CN117126821A - 一种牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶的分离提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及蛋白提取技术领域，具体公开了一种牛血Cu‑Zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，包括：1），从新鲜牛血中分离得红细胞，将红细胞溶胀破壁；2），加入水溶性含铜化合物，搅拌加热至50‑70℃，保温20‑30min，降温至5‑10℃，加入助沉剂，离心，取上清液；3），超滤浓缩；4），冷却至2‑4℃，调节pH为4.8‑5，加入2‑4℃的无水乙醇，静置1‑2h，离心，取沉淀，用2‑4℃pH为4.8‑5的乙醇水溶液重悬，离心，取沉淀；5），用水溶解，然后超滤、干燥，得牛血Cu‑Zn超氧化物歧化酶。本发明具有降低成本、提高效率的优点。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白提取领域，尤其是涉及一种牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶的分离提取方法。
背景技术
超氧化物歧化酶，别名肝蛋白、简称:SOD。SOD是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质超氧阴离子自由基。
SOD是生物体内氧自由基的天然清除剂，具有广泛的医用价值，具有抗炎症、抗辐射、抗肿瘤、抗衰老和缺血后再灌流损伤的恢复等功能，因而可以治疗由超氧自由基引起的多种疾病，尤其是对关节炎和类风湿性关节炎有特殊的疗效，可作为药品、食品及日化产品的添加剂和溶血液制备。
目前SOD纯化制备方法各异，常用方法有经典法、离子交换法、疏水色谱法、凝胶过滤法和金属螯合亲和层析法等，大都采用柱层析法分离纯化，需要消耗大量缓冲盐和长时间洗柱过柱层析，成本较高、效率较低，因此，还有改善空间。
发明内容
为了降低成本、提高效率，本申请提供一种牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶的分离提取方法。
本申请提供的一种牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶的分离提取方法采用如下的技术方案：一种牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，包括以下步骤：
步骤1)，从新鲜牛血中分离得红细胞，将红细胞溶胀破壁，得溶血液；
步骤2)，向溶血液中加入水溶性含铜化合物，搅拌加热至50-70℃，保温20-30min，降温至5-10℃，加入助沉剂，离心，取上清液；
步骤3)，超滤浓缩，得浓缩液；
步骤4)，将浓缩液冷却至2-4℃，调节pH为4.8-5，加入2-4℃的无水乙醇，静置1-2h，离心，取沉淀，得一次沉淀物，将一次沉淀物用2-4℃pH为4.8-5的乙醇水溶液重悬，离心，取沉淀，得二次沉淀物；
步骤5)，将二次沉淀物用水溶解，然后超滤、干燥，得牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶；
所述助沉剂为聚合硫酸铁、二氧化硅、对苯乙烯磺酸钠的复配。
通过采用上述技术方案，在铜离子存在的条件下，通过加热，使得大多数杂蛋白尤其是血红蛋白在50-70℃高温下变性，但目标产物SOD能在70℃仍旧保持稳定，不会出现变性，然后通过特殊的助沉剂将变性的血红蛋白快速沉淀下来，在离心的配合下，能快速得到上清液，通过将上清液浓缩后，能得到SOD浓度较高的浓缩液，然后再配合在2-4℃及4.8-5的pH条件下加入无水乙醇，能使得浓缩液中的SOD析出，通过离心得到沉淀物，此时即可得到纯度较高的SOD，再配合超滤，进一步出去母液杂蛋白，即可获得高纯度的目标产品SOD，而且获得的SOD具有较高的活性，提取工艺成本较低，效率较高，制得的产品质量较佳。
通过助沉剂为聚合硫酸铁、二氧化硅、对苯乙烯磺酸钠的复配，能使得变性蛋白更容易被助沉剂吸附，从而通过离心即可快速分离沉淀和上清液，若没有特殊的助沉剂辅助，离心时沉淀与上清液难以分离，导致分离效率大幅下降。
优选的，所述助沉剂中聚合硫酸铁、二氧化硅、对苯乙烯磺酸钠的质量比例为8-9：3-4：2-3。
通过采用上述技术方案，通过具体选择聚合硫酸铁、二氧化硅、对苯乙烯磺酸钠的质量比例，使得变性蛋白能更好地被助沉剂吸附，从而更易于分离得到沉淀和上清液，提取SOD的效率更高。
优选的，所述步骤2)中，每1L溶血液中加入1-5g助沉剂。
通过采用上述技术方案，通过具体选择助沉剂的投入量，起到很好的吸附变性蛋白以提高分离效率的效果，同时更好地控制成本，SOD提取成本较低，具有较高的经济价值。
优选的，所述步骤1)中，从新鲜牛血中分离得红细胞时，通过向新鲜牛血中加入柠檬酸钠溶液，然后经离心分离得红细胞。
通过采用上述技术方案，通过添加柠檬酸钠能起到较好的抗凝效果，减少牛血凝固导致原材料浪费的现象，具有更高的经济价值。
优选的，所述步骤1)中，将红细胞溶胀破壁时，先用生理盐水洗涤，然后加入去离子水溶胀破壁。
通过采用上述技术方案，通过采用生理盐水洗涤，减少红细胞上带有的杂质，使得制得的溶血液的杂质更少，更有利于提高SOD的纯度。
优选的，所述步骤2)中，水溶性含铜化合物为氯化铜。
通过采用上述技术方案，通过具体选择氯化铜，保持SOD的活性的效果更佳，制得的SOD的活性更高，质量更好。
优选的，所述步骤2)中，每500mL溶血液中投入0.9-1.1g氯化铜。
通过采用上述技术方案，通过具体选择氯化铜的投入量，保持SOD的活性的效果更佳，制得的SOD的活性更高，质量更好，同时能较好地控制成本，具有更高的经济价值。
优选的，所述步骤4)中，将浓缩液冷却至4℃，调节pH为4.95，加入4℃的无水乙醇，静置1h，离心，取沉淀，得一次沉淀物，将一次沉淀物用4℃pH为4.95的乙醇水溶液重悬，离心，取沉淀，得二次沉淀物。
通过采用上述技术方案，通过具体选择4℃和pH为4.95的条件，使得SOD析出效果更佳，得到的SOD更多，收率更高，具有更高的经济价值。
优选的，所述步骤3)中，超滤浓缩时，先用0.45um滤膜过滤后，再用3K超滤膜浓缩。
通过采用上述技术方案，通过先过滤，能进一步减少杂蛋白，有助于提高SOD的纯度，制得的SOD质量较高。
优选的，所述步骤3)中，浓缩液体积与步骤1)中处理的新鲜牛血的体积比例≤1/10。
通过采用上述技术方案，通过具体选择浓缩液的体积，得到的浓缩液中SOD的浓度恰到好处，避免浓度过低导致加入乙醇后SOD难以析出的情况，使得SOD的收率较高。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、由于本申请在铜离子存在的条件下，通过加热，使得大多数杂蛋白尤其是血红蛋白在50-70℃高温下变性，但目标产物SOD能在70℃仍旧保持稳定，不会出现变性，然后通过特殊的助沉剂将变性的血红蛋白快速沉淀下来，在离心的配合下，能快速得到上清液，通过将上清液浓缩后，能得到SOD浓度较高的浓缩液，然后再配合在2-4℃及4.8-5的pH条件下加入无水乙醇，能使得浓缩液中的SOD析出，通过离心得到沉淀物，此时即可得到纯度较高的SOD，再配合超滤，进一步出去母液杂蛋白，即可获得高纯度的目标产品SOD，而且获得的SOD具有较高的活性，提取工艺成本较低，效率较高，制得的产品质量较佳。
2、本申请中优选通过助沉剂为聚合硫酸铁、二氧化硅、对苯乙烯磺酸钠的复配，能使得变性蛋白更容易被助沉剂吸附，从而通过离心即可快速分离沉淀和上清液。
3、本申请中优选通过具体选择聚合硫酸铁、二氧化硅、对苯乙烯磺酸钠的质量比例，使得变性蛋白能更好地被助沉剂吸附，从而更易于分离得到沉淀和上清液，提取SOD的效率更高。
附图说明
图1为实施例1的SOD电泳图；
图2为实施例2的SOD电泳图；
图3为实施例3的SOD电泳图；
图4为实施例4的SOD电泳图；
图5为对比例1的SOD电泳图；
图6为对比例2的SOD电泳图；
图7为对比例3的SOD电泳图；
图8为对比例4的SOD电泳图；
图9为对比例5的SOD电泳图；
图10为对比例6的SOD电泳图；
图11为对比例7的SOD电泳图。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
实施例1
一种牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，包括以下步骤：
步骤1)，配置浓度为8％的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂，取50mL抗凝剂和950mL新鲜牛血，投入容器中，混合均匀，然后通过2000r/min离心15min，分离得红细胞，将红细胞用浓度为0.9％的生理盐水洗涤三次，然后加入2000mL去离子水溶胀破壁，制得溶血液。
步骤2)，向溶血液中加入氯化铜，每500mL溶血液中加入0.9g氯化铜，然后转速240r/min，搅拌30s，然后将溶血液加热至50℃，保温30min，然后降温至5℃，加入助沉剂，每1L溶血液中加入1g助沉剂，然后5000r/min离心15min，取上清液。
步骤3)，将上清液用0.45um滤膜过滤除去微小杂蛋白颗粒后，用3K超滤膜浓缩至50ml。
步骤4)，将浓缩液冷却至2℃，调节pH为4.8，加入2℃的无水乙醇，静置1h，恒温2℃下，4000r/min离心30min，取沉淀，得一次沉淀物，将一次沉淀物用2℃pH为4.8的乙醇水溶液重悬，离心，取沉淀，得二次沉淀物。
步骤5)，将二次沉淀物用去离子水溶解，然后用3K超滤膜超滤洗去残留乙醇，冷冻干燥，得牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶。
其中，助沉剂为聚合硫酸铁、二氧化硅、对苯乙烯磺酸钠的复配，聚合硫酸铁、二氧化硅、对苯乙烯磺酸钠的质量比例为8：3：2。
聚合硫酸铁购置于济南端星化工科技有限公司，100目。
二氧化硅购置于杭州仲鸿化工新材料有限公司，1000目。
对苯乙烯磺酸钠购置于武汉华翔科洁生物技术有限公司。
实施例2
一种牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，包括以下步骤：
步骤1)，配置浓度为8％的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂，取50mL抗凝剂和950mL新鲜牛血，投入容器中，混合均匀，然后通过2000r/min离心15min，分离得红细胞，将红细胞用浓度为0.9％的生理盐水洗涤三次，然后加入2000mL去离子水溶胀破壁，制得溶血液。
步骤2)，向溶血液中加入氯化铜，每500mL溶血液中加入1g氯化铜，然后转速240r/min，搅拌30s，然后将溶血液加热至70℃，保温20min，然后降温至10℃，加入助沉剂，每1L溶血液中加入5g助沉剂，然后5000r/min离心15min，取上清液。
步骤3)，将上清液用0.45um滤膜过滤除去微小杂蛋白颗粒后，用3K超滤膜浓缩至50ml。
步骤4)，将浓缩液冷却至4℃，调节pH为4.95，加入4℃的无水乙醇，静置1h，恒温4℃下，4000r/min离心30min，取沉淀，得一次沉淀物，将一次沉淀物用4℃pH为4.95的乙醇水溶液重悬，离心，取沉淀，得二次沉淀物。
步骤5)，将二次沉淀物用去离子水溶解，然后用3K超滤膜超滤洗去残留乙醇，冷冻干燥，得牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶。
其中，助沉剂为聚合硫酸铁、二氧化硅、对苯乙烯磺酸钠的复配，聚合硫酸铁、二氧化硅、对苯乙烯磺酸钠的质量比例为8.5：3.5：2.5。
聚合硫酸铁购置于济南端星化工科技有限公司，100目。
二氧化硅购置于杭州仲鸿化工新材料有限公司，1000目。
对苯乙烯磺酸钠购置于武汉华翔科洁生物技术有限公司。
实施例3
一种牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，包括以下步骤：
步骤1)，配置浓度为8％的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂，取50mL抗凝剂和950mL新鲜牛血，投入容器中，混合均匀，然后通过2000r/min离心15min，分离得红细胞，将红细胞用浓度为0.9％的生理盐水洗涤三次，然后加入2000mL去离子水溶胀破壁，制得溶血液。
步骤2)，向溶血液中加入氯化铜，每500mL溶血液中加入1g氯化铜，然后转速240r/min，搅拌30s，然后将溶血液加热至60℃，保温25min，然后降温至8℃，加入助沉剂，每1L溶血液中加入2.5g助沉剂，然后5000r/min离心15min，取上清液。
步骤3)，将上清液用0.45um滤膜过滤除去微小杂蛋白颗粒后，用3K超滤膜浓缩至50ml。
步骤4)，将浓缩液冷却至3℃，调节pH为4.95，加入3℃的无水乙醇，静置1.5h，恒温3℃下，4000r/min离心30min，取沉淀，得一次沉淀物，将一次沉淀物用3℃pH为4.95的乙醇水溶液重悬，离心，取沉淀，得二次沉淀物。
步骤5)，将二次沉淀物用去离子水溶解，然后用3K超滤膜超滤洗去残留乙醇，冷冻干燥，得牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶。
其中，助沉剂为聚合硫酸铁、二氧化硅、对苯乙烯磺酸钠的复配，聚合硫酸铁、二氧化硅、对苯乙烯磺酸钠的质量比例为8.5：3.5：2.5。
聚合硫酸铁购置于济南端星化工科技有限公司，100目。
二氧化硅购置于杭州仲鸿化工新材料有限公司，1000目。
对苯乙烯磺酸钠购置于武汉华翔科洁生物技术有限公司。
实施例4
一种牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，包括以下步骤：
步骤1)，配置浓度为8％的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂，取50mL抗凝剂和950mL新鲜牛血，投入容器中，混合均匀，然后通过2000r/min离心15min，分离得红细胞，将红细胞用浓度为0.9％的生理盐水洗涤三次，然后加入2000mL去离子水溶胀破壁，制得溶血液。
步骤2)，向溶血液中加入氯化铜，每500mL溶血液中加入1.1g氯化铜，然后转速240r/min，搅拌30s，然后将溶血液加热至70℃，保温20min，然后降温至10℃，加入助沉剂，每1L溶血液中加入5g助沉剂，然后5000r/min离心15min，取上清液。
步骤3)，将上清液用0.45um滤膜过滤除去微小杂蛋白颗粒后，用3K超滤膜浓缩至50ml。
步骤4)，将浓缩液冷却至4℃，调节pH为5，加入4℃的无水乙醇，静置2h，恒温4℃下，4000r/min离心30min，取沉淀，得一次沉淀物，将一次沉淀物用4℃pH为5的乙醇水溶液重悬，离心，取沉淀，得二次沉淀物。
步骤5)，将二次沉淀物用去离子水溶解，然后用3K超滤膜超滤洗去残留乙醇，冷冻干燥，得牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶。
其中，助沉剂为聚合硫酸铁、二氧化硅、对苯乙烯磺酸钠的复配，聚合硫酸铁、二氧化硅、对苯乙烯磺酸钠的质量比例为9：4：3。
聚合硫酸铁购置于济南端星化工科技有限公司，100目。
二氧化硅购置于杭州仲鸿化工新材料有限公司，1000目。
对苯乙烯磺酸钠购置于武汉华翔科洁生物技术有限公司。
对比例1
一种牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，包括以下步骤：
步骤1)，配置浓度为8％的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂，取50mL抗凝剂和950mL新鲜牛血，投入容器中，混合均匀，然后通过2000r/min离心15min，分离得红细胞，将红细胞用浓度为0.9％的生理盐水洗涤三次，然后加入2000mL去离子水溶胀破壁，制得溶血液。
步骤2)，向溶血液中加入氯化铜，每500mL溶血液中加入1g氯化铜，然后转速240r/min，搅拌30s，然后将溶血液加热至70℃，保温20min，然后降温至10℃，加入助沉剂，每1L溶血液中加入5g助沉剂，然后5000r/min离心15min，取上清液。
步骤3)，将上清液用0.45um滤膜过滤除去微小杂蛋白颗粒后，用3K超滤膜浓缩至50ml。
步骤4)，将浓缩液冷却至4℃，调节pH为4.95，加入4℃的无水乙醇，静置1h，恒温4℃下，4000r/min离心30min，取沉淀，得一次沉淀物，将一次沉淀物用4℃pH为4.95的乙醇水溶液重悬，离心，取沉淀，得二次沉淀物。
步骤5)，将二次沉淀物用去离子水溶解，然后用3K超滤膜超滤洗去残留乙醇，冷冻干燥，得牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶。
其中，助沉剂为聚合氯化铝、二氧化硅、对苯乙烯磺酸钠的复配，聚合硫酸铁、二氧化硅、对苯乙烯磺酸钠的质量比例为8.5：3.5：2.5。
聚合氯化铝购置于云南淼淳水处理科技有限公司，80目。
二氧化硅购置于杭州仲鸿化工新材料有限公司，1000目。
对苯乙烯磺酸钠购置于武汉华翔科洁生物技术有限公司。
对比例2
一种牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，包括以下步骤：
步骤1)，配置浓度为8％的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂，取50mL抗凝剂和950mL新鲜牛血，投入容器中，混合均匀，然后通过2000r/min离心15min，分离得红细胞，将红细胞用浓度为0.9％的生理盐水洗涤三次，然后加入2000mL去离子水溶胀破壁，制得溶血液。
步骤2)，向溶血液中加入氯化铜，每500mL溶血液中加入1g氯化铜，然后转速240r/min，搅拌30s，然后将溶血液加热至70℃，保温20min，然后降温至10℃，加入助沉剂，每1L溶血液中加入5g助沉剂，然后5000r/min离心15min，取上清液。
步骤3)，将上清液用0.45um滤膜过滤除去微小杂蛋白颗粒后，用3K超滤膜浓缩至50ml。
步骤4)，将浓缩液冷却至4℃，调节pH为4.95，加入4℃的无水乙醇，静置1h，恒温4℃下，4000r/min离心30min，取沉淀，得一次沉淀物，将一次沉淀物用4℃pH为4.95的乙醇水溶液重悬，离心，取沉淀，得二次沉淀物。
步骤5)，将二次沉淀物用去离子水溶解，然后用3K超滤膜超滤洗去残留乙醇，冷冻干燥，得牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶。
其中，助沉剂为聚合硫酸铁、活性炭、对苯乙烯磺酸钠的复配，聚合硫酸铁、二氧化硅、对苯乙烯磺酸钠的质量比例为8.5：3.5：2.5。
聚合硫酸铁购置于济南端星化工科技有限公司，100目。
活性炭购置于石家庄宏森活性炭有限公司，200目。
对苯乙烯磺酸钠购置于武汉华翔科洁生物技术有限公司。
对比例3
一种牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，包括以下步骤：
步骤1)，配置浓度为8％的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂，取50mL抗凝剂和950mL新鲜牛血，投入容器中，混合均匀，然后通过2000r/min离心15min，分离得红细胞，将红细胞用浓度为0.9％的生理盐水洗涤三次，然后加入2000mL去离子水溶胀破壁，制得溶血液。
步骤2)，向溶血液中加入氯化铜，每500mL溶血液中加入1g氯化铜，然后转速240r/min，搅拌30s，然后将溶血液加热至70℃，保温20min，然后降温至10℃，加入助沉剂，每1L溶血液中加入5g助沉剂，然后5000r/min离心15min，取上清液。
步骤3)，将上清液用0.45um滤膜过滤除去微小杂蛋白颗粒后，用3K超滤膜浓缩至50ml。
步骤4)，将浓缩液冷却至4℃，调节pH为4.95，加入4℃的无水乙醇，静置1h，恒温4℃下，4000r/min离心30min，取沉淀，得一次沉淀物，将一次沉淀物用4℃pH为4.95的乙醇水溶液重悬，离心，取沉淀，得二次沉淀物。
步骤5)，将二次沉淀物用去离子水溶解，然后用3K超滤膜超滤洗去残留乙醇，冷冻干燥，得牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶。
其中，助沉剂为聚合硫酸铁、二氧化硅、聚丙烯酰胺的复配，聚合硫酸铁、二氧化硅、对苯乙烯磺酸钠的质量比例为8.5：3.5：2.5。
聚合硫酸铁购置于济南端星化工科技有限公司，100目。
二氧化硅购置于杭州仲鸿化工新材料有限公司，1000目。
聚丙烯酰胺购置于无锡蓝波化学品有限公司。
对比例4
一种牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，包括以下步骤：
步骤1)，配置浓度为8％的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂，取50mL抗凝剂和950mL新鲜牛血，投入容器中，混合均匀，然后通过2000r/min离心15min，分离得红细胞，将红细胞用浓度为0.9％的生理盐水洗涤三次，然后加入2000mL去离子水溶胀破壁，制得溶血液。
步骤2)，向溶血液中加入氯化铜，每500mL溶血液中加入1g氯化铜，然后转速240r/min，搅拌30s，然后将溶血液加热至70℃，保温20min，然后降温至10℃，加入助沉剂，每1L溶血液中加入5g助沉剂，然后5000r/min离心15min，取上清液。
步骤3)，将上清液用0.45um滤膜过滤除去微小杂蛋白颗粒后，用3K超滤膜浓缩至50ml。
步骤4)，将浓缩液冷却至4℃，调节pH为4.95，加入4℃的无水乙醇，静置1h，恒温4℃下，4000r/min离心30min，取沉淀，得一次沉淀物，将一次沉淀物用4℃pH为4.95的乙醇水溶液重悬，离心，取沉淀，得二次沉淀物。
步骤5)，将二次沉淀物用去离子水溶解，然后用3K超滤膜超滤洗去残留乙醇，冷冻干燥，得牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶。
其中，助沉剂为聚合氯化铝、活性炭、对苯乙烯磺酸钠的复配，聚合硫酸铁、二氧化硅、对苯乙烯磺酸钠的质量比例为8.5：3.5：2.5。
聚合氯化铝购置于云南淼淳水处理科技有限公司，80目。
活性炭购置于石家庄宏森活性炭有限公司，200目。对苯乙烯磺酸钠购置于武汉华翔科洁生物技术有限公司。
对比例5
一种牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，包括以下步骤：
步骤1)，配置浓度为8％的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂，取50mL抗凝剂和950mL新鲜牛血，投入容器中，混合均匀，然后通过2000r/min离心15min，分离得红细胞，将红细胞用浓度为0.9％的生理盐水洗涤三次，然后加入2000mL去离子水溶胀破壁，制得溶血液。
步骤2)，向溶血液中加入氯化铜，每500mL溶血液中加入1g氯化铜，然后转速240r/min，搅拌30s，然后将溶血液加热至70℃，保温20min，然后降温至10℃，加入助沉剂，每1L溶血液中加入5g助沉剂，然后5000r/min离心15min，取上清液。
步骤3)，将上清液用0.45um滤膜过滤除去微小杂蛋白颗粒后，用3K超滤膜浓缩至50ml。
步骤4)，将浓缩液冷却至4℃，调节pH为4.95，加入4℃的无水乙醇，静置1h，恒温4℃下，4000r/min离心30min，取沉淀，得一次沉淀物，将一次沉淀物用4℃pH为4.95的乙醇水溶液重悬，离心，取沉淀，得二次沉淀物。
步骤5)，将二次沉淀物用去离子水溶解，然后用3K超滤膜超滤洗去残留乙醇，冷冻干燥，得牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶。
其中，助沉剂为聚合硫酸铁、活性炭、聚丙烯酰胺的复配，聚合硫酸铁、二氧化硅、对苯乙烯磺酸钠的质量比例为8.5：3.5：2.5。
聚合硫酸铁购置于济南端星化工科技有限公司，100目。
活性炭购置于石家庄宏森活性炭有限公司，200目。
聚丙烯酰胺购置于无锡蓝波化学品有限公司。
对比例6
一种牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，包括以下步骤：
步骤1)，配置浓度为8％的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂，取50mL抗凝剂和950mL新鲜牛血，投入容器中，混合均匀，然后通过2000r/min离心15min，分离得红细胞，将红细胞用浓度为0.9％的生理盐水洗涤三次，然后加入2000mL去离子水溶胀破壁，制得溶血液。
步骤2)，向溶血液中加入氯化铜，每500mL溶血液中加入1g氯化铜，然后转速240r/min，搅拌30s，然后将溶血液加热至70℃，保温20min，然后降温至10℃，加入助沉剂，每1L溶血液中加入5g助沉剂，然后5000r/min离心15min，取上清液。
步骤3)，将上清液用0.45um滤膜过滤除去微小杂蛋白颗粒后，用3K超滤膜浓缩至50ml。
步骤4)，将浓缩液冷却至4℃，调节pH为4.95，加入4℃的无水乙醇，静置1h，恒温4℃下，4000r/min离心30min，取沉淀，得一次沉淀物，将一次沉淀物用4℃pH为4.95的乙醇水溶液重悬，离心，取沉淀，得二次沉淀物。
步骤5)，将二次沉淀物用去离子水溶解，然后用3K超滤膜超滤洗去残留乙醇，冷冻干燥，得牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶。
其中，助沉剂为聚合氯化铝、活性炭、聚丙烯酰胺的复配，聚合硫酸铁、二氧化硅、对苯乙烯磺酸钠的质量比例为8.5：3.5：2.5。
聚合氯化铝购置于云南淼淳水处理科技有限公司，80目。
活性炭购置于石家庄宏森活性炭有限公司，200目。
聚丙烯酰胺购置于无锡蓝波化学品有限公司。
对比例7
一种牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，包括以下步骤：
步骤1)，配置浓度为8％的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂，取50mL抗凝剂和950mL新鲜牛血，投入容器中，混合均匀，然后通过2000r/min离心15min，分离得红细胞，将红细胞用浓度为0.9％的生理盐水洗涤三次，然后加入2000mL去离子水溶胀破壁，制得溶血液。
步骤2)，向溶血液中加入氯化铜，每500mL溶血液中加入1g氯化铜，然后转速240r/min，搅拌30s，然后将溶血液加热至70℃，保温20min，然后降温至10℃，然后5000r/min离心15min，取上清液。
步骤3)，将上清液用0.45um滤膜过滤除去微小杂蛋白颗粒后，用3K超滤膜浓缩至50ml。
步骤4)，将浓缩液冷却至4℃，调节pH为4.95，加入4℃的无水乙醇，静置1h，恒温4℃下，4000r/min离心30min，取沉淀，得一次沉淀物，将一次沉淀物用4℃pH为4.95的乙醇水溶液重悬，离心，取沉淀，得二次沉淀物。
步骤5)，将二次沉淀物用去离子水溶解，然后用3K超滤膜超滤洗去残留乙醇，冷冻干燥，得牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶。
实验1
SOD活性的测定
1.1邻苯三酚自氧化速率的测定
在试管中按表1加入缓冲液和双蒸水，于25℃恒温20min后加入25℃预热过的邻苯三酚，迅速摇匀，立即倾入比色杯中，在波长325nm处每30s测定1次吸光值A325nm，对照管浓度为10mmol/L的盐酸代替，试剂1为双蒸水，试剂2是浓度为100mmol/L的Tris-HCl缓冲液，试剂3是浓度为45mmol/L的邻苯酚溶液，试剂4是浓度为10mmol/L的盐酸。
1.2SOD活性的测定
SOD活性的测定按表1操作，加入邻苯三酚前先加入一定量的SOD,并减少同体积双蒸水，其他操作均与上相同，所测吸光度为B325nm，通过测定邻苯三酚的自氧化反应速度(ΔA325nm/min)和SOD抑制下的自氧化反应速度(ΔB325nm/min)，便可计算出SOD活力，活力单位定义为：25℃，1ml反应液抑制邻苯三酚自氧化速率达50％的酶量定为一个活力单位(U)。
使用仪器如下：
752紫外可见分光光度计，设备编号：ZJ-01-41。
JF分析天平，设备编号：ZJ-01-033。
表1邻苯三酚自氧化速率测定加样表
在选择性热变性实验步骤后测SOD活性，设为100％回收率，依次测定超滤浓缩后和两次乙醇析出后的SOD活性，计算整个实验活性回收利率。详见表2。
表2牛血SOD各步骤回收率比较
根据表2可得，SOD活力保持69-75％。SOD的活力保持在较高水平，且实施例与对比例的SOD活力差距不大，均能使制得的SOD保持较高的活力。
实验2
用SDS－PAGE聚丙烯酰胺电泳法测定SOD的纯度，5％浓缩胶，15％分离胶。牛SOD分子量33kDa，由两个亚基组成，SDS-PAGE电泳显示亚基分子量16.5kDa。各实施例及对比例制得的SOD的电泳图详见图1-11。
图1中：1-Marker；2-步骤2)制得的上清液；3-步骤5)制得的SOD。
图2中：1-Marker；2-步骤2)制得的上清液；3-步骤5)制得的SOD。
图3中：1-Marker；2-步骤2)制得的上清液；3-步骤5)制得的SOD。
图4中：1-Marker；2-步骤5)制得的SOD；3-步骤2)制得的上清液。
图5中：1-Marker；2-步骤2)制得的上清液；3-步骤5)制得的SOD。
图6中：1-Marker；2-步骤2)制得的上清液；3-步骤5)制得的SOD。
图7中：1-Marker；2-步骤2)制得的上清液；3-步骤5)制得的SOD。
图8中：1-Marker；2-步骤5)制得的SOD；3-步骤2)制得的上清液。
图9中：1-Marker；2-步骤2)制得的上清液；3-步骤5)制得的SOD。
图10中：1-Marker；2-步骤5)制得的SOD；3-步骤2)制得的上清液。
图11中：1-Marker；2-步骤5)制得的SOD；3-步骤2)制得的上清液。
根据图1-11可得，各实施例的SOD纯度显著高于各对比例的SOD纯度。
结合实验1、2的数据对比可得，各实施例的提取物工艺在特殊的助沉剂的帮助下，制得的SOD活性高，纯度高，无需长时间上柱，也无需浪费大量缓冲盐，提取效率较高，成本较低，提取得到的目标产品质量也较佳。
而对比例1-7由于改变了助沉剂的特殊复配体现或取消助沉剂，导致在离心过程中，变性蛋白未能很好地分离，从而使得制得的SOD中杂质增多，虽然SOD的活性较高，但纯度有显著的下降。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (10)
1.一种牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1），从新鲜牛血中分离得红细胞，将红细胞溶胀破壁，得溶血液；
步骤2），向溶血液中加入水溶性含铜化合物，搅拌加热至50-70℃，保温20-30min，降温至5-10℃，加入助沉剂，离心，取上清液；
步骤3），超滤浓缩，得浓缩液；
步骤4），将浓缩液冷却至2-4℃，调节pH为4.8-5，加入2-4℃的无水乙醇，静置1-2h，离心，取沉淀，得一次沉淀物，将一次沉淀物用2-4℃pH为4.8-5的乙醇水溶液重悬，离心，取沉淀，得二次沉淀物；
步骤5），将二次沉淀物用水溶解，然后超滤、干燥，得牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶；
所述助沉剂为聚合硫酸铁、二氧化硅、对苯乙烯磺酸钠的复配。
2.根据权利要求1所述的一种牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，其特征在于：所述助沉剂中聚合硫酸铁、二氧化硅、对苯乙烯磺酸钠的质量比例为8-9：3-4：2-3。
3.根据权利要求1所述的一种牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，其特征在于：所述步骤2）中，每1L溶血液中加入1-5g助沉剂。
4.根据权利要求1所述的一种牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，其特征在于：所述步骤1）中，从新鲜牛血中分离得红细胞时，通过向新鲜牛血中加入柠檬酸钠溶液，然后经离心分离得红细胞。
5.根据权利要求4所述的一种牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，其特征在于：所述步骤1）中，将红细胞溶胀破壁时，先用生理盐水洗涤，然后加入去离子水溶胀破壁。
6.根据权利要求1所述的一种牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，其特征在于：所述步骤2）中，水溶性含铜化合物为氯化铜。
7.根据权利要求6所述的一种牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，其特征在于：所述步骤2）中，每500mL溶血液中投入0.9-1.1g氯化铜。
8.根据权利要求1所述的一种牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，其特征在于：所述步骤4）中，将浓缩液冷却至4℃，调节pH为4.95，加入4℃的无水乙醇，静置1h，离心，取沉淀，得一次沉淀物，将一次沉淀物用4℃pH为4.95的乙醇水溶液重悬，离心，取沉淀，得二次沉淀物。
9.根据权利要求1所述的一种牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，其特征在于：所述步骤3）中，超滤浓缩时，先用0.45um滤膜过滤后，再用3K超滤膜浓缩。
10.根据权利要求9所述的一种牛血Cu-Zn超氧化物歧化酶的分离提取方法，其特征在于：所述步骤3）中，浓缩液体积与步骤1）中处理的新鲜牛血的体积比例≤1/10。
Priority Applications (1)
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2023
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Patent Citations (6)
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| 王保全等: "用低聚PAAS热沉淀法提取血液超氧化物歧化酶", 现代生物医学进展, vol. 9, no. 19, pages 1 * |
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