JPS59135900A - クレアチンキナ−ゼの定量用組成物及び定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明ｉｔ、水性７１に中のクレアチンキナーゼ含１１
：の分析に関し、さらに詳しくＣ５、生物学的液体、た
とえば、１ｒ１１７メイ中のクレアブーンキナーゼの分
析用試薬組成物及びその分析方法にじ’］′−Ｊ’る。

従来技術 生物学的液体、竹にヒト血ｊ′ｉｔ中のクレアチンキナ
ーゼの存在及び量の測定は、心Ｒ／ｊ梗塞症の診１１Ｊ
＋において非常に有用になってきでいる。

従来のクレアチンキナーゼ測定法は一般に、クレアチン
キナーゼが′Ｆ記式で示される正逆両反応を触媒すると
いうことに関係している：クレアチン」−アシーゝノン
ン三＃　ｉ’Ｐ＼−ゝ燐（４ｅ　ｌ　レアブーン１アテ
゛ノシンＬ隣酊。

これら正逆両反応は勺ルｈ人に１更用されているが、逆
ＪＸ比、ｄ−正反１１Ｌ、よりも約６招連いので便反応
の１吏用の力が々Ｊましい。

溶１１ダ中のクレアチンキナーゼを測定するだめのいく
つかの周知方法は、たとえば、Ｎ、Ｗ、タイ１−Ｃ倶」
−リａ−１−ＣｈｅＱ　５ｔｒ７）、Ｗ、Ｒ，リウンダ
ースを土（Ｗ、Ｂ、　５ａｕｎｄｅｒｓ　Ｃｏ、）　、
１９７０年、４６６〜４７０−Ｚ−ジにｉ己載されてい
るような２，１中十／。Ｚ　＆：Ｉ、−そＪ１赴しにの
反応を結０：　（＝Ｊけることを菖む。この文献に記載
された１つの測定法（ｄ　４６７４−〕の式４５ａ〜４
５ｃに説明されている。一連の反応の測″ｌＪｉ　’Ｊ
’　１ｉＥ（な［１的生成物は、分光光１我バ１によっ
て３４　（，１ｎｍで存在が測定されるニコブーンーｊ
−ミドアブ゛ニンジヌクレｊナト燐酸（４冗４１す、以
１’　ＮＡＩ）ＰＨと称する）である。しかしながら、
とのツノ法＆、に仔晶めでｐＨ−１ｙ６受性であって、
１長密なｐｔｌコントロールが宵１１長されなければか
なりのｊｌ’ｌ’ｂｊ−を生じやすい。さらに、ＮＡＩ
）ＰＨ及びＮＡＩ］）（ｊｌｉｊ２化型）は比較的不安
定である。ＴＪＶ７ツセイ法Ｑ」１、比１：１５的にＫ
ｌ　４！ｆｔｔな目１測を必ｔνとし、しかもクレアチ
ンキナービ病性を・側’ｙ−ｅ−Ｊる場汀にｔｊ、柿々
の血）１〜成分からの妨害を受けやすいので望ましくな
い。

クレアチンキナーゼが生物学的ｆ表体中で明らかにスル
フヒドリル（すなわち、メルカプト）酸化及Ｏ−ジスル
フィド形成により不友定であることもま／こ、周知であ
る。このため、全りレアチ′シ゛ギナーゼ活性を回１夏
するために溶液アッセイでは活１生化剤が用いられる。

当業界で周知の分析方法、たとえｄ゛、ＵＶ吸光度の変
化を測定する方法において使用さオＬる最も普通の活性
化剤としてしよ、チオグルコース、ジチオトレイト−ル
、ノチオエリトリト−ル、メルカクトエタノール、Ｎ−
アセチルシスディン及びグルタチオンのようなスルフヒ
ドリル化合物が挙げられる。しかしながら、周知の方法
ではＦ９［望のクレアチンキナーゼ活性化のために充分
な高い濃度で活性化剤を匝用すると、それらは比色分析
にイ１用な多くの試・’ｈ　（、ｌｔ　Ｖ２４ｉｉ示１
ｆ４としでも知られる）に不利な影袢を４ｊえる。−１
１−１活１テ１化剤＆、ｌ　ＩＱ、原体を酪白して、色
−＋Ｌを減少し、アッセイをより人山ｊ　Ｌやずくする
。菱！１山１’ｌ；　ｔｔ、Ｊ、、／ことえＶ」：周幻
ｌの１ＪＶｉ人の１．１：１合にｌｌｊト、ｊＨ□（て
、Ｊうっ／こ。このことはイ浸家りの１夕１］１　　に
１１（゛す　。

元りｉの１自り 不発り」の目的は、水＋を液中のりｌ／アチンギナーセ
゛を測定するだめの改良さｔｌ／ζｌ／反力法成物を提
供することにある。安冗なイ・（・・；１コ及び４：＋
ｊ　ｌｌｊ　ｌＪ能で１（）現性のある比色変化をＳ生
するダ定な副４１．物を汀む−Ｍｉｈの反応＾Ｓ利用う
゛ることによって、周知のＵＶアッセイ法の間ｉＴ’！
ｉ、’ｌ’ｊ’に敦！１ＩＩＩ注の間：Ｉ（１４回ポし
する比色法が望」れでいる。

元！、！ｌｊの隔成 木９１昶１］は、この目的をｃ１成する方法及び対応す
る糸旧戊′Ｉ勿を」是１共Ｊる。クレアチンキナーゼの
定」、；方法は、 （Ａ）　　（１）液口（のサングルと（２）クレアヂ：
／キナーゼ含有液の存在トーで次のｌ１ｌＩｉ序の一、
’＋１４の反応（ａ）　、　（ｂ）及び（Ｃ）： （ａ）　　クレアチンキナーゼの台１℃■；で燐酸クレ
アチンとアブ゛ノシンニ：ｌｆｆ１ｉ　！Ｗｉｇとを反
応さ一硅てクレアチン及びアデノシン三燐ｆ’、’５を
形成し；（ｂ）グリヒロールギナーゼ及びアデノシン三
＋１１１？１＼苛のイア召−下でグリセロールを；・を
ｒ’ＲｆヒしてＬ−α−ダグ１ルセロホスフエート形成
し７；そして（Ｃ）α−グリセロポスフェートオキシダ
ーゼ及び比色指示薬組成物の存在ＦでＬ−α−グリセロ
ホスフェートを酸化して吸光度（ｏｐｔｉｃａｌｄｅ＋
１ｅｉｔｙ）　ｆ化を生じる を行なう試薬とｔ接触せしめ、そ（７て（Ｉ３）該吸ゲ
Ｃ度変化の＋、ＳＩＪ合を定則的に検出するエイ呈を・
含んでなる。

本発明のｉｌ目成物は、（ａ）ｔに、「ｒ；にクレアチ
ン、（ｂ）アテ゛ノシンニ燐酸、゛（ｃ）グリセロール
、（ｄ）グリセロールへ−ナーゼ、（ｅ）α−グリセロ
ホスフェートオキシダーゼ及び（ｆ）色原体を含む比色
指示薬組成ｌ；勿を３゛んでなる。

以１余白 翰叩−ｐ合々退 本発明ｔ；ｔ、周知方法にイヅる多くの利点を有」る。

不発ｊｌ、１１は、／ことえは、周・丈１１のＵＶ法よ
りもん通りＪｌ’ｌ：が少ない。このだめ、本情明によ
れＱ、１；、「６．磁ス被りトルのｉＴＪ視領域（一般
に４００〜９００　ｎｍ）のいくつかの）皮」（の１１
）において１ｍ＞ｊ−′用ｆ！ｉ−（な色の変化を通し
てクレアチンキナーゼの１，１刺叶１が・ちり［Ｌつ正
イ面な分析ができるのである。用社’、　１ｉｆｚ代に
おけるこシ１らのｉｆ！ＩＩ　’ｉ７　＆；ｌ、低波長
（たとえは、約４（１Ｏｎｍ未（１！１ｌｉ）にｊＦ−
けるＵ　Ｖ　１ｌｌｌｌ定よりも高１．：４　Ｌ”＜べ
たとえ６，１：、５００　ｎｍを超える波Ｌ＋：）で行
なッ／コ用ｉ”ｉにＨｈｌＪに、血清成夕士からの妨占
を・Ｕけにくい、。

＋ボ明ではＮＡＩ）Ｐ”−及びＮＡＤＰＩＩを使用しな
い一連の反応が用いられるので、ＮＡＤＰ”−及こ）Ｎ
Ａｏｒｑ＋の安定性は本発明では関係がない。さらに、
本今へ明によれば、少１τ；の液体−リ”ンゾ゛ルを用
いて溶液（・；ミ式でも乾燥様式ても水性ｉ＋１．　（
だとえ（」、旧情）のアッセイがｉり能である。−また
１、４Ｎづ［、明の実施に１シＰ用する１“（）Ｙ素（
ｌよ比較的広いｐＨ１ｌｔ１．ｉ、囲にわ／こっ゛Ｃ活
性である。１１ｒつで、Ｅ制、宕・穎刹コン］・ロール
は不′７早である。本発明の組成Ｊｌｌａ（を用いる乾
４．Ｑ、＋・＋、）、ｊｆｉ”鯰（（においては、クレ
アチンキナーゼ活性化剤Ｕｌ、このような要素中で比較
的高い活性化剤濃度が使用し易いような１．）ノ９［に
まＡ−ｋＪ、）１勿、・１４で曲用土きる。思いがＵ」
ないことに、ある４重のメツしカブ゛１・−菖・１７占
１＋化ｆｉ１．ｌ、ｊ−なわら、Ｎ−アセチルシスティ
ンは乾燥１ル紫中のクレアチンキナーゼをＪＩＬ分に活
（〈Ｌ化して１１１１１′でＩ’Ｊ現住のある粕果を生
じ、同局に色原体を・無１．ｉｐできるほどしか妨ＮＵ
’　Ｌないことが判明した。グレインギュベーションー
１程もまだ、この乾燥安素の使用によって回避される。

作用 本発明ｄ、水性散中のクレアチンキナーゼの定（６）に
１５℃１する。本発明の実施は、生物学的液体、たとえ
ば、全面１血漿、　ｎｕ？ｉ’ｒ　、リンパ液、胆汁、
尿。

Ｉｌｖ髄散、喀痰、汗等ならびにヒトまたは７（ｄ）物
の１１１便（ｓｔｏｏｌ　５ｅｃｒｅｔｉｏｎ８）を用
いて行なうことができる。骨格筋、心臓、腎臓、肺、脳
９羽髄、皮ｒＭ　二’ｊのようなヒトまだは動物の組織
の液体標本も使用できる。本発明の実施に好ましい生物
学的液体ｉ」、ヒトの血清である。（・１とんどのり４
自・、１（Ｉｔ捏ｆに１、稀釈の必ｌ我がないが、クレ
アチンキナーゼの早が狛、性心助ｊ＋１ｉ　；彰の患′
ｈの１１１１イ′１−の、しうにＡ゛ら；：へに高い揚
台には最適な結！４！、５１ＨＩるためにｆｉ＋ｉ　Ａ
ｉぐ」−ることができる。血清に１２、ＩＪＩＩ　ｒ鳴
したヒトまたは中枦吻の曲品のようなｌｊ′？ｌ蛋白Ｔ
↓溶液でｔＴ＆釈できる。

以ドのＫＸ　１ｉ１ｆｉ　ｋ、’１′、分析溶ｔ１に及
び法燥分析四素の両方に１ｔ１１するも（７）Ｃあルカ
、試＞Ｗ　？−Ｊ、全で乾！、１’ｔ：：　Ｉ、　ｒ’
ｊ　形−ｊ、（１で提供でき、１１Ｊｌ用的曲に水で肖
（１１：成でさること１１、熟練した当菓−ｉｌ］なら
ば容易に埋順てきよう。このノ１７！、ｌの爵１成ノ吻
は、これによって明白にされる、。

本発明の前、ｊ１方法にｒ・・ける々′臂−の１父１５
１ムは、水ＩＩ１．。

を夜“す゛ンフ０ル中、クレアチンキナーゼ゛の１７１
ド７−クレアチン及びＡＴＰを形成するりｒ目−゛クレ
アチンとＡＤＰとの反応である。この反Ｊｃλが、１［
１篩〜、五ｌ＋ｌｌｉ金ス・ｆｉイオンのよりなＩＩｉ
！素補因子のイｆ在１・で進行するととｔＪ、当乙界で
公知である。浦因力＝の回Ｃ」、以トに１ホヘル。ｉ４
　ｆ’７クレアチンはカルパイオケム（Ｃａｌｂｌｏｃ
ｈｅｍ）［カルノオルニア州う・ジョン（Ｌａ　Ｊｏｌ
ｌａ）　］をＮむ多数の入手源のいずれからも市販され
ている生物学的化合物である。ＡＤＰはヌクレオチドＡ
ＴＰの加水分フ管型である。ＡＩ）Ｐは多数の四二：、
Ｌ、、的人手源、たとえば、シグマ・タミヵル社（Ｓｉ
ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）　（ミズーリ州七
ンｉ・ルイス）から容易に入手できる。

次の反応において、グリセロールキナーゼはＡＴＰの存
在下でグリセロールのし一α−グリセロホスフェー用・
への燐酸化を触ＩＩν、−Ｊる。−・般に、本発明をう
甘〈実施するには任意のグリセロールキナーゼが有用で
あるが、大腸ｉ￥ｊ（Ｅ、ｃｏｌｌ）及びカンジダ・ミ
コブリレマ（Ｃａｎｄｌｄａ　ｍｙｃｏｄｅｒｍａ）か
らイｑだものが々ｆま（〜い。他の入手佇からのグリセ
ロールキナーゼ酵素も当菓界で公知である。このような
拐ｆ１の充分な議論ならびにそれらの＋ｉ、’：ｌ製及
び反応性に関する詳１？ｌｌＩな言及は、Ｔ、Ｅ、バー
マン（Ｂａｒｍａｎ）％　　−”−−イ−ν：”ｆ　　
Ｊ’ｊ−Ｉ　／　’：イードフ：−２−１　　（Ｅ＋１
−ｚ、、ｙｍ！！ＪＴ４−ｎ−Ｑ、ｏ−ｏ−に、）、■
、スプリン力一一フェルラ−り（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖ
ｅｒｌａｇ）、＝　ニーヨーク（１９６９年）、４０１
〜４０２−！！−ゾに見られる。ウアーシントン・ノク
イオクミカル・カンパニー（ＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎＢ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）（ニュージャ
ージー州フリーホールド）はグリセロールキナーゼの商
業的入手源である。

本発明の組成物に有用なグリセロールはまた、たとえば
、イーストマン・オーガニック・ケミカルズ（Ｅａｓｔ
ｍａｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（テネ
シー州キングスポート）から商業的に容易に入手できる
し、あるいは当業界で公知の手法を用いて製造できる。

グリセロールは遊離型でもグリセロールの脂肪酸エステ
ル（たとえば、トリグリセリド）としても提供できる。

本発明の実施には遊離グリセロールを使用するのが好ま
しい。

一連の反応の次の工程は、Ｌ−α−グリセロホスフェー
トオキシダーゼ、電子受容体及び比色指示薬組成物の存
在下でＬ−α−グリセロホスフェートを酸化して、比色
分析によって検出可能な物質を生成することを含む。こ
の物質は液体サンプル中に含まれるクレアチンキナーゼ
と定量的に関係する。

Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼは、種々の
入手源から得ることのできる微生物の酵素である。この
配素及び代表的な入手源に関する詳細は、米国特許第４
，２４１，１７８号に記載されている。

また、次の文献は酵素とその調製及び抽出の有用な方法
とについて述べている；エスダース（Ｅｓｄｅｒｓ）ら
、「ストレプトコッカス・フェシウムＡＴＣＣ１２７５
５からのＬ−α−グリセロホスフェートオギシダーゼの
精製及び性質（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐ
ｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｌ−α−Ｇｌｙｃｅｒｏｐ
ｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｆａｅｃｉｕｍ　ＡＴＣＣ１２
７５５）」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５４，２７
１０〜２７１５ページ（１９７９年）；コディヂエク（
Ｋｏｄｉｔｓｃｈｅｋ）ら、「ストレプトコッカス・フ
ェシウム，Ｆ２４中のα−グリセロホスフェートオキシ
ダーゼ（α−Ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｏｘ
ｉｄａｓｅ　ｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏ−ｃｏｃｃｕｓ　Ｆ
ａｅｃｌｕｍ，Ｆ２４）」、ジャーナル・オブ・バクテ
リオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌｏｇｙ），９８（３），１０６３〜１０６８ページ（
１９６９年）及び米国特許第４，１６６，００５号〔１
９７９年８月２８日にマシュア力ー（Ｍａｓｕｒｅｋａ
ｒ）らに対して発行された〕。この酵素はまた、東洋醸
造（静岡県）から商業的に入手し得る。

Ｌ−α−グリセロホスフェートの酸化は比色指示薬組成
物の存在下で起こる。オキシダーゼによるＬ−α−グリ
セロホスフェートの酸化を可能にし、それと共に比色分
析によって検出可能な物質を生成できる電子受答体を含
む組成物が本発明への使用に適当である。

一実施態様において、Ｌ−α−グリセロホスフェートは
指示準組成吻中の色原体と直接反応する。

このような色原体は還元されて、色の変化（すなわち、
吸光度のシフト）を生ずる、すなわち、還元前に無色で
あるのが発色するか、あるいは色濃度を減少させる（色
のシフトではない）ことができる。この場合、色原体が
電子受容体である。次に、これらの変化はいずれも監視
されてクレアチンキナーゼ活性が測定できよう。いくつ
かのインドフェノール類、フェリシアン化カリウム及び
いくつかのテトラゾリウム塩はこの実施態様の実施に有
用である。たとえば、フェナジンと組み合わせたまたは
単独の２，６−ジクロロフェノール，インドールフェノ
ール，及びフェナジンと組み合わせたまたは単独の２−
（ｐ−インドフェニル）−３−（ｐ−ニトロフェニル）
−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリドが時に
有用である。

別の好ましい実施態様においては、非色原体電子受容体
、たとえば、酸素は下記式に従って、Ｌ−α−グリセロ
ホスフェートを酸化して中間物質を生成し、それが次に
比色指示薬組成物中の独立した色原体と反応して、比色
分析によって検出可能な物質を生成する： （３ａ） （４）中間物質＋比色指示薬組成物→比色分析によって
検出可能な物質。

この好ましい実施態様の実施においてクレアチンキナー
ゼの定量は、電子受容体としての空中酸素ならびに（１
）過酸化活性を有する物質及び（２）色原体を含んでな
る比色指示薬組成物を用いて行なう。

反応（３ａ）は反応生成ｊＶ４と（〜てジヒドロキシア
セトンホスフェート及び１（、’４　ｊｊＱ化水２（二
を生成“Ｊる３、式（４）において過酸化水素と反応す
るのに有用な比色指示Ｊ、’：　＋１ｉＬＩ成物は尚粟
ｈ１１．で公知である。一般に、このよりなｉ（旧戊物
Ｃ」、鍋酸仕ハ゛、１ｊ　（／１を１１する！ｌ’／１
賀を含んでなる。々ｆ；口、＜シ」１．この物ｒ：１は
ペルオキシダーゼである。

ペルオキシダーゼは、：ｉｔ、−！Ｉｌ’ｌ’（化水素
が別の物：１・１．を酸化する］又応全ｐ逮媒・ｊ“る
［１ｆネ゛である。ベル刊キシダーゼケよ一般に、鉄７
Ｊ？ルフィリンを剖むｉｊ、！合蛋白質である。ベル刊
キシダーゼは、西ｌ」−ソナビ、じゃがいも、いりじく
ル’ｉｆ　ｉｉ＋４校びかふ（＜＋（＋物−ぞレオキシ
ダーゼ）；乳７′１−　（ラクトペルオキシダーゼ）；
ナラびに白」（１１３：ｉｊミ（ベルド波ルオキソタ゛
−ビ）中に存在する。４ルオキシダーセ゛Ｏ′、１、ｔ
プこ、ｉ救主物中にも存在し、発酵によって生成できる
。セオレル（Ｔｈｅｏｒａｌｌ）及びメーリ４　（Ｍａ
ｅｈｌｙ）によってＡｃｔａ　Ｃｈｅｍ、５ｃａｎｄ、
、第４巻、４２２〜４３４−！’−ジ（１９５０年）中
に開示されたようないくつかのきＪ戊−りレオキシダー
ゼもまたイ〕）目である。Ａ了ましい被ルオキシダーゼ
υ）西）１−わさびから′１１ｔられたものである１、 これらより少しらるが、シリカクゝルに甲支１１）（い
−またヘミン、メトヘモグロヒ゛ン、伺へ−ン′＼１−
グ１−１ヒ゛ン、ヘモグロビン、へ−巳クロＩ・−りゞ
ン、−１″ルカリ１土ヘマチン、ヘミン誘シ！ンイ本、
スルポジーアンＩ：ンｆＪ：　。

タンニン１ζ２ｐＪ＜、フェロシアン化第−１＜　、　
、ＪＣ−り。

ム酸塩したとえは、クロム１１旧ｂｆｅ　ｔイ？カリウ
ム（ｐｏｔａｑｓｌｕｍ　ｃｈｒｏｍｌｃ　！Ｉｕｌｆ
ｌＩｔｅ）　］　ＷｊのようなＩ勿ｌｉｔも１）用であ
る。

比色指示病１ｌｉｌｌ成物はまた、定量的に測定しｊＩ
Ｉる定；１；的比色に１．−化（たとえば、発色９色の
変化または色１．′、↓度の匹化）を直接的または間接
的に生ずる有色まだは＃＋ｔ１を色の物質である色原体
を含んでなる。

このよう１色原体は染料、染料形成′吻ア支または染オ
・１両脇体であることができる。色原体の反応によって
生じる色（ｒｉ　’ｔｉｔ磁スペクトルのｒＪ視ｂ〔（
域（すなわら、わ４．００〜９００　ｎｍ　）にある。

本発明に何月な指示薬組成ｌ物中に使用できる、過酸化
水素及びペルオキシダーゼの存在下で発色する色原体と
しては次のものが挙げられる（必９１シならば発色剤と
共に用いる）：モノアミンテ１．ジアミンｒ頃、フェノ
ールｙ、ｉＩ　、ポリフェノール類、芳香ノ、冶１わ、
１１．ロイコ染料、有色火柵’ｊ’Ｊ’　。

ペルオキシダーゼの存在下で酸化され得る物ｒｉを富み
且つ比色分析によって検出Ｆｉｌ能なＩｉ４／Ｊ′Ｉ（
２生ずることのできる池の色ｊチ（休としてはいくつか
のＩＥ　Ｆｌ　ｉＶ成性イｌ成物が４・けられる。−面
では、このような色原体は、ペルオキシダーゼによって
酸化された時にそれ自体とまだはその眞元型とさらに結
合して染料を形成することのてきる化合物を菖むことが
できる。このような自己ろ＾色化合−１勿Ｃ１、当業界
で公知の１Ｉｌｊ々のヒドロキ／ル化化合物を含む。

検出可ｒ１シな物′を骨」１、フェノール性基または活
性メチレン基を含むような１６色剤とｊ・１．２化４，
１−合することのできるＫ）Ｌ−」ギシダーゼーｉ！１
．ｌｒｌ化ｉ１１〕化Ａ！吻を；）む色原体とこのよう
な発色剤とによって形成場ることかできる。このような
１雲化性化合物の代表的なものは、ペンジデン及びその
同族体、ｐ−フェニレンジアミン類、ｐ−アミノフェノ
ール！用、４−アミノアンチピリン等である。多数の自
己発色化合物を含む広範囲のこのような発色剤は、アゝ
−・セオリー・メブ・ザ・フォトグラフィック・プロ゛
ワ（’ｒ１１．−２−ひ？−リーη）１多−リ■助ｏｔ
叶（見帥−ｊ−２−ＰＬ、ｏ−タタ＾Ｑ　、　ミー　ズ
（Δ４ｅ　ｅ　ｇ　）及びジェームス（Ｊａｍｅｓ戸、
１臥（１９６６年）、第１７章；コザー（Ｋｏｓａｒ）
　、ライト−センシティブ・システ１１ズ（Ｌｉｇｈｔ
−８ｅｎｓｉｔｉｖｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）　、１９６５
年、２１５〜２４９ページ及び米ＩＥ［ｉｌ　ｑ、ｌｊ
訂第４．３２１，３９７−号（１９８２年３月２３日に
ニックス（Ｎｌｘ）らに対して発行された〕のような先
行文献に記載きれている。

さらに別の好ましい一面において、比色分析によりて検
出ｎ」能な物質は、ロイコ染料をぜレオキシダーゼによ
って対応する色％４２．１．！Ｊに酸化することによっ
て形成できる。

本発明の実施には、米国特ハ′１−第４，２４１，１７
８号及び同車−＞、ｏ　８９，７４７　＠に記載されだ
ロイコ染料を沈む種々のロイコ染料が色原体として有用
である。

本発明に使用するのがｉｔｒ、ｔシいロイコ染月け、米
国！１旨′「第４，０８９，７４７弓のトリアリールイ
ミダゾール・１、ｌである。これらの染料（よ一般に１
・記式をイＪする： ■− 〔式中、Ｒ”　　、　１１２及びＲ’は各々、イ１１　
（（３，１１”、であり、それらのうち少なくとも１つ
がｌｉｉ、ｉ　、、ｊ、数１８　’＊だはツレ以下のオ
ルトま］こは・？ラーヒドロキソーｉ１”（’　Ｊｊ：
、’（アリール〕１℃である〕。１１１Ｌの２１固のり
古は、炭曙り、シ（４□（玩体を用いて（′ｉ飄ｆ！カ
ロメル箱１極に対して［梨状１１４．圧８Ｉによッテ（
相定した〕Ｊ場合に・ｒミダゾール（７）　ｒｉ’２化
ｉ１ｊ、位が約−７０ｍ　Ｖ〜約＋１１０ｒｎＶである
ように選択する。ここで用いたアリールは、芳香族炭火
水素基（たとえは、１〆百″、トされた芳香１Ｍ基を含
゛むフェニル、ナフチル省“）を包含するものとする。

炭素原子の糺ミ数は、ｌＩ′４′、ｊ果基を含む芳香族
基中の炭素原子の−（を１１１す。有用なトリアリール
イミダゾール−１ｌ′ｆ及びそれらの１１ζす’！ｒ’
ｊについての１；’Ｉ’　＋ｌ！ｉ１．ｌは、米国）１
１１ａ′１：ンｉ”：　４，０８９，７４７弓及ξノこ
こにｊ！）（べ／、−、参考文献に記１代されている。

時に１ｊ用な１フイコ染。１・１としマニ（・１．２−
　（３，！’＋−ノメトギシー４−ヒトＩ３ヤシ：フェ
ニル）　−４，５−ビス（４−ノノヂルアミノフェ二ル
）イミクゝゾール、２−（４−ヒ１゛ロ代シー：（−ノ
ドキシフェニル）　−４，５−ビス（ｐ−ツメチル゛ア
ミノノエニル）−１１１−イミダゾール及び２−（３−
コニトキ・ノー４−ヒドロヤ・／フェニルー４．５−ビ
ス（ｐ−ジメチルアミノノエニル）　−１，Ｈ−イミダ
ン゛−ルがノｊチげられる。

所・ｌ＜の色を形成するためにロイコ染料がしば［７ば
発色剤化合物と一緒に用いられることは当韮界において
公知である。これらを−１篭に用いる用台所望の結（１
−を、？灯るために染Ｅｌと発色剤は特別に緩衝化され
だｊ（Ｍ、体中で遍Ｖυにイ且み合わせなければならな
いことも知られている。本発明の実施に有用な代表的発
色剤としては、フェノール、ナント−ル、芳香族アミン
壕だは反応１／Ｉ：メチｌノン発色Ｆｉｌｌが挙げられ
る。いくつかのロイコ染１”ｌ　ｌＪ：発色？■すなｌ
−でも使用でへる。

本発明のつ：’ｆ：　ｌ１ｌｉに有用な比色１．相示塾
、（、［ｌ　ｈ！ζ７ｊ１：乃の成分の２−’：’＋度
か、１、サンプル中のクレアブン吉ナーゼの、Ｙ、’ｌ
（度１倹１１−ロ旧「′１１のイ＋’ｊ度、肘成さｉｌ
、るごイーネ１．トゾｌ用されるアッセイ法等に大きく
　＃ｊ’ｅイｊし１、当ｊｉ胃１ならυ、ｊ容易に決犀
できる。イ（旨］〈的な値を以下の；ｒ目表及び第１１
衣に示す。

本発明の骨１１１１．な−ｆ　ッ（イＸｔ！−１．ＩＡ
悟）、＋　ｐ、Ｉ、？ｒｔＬ、＜０１、充分ソ≧クレア
ヂンキナーセ゛ン占１・土をｌ＋１．＋Ｉ！Ｊ−Ｊる１
１申ｊたシ；〕、それ以上のクレアチンキナーゼ活性化
剤を菩む。これらの活性化剤は、比色指示ｙｇ　＆［１
成物に対して実２（的に小？、’ｆｉ　ｌ！ｌユである
ような状、（！すＣ−アッセイ組成・物中に存在する。

すなわ０、清１イ１．化）′１すは、比臼、指示薬組成
！ｌ：イ＋に刈して実９−Ｊ的に不活１イ１．であるよ
うな、］局所（たとえば、＋ｉ：′／、ｌ・ｉ′６・周
索においで）才ｌｊ＆よ濃度（またにＬ被）Σン量）も
しくは形態（たとえをよ、カフ０セル化）で存在する。

たとえＱ、、ｌ：、溶液アッセイ法はおいては、活性化
剤は、比色指示；に％組成物の成り３．　（ｔなわち、
過ｒｉ！９化（ｂ＋　７４、たとえば、ｄｊＬ」キシダ
ー七゛寸／こｔＪ：色用先ｆ本、メことえば、ロイコ５
壮料）のいずＪｌ、をも妨害しｔ′ｒい（ずなわら、反
応しないかあるｚｉ＋反応を・触７＋１．ｊしない）よ
うに充分に１０い、ｙ’ｇ　ｌ＋’、ＩｘてイＪ在゛ノ
゛る。このような妨害は許通は、色ＪＩＪ、　ｉ本の望
ましくない洋白として表われる。要素中に活性化剤を配
置することによって妨害を回メ；浴することができる。

れ外なことに、乾燥便、（ヌアッセイ法で仁１：　＋’
Ｉ％　淵度の活性化剤を１更用でき、さらにパ“ぎ・）
１の６す；白を回う臀できることが判明した。

４Ｉｌｉ々の化合！ｌ＋ｉ、＋がＩ’（ｆ　Ｗ反応にお
いてクレアチンキナーゼ活性化剤 ０用な活性化剤はメルカグトー含有化合物（チオール−
含有化合物まだはスルフヒドリル化合物としても知られ
る）、たとえば、チ討グルコース。

ノヂ第１・レイトール・、ゾチオエリトリトール、メル
カフ０トエタノール、グルタチオン、Ｎ−アセデルシス
ティン、システィン、チオグリセロール及びチオグリコ
ール酸である。溶液アッセイ法及び乾Ｈコアッセイ法の
両者に好ましい活性化剤ｆｃ１：　Ｎ　−アセチルシス
テインである。

溶液アッセイ法においては、任意成分である活性化剤の
最終アッセイ溶液濃度が重要である。溶液アッセイにお
いて本発明を実施する場合には、活性化剤は最終アッセ
イ溶液中で測定した時に約０．２ｍＭ未満の量で、好ま
しくは約０．０５〜約０．１５ｍＭの量で存在する。

の他の必須試薬の一鍜′的に４゛）用なｉｒ：Ｊ：　ｌ
Ｉｊ、ｉ’ｉ＋、四と灯ｊしい謎ＩＮシ範囲に門する謀
１いを示１．−〔いる。これらの−）糺は最終アッセイ
溶１１ス中で訓スＩ（シ／ζ。Ｊ・１）へ！ならば、１
（目の試８１Ｉ・（〆（とえＯ；１゛、醇醤・：、浦因
イ、イ′１ト媒。

アデニレートキナーゼ阻７１１剤４゛ｒ）を溶１１；２
中に含ま、１圭ることができること＆：１、当イ□界に
お・いて公知−Ｃある。

これらｆｌ：ｉｊ四囲外もイ〕用な結果を７！１られる
ことｔＪ当然である。しかしながら、これらｔ：１一般
に、示し７た１１１１す、勃゛に・１」用である及び、
ｉＩｆ、　！ｌＨｌ−いことがわかっでいるｔ＋’ｉｉ
ｊ四である。本’１３　ｉｉ：ｌ貼・：中におい−Ｃは
、ｊ′ｉ７素の１国ド単（１７を、（・’、’４．３１
Ｚｉアツセイ千汁ｌ・で１分間に１マイクロモルの：勿
１．Ｊ＋を１１獣化〕−るＩ＋Ｙ：本の１１１として定
４３もし７た。

当粟昇でよく知られでいる７１１ノリ、・１（殆明Ｕ）
実が１１にＪ目いた醇■、Ｑ、１１、〔１々、ｌ・１１
−γ占１律力布足・ＩＪする、すなわち、Ｉ’；ｔ’　
７４のイ占１牙はＰＩＩにＬｌ・４、じ−こ変化する。

決定的なことでぐ、［ない〃）、本う６明ｑ）ア、セ・
イｆ、１１．ＩＪす１男＋＝、約６．０〜約９０、好ｊ
シ＜　６Ｊ：ｆ′ノロ５〜Ａす７，５のＰＩＩにおいで
１．ノ鮨西化することが望ましい。緩１１（す化を・す
る方法及Ｕ−緩１’！ｉｆ削Ｃよ当イこ昇におい４公り
１１である。

本う６１．！’ｌの方１．″、及び、山１戊′吻は溶（
′イクアアセイ及び軒。

燥質素−〕゛ッセイの両方に適応しｉｌる。ノことえに
１、前１１シ、戒所ｌ且Ｊ戊′吻とコ］１市当な溶νＩ
＾（／辷とえ１１、ア＋トン）と忙含む溶液を１．：１
■製し、水性／＋＋のザンノ°ルを・所尾？ψ：ｈＬの
該ポ１１成物に加えることによって水性液中のクレアチ
ンキナーゼが右、易に１ｉｌｌｌ　＞ｉされる。１人い
で、元（Ｔ′ｌ、の？１（ｌ自゛を−１７”・！′けは
３７℃゛で′吊Ｊ目の勺）ｌ、′。

）’に　Ｉ成田を用いて照１１−１する。この／１′１
液アッーセイθ−１１、例１においてよりｉｒｌ’　ｉ
、ｌｌｌにうホベる。

、４）るいＱ−１１、試り１↓Ｉ、１４成物目、米１＊
ｌ　１ｉＬ１’ｒす１ジ３．９９２，１５８袷し１９７
６年１１月工６日にプルジビロビノソ（Ｐｒｚｙｂｙｌ
ｏｗｌｃｚ）らに対して９１’（ｉされた）に１尼載さ
れているような乾燥分析Ｖだ索に沈ませるのがりイま１
〜い。次いで、こり質素を一りレアチンキナーゼ沈１１
−リンプルと接触せしめる（たとえは、茨木にツンノ０
ルをスポットする）ことによってりＶ　７　チア　キナ
ーゼの量を測足する。この場合、賢素の”）”１を賊の
１つにおける色の変化の割合はＡＴＬ）形成の割合に直
接的に相関し、それがさらにサンプル中のクレアチンキ
ナーゼ活性の割合に直接的に（１１門１−る。

本発明の分析要素ｔよ一般に、本発明の組成物の試薬を
Ｗむ少なくとも１つのイｉ）域を有する。この要請中で
、クレアチンキナーゼ活１生化剤は、比色指示薬組成物
に対して実質的に不活性であるような一度もしくは形態
（たとえ幻５、カプセル化）でまだはそのような（４所
に存在−ｊゐことができる。

狭素は支持体と醒誠の（少なくともｔｒ↓１及び第２の
９・（１ト・・児を言−み、４”＋、！￥賊がある（ｊ
ｉｊの試薬を７λんでい４）ことが１１すしい。ρ了ま
しくは、・１３】の帯域は支ｊＮ体にＩ青」２・３する
１、こＩｔらのイ１）賊Ｑコ、ＬＬいにン代体接月１１
）シ、このことｉＪ、ｌ）、！１両する・１１Ｙ域の４
１ノね合わせられた１ｉ１４　、ｌｉＡ！の間を敢１＋
がｌ［１１過できることを意味している。すなわし、７
１何４＼ｊ佼／ｉ、ｌｔとＱ−ｊ２、重体ｊ綻触［）で
いる帯域の間で１１−１体の成分ケ輸込できる１、じ力
を指ず。

好ましくＩ；シ、帯域な」１、別個のい、担１ｆ＋ｊ−
Ｃあるが、１ｆ１７１’ま／こはぞれ以上の７＋Ｆ威が
巽ネの１つの層中にあることもできる。代表的な一；１
：へ操安ぷの形式は当采界において公知であり、／こと
え＆−Ｊ、ｌ　％　Ｗ’＋　ＪｔＢ　Ｌだ米国！１ケ１
１１稍”３，９９２，１５８シづ；ならひに、米１１．
１竹に１第４．０４２，３３５−け［１９７７年８Ｊ−
］１６日にクレメント（ＣＩｅ＋ｎｅｎｔ）に対１７で
発行された〕；同第４，１４４．３（１６号［１９７９
年３月１３　Ｆ−１にアイギャジス（Ｆｉｇｕｅｒａｓ
）に対して発行された〕；同第４．１３２．５２８１ｆ
；　［１９７９年１月２日にアイケンベリー　（Ｅｔｋ
ｅｎｂｅｒｒｙ）らに対し−Ｃ＝行す’ｌｌ−１ｔ　）
　；　回＝。

４．０５０，８９８号（１９７７年９月２７日にゴッフ
ェ（Ｇｏｆｆｏ）らに対して発行されだ」；及び（ＩＪ
発行特４′口込３０，２６７　＠　（１９８０年５月６
日にブラシ（１３ｒ　ｕ　ｎ　ｃ　ｈ　ｉ　）に対して
丙発行された〕に記ｉ或されている。

１４４索の支持体は任７轍の寸法安定性Ａ：」料〔たと
えｉｒ：Ｌ　ｄ＝　ＩＪ　（エチレンプレフタレート）
〕かう成ることができ、９ノ友明であるのが好捷しい。

本発明の力析峨素において、クレアチンキナーゼ活性化
剤は意外にも、冶液アッセイ法で用いられるよりもはる
かに多−：ｊ（に用いることができる。

たとえは、要素中に活性化剤は約２ｇ／ｍ　以下（すな
わちＮ　　１．３０　ｍＭまで）、好ましくは約０．１
５〜約１．？／ｍ２（すなわち、１０〜６５　ｍＭ）の
彼偵１゛１でイｆ在できる。

本発明の笑加１においでは、クレアチンキナーゼの１占
（」：によって生する色が活性化剤によって消えないよ
うに活性化剤と１し色指示ＩＫ　ｉＰｈ成１４１１とＣ
−１、吸糸の）４なる帯域に位Ｊｉ−＋’−ぜしめるの
が１３ノ寸１−７い１．好寸しく　（Ｉ：Ｉｌ、」上包
」旨示嶋’ｉ　ｒｐｆｉ　／戊′１１４を：　ｇＰ、　
ｌの・、１）１・視に、ン占１＝４−化剤をへ′Ｃ２の
帯域に位置せしめる。１Ｑｌｔｙたけそれ以上の他のツ
１；１成（Ｉｌ、とえは、試４１層下ドさシ、４布、４
１す１計域）も゛まだ、費素中に、たとえは、第１の計
域と第２の・Ｉ′１♂域との同に付仕することができる
。

鏝述の例３〜８に示されるように、いくつかの活性化剤
がクレアチンキナーゼを多少粘性化するのに有用である
。池の６！ｉ性化剤、たとえは、チオグルコースｔ３［
クレアチンキナーゼ゛を中）ｌ早Ｌ１．１に７占１住化
し、色原体を無視できる４′月焦しかＩｔＩｉ害（／ヒ
とえば、染オｌ　Ｎｇ’ｉ白）しない。しかしながら、
１時に好ましい？４ｉ　’（’ｆ化剤であるＮ−アセチ
ルブスディンｄ牛１に高い粘性化「ｉ［：をカくすと共
に色）い体を坤１’ｌＷできる程１硯しか妨′占１．　
／ｉ：いことが１ｆ況孔・でされた。

本夕ら明の組成物を用いるために調心される椙４・１及
び安糸ハ、たとえは、米国１ｆ、！、；’ｌ’　４３，
０９２，４６５号、Ｉｌ３，４１８，０９９号、第３，
４１８，０８３弓、第２，８９３，８４３号、亀２，８
９３，８４４号、第２，９１２，３０９号、と１シ３．
００８，８７９号、ｍ　３，８０２，８４２号、ｓｓ　
３，７９　ｓ、ｏ　６４号、第３，２９８，７３９号、
第３，９１５，６４７号、ｉ刊３，９１７，４５３号、
１．＋ｘ　：３．９９　：う＋　５９４　、ｊ；、第：
（，９３６，３５７’じ、第４．２７０．９２　（１号
、第４，２４８，８２９　＋弓、ａｊ番４，２５５，３
８４号及びｊ１已４，２５６．Ｃｉ　９３シ゛ハ莢１譜
１ヶ訂亀２，０５２ｊｌ　５７号ならびに’）　’ｊ゛
７５−　：　７７−、（−ロ、＞　−ＣＩ　−イ３＋、
−Ｔ　（Ｒｅ、−ａ−ｅ−２ｒｃ、４＋Ｄ　ｉ　、−ｑ
　ｃ、３　＋！−！ｌ　！４．−ｒ　！　）、ｄ”ｙ　
１４６　ａ　、　］　！＋　７１時年６月、アイテム（
ＩｔＰｍ）　１４６３８に１ｉ１４１ｊＨｔ−されてい
るう本発明の好ましい−′、Ｆ（施、１；１．；ｊ　、
１求において、ソ、れ：・５Ｑ、１支持体ならひに支持
体十にｌｔＬ：・Ｉ心）［ｌ（支１侍体から）に互いに
メ１グイ本Ｊ９　＋扛ｊる（人の・計１成を含む；α−
グリセロポスフェート刊ギキシーゼならびに１１引１安
化活性を・自−Ｊる物７ＪＬ及び色原体を含んでなる比
巴指示薬組成物を含むＭＬ録帯域；％　ｌＪ’ｙクレア
チン、アデノシンニ鳩、酸、グリセロール及びグリセロ
ールキナーゼ金倉む試薬帯域；ならびに クレアチンキナーゼ活性化剤、好ましくはＮ−アセチル
ンステインを含む等方面に多孔質の塗布イＩＹ域。

本づ６明のヤ２素の帯域の１個またはそれ以上は、緩雨
剤、界１１１活性剤、結自剤（代表的には親水性結合ｊ
１す）、アデニレ−トギナーゼ阻１１作５’ｌ　＋　？
・′：ｉバ昌１”１ｆ素補因イ及びキレート剤を含む舅
生しいがＩに７１′４のｌｉｉ々の（（ｌ；、の成分を
含むことができ、それらは当痕昇において公知で、り　
６ｏたとえは、１・１γ搾卜活・ｊ・′［：を助長する
ためにイル台によってな」、Ｌ′ｉト恭浦囚１子（一般
的にＶよ二価の金Ｊｉ（”ｌイ」ン、たどえｌｒ、Ｉ２
、へＱｐ：　　、ｈｌｎ　　。

Ｃａ２−”、Ｆｅ”、Ｂａ２−’−＋Ｓｒ２’−＋Ｃｏ
２”：’ｐ　）　ａ−１史用する。

さしに、クレアチン虎ナーゼフッ士イにおいて、′アッ
セイをれる’ｔｖ体がアフ゛ニレート・Ｖナーゼ紮剣む
、１４合にはアゾーレートキナーセ゛１ｉｌ−１’ｉ”
ｉ削しｌ″ことえば、フッ化ナトリウノ・、アテ゛ノソ
ンー煉１　ｆ’ｔｌ′７及び二アデノシン−７ｉ、’ｉ
１１’１’３（ｄｌａｄｅｎｏｓｉｎｐ　ｐｒｎｔ、ａ
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）］を用いることが宋ましいことが
易い。しかしながら、こりような、ｉ、用は木））Ｉ３
明の−れ施において任７も”朱、である。Ｊｉｙ、、　
＞、、りのｉ＋ｔ’　細校ひ倹布帯１ａ”、　’Ｊ）　
’ｈに１１．５．″」１な成分はｉｉｌノ１１さの米国
ノ１′ｆ訂２１ル３．９９２，１５８号及びこ１（国″
１」“１．′１第４，２５８，００１÷−４（１，１，
９８１’ｌ”　３月２４１」にピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）
らに発行された〕ならひに英国ｈ”ｉ’ｔ’を出願第２
，０５２，０５７弓（１９８１ど１Ｆ１月２１８公告さ
れた）に見られる。〈ニ；（布帯域い２、たとえは、繊
維、）ｊ料もしくは非（・！・＜Ｋ、ｆｌ：Ｕ料または
その両方から成ることができる。分析安上の例全例２に
示す。

本発明の分析Ｊ枝素中の試−ＩＧの被俊早は、分析ｊ−
る液体に応じて広く変化させることができる。次のｇ＋
Ｅ　ＩＩ衣は、必須試桑の−Ｆ’的に有用な彼偵Ｌ４及
び好ましい被梼垣に関する基準を示しているが、１［ハ
の扱４：ｊｆ　ｉｔｉ：も有用である。

す、下企白 １”　　　　　　　　　１１”）　　　　ＣＩ　　　　
ＯＯ０例 発明の詳細な説明するために次の例を挙ける。

１　耐滑アッセイ法 発明の組成物及び方法を用いるに当り、次のを使用」し
た。比較と１７での既知のＵ　Ｖ反応式及び木明卸１書
に記載した新Ｗ５？比色反応式を用いてクレアチンキナ
ーゼの活性を溶液アッセイで迎１、両方法でイ■ら１＋
た結果を比較した。

販のウサギ筋肉クレアチンキナーゼの５秤のる稍（９０
，１６７，２０７，２８４及び８１３／ｌ　）を、ロー
カルの医療１ｆｌＮ設から入手しトＩｆ＋：清に加還る
ことによって、一連の（６１１液ンフ０ルをＭ’Ｍ　！
＋ｃ＋　Ｌだ。クレアチンキナーゼヲ活するために活性
化剤チ刺グルコース約０１ｍＭ加した後、各検早すンフ
０ル約５００μｅを４１！？、ね１０　分間７°レイン
キュベートシた。次いで、するまで、ヴンプルを氷冷し
た。

の１戊分を含む比色拐示県組成物を調４（ｆ［、た；リ
アリールイミダゾールロイコ染料である（３．５−ノメ
トキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ビス（４
−ツメブールアミノフェニル）イミダゾール２．８ｍり
； 西ン１わさびベル」キシダーセ゛１２６ｍｑ：Ｉｎ　’
１”Ｊ：　トシ１　試ａｉＦ　１４１−／’　−’：　
トｙ　５００　μｉ；　　；１−リドｙＴＭ（’ｒｒｉ
ｔｏｎＴＭ）Ｘ　−１００界１Ｔｉｉ活Ｐｌ−ＡＩｌ　
［ヘンシルパニア州フィラデルフィアのローム及ハース
（Ｙえｏｈｍ　＆　）ｔａｎｓ　）から入手「１峠〕０
１％；及び 最終指示帖組成物容１￥１−を５０ｍ１にするのに充分
な０１Ｍ酊酸イミダノール緩種ｉ液（＋Ｊｌ　７．０　
）。

０、１　ｍｌ中に次の成分を含む試鵠ｉ冑ｆｌ、臼′ト
５ノ）　５］Ｈ，＋１製した一゛ クリセローノ１　５マイクロモノ（； 塩化マグネシウム（、ｉ′ｉＩｌ因イ）５マイクロ千ノ
ｌ；ΔＩ）Ｐ　２マイクロモノＬ； ｄｉＱ酸クレりヂン　３５マイクロモル；グリセロール
吉ナーゼ　Ｏ，：３９１Ｊ　；アデノシン−燐陵（−ア
デニレートキナーゼ活ゼ１−ＩＳＨ害剤）５マイクロモ
ル； ニアデノシンＬ燐酸（アデニレートキナーゼ活性阻害剤
）　０．　（１２マイクロ士ル；及びα−グリセロホス
ノ、−トオ痺シターゼ１２Ｕ。

血清を１０ｍＭ　チオグリコースと共匝少なくとも５分
出ｊブ゛レインギュベートしでクレアチンキナーゼを古
漬性化した。次いで、活性化した各血清ランプル中のク
レアチンキナーゼの活性を次のようＰＣＬ、てれ相定し
た。

比色指示薬組成物約０．９　ｍｌを試薬混合物０．１　
ｍｌと共に一５個のキュペ、、トの各々の中て３７℃に
お・いて、分光光１）７６１で６４０　ｎｍのパックグ
ラウンド吸光度がそれ以上観察されなくなる着で、筒片
にプレインギュベートした。次いで、活性化された各血
清−リーンプル約１０μｌを各キュベツトに加えて反応
を開始させ、そして６４０　ｎｍにおける発色の割合を
ペックマンモデル（ＢｅｃｋｍａｎＭｏｄｅｌ　）　２
５分光光度泪を用いで測定した。各キスペット中のクレ
アチンキナーゼ活性化剤の最終濃度は約０．　ｉ　ｒｎ
Ｍであった。

各血清ランゾル中のクレアチンキナーゼ活性を、３４０
　ｎｍの紫外線検出を生ずる既知の一連の反応を月４い
て回４ｒＮ　ｉ・（−シーロ萌定しグこ。クト・ア千ン
＝ｖナーゼ活件のこのλＩＩ！ｌ；測定Ｑ」、活１・二
１さｉＬだ各面ｉ’ｒＪ　−！Ｊ−ンフ′″ルＪ　（］
　ｔｒｌをカルバイ側ケム（（ｒ、ｓ　Ｉｂｉｏｃｈｅ
ｍ。

カリフォルニフ州う・ジョラ）から市販Δｉ１−℃いる
クレアチンへ一ナーセゝマックスーノ平、りＴ　Ｍ　（
八ｉａｘ−ＰａｃｋＴＭ）　’（，７ト中の試薬混合物
１に加ぐることによって行なった。この、皆１合も、１
ル′ｐ、　）ｌ、、Ｉ（Ｊ　１ｉｌｌｌ　５ぜにべ。

クマン士プ゛ル２５分光光度３１合用いた。このＵ■ブ
′ンセイＩ」既知の−ｊ「Ｖの反応、−１’　ｆ：ｒ・
わ１っ、前に述べたタイエッツの参乙文南；（の４６７
ベー〕、）シ斤１．４５１１〜４５ｃに教示ネれている
ものをｙｌｌいる。

ＵＶ史・１照測定及び比色測定によって得らノ１／こブ
゛−タを月４いて作製した検ｈ；’　ｌＩ’は全杉弓１
１ｉｈ・囲にわたって直膨であった。これら２方法の間
の回す１１）糸＋ｉｌの勾配は０．９９であった。この
ことは木冗明の方法による液体−リンフ０ル中のフレア
方ンキナーービｉｔ”’度の１１川定か・１６頼できる
ものであることを示している。

３個の血清ヤングル（クレアチンキナーゼ、’７゛ｉ度
は各々３７，１６２及び３６５　Ｕ／ｌでを）る）の各
各の６回の反彷溶液アッセイを、オ・例中でＱｉｌに述
べた比色ｌノーを７用いて’４ｊ’／ｉ−い、木う′ｌ
“明の方法のイ（着６を求めた。この結果を以下の第１
■表に示−す。変…）１係数ｔ」−１標準偏差を平均値
の１８ｒ分率で表わし、／トものであり、相対変動の指
標である。

第　■（表 ３７．０１　Ｕ／ｌ　　　　　　２．０６　　　　５．
６係ｉ　６１．７７　ｔＪ／ｌＦ）、１１２　　　　３
．４多３６５．４７１Ｊ／１８．０２　　　　２．２婆
比１７においては、ｕｖ７．、セイ法をＪ、ｔｌいた３
Ｈの反イリ溶ｒｔｙ−γッセイでクレアチンｒ＝１□度
３　Ｇ　５　Ｕ／、（２しく−おけるＣＯＶけ１ｏチで
Ｊ−１つだ。本発明の出色法に関するＣＯＶ　ｆｉ１′
＋か低いのは、この方θテが（ΦめてｉＬ確なりレアヂ
ンＡナーゼ１ｉｌｌ定法であることを示している。

Ｘ、イ；Ｌ、ｌｊ準偏ｐ１及び象勅係数１、）・ｓ″：
　Ｎ’ｓ　ｒノーにｉｔｔッｌ’ｊＺめた。

１月）２　乾式分析り、ツメ− １ｆｆ述の米国４′ｌｌ’Ｍ’ｌ　３．９９２．１５８
号中ｔｂ−ａａ、的ａ己載に（ｆって、ｔ・（のｊｌ・
１．告のφン１式の）１行“ｙ９・を３周製した； 展開帯域　Ｎ−アセチルシスライン活１’ｌ−化？’ｉ
ｌ（０，５ｇＡｎ２） １ガ′１酸セルロ一ス結合剤 ト　リ　ト　ン”（Ｔｒｉｔｏｎ　ＴＭ　）　　Ｘ　　
−４０５ｊ′１ｍ活性剤１ ブリジ”　（Ｈｒｌ　ｊ　”　）　９８ｆｔ’而活１；
ｔ、　Ｗｌ、ｌ　２ボ゛リウレタン結合剤 二ｒＬＣ化ブータン 試鈷帯ｊΦ　ゼラチン結合削 ２−ビス（２−ヒドロキノｊニチル）′アミノー２−（
ヒドロキシメチル）−１゜３−ブ′ロノぐンノ刊−ル紡
傅ｉ斉Ｉｆ　（＋旧＝７）トリトン 燐ｒ１ベクレアヂン（　１．　５　ｇ／ｕ＋２）アデノ
シンニ燐酸（　０．　１　５　、９／う７７２）アデノ
シンーリＶ酸 グリ（二ロー・ル（　ｆ１２（ｌ　ｊ／／ｍ　）百“　
’ｊ”ｊ”！．−ｑ４゛′ネ　シ　“ン　′・１エアラ
−ノンン−Ｉ＋’．　Ｕ”ｊ酸 りリ側くロール４：ノ−　ビ（　４　：（０　０　Ｕ／
ｍ　、）１１１１さ・ｉイ［目・１．セラフンＡ’７Ｉ
含ｒｏｌｌビスビー）１スノ（弓ｊ、ニルメブノしエー
テルイＪψ化剤 ２−ビス（２−ヒドロキシエチル）ア ミノ−２−（ヒ１０キシメナル）−１＋３−プロ・やン
ノメールｋｊＵ　’ｆｌＲ　剤（　ｐＨ＝　７　）５　
＋　５−　・ノメプ゛ルー１　、３−シクロへ痺ヤン・
ソオン酸化防止剤 ２　−　（　３　＋　５−ゾメト二■シー４ーヒドロ痺
ジフェニル）　−　４．　、、　５−ビス（４−ゾメチ
ルアミノフ、ニル）ロイコ染料 （　０．　２　＆／ｍ２） ２、４−ノーローペンチルフェノール 溶Ｕー アルカノールＴＭ（ΔＩｋａｎｏｌＴＭ）　Ｘ　Ｃ界面
活性剤５ ト　リ　ｌ・ン”　Ｘ　　−　　２　　０　　０界面Ｉ
□ｉ’ｉ　ｌｉ：ｉ：剤１フスコルビＪ　酸：Ａ−　＝
ｒシダーゼ被ルメギキシーゼ（　３　２　！１　０　０
　Ｕ／ｍ２）グリコール酸 αーグリセロポスフェー１・刊キンターゼ（：う２　（
ｌ　Ｏ　ＬＪ／＋＋＋　）支持体　　ボ″す（エチレン
テレフタレート）１ペンシルバニア州フイラプゞノ１フ
イ７　ノｏ　−　ム＆ハース（　Ｒｏｈｍ　＆　＋Ｉｓ
ａｓ　）から入手１旧Ｉ［′。

２イリノイ州シカゴのユニ刊ン・カーバ・イド（　ＬＪ
ｎｉｏｎ　Ｃａｒｂｉｄｅ　）から入手１」能。

５プラウエア州ウィルミントンの５’ユ，拌ン（　Ｌ）
ｕＰｏｎｔ　）から入手＋＋Ｊ能。

四素に血・清゛リンゾル１　０　ｌｔｌスポッ［・シた
」」１合に３２ｍＭとなるような充分な（、ｙ”　Ｈ＠
−でＮ−アセチル７スフインをＪ国１ｉ卜）ｉ；司」Ｄ
　（　ｓｐｒｅｅｄｉｎｇｙ．ｏｎｅ　）に混合した。

活）（１，化剤に血ｉ１Ｔ　”ｌシフ０ル中のクレアチ
ンキナーゼを活性化させるためにＣ，、要素のブレイン
キュベーションは必個なかった。さらに、意外なことに
、このような高ν．１度で存在する活性１ヒ剤によって
色原体＆：ｌ、妨害されなかった。

１中々のｊｉのクレアチンキナーゼ（７．５〜２６７３
Ｕ／ｌ）を含むヒト血清ザンフ０ル約１０μｌを前ｔ１
−１□ 要素にスポットし、ペックマンモデル２５分光光度剖（
乾燥９素アッセイに使用するために変形した）を用いて
３７℃、（３　７　０　ｎｍにおいて約５分間にわたっ
て色濃度を測定した。同一のヤンプルを寸だ、ロートケ
ムＴＭ（　ＲｏｔｏｃｈｅｍＴＭ）遠心分析機〔メリー
ランド州シルバー・スブリングスのアミコ（　ＡＭＩＣ
Ｏ　）から入手可能〕を用いてアッセイした。

ロートケムＴＭ　　アッセイ及び本発明の要素によって
得られたデータを用いて直線の回帰曲線を７０口，トシ
た。この曲Ｐ♂の勾配は０．９８４、切片は５、　８　
Ｕ／ｌ及びγ値は０９９３であり、これら全ては、本発
明の東素中で′ーｊ′：施された本発明の比色法によっ
て、アッセイされたヒＩ・血清中のクレアチンキナーゼ
活性が信頼性を持って正確に測定されたことを示してい
る。

４・０々のクレアチンキナーゼ活性化剤を展開帯域中に
混合した以外は、例２に記載したのと同様にして乾式分
析璧素を調製した。仕＋１＜’！（４５〜：つ００Ｕ／
ｌ　）、中程度（３００〜６００　Ｕ／ｌ　）及び高度
（６Ｑ　ＯＵ／ｌを超える）のクレアチンキナーゼ活性
を各々含んでなる３ｆｉｔのヒト血清フ０−ルからのヤ
ンプル１０μｌを各要素にスボ゛ットした。クレアチン
キナーゼ活性の割合な例２に記載したのと同様にして３
７℃、６７０　ｎｍにおいて測定した。

次のめ■表に、これらの画定の結果を示す。

さらに、同様にしてｎｌ、！製しだ岐素に過酸化水素１
０μｌをスヂットし、クレアチンキナ−七゛ｆ占（生化
剤による塗料漂白の割合を、生ずる６１″士度の経時的
減少を１ｔｌｌｌ定１゛ることによって示した。これら
の結果もまた、次の第■表に示゛Ｊ０ 以下余白 第■表のブ゛−タから、活性化剤Ｉく−アセチルシステ
イン及びブ刈グリコールのいずノ１も本づε、明の璧素
に有意な染オー１漂白を引き起こさなかったことは明白
でろ／′）。しかしながら、Ｎ−アセチルシスディンを
含む要素においては、−貫してより不変の割合がイ（Ｉ
られだ。従って、試、すした活１（ｔ：化剤の）　’Ｆ
ｙ　ｉ　　Ｎ−アセチルシスディンにシ思いかりないこ
とに、クレアチンキナーゼの高い活＋’ｌ　ｆｌ′と無
ｉｒ＋、できる稈央の色ｇ体の妨害（ずなわら、染料１
３．’＋　Ｆｌ）を示した。

例９　クレブブーンギナーヒ宥占中土佳」’、ｌ　’ｉ
＋丘及び−１１ｆ考有吸メ；５ これ（」−、タレアヂンギナーセ育占１’を化ｌ川を含
む＋２゜燥分析契素によるクレアチンキナーゼ活性のσ
（（１定と、クレアグーンキナーゼ活１（１化剤を含ま
２ｃいｉＵ：、　；ｌ（による測定とを比較する比較１
ｔ’ｉｌである。

対照吸素にクレアチン式ナーゼ活計化剤を菖１ぜなかっ
た以外ｔ」２、Ｉ＋ｌｌ　２に記４１ρしたのと同ｔｉ
、ｔｉ　ｋＬ　Ｌ。

て２４重の乾燥分析を素を絹製ｌ〜だ。もう１イΦ目２
、Ｎ−アセチルシスティンを約０．５４　ｇ／ｍ　　’
ｉｉ′−んでい１″こ。谷（＋１１の要素に、例３〜８
の面：ｒ；プ゛−ルからのザンプル（すなわち、棹準、
中程度及び高鹿のクレアチンキナーゼ活性を一有する）
をスポ丹し、　　　　　□次い°Ｃ，クレアヴンギナー
ゼ活性の割合を測定］また。活性化剤を含む不発明の線
素ｅ農↓、）合には、クレアチンキナーゼ活性のＪ″々
加が観察さｈだ。

□ ｔ１ビ「打出願人 ゴース１マン　コダックカンノン二一 ！［脣′ｌ出願代理人 弁理±　１１ｆ　　木　　　朗 弁１１１１士　西　舘　第１１　　之 弁理士　石　）Ｈ敬 弁上ｔ−ＩＨ±　ｔ、１．＋　　口　昭　之弁理士　西
　出　邪　也 アメリカ合衆国ニューヨーク１４ ５５９スペンサーボート・サウス ・ユニオン・ストリート３０４ ５８９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、水性液中のり１／アヂンギナーセ゛の定１−Ａ一方
   法であって、 （Ａ）　　（１）該水１（「液の」ノンプルと（２）ク
   レアチンキナーゼ含有液の存在−トで次の順序の一連の
   反応（ａ）。 （ｂ）及び（Ｃ）： （ａ）　　クレアチンキナーゼの存在下ですＣ酸りレア
   チンとアデノシン三燐酸とを反応さｌてクレアチン及び
   アデノシン三燐酸を形成し； （ｂ）　　グリセロールキナー−ビ及びアデノシン三燐
   酸の存在Ｆでグリセロールを侍ＦりＨ化してＬ−α−グ
   リセロポスフェー１−を形成しニーそして（ｃ）α−グ
   リセロホスフェート刊ギゾグーセゝ及び比色指示薬組成
   物の存在下でＬ−α−グリセロホスフ、−トを酸化して
   吸光度敦化を生じる反応を行なう試薬とを接１独せしめ
   、そしで（Ｂ）　　該吸光度変化の割合を定則的に検出
   するとと全含んでなるフレアチンキラーゼの定一方法。 ２、　　（ａ）燐酸クレアチン、（ｂ）アテ゛ノシンニ
   リ、１酸、（ｃ）グリセロール、（ｄ）クリセロールキ
   ナーゼ、（ｅ）α−グリセロボスフェートオキシダーゼ
   、及び（ｆ）比色指示薬組成物を・ａんでなる、水性液
   中クレアチンキナーゼ定ｈ）用組成物。