DE68911726T2 - Luciferase. - Google Patents
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Description
- Diese Erfindung betrifft eine Luciferase, die die Oxidation von Luciferin durch ein Sauerstoffmolekül katalysiert.
- Da eine Luciferase, die von Luciola lateralis abgeleitet ist, instabil ist, war bislang ihre Reinigung nicht erfolgreich [Tanpakushitsu Kakusan Koso (Protein, Nucleic Acid, Enzyme) Band 32, Nr. 10, S. 44-59, insbesondere S. 47 (S. 1234-1249, insbesondere S. 1237), (1987)].
- Luciferasen sind sehr effizient verwendbar, beispielsweise zur quantitativen Bestimmung von ATP.
- Die vorliegende Erfindung will eine Luciferase zur Verfügung stellen, die von Luciola lateralis abgeleitet ist.
- Im Hinblick auf den oben beschriebenen Zustand forschten die gegenwärtigen Erfinder hart, und als Folge davon gelang es ihnen, eine Luciferase aus dem Hinterteil von Luciola lateralis zu isolieren, wodurch die vorliegende Erfindung erreicht wurde.
- D.h., die vorliegende Erfindung stellt eine Luciferase mit den folgenden physikochemischen Eigenschaften dar:
- Die Luciferase ist ein Enzym, das die Oxidation von Luciferin durch ein Sauerstoffmolekül katalysiert, wie durch die Enzymreaktionsformel:
- Luciferin + ATP + O&sub2; T Oxyluciferin + AMP + Pyrophosphorsäure + CO&sub2; + Licht
- gezeigt wird.
- Die Luciferase wirkt nicht auf ADP, CTP, UTP und GTP.
- Das pH-Optimum ist 7,5 bis 9,5, während Luciferin als Substrat verwendet wird (siehe Fig. 1). Der pH-stabile Bereich des Enzyms beträgt 6,0 bis 10,5 (siehe Fig. 2).
- 0ºC bis 50ºC.
- Bei pH-Werten von 5,0 oder weniger und 12,0 oder mehr, wird die Luciferase nach 4stündiger Einwirkung unter diesen oben erwähnten Bedingungen vollständig inaktiviert. Bei pH 7,8 wird die Luciferase durch Hitzebehandlung bei einer Temperatur von 55ºC während 15 min vollständig inaktiviert.
- Nach Behandlung bei einer Temperatur von 40ºC während 15 min hat die Luciferase eine restenzymatische Aktivität von 78,3 %. Selbst bei einer Behandlung bei einer Temperatur von 50ºC während 8 min hat die Luciferase eine enzymatische Restaktivität von 6 %.
- Die Luciferase ist aus Luciola lateralis erhältlich.
- Fig. 1 ist ein Graph, der die optimale pH-Region des erfindungsgemäßen Enzyms zeigt, und Fig. 2 ist ein Graph, der den pH-Stabilitätsbereich des erfindungsgemäßen Enzyms zeigt.
- Die vorliegende Erfindung wird nachstehend im Detail erklärt.
- Zunächst werden die physikochemischen Eigenschaften des vorliegenden Enzyms nachstehend beschrieben.
- Das Enzym katalysiert die Oxidation von Luciferin durch ein Sauerstoffmolekül, wie durch die folgende enzymatische Reaktionsformel gezeigt wird: Luciferin + ATP + 02 vorliegendes Enzym Oxyluciferin + AMP + pyrophosphorsäure + CO&sub2; + Licht
- Das Enzym wirkt nicht auf ADP, CTP, UTP und GTP.
- Das pH-Optimum ist, wie in der Fig. 1 gezeigt ist, 7,5 bis 9,5, wie gemessen wurde, indem die Reaktion unter Verwendung von Luciferin als Substrat bei verschiedenen pH-Werten in einer 25 mM Glycylglycin-Pufferlösung von 6,5 bis 11,5 und bei einer Temperatur von 30ºC ausgeführt wurde und die Lichtquanten (die Photonenzahl), die in 20 s emittiert wurde, gemessen wurde. Der stabile pH-Bereich des Enzyms ist, wie in Fig. 2 gezeigt ist, 6,0 bis 10,5, wie gemessen wurde, indem man das Enzym zu den jeweiligen Pufferlösungen [25 mM Phosphat-Pufferlösung (pH 4,6 bis 8,0) und 25 inM Glycin Natriumchlorid-Natriumhydroxid- Pufferlösungen (pH 8,0 bis 11,5), wovon jede Ammoniumsulfat auf 10 % des Sättigungswertes enthält], die Luciferin enthalten, zugibt und das Enzym bei einer Temperatur von 0ºC 4 h einwirken läßt. In Fig. 2 zeigen - und Δ-Δ die Aktivität im Fall der Verwendung der 25 mM Phosphat-Pufferlösungen bzw. die Aktivität im Fall der Verwendung der 25 mM Glycin Natriumchlorid- Natriumhydroxid-Pufferlösungen.
- Eine Luciferinmischlösung wird durch Mischen von 8 ml 25 mM Glycylglycin-Pufferlösung (pH 7,8), 0,5 ml Magnesiumsulfatlösung (eine Lösung, hergestellt durch Zugabe von Magnesiumsulfat zu 25 mM Glycylglycin- Pufferlösung (pH 7,8) auf eine Magnesiumsulfatkonzentration von 0,1 M] und 0,8 ml einer Luciferinlösung [eine Lösung, die durch Zugabe von 25 mM Glycylglycin-Pufferlösung (pH 7,8) bis zu einer Luciferinkonzentration von 1 mM erhalten wurde] hergestellt.
- Zu einer Mischung aus 400 ul der so erhaltenen Luciferinmischlösung und 10 ul zu untersuchender Luciferase werden 80 ul einer ATP-Lösung [eine Lösung, die durch Zugabe von ATP zu einer 25 mM Glycylglycin- Pufferlösung (pH 7,8) auf eine ATP-Konzentration von 10 mM erhalten wurde] hineingegeben. Gleichzeitig mit der Zugabe wird die Anzahl an erzeugten Photonen durch Aufaddition während 20 s mittels eines Luminometers (LUMINESCENCE READER BLR-201, hergestellt von ALOKA CO., LTD.) gemessen.
- Wenn die Reaktion bei pH 7,8 und den jeweiligen Temperaturen ausgeführt wird und die in 20 s emittierten Lichtquanten (die Photonenzahl) gemessen werden, reicht die geeignete Temperatur für die Wirkung von 0ºC bis 50ºC.
- Bei pH-Werten von 5,0 oder weniger und 12,0 oder mehr, wird das Enzym nach 4 h vollständig inaktiviert.
- Bei pH 7,8 wird das Enzym vollständig durch Hitzebehandlung bei einer Temperatur von 55ºC während 15 min inaktiviert.
- Nachdem 100 ul einer Lösung [60 mM Phosphat-Pufferlösung (pH 7,5), mit 10 % (V/V) Ethylenglycol, 0,1 M NaCl und 0,2 % (G/V) Albumin], die 100K-Count eines gereinigten Enzympräparats enthielt, bei einer Temperatur von 40ºC während 15, 30 bzw. 60 min. aufbewahrt wurde, wurde die restliche enzymatische Aktivität gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.
- Zum Vergleich sind in Tabelle 1 auch die Ergebnisse der Messung der Restaktivitäten von Luciferasen von Luciola cruciata und Photinus pyralis auf dieselbe Weise wie oben beschrieben gezeigt. Tabelle 1 Restaktivität von Luciferase (%) Luciferasetyp Haltezeit (min) Luciola lateralis (erfindungsgemäß) Luciola cruciata (Referenz) Photinus pyralis (Referenz)
- Wie aus Tabelle 1 klar ist, kann ersehen werden, daß die vorliegende Erfindung in einer Luciferase besteht, die den Referenz-Luciferasen in Hitzebeständigkeit deutlich überlegen ist.
- Als nächstes wird ein konkreter Weg zur Herstellung des erfindungsgemäßen Enzyms nachstehend beschrieben.
- Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Enzyms kann ein beliebiges Verfahren angewandt werden; beispielsweise kann das folgende Verfahren angeführt werden:
- Als die in der vorliegenden Erfindung verwendete Luciola lateralis kann eine beliebige natürliche oder künstlich gezüchtete Luciola lateralis verwendet werden. Da eine große Menge von Luciferase im Hinterteil von Luciola lateralis existiert, ist dieses Hinterteil als Quelle, aus der Luciferase separiert wird, geeignet.
- Luciola lateralis wird zu einer Pufferlösung zugegeben und unter Erhalt eines gemahlenen Produkts gemahlen. Als Pufferlösung kann eine beliebige verwendet werden, solange sie nicht Luciferase inaktiviert, und als Beispiel können Lösungen angeführt werden, die durch Zugabe von Ammoniumsulfat zu jeweils Tris(hydroxy)aminomethan- Salzsäure-Pufferlösungen, Glycin Natriumchlorid- Natriumhydroxid-Pufferlösungen, Phosphat-Pufferlösungen etc. auf 10 % Sättigungswert hergestellt werden.
- Als Mittel zum Vermahlen können beispielsweise ein Verfahren unter Verwendung eines Mörsers und einer Reibschale und Verfahren unter Verwendung eines Homogenisators, eines Waring-Mischers, einer französischen Presse oder dgl. angeführt werden. Anschließend wird der Rückstand von dem gemahlenen Produkt durch gewöhnliche Zentrifugation, Filtration oder dgl. unter Erhalt einer Rohenzymlösung gemahlen. Falls nötig wird das Rohenzym durch ein Verfahren behandelt, das geeignet ausgewählt wird aus Gefriertrocknung, alkoholischer Fällung, Acetonfällung etc., so daß ein Rohenzympulver erhalten wird. Ein gereinigtes Enzympräparat kann aus der Rohenzymlösung oder dem Rohenzympulver durch eine Kombination von Methoden erhalten werden, die geeignet ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus beispielsweise Gelfiltrationsverfahren unter Verwendung von Sephadex, Ultrogel, Biogel etc.; Adsorption- und Eluierungsverfahren unter Verwendung von Ionenaustauschern; elektrophoretischen Verfahren unter Verwendung von Polyacrylamidgelen etc., Adsorptions- und Eluierungsverfahren unter Verwendung von Hydroxyapatit; Sedimentationsverfahren wie Sucrose- Gradientenzentrifugation und dgl., affinitätschromatographische Verfahren und Fraktionierungsverfahren unter Verwendung einer Molekularsiebmembran, einer Hohlfasermembran etc.
- Die vorliegende Erfindung wird durch das folgende Beispiel weiter erklärt.
- Zu 25 mM Tris(hydroxy)aminomethan-Salzsäurepuffer wurden 1 mM Dinatriumethylendiamintetraacetat und 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid zugegeben, gefolgt von Zugabe von Ammoniumsulfat auf 10 % des Sättigungswerts. Zu 15 ml der so erhaltenen Mischlösung (pH 7,8) wurden die Hinterteile von 200 Insekten (Luciola lateralis) (gekauft von Seibu Department Store Co., Ltd.) zugegeben und mittels eines PHYSCOTRON (hergestellt von NITI-ON Medical and Physical Instrument Manufacturing Company LTD.) zerstört. Die so erhaltene Flüssigkeit wurde bei 12 000 Upm während 20 min unter Erhalt von 14,5 ml eines überstands (einer Rohenzymlösung) zentrifugiert.
- Die so erhaltene Rohenzymlösung wurde unter Verwendung von Ammoniumsulfat auf herkömmliche Weise ausgesalzen, und der bei 30 bis 70 % Sättigung gebildete Niederschlag wurde bei 30 000 Upm 10 min zentrifugiert. Der resultierende Niederschlag wurde in einer 25 mM Mischlösung [eine Lösung (pH 7,8), hergestellt durch Zugabe von 1 mM Dinatriumethylendiamintetraacetat und Ammoniumsulfat in einer Menge, daß eine 10%ige Sättigung damit bewirkt wurde, zu einer kleinen Menge von 25 mM Tris(hydroxy)aminomethan-Salzsäurepuffer] unter Erhalt einer Lösung gelöst.
- Danach wurde diese Lösung einer Gelfiltrationschromatographie unterworfen, indem dieselbe durch eine Ultrogel AcA 34 (hergestellt von Pharmacia K.K.) Säule, die mit der obigen 25 mM Mischlösung äquilibiert worden war, geschickt wurde, so daß eine aktive Fraktion erhalten wurde. Die so erhaltene Fraktion wurde gegen eine Phosphatpufferlösung dialysiert [eine Pufferlösung, hergestellt durch Zugabe von 0,1 M Natriumchlorid und 10 % (V/V) Ethylenglycol zu einer 10 mM Natriumhydrogenphosphat-Natriumdihydrogenphosphat-Lösung]. Die dialysierte Lösung wurde auf einer Hydroxyapatit HPLC (TSK Gel HA-1000, hergestellt von Toyo Soda Mfg. Co., Ltd.) Säule, die mit 10 mM Phosphatpuffer äquilibriert worden war, adsorbiert und eine lineare Gradienteneluierung mit Phosphatpufferlösungen (pH 7,5), die in der Konzentration von 10 bis 100 mM reichten, wurde ausgeführt, wodurch 180 ul (enzymatische Aktivität 2,4 x 10² K Count) einer gereinigten, luciferaseaktiven Fraktion, abgeleitet von Luciola lateralis, erhalten wurden.
Claims (2)
1. Luciferase mit den folgenden physikochemischen
Eigenschaften:
(1) Wirkung
Die Luciferase ist ein Enzym, das die Oxidation von
Luciferin durch ein Sauerstoffmolekül katalysiert,
wie durch die folgende enzymatische Reaktionsformel
gezeigt wird:
Luciferin + ATP + O&sub2; T
Oxyluciferin + AMP + Pyrophosphorsäure + CO&sub2; + Licht
(2) Substratspezifität
Die Luciferase wirkt nicht auf ADP, CTP, UTP und GTP.
(3) pH-Optimum- und pH-Stabilitätsbereich
Das pH-Optimum ist 7,5 bis 9,5, wenn Luciferin als
Substrat verwendet wird (siehe Fig. 1). Der stabile
pH-Bereich des Enzyms beträgt 6,0 bis 10,5 (siehe
Fig. 2).
(4) Geeigneter Temperaturbereich für die Wirkung:
0ºC bis 50ºC.
(5) Bedingungen der Inaktivierung durch pH,
Temperatur, etc.
Bei pH-Werten von 5,0 oder weniger und 12,0 oder mehr
wird die Luciferase nach 4stündiger Einwirkung unter
diesen oben erwähnten Bedingungen vollständig
inaktiviert. Bei pH 7,8 wird die Luciferase durch
Hitzebehandlung bei einer Temperatur von 55ºC während
15 min vollständig inaktiviert.
(6) Thermische Stabilität
Nach Behandlung bei einer Temperatur von 40ºC während
15 min hat die Luciferase eine enzymatische
Restaktivität von 78,3 %. Selbst nach einer
Behandlung bei einer Temperatur von 50ºC während 8
min hat die Luciferase eine enzymatische
Restaktivität von 6 %.
(7) Quelle:
Die Luciferase ist aus Luciola lateralis erhältlich.
2. Luciferase gemäß Anspruch 1, die von Luciola
lateralis abgeleitet ist.
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