EC-EP/M (Resindion Srl, Milán) y 500 partes por millón de benzoato de p-hidroximetilo a una mezcla de 2 litros de lisado celular sin procesar con una actividad UdP de alrededor de 500 unidades/ml y 8 litros de un lisado celular sin procesar con una actividad PNP de alrededor de 125 unidades/ml. La mezcla se mantuvo a temperatura ambiente con agitación suave durante 48 horas; la mezcla se dejó clarificar, se retiró el sobrenadante líquido, la resina se filtró a vacío en un embudo Buchner y se lavó, en el embudo, con alrededor de 20 litros de agua desionizada.

El catalizador inmovilizado se caracterizó mediante determinación de la actividad de transglicosilación y se mantuvo a 4ºC en tampón fosfato 100 mM - propanol al 20% - p-hidroxibenzoato de etilo 500 ppm.

Ejemplo No. 5

Ejemplos de preparación de nucleósidos mediante la reacción de transglicosilación catalizada por las enzimas UdP y PNP coinmovilizadas mediante enlaces covalentes a un sustrato sólido a) Preparación de Ara-A

Se añadieron 10 gramos (peso húmedo) de catalizador inmovilizado con actividad de transglicosilación de alrededor de 12 unidades/gramo, previamente filtrado de la solución conservante y lavado en el filtro con agua desionizada, a 150 ml de una solución mantenida termostáticamente a 60ºC y que tenía la composición siguiente:

Ara-U 25 mM

adenina 25 mM

tampón fosfato potásico 30 mM, pH 7.

Después de 1 hora a 60ºC, se retiró el catalizador (y se hizo reaccionar en una nueva reacción de bioconversión) y se enfrió el filtrado para recuperar el precipitado, constituido por Ara-A sin procesar, que se purificó por cristalización a partir de agua.

El rendimiento de bioconversión de la reacción fue \geq 70%. La pureza de Ara-A después de la cristalización, determinada mediante análisis de HPLC, fue mayor del 98%.

b) Preparación de \beta-D-arabinofuranosil adenina (Ara-DAMP)

Se añadieron 65 gramos (peso húmedo) de catalizador inmovilizado con actividad de transglicosilación de alrededor de 13 unidades/gramo, previamente filtrado de la solución conservante y lavado en el filtro con agua desionizada, a 2 litros de una solución mantenida termostáticamente a 60ºC y que tenía la composición siguiente:

Ara-U 30 mM

2,6-diaminopurina (DAMP) 30 mM

tampón fosfato potásico 30 mM, pH 7.

Después de 2.5 horas a 60ºC, se retiró el catalizador (y se hizo reaccionar en una nueva reacción de bioconversión) y se enfrió el filtrado para recuperar el precipitado, constituido por Ara-DAMP sin procesar, que se purificó por cristalización a partir de agua.

El rendimiento de bioconversión de la reacción fue \geq 70%. La pureza de Ara-DAMP después de la cristalización, determinada mediante análisis de HPLC, fue mayor del 98%.

c) Preparación de \beta-D-arabinofuranosil-2-fluoroadenina desfosfatada (fludarabina desfosfatada)

Se añadieron 30 gramos (peso húmedo) de catalizador inmovilizado con actividad de transglicosilación de alrededor de 13 unidades/gramo, previamente filtrado de la solución conservante y lavado en el filtro con agua desionizada, a 800 ml de una solución con dimetil sulfóxido (DMSO) al 40% mantenida termostáticamente a 60ºC y que tenía la composición siguiente:

Ara-U 75 mM

2-fluoroadenina 50 mM

tampón fosfato potásico 30 mM, pH 7.

Después de 4 horas a 60ºC, se retiró el catalizador (y se hizo reaccionar en una nueva reacción de bioconversión) y se enfrió el filtrado para recuperar el precipitado, constituido por fludarabina desfosfatada sin procesar, que se purificó por cristalización a partir de una mezcla DMSO/agua.

El rendimiento de bioconversión de la reacción fue \geq 70%. La pureza de la fludarabina desfosfatada después de la cristalización, determinada mediante análisis de HPLC, fue mayor del 98%.

d) Preparación de 2'-deoxiadenosina

Se añadió 1 gramo (peso húmedo) de catalizador inmovilizado con actividad de transglicosilación de alrededor de 13 unidades/gramo, previamente filtrado de la solución conservante y lavado en el filtro con agua desionizada, a 200 ml de una solución mantenida termostáticamente a 60ºC y que tenía la composición siguiente:

2'-deoxiuridina 75 mM

adenina 50 mM

tampón fosfato potásico 30 mM, pH 7.

Después de 2 horas a 60ºC, se retiró el catalizador (y se hizo reaccionar en una nueva reacción de bioconversión) y se enfrió el filtrado para recuperar el precipitado, constituido por 2'-deoxiadenosina sin procesar, que se purificó por cristalización a partir de H_{2}O. El rendimiento de bioconversión de la reacción fue \geq 70%. La pureza de la 2'-deoxiadenosina después de la cristalización, determinada mediante análisis de HPLC, fue mayor del 98%.

a) Preparación de 2'-deoxiguanosina

Se añadieron 5 gramos (peso húmedo) de catalizador inmovilizado con actividad de transglicosilación de alrededor de 13 unidades/gramo, previamente filtrado de la solución conservante y lavado en el filtro con agua desionizada, a 90 ml de una solución mantenida termostáticamente a 60ºC y que tenía la composición siguiente:

2'-deoxiuridina 60 mM

tampón fosfato potásico 30 mM, pH 7.

Se añadieron de forma muy lenta (2.5 ml/hora) 5 ml de una solución de guanina 0.8 M en NaOH al 30%, mientras que la mezcla de reacción se mantuvo a pH 7 mediante la adición continua de HCl al 20%. Después de 2.5 horas a 60ºC, se retiró el catalizador (y se hizo reaccionar en una nueva reacción de bioconversión) y se enfrió el filtrado a 50ºC para eliminar la guanina sin reaccionar mediante filtración. El filtrado se enfrió después a 4ºC para precipitar la 2'-deoxiguanosina que se purificó por cristalización a partir de H_{2}O. El rendimiento de bioconversión de la reacción fue \geq 70%. La pureza de la 2'-deoxiguanosina después de la cristalización, determinada mediante análisis de HPLC, fue mayor del 98%.

a) Preparación de (N'-(\beta-D-ribofuranosil)-5-hidroxiimidazol-4-carboxamida (mizoribina)

Se añadieron 5 gramos (peso húmedo) de catalizador inmovilizado con actividad de transglicosilación de alrededor de 12 unidades/gramo, previamente filtrado de la solución conservante y lavado en el filtro con agua desionizada, a 100 ml de una solución mantenida termostáticamente a 60ºC y que tenía la composición siguiente:

uridina 225 mM

hidroxicarbamoil-imidazol 150 mM

tampón fosfato potásico 30 mM, pH 7.

Después de 6 horas a 60ºC, se retiró el catalizador (y se hizo reaccionar en una nueva reacción de bioconversión) y se enfrió el filtrado, y se purificó la mizoribina de allí mediante cromatografía en una columna de intercambio iónico. El rendimiento de bioconversión de la reacción fue \geq 80%. La pureza de la mizoribina, determinada mediante análisis de HPLC, fue mayor del 98%.

a) Preparación de 2'-deoxiadenosina en un reactor continuo

Se empaquetó una preparación del catalizador inmovilizado con una actividad de transglicosilación de alrededor de 12 unidades/gramo a una altura de 4 cm en una columna mantenida termostáticamente a una temperatura de 40ºC y que tenía un diámetro de 2 cm, (volumen de la columna = 12.5 ml). Se bombearon a través de la columna de catalizador 3 litros de una solución precalentada a 40ºC y que contenía adenina 10 mM, 2'-deoxiuridina 15 mM y tampón fosfato 30 mM, pH 7, por medio de una bomba con un flujo calibrado de 2.5 ml/minuto (velocidad de flujo = 1/5 del volumen de la columna/minuto). Se recogieron alícuotas del eluido después de 30 y 60 minutos y después a intervalos de 2 horas hasta 20 horas y se analizaron mediante HPLC para determinar el rendimiento de bioconversión que estaba en el intervalo entre el 83% y el 86% para todas las muestras.

Claims (29)

1. Biocatalizador utilizable para las reacciones de transglicosilación, que contiene una matriz sólida funcionalizada con grupos epoxi y las enzimas uridina fosforilasa y purina nucleósido fosforilasa, caracterizado en que las enzimas uridina fosforilasa y purina nucleósido fosforilasa están coinmovilizadas en la matriz sólida mediante la formación de enlaces covalentes.

2. Biocatalizador según la reivindicación 1, caracterizado en que los enlaces covalentes se producen mediante una reacción entre los grupos epoxi de la matriz sólida y los grupos amino de las enzimas.

3. Biocatalizador según la reivindicación 2, caracterizado en que los grupos amino son grupos amino de los residuos de lisina presentes en las cadenas polipeptídicas de las enzimas.

4. Biocatalizador según las reivindicaciones 1-3, caracterizado en que la matriz sólida tiene una concentración de grupos epoxi de no menos de 50 \mumoles/gramo de resina húmeda, preferiblemente una concentración de alrededor de 100 \mumoles/gramo de resina húmeda.

5. Biocatalizador según las reivindicaciones 1-3, caracterizado en que la matriz sólida es una resina epoxi.

6. Biocatalizador según la reivindicación 5, caracterizado en que la resina epoxi se selecciona de entre Sepharose® activada con epoxi, Fractogel®, TSK AF-Epoxy, Eupergit® C, Eupergit® C250L, Sepabeads® EC-EP/M y Sepabeads® EC-EP.

7. Biocatalizador según la reivindicación 5, caracterizado en que la resina epoxi tiene un tamaño de partícula de entre 200 y 600 micrómetros.

8. Biocatalizador según las reivindicaciones 1-3, caracterizado en que la matriz sólida en un gel de agarosa funcionalizado con grupos epoxi, un gel de sílice funcionalizado con grupos epoxi, un polímero basado en metacrilamida-bisacrilamida funcionalizado con grupos epoxi, o un polímero de polimetacrilato funcionalizado con grupos
epoxi.

9. Biocatalizador según las reivindicaciones 1-8, caracterizado en que las enzimas UdP y PNP son de origen procariota.

10. Biocatalizador según las reivindicaciones 1-8, caracterizado en que las enzimas UdP y PNP se producen mediante un método recombinante.

11. Biocatalizador según la reivindicación 10, caracterizado en que las enzimas UdP y PNP están contenidas en la parte soluble no procesada extraída de las células recombinantes o en preparaciones parcialmente purificadas o purificadas derivadas de las partes solubles no procesadas extraídas de las células recombinantes.

12. Uso del biocatalizador según las reivindicaciones 1-11 para la producción de nucleósidos mediante una reacción enzimática de transglicosilación entre un nucleósido donante de azúcar y una base heterocíclica aceptora de
azúcar.

13. Uso según la reivindicación 12, caracterizado en que el azúcar del nucleósido donante es \beta-D-ribosa, 2'deoxi-\beta-D-ribosa, 2'-3'-dideoxi-\beta-D-ribosa, \beta-D-arabinosa, \alpha-L-xilosa o derivados aminados o derivados halogenados de los mismos.

14. Uso según la reivindicación 12, caracterizado en que la base de nucleósido donante es uracilo.

15. Uso según las reivindicaciones 12 a 14, caracterizado en que la reacción de transglicosilación se lleva a cabo en una fase acuosa.

16. Uso según las reivindicaciones 12 a 14, caracterizado en que la reacción de transglicosilación se lleva a cabo en presencia de tampón fosfato.

17. Uso según las reivindicaciones 12 a 14, caracterizado en que la reacción de transglicosilación se lleva a cabo a un pH de entre 6 y 8, preferiblemente entre 6.5 y 7.5.

18. Uso según las reivindicaciones 12 a 14, caracterizado en que la reacción de transglicosilación se lleva a cabo a temperaturas de hasta 75ºC y preferiblemente a temperaturas de entre 55 y 60ºC.

19. Uso según las reivindicaciones 12 a 18, caracterizado en que, tras la conclusión de la reacción, el catalizador inmovilizado se separa de la mezcla de reacción mediante filtración, decantación, o centrifugación y se reutiliza en reacciones de transglicosilación sucesivas.

20. Uso según las reivindicaciones 12 a 18, caracterizado en que la reacción de transglicosilación se lleva a cabo en un sistema continuo en el que la reacción se completa mediante paso a través del catalizador que se mantiene en una columna o en un reactor continuo controlado termostáticamente.

21. Método para la preparación de un biocatalizador según las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado en que las enzimas uridina fosforilasa y purina nucleósido fosforilasa se ponen en contacto con la matriz sólida, funcionalizada con grupos epoxi, con agitación, a un pH de entre 6 y 9, y a una temperatura de entre 10 y 50ºC.

22. Método según la reivindicación 21, caracterizado en que las enzimas uridina fosforilasa y purina nucleósido fosforilasa se ponen en contacto por separado con dos fracciones distintas de la matriz sólida que después se juntan para dar el biocatalizador.

23. Método según las reivindicaciones 21-22, caracterizado en que las enzimas uridina fosforilasa y purina nucleósido fosforilasa se utilizan en una proporción de actividades enzimáticas uridina fosforilasa:purina nucleósido fosforilasa de entre 1:0.5 y 1:3, preferiblemente en una proporción de alrededor de 1:1.

24. Método según las reivindicaciones 21-23, caracterizado en que (a) la biomasa obtenida mediante la fermentación de las cepas bacterianas que expresan las enzimas uridina fosforilasa y purina nucleósido fosforilasa se someten a lisis y se centrifugan para separar las fracciones solubles no procesadas, (b) la mezcla de las fracciones solubles no procesadas así obtenidas se pone en contacto con la matriz sólida funcionalizada con grupos epoxi sin pasos de purificación adicionales.

25. Método según la reivindicación 24, caracterizado en que se usa una única cepa bacteriana que expresa simultáneamente las enzimas uridina fosforilasa y purina nucleósido fosforilasa, o se usan dos cepas bacterianas diferentes que una expresa la enzima uridina fosforilasa y la otra la enzima purina nucleósido fosforilasa.

26. Método según las reivindicaciones 24-25, caracterizado en que las cepas bacterianas son recombinantes.

27. Método según las reivindicaciones 24-26, caracterizado en que, antes del paso (a), la biomasa se somete a un tratamiento por calor a una temperatura de 50-70ºC, preferiblemente a 60ºC.

28. Método según la reivindicación 27, caracterizado en que el tratamiento por calor se realiza durante 20-40 minutos, preferiblemente durante 30 minutos.

29. Un biocatalizador que se puede producir mediante el método según las reivindicaciones 21-28.