DE2708384A1 - Proteinasen aus trypanosomen, verfahren zu deren herstellung sowie ihre verwendung - Google Patents
Proteinasen aus trypanosomen, verfahren zu deren herstellung sowie ihre verwendungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft eine neue Proteinase erhältlich aus Trypanosomen,
ein Verfahren zu deren Herstellung aus Trypanosomen sowie deren Verwendung als Arzneimittel und als Antigen für den immunologischen
Nachweis von Antikörpern im Serum von mit Trypanosoma cruzi infizierten Patienten.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Proteinase aus Trypanosomen zu isolieren, die sowohl in Hinsicht auf eine frühe
immunologisch serologische Diagnostik der Infektion der Chagas-Krankheit
als auch als Bestandteil einer Chagas-Vaccine von Bedeutung sein könnte.
Gegenstand der Erfindung ist eine aus Trypanosoma cruzi erhältliche
Proteinase, gekennzeichnet durch folgende Parameter:
a) ein mittleres Molekulargewicht von 200 00 - 40 000
b) isoelektrischer Punkt pH 5,3 - 0,2
c) Michaelis-Konstante mit dem Substratt\-N-Benzoyl-Arginin-p-Nitroanilid
von 1,22 χ 10~4 M - 0,05
d) Reaktionsoptimum mit ^-N-Benzoyl-Arginin-Nitroanilid
als Substrat bei pH 8,5 - 1,5 und einer Temperatur von 400C - 100C.
Abhängig von den angewandten Methoden zur Bestimmung des Molekulargewichtes
wurden dadurch bedingte differierende Werte erhalten.
Im einzelnen wurde bestimmt ein Molekulargewicht von 1,8 - 2,3 χ 10
mit Hilfe einer Molekularsiebfiltration unter Verwendung eines mit
Epichlorhydrin vernetzten Dextrans als Träger, wie es von der Firma Pharmacia, Upsala, als SEPHADEX G 150 im Handel erhältlich
ist. Als Standardsubstanzen wurden bei diesem Verfahren mitgeführt das Enzym Katalase, die Proteine Ovalbumin und Gammaglobulin,
ferner Cytrochrom C.
Bei der Bestimmung des Molekulargewichtes mit Hilfe einer Elektrophorese
mit Polyacrylamid als Träger und einem Puffer, der 2 % Natriumdodecylsulfat enthält, wurde ein Molekulargewicht von 1,6 -
2,1 χ 105 ermittelt.
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sich
Mit der sogenannten Gradienten-Gel-Elektrophorese ergab^ein Molekulargewicht
von 1,45 bis 1,9 χ 10 . Dies ergibt im Mittel nach
den drei verschiedenen Methoden ein Molekulargewicht von 200 000 000.
Bei der Ermittlung des isoelektrischen Punktes wurde das Protein Präalbumin als Referenz mitgeführt.
Das Enzym besteht zu etwa 98 % aus Aminosäuren. Das entsprechend dem vorgelegten Beispiel hergestellte Enzym zeigte folgende
Aminosäure-Zusammensetzung bestimmt nach dem Verfahren von
S. Moore, D.H. Speckman, W.H. Stein, Anal. Chem. 3J), Seite 185,
HÄUFIGKEIT IN % AMINOSÄURE
Lysin
Histidin Ammoniak Arginin Asparaginsäure Threonin Serin
Glutaminsäure Prolin Glycin Alanin Cystin (halb) Valin
Methionin Isoleucin Leucin Tyrosin Phenylalanin Tryptophan
100,00
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5 | ,47 |
1 | ,52 |
(18 | ,14) |
4 | ,57 |
9 | ,47 |
6 | ,00 |
5 | ,09 |
10 | ,26 |
4 | ,83 |
8 | ,16 |
8 | ,71 |
2 | ,33 |
8 | ,16 |
2 | ,85 |
4 | ,79 |
9 | ,11 |
1 | ,54 |
4 | ,62 |
2 | ,09 |
ist
Jeder der wiedergegebenen Einzel-Werte mit einer methodisch bedingten
Fehlerbreite von - 10 % behaftet.
Die chromatographische Analyse des hydrolysierten Enzyms zeigt die Anwesenheit von fünf Zuckerbausteinen, nämlich Glukose,
Galaktose, Mannose, Xylose und Glukosamin. Ribose und Desoxyribose konnten nicht gefunden werden.
Zur Bestimmung der Spezifität wurden die p-Nitroanilide von
^-N-Benzoyl-Arginin, <X-N-Acetyl-Tyrosin, Alanin, Glutamin,
Glycin, Leucin, Lysin, Phenylalanin, Prolin und«<-N-Benzoyl-Lysin
einer Reaktion mit der Protease unterworfen. ^-N-Benzoyl-Arginin-p-Nitroanilid
und oC-N-Benzoyl-Lysin-p-Nitroanilid werden gespalten. Zur genaueren Bestimmung der Spezifität
wurden folgende Oligopeptide untersucht:
Ala-Ile His-Lys Ser-Gly
Arg-Leu Leu-Ala
Asp-Leu Lys-Gly Thr-Phe
Lys-Lys-Lys
Gly-Leu Met-Asp Try-Gly
Gly-His-Gly Phe-Leu Tyr-Leu
Glu-Tyr Pro-Leu Val-Gly
Von diesen Peptiden werden Arg-Leu, Try-Gly und Tri-Lys gespalten.
Demnach spaltet das Enzym Peptid-Bindungen, an denen die Carboxyl-Gruppen von Arginin, Tryptophan und C^-Amino-substituiertem
Lysin beteiligt sind.
Der Einfluß verschiedener Inhibitoren auf die Aktivität des Enzyms stellt sich wie folgt dar:
SUBSTANZ KONZENTRATION (M)
(50 % Hemmung)
OC -N-Benzoyl-Arginin 7,0 χ 10
CdSO4 3,4 χ 10~3
Jodacetamid (IAA) . 8,0 χ 10~3
— 6 —
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SUBSTANZ KONZENTRATION (M)
(50 % Hemmung)
N-Äthylmaleinimid (NEM) 2,5 χ 10~4
-4 Jodessigsäure 4,8 χ 10
CuCl2 · 5,2 χ 10~4
ZnCl2 8,0 χ 10~4
p-(Äthyl-Mercuri)-Mercapto-Benzol- -
sulfonsaures Natrium (Thiocid) 8,0 χ 10
HgCl0 2,9 χ 10~6
— 6 p-Chlormercuribenzoat (pCMB) 8,0 χ 10
Tosyl-Lysin-Chloromethyl-Keton (TLCK) 4,5 χ 10~8
Die Hemmung des Enzyms durch p-(Äthyl-Mercuri)-Mercapto-Benzolsulfonsaures
Natrium (Thiocid) und durch Tosyl-Lysin-Chloromethyl-Keton (TLCK) ist nicht kompetitiv.
Gasförmiger Sauerstoff zeigt einen hemmenden Einfluß auf die Enzym-Aktivität; eine 30-minütige Einwirkungszeit von 0
hemmt 60 % der eingesetzten Aktivität. Diese Hemmung ist reversibel. Eine Konzentration von 5 mM Mercaptoäthanol hebt
die Hemmung fast vollständig auf.
Wird der Enzym-Lösung Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) in einer
Konzentration von 0,1 μΜ/ml oder Jodacetamid (IAA) in einer Konzentration
von 10 μΜ/ml zugegeben, so haben diese Substanzen zwar keinen Einfluß auf die Aktivität der Protease, schützen
diese jedoch vor der inaktivierenden Wirkung von Sauerstoff. Dies, zusammen mit den Resultaten der Hemmung, deutet auf die
Anwesenheit von Sulfhydryl-Gruppen im Enzym-Molekül.
Die starke Hemmung der Protease durch Tosyl-Lysin-Chloromethyl-Keton
duetet auf die Anwesenheit eines katalytischen Histidins im aktiven Zentrum des Enzym-Moleküls hin.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung des Enzyms aus Trypanosomen, vorzugsweise aus der Kulturform
von Trypanosoma cruzi.
Kulturformen von Trypanosoma cruzi werden beispielsweise wie folgt erhalten: _ 7 _
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Eineepimastigote KuIturform von Trypanosoma cruzi, Stamm Brasil,
wird auf diphasischem Blutagar (modifiziert nach Senekjie) 4-5
Tage bei 280C gezüchtet. Die flüssige Phase mit den Trypanosomen
wird danach durch sterile Gaze filtriert. Die so erhaltene Trypanosomen-Suspension dient als Inoculum für die Vermehrung
im LiT-Medium (Canargo, E.P., Rev. Inst. Med.Trop. Sao Paulo. S, Seite 93 - 100 (1964)). Nach einer Inkubation bei 28°C über
fünf Tage wird die Suspension zentrifugiert und das Sediment zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Danach
werden die Trypanosomen mechanisch aufgebrochen, vorzugsweise durch Verwendung von Ultraschall. Auch eine Lyse der Organismen
ist möglich.
Während die überstehende Kulturflüssigkeit keine proteolytische
Aktivität aufweist, zeigt eine Suspension der aufgebrochenen Trypanosomen Proteinase-Aktivität. Nach einer hochtourigen Zentrifugation
kann die gesamte freigesetzte proteolytische Aktivität im überstand wiedergefunden werden. Es handelt sich demnach um
ein in wäßrigem Medium vollständig lösliches, nicht partikelgebundenes Enzym.
Die wasserlösliche Proteinase aus Trypanosoma cruzi zeigt folgendes
Fällungsverhalten:
a) Sie ist mit in der Proteinchemie üblicherweise zur Protein-Ausfällung
verwendeten Salzen fällbar. Sie fällt beispielsweise mit Ammoniumsulfat bei einer Sättigungskonzentration von 50 % (ca. 2 Mol/l) aus der Lösung aus
und kann als Präzipitat gewonnen werden. Statt Ammoniumsulfat kann säbstverständlich jedes andere geeignete Salz zur
Ausfällung der Proteinase verwendet werden, wenn es der Proteinase-enthaltenden Lösung bis zu der entsprechenden
Konzentration zugesetzt wird.
Ganz allgemein kann bei der Handhabung der erfindungsgemäßen
Proteinase durch Zusatz von SH-Gruppen enthaltenden Substanzen wie Merkaptoäthanol oder Dithiothreitol die Enzymaktivität
stabilisiert werden.
■ - 8 -
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• - 8 -
b) Mit Hilfe der Molekularsiebfraktionierung läßt sich das Enzym von begleitenden Verunreinigungen abtrennen. Mit
Rücksicht auf das Molekulargewicht des Enzymes sind solche Molekularsiebe am besten geeignet, welche Proteine mit
Molekulargewichten um 200 000 anzureichern vermögen, sei es, daß derartige Substanzen vom Molekularsieb ausgeschlossen
werden, d.h. das Sieb durchlaufen, sei es, daß sie von dem Sieb festgehalten, d.h. verzögert wieder freigegeben werden.
Bei der Verwendung des mit Epichlorhydrin vernetzten kugelförmigen Dextrans, welches von der Firma Pharmacia,
Upsala, als SEPHADEX G 200 vertrieben wird, wird das Enzym festgehalten. Wird dieses Material als Füllung einer
Chromatographiesäule verwendet und die das Enzym enthaltende Lösung auf die Säule aufgetragen, werden höhermolekulare
Verunreinigungen vor dem Enzym und niedrigmolekulare Verunreinigungen nach dem Enzym aus der Säule eluiert. Indikator
für die Gewinnung des proteolytischen Enzyms ist die Aktivität der bei der Chromatographie gewonnenen einzelnen
Fraktionen gegenüber einem hierfür geeigneten Substrat, beispielsweise dem 'X-N-Benzoyl-Arginin-p-Nitroanilid, unter
den oben genannten Bedingungen. Die proteolytisch aktiven Franktionen werden gesammelt, sie enthalten das angereicherte
Enzym.
c) Die Proteinase aus Trypanosomen wird bei niedriger Leitfähigkeit
der sie enthaltenden Lösung von Anionenaustauscherharzen gebunden. Besonders geeignet sind Ionenaustauscher
mit Aminoäthyl-, Diäthylaminoäthyl-, Triäthylaminoäthyl-Gruppen
und vergleichbarer Funktionen. Bevorzugt werden Ionenaustauscher die diese Gruppen an Cellulose oder vernetztem
Dextran als Trägermaterial tragen. Bei der Verwendung derartiger Ionenaustauscher, vorzugsweise eines
Diäthylaminoäthyl-Ionenaustauschers, wird das Enzym aus einer Lösung niedriger Salzkonzentration adsorbiert. Ein
großer Teil der begleitenden Verunreinigungen wird dabei nicht gebunden. Das Enzym kann durch Anwendung einer EIutionslösung
mit höherer Salzkonzentration bzw. Leitfähgikeit vom Ionenaustauscher wieder desorbiert werden. Einfacherweise
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kann dies durch die Verwendung einer linear ansteigenden Salzkonzentration erfolgen. Auch hierbei wird, ähnlich
wie bei der Molekularsiebfraktionierung, die Aktivität der Fraktionen verfolgt und diejenigen Fraktionen herausgegriffen,
welche mit einem geeigneten Substrat proteolytische Aktivität aufweisen.
Bei Kenntnis dieser Verfahrensbedingungen steht es dem Fachmann selbstverständlich frei,· die genannten oder vergleichbare Maßnahmen
miteinander zu kombinieren, um aus der durch den Aufschluß der Trypanosomen gewonnenen, noch Begleitsubstanzen enthaltenden Lösung
die Proteinase in der gewünschten Reinheit darzustellen.
Wird beispielsweise eine Proteinase enthaltende Lösung zuerst einer Diäthylaminoäthyl-Ionenaustauscher-Chromatographie und an-\
schließend einer Molekularsiebfraktionierung unterworfen, so kann die spezifische Aktivität bezogen auf die Spaltung von ^-N-Benzoyl-Arginin-p-Nitroanilid
(ΒΛΡΛ-Test) von 10 bis 20 Einheiten/ml (Definition siehe Beispiel) auf etwa 700 bis 1000 Einheiten/ml der
Lösung angereichert werden.
Die auf diese Weise erhältliche Proteinase aus Trypanosoma cruzi erweist sich als immunogen. Wird sie Wirbeltieren, insbesondere
Versuchstieren wie Kaninchen, in einer ausreichenden Menge parenteral appliziert, so werden spezifische Antikörper gegen das Enzym
gebildet.
Es zeigt sich, daß das von den Tieren gewonnene Serum in den einschlägigen Techniken der Immundiffusion bzw. der Immuno-Elektrophorese bei Reaktion mit der Proteinase Präzipitationsbanden
ausbildet. Durch Hemmversuche läßt sich zeigen, daß die Aktivität der Proteinase durch Zusatz von Immunserum zu annähernd 100 %
gehemmt werden kann.
Diese inhibitorische Aktivität der spezifisch gegen die Trypanosomen-Proteinase gerichteten Antikörper zeigt bereits anschauchlich
deren Verwendbarkeit als Arzneimittel. Erfindungsgemäß wurde
außerdem nachgewiesen, daß permanente Kulturen der Zellinie HeLa
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gegen das Eindringen von infektiösen Trypanosomen durch Zugabe des spezifischen Anti-Enzyms zur HeLa-Kulturflüssigkeit geschützt
werden können. Damit wird nahegelegt, einerseits Probanden durch aktive Immunisierung mit dem erfindungsgemäß erhältlichen Enzym
vor der intrazellulären Vermehrung der infektiösen Trypanosomen und damit vor dem Eintreten pathologischer Veränderungcm zu
schützen, andererseits durch eine therapeutische Gabe von Anti-Proteinase
als Immunserum oder einer entsprechenden Antikörper-Präparation die weitere Ausbreitung der Trypanosomen in Wirtszellen zu verhindern.
Es ist deshalb auch Gegenstand der Erfindung, die Proteinase aus Trypanosomen als Bestandteil eines aktiv immunisierenden Agens
zu verv/enden.
Eine Dosis des immunisierenden Agens enthält eine für die Ausbildung
von Antikörpern ausreichende Menge der Proteinase in einem physiologisch verträglichen Medium. Das immunisierende Agens kann einerseits
als Arzneimittel, andererseits zur Herstellung von Antiseren verwendet werden. Auf diese Weise erhältliche Antiseren sind
ihrerseits Bestandteile wichtiger Arzneimittel gegen Trypanosomen. Endlich stellt die Proteinase selbst als Antigen ein wertvollen
Mittel zum diagnostischen Nachweis und zur Bestimmung der Enzyn-Antikörper in vitro und in vivo dar. Hierfür sind alle iranunologischen
Techniken zur Bestimmung von Antigenen bzw. Antikörpern geeignet.
Die Erfindung wird am nachstehenden Beispiel näher erläutert.
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19,5 Liter einer ausgewachsenen Fermenterkultur mit insgesamt
2,9 χ 10 Trypanosoma cruzi (Kulturform D1) werden zentrifugiert
(Sorvall RC 28, Durchlaufrotor SS 34, 39 000 χ g) und der Überstand verworfen. Das Trypanosomen-Sediment wird 2 χ in 200 ml
0,9 %iger NaCl-Lösung aufgenommen und erneut zentrifugiert (Sorvall
Superspeed, Modell RC 2B, Rotor GSA, 8 000 χ g/ 30 Minuten). Das Sediment wird in 50 ml 0,1 Mol Trishydroxymethyl-aminomethan-HCl-Puffer
pH 7,5 + 5 iiiM/1 Mercaptoäthanol aufgenommen und unter Kühlung
bei 40C mit Ultraschall behandelt (Branson Sonifier B-12;
6 χ 30 Sekunden, Output, 10). Das Homogenat wird zentrifugiert
(16 300 χ g / 60 Minuten) und das Sediment verworfen. Die proteolytische Aktivität des Uberstandes im BA?A-Test bestimmt. Die Gesamtaktivität
beträgt 6071,1 TU (TU= 1 Trypsin-Einheit = Extinktion, die 10 ug Trypsin in 20 Minuten bei 400C und pH 8,5 bei 1mM/l
BAPA in einem Endvolumen von 7 ml bei 405 η m erzielt). Spezifische
Aktivität 13.2 TU/mg Protein.
Dieser Überstand wird auf eine DSAE SEPHADEX A 50 Ionenaustausch-Chromatographie-Säule
aufgetragen (Säule = 8 χ 10 cm) und mit einem Elutionspuffer von 50 mii/l Trishydroxymethylaminomethan-HCl-Puffer
pH 7,5 + 5mM Mercaptoäthanol mit einem linearen Gradienten von 0 bis 1 Mol/l NaCl eluiert. Die ProteinbeStimmung erfolgt
mit einem Uvicord Durchflußphotometer bei einer Wellenlänge von 280 nm. Das Fraktionsvolumen beträgt 25 ml. Die Elution der proteolytisch
aktiven Fraktionen tritt bei einer Konzentration von 0,2 bis 0,3 Mol/l NaCl ein. Laufzeit der Chromatographie ca. 20 Stunden
bei Raumtemperatur. Die Proteinase-Aktivität der einzelnen Fraktionen wird im BAPA-Test bestimmt. Die aktiven Fraktionen
werden vereinigt und durch ultrafiltration (Amicon Membran üF-100
eingeengt. Die Aktivitätsbestimmung des Konzentrates ergibt eine Gesamtaktivität von 5413,1 TU, die spezifische Aktivität ist
239,7 TU/mg Protein.
Das Konzentrat wird auf eine SEPHADEX G-200 Säure aufgetragen
(Säule = 48 χ 5 cm) und mit 0,05 Mol Trishydroxymethyl-aminomethan-HCl-Puffer
pH 7,5 + 5 mM/1 Mercaptoäthanol eluiert. Die Protein-
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bestimmung erfolgt wieder bei 280 nm im Durchflußphotometer. Das
Fraktionsvolumen beträgt 25 ml. Die Laufzeit der Chromatographie
beträgt ca. 24 Stunden bei Raumtemperatur. Die proteolytische
Aktivität wird im BAPA-Test bestimmt, die aktiven Fraktionen vereinigt und eingeengt. Die Aktivität des reinen Enzyms ergibt
insgesamt 4699,1 TU, die spezifische Aktivität ist 721,0 TU/mg.
Das Enzym wird demnach in diesem Beispiel mit einem Reinigungsfaktor von 55 isoliert, bei einer Ausbeute von rund 80 % der
ursprünglich im Aufschluß vorhandenen Aktivität.
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Claims (4)
1. Proteinase erhältlich aus Trypanosoma cruzi, gekennzeichnet
durch
a) ein mittleres Molekulargewicht von 200 000 +_ 40 000;
b) einen isoelektrischen Punkt pH 5,3 — 0,2 ;
c) eine Michaelis-Konstante von 1,22 χ 10 M - 0,05
d) ein Reaktionsoptimum mit o(-N-Benzoyl-Arginin-p-Nitroanilid
als Substrat bei pH 8,5 - 1,5
und einer Temperatur von 4 00C - 100C
2. Verfahren zur Herstellung einer Proteinase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine diese enthaltende Lösung
einer Kombination folgender Maßnahmen solange unterworfen wird bis Begleitsubstanzen nicht mehr nachgewiesen werden
können:
a) Zugabe von in der Proteinchemie verwendeten Salzen bis zur Ausfällung der Proteinase;
b) Molekularsiebfraktioniarung zur Gewinnung von Proteinen
mit einem mittleren Molekulargewicht von 200 000 - 40 000;
c) Adsorption an Ionenaustauscherharzen und fraktionierte
Elution davon
wobei jeweils die proteolytisch wirksamen Fraktionen gewonnen werden.
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ORIGINAL INSPECTED
2 HOE 77/B 004
3. Verwendung einer Proteinase nach Anspruch 1 als immunisierendes
Agens in einer für die Ausbildung von Antikörpern ausreichenden Menge in einem physiologisch verträglichen Medium,
4. Verwendung einer Proteinase nach Anspruch 1 als Diagnostikum
zur Bestimmung von Enzymantikörpern in vitro und in vivo.
809836/0025
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US3993743A (en) * | 1973-08-07 | 1976-11-23 | Research Corporation | Method for diagnosis of Chagas' disease |
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1978
- 1978-02-24 GB GB7448/78A patent/GB1592535A/en not_active Expired
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8130 | Withdrawal |