JPH01108998A - コレステロールおよびトリグリセリドの同時アッセイ法およびそれに用いる試薬システム - Google Patents
コレステロールおよびトリグリセリドの同時アッセイ法およびそれに用いる試薬システムInfo
- Publication number
- JPH01108998A JPH01108998A JP63237453A JP23745388A JPH01108998A JP H01108998 A JPH01108998 A JP H01108998A JP 63237453 A JP63237453 A JP 63237453A JP 23745388 A JP23745388 A JP 23745388A JP H01108998 A JPH01108998 A JP H01108998A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cholesterol
- reagent system
- lipase
- substrate
- determination
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 title claims abstract description 82
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 60
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 title claims abstract description 41
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 22
- 238000003556 assay Methods 0.000 title abstract description 29
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 46
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 36
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 claims abstract description 19
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 claims abstract description 19
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 claims abstract description 18
- 102000057621 Glycerol kinases Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 108700016170 Glycerol kinases Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 108010089254 Cholesterol oxidase Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims abstract description 15
- 108010029942 microperoxidase Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims abstract description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 108010055297 Sterol Esterase Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000000019 Sterol Esterase Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 5
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 claims abstract 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 claims abstract 2
- RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 4-aminoantipyrine Chemical compound CN1C(C)=C(N)C(=O)N1C1=CC=CC=C1 RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 12
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 claims description 11
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 claims description 11
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 230000005670 electromagnetic radiation Effects 0.000 claims description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 11
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- 230000009102 absorption Effects 0.000 abstract 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 abstract 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 abstract 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 11
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 10
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 10
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 7
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 7
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 7
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K phosphonatoenolpyruvate Chemical compound [O-]C(=O)C(=C)OP([O-])([O-])=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 4
- NRHMKIHPTBHXPF-TUJRSCDTSA-M sodium cholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 NRHMKIHPTBHXPF-TUJRSCDTSA-M 0.000 description 4
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 3
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- GLDQAMYCGOIJDV-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC(O)=C1O GLDQAMYCGOIJDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000008620 Cholesterol Assay Methods 0.000 description 1
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001840 cholesterol esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000003271 compound fluorescence assay Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 229940071221 dihydroxybenzoate Drugs 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 239000001008 quinone-imine dye Substances 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N sn-glycerol 3-phosphate Chemical compound OC[C@@H](O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 108010079522 solysime Proteins 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/61—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving triglycerides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、同時反応において試料の電磁放射吸収特徴の
変化をモニターすることにより、単一の試薬で複数の基
質を同時に測定する方法および該方法に用いる試薬シス
テムに関する。さらに詳しくは、本発明は、２またはそ
れ以上の波長において二つの同時反応をモニターするこ
とにより、血清中のコレステロールおよびトリグリセリ
ドを同時に測定する方法および該方法に用いる試薬シス
テムに関する。
変化をモニターすることにより、単一の試薬で複数の基
質を同時に測定する方法および該方法に用いる試薬シス
テムに関する。さらに詳しくは、本発明は、２またはそ
れ以上の波長において二つの同時反応をモニターするこ
とにより、血清中のコレステロールおよびトリグリセリ
ドを同時に測定する方法および該方法に用いる試薬シス
テムに関する。
（従来の技術および発明が解決しようとする課題）診断
学の分野において、試料物質中に存在する基質を同定ま
たは定量するために種々のアッセイ法が考案されている
。しかし、残念なことに、所定の試料について２種以上
の基質を診断することが望ましいにもかかわらず、従来
のアッセイ法は通常、一つの型の基質に対してのみ特異
的である。
学の分野において、試料物質中に存在する基質を同定ま
たは定量するために種々のアッセイ法が考案されている
。しかし、残念なことに、所定の試料について２種以上
の基質を診断することが望ましいにもかかわらず、従来
のアッセイ法は通常、一つの型の基質に対してのみ特異
的である。
このため同じ試料について多数の試験を行うことが必要
となり、診断に要する費用を増大させ、効率も下がるこ
とになる。従って、複数の基質を効率的なやり方で同定
または定量することができるような診断試験法を開発す
ることが望まれている。
となり、診断に要する費用を増大させ、効率も下がるこ
とになる。従って、複数の基質を効率的なやり方で同定
または定量することができるような診断試験法を開発す
ることが望まれている。
たとえば、コレステロールおよびトリグリセリドは、臨
床化学の研究所において一層普通に行なわれる二つの試
験対象物質である。コレステロールの分析は、通常、コ
レステロールエステラーゼ１、ペルオキシダーゼ［トリ
ンダー（Ｔ ｒｉｎｄｅｒ）法］を用いて行なわれる［
ティーツ（Ｔｉｅｔｚ、Ｎ、Ｗ、）のテキストブック・
オブ・クリニカル・ケミストリー（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ
ｏｆ Ｃ１１ｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９
８６年、８８３頁参照］。トリシダー法においては、コ
レステロールエステラーゼによりコレステロールエステ
ルを加水分解して遊離のコレステロールと脂肪酸を生成
させる。ついで遊離のコレステロールをコレステロール
オキシダーゼにより酸化させて過酸化水素を生成させる
。ついで過酸化水素をペルオキシダーゼおよび色素生成
酸素受容体（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ｏｘｙｇｅｎ
ａｃｃｅｐｔｏｒ）と反応させ、４００〜５００ｎｍに
おいて色変化を生じさせる。
床化学の研究所において一層普通に行なわれる二つの試
験対象物質である。コレステロールの分析は、通常、コ
レステロールエステラーゼ１、ペルオキシダーゼ［トリ
ンダー（Ｔ ｒｉｎｄｅｒ）法］を用いて行なわれる［
ティーツ（Ｔｉｅｔｚ、Ｎ、Ｗ、）のテキストブック・
オブ・クリニカル・ケミストリー（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ
ｏｆ Ｃ１１ｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９
８６年、８８３頁参照］。トリシダー法においては、コ
レステロールエステラーゼによりコレステロールエステ
ルを加水分解して遊離のコレステロールと脂肪酸を生成
させる。ついで遊離のコレステロールをコレステロール
オキシダーゼにより酸化させて過酸化水素を生成させる
。ついで過酸化水素をペルオキシダーゼおよび色素生成
酸素受容体（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ｏｘｙｇｅｎ
ａｃｃｅｐｔｏｒ）と反応させ、４００〜５００ｎｍに
おいて色変化を生じさせる。
一方、トリグリセリドの分析は、一般にリパーゼ／グリ
セロールキナーゼ法により行なわれる（ティーツの上記
文献８８７頁参照）。トリグリセリドを微生物リパーゼ
により加水分解してグリセロールと遊離の脂肪酸を生じ
させる。グリセロールキナーゼの存在下でグリセロール
とＡＴＰとはグリセロール−３−リン酸 ＋ ＡＤＰを
生じる。
セロールキナーゼ法により行なわれる（ティーツの上記
文献８８７頁参照）。トリグリセリドを微生物リパーゼ
により加水分解してグリセロールと遊離の脂肪酸を生じ
させる。グリセロールキナーゼの存在下でグリセロール
とＡＴＰとはグリセロール−３−リン酸 ＋ ＡＤＰを
生じる。
この反応から生成したＡＤＰがホスホエノールピルビン
酸とともにピルビン酸と反応してＡＴＰおよびピルビン
酸を生じる。生成したピルビン酸は乳酸デヒドロゲナー
ゼと反応して乳酸を生じ、それと同時にＮＡＤＨを酸化
させて３４０ｎｍにおける吸光度を減少させる。
酸とともにピルビン酸と反応してＡＴＰおよびピルビン
酸を生じる。生成したピルビン酸は乳酸デヒドロゲナー
ゼと反応して乳酸を生じ、それと同時にＮＡＤＨを酸化
させて３４０ｎｍにおける吸光度を減少させる。
上記両アッセイは、別々の試薬を用い別々のセルで行な
われる。このため臨床化学研究所における時間と費用が
かさむことになる。この二つの試験を一つの試験にまと
めることができれば、研究所は生産性の向上と費用の削
減を実現することができるであろう。
われる。このため臨床化学研究所における時間と費用が
かさむことになる。この二つの試験を一つの試験にまと
めることができれば、研究所は生産性の向上と費用の削
減を実現することができるであろう。
二つの試験を一つにまとめることは容易にできる仕事で
はない。両基質の正確な測定ができるように条件を選択
しなければならない。たとえば、従来のコレステロール
オキシダーゼ法とトリグリセリドリパーゼ／グリセロー
ルキナーゼ法を組み合わせることは、コレステロールの
反応で生じたペルオキシダーゼがトリグリセリドの反応
で生じたＮＡＤＨを酸化させるという事実により排除さ
れる。
はない。両基質の正確な測定ができるように条件を選択
しなければならない。たとえば、従来のコレステロール
オキシダーゼ法とトリグリセリドリパーゼ／グリセロー
ルキナーゼ法を組み合わせることは、コレステロールの
反応で生じたペルオキシダーゼがトリグリセリドの反応
で生じたＮＡＤＨを酸化させるという事実により排除さ
れる。
単一の反応容器中において二つのアッセイを組み合わせ
る一つのやり方は、連続アッセイを行うことである［ル
ーダラー（Ｌ ｕｄｅｒｅｒ）の米国特許第４゜４２５
、４２７号およびキャム（ｃａｎ）らのヨーロッパ特許
筒１：１３０６４号各明細書参照］。連続アッセイでは
、第一のアッセイ用の試薬を容器に加え反応を進行させ
る。ある時間の経過後に第一の成分の濃度を決定する。
る一つのやり方は、連続アッセイを行うことである［ル
ーダラー（Ｌ ｕｄｅｒｅｒ）の米国特許第４゜４２５
、４２７号およびキャム（ｃａｎ）らのヨーロッパ特許
筒１：１３０６４号各明細書参照］。連続アッセイでは
、第一のアッセイ用の試薬を容器に加え反応を進行させ
る。ある時間の経過後に第一の成分の濃度を決定する。
ついで第二の試薬を容器に加えて第二の成分との反応を
起こさせるのであるが、この第二の試薬は第一の反応を
停止させるものであるか、そうでない場合は第一の反応
が完了した後に加える。ある時間の経過後に第二の成分
の濃度を決定する。これらの反応は、フィルターホイー
ルかまたはダイオードアレイを用いることにより、同じ
かまたは異なる波長でモニターすることができる。
起こさせるのであるが、この第二の試薬は第一の反応を
停止させるものであるか、そうでない場合は第一の反応
が完了した後に加える。ある時間の経過後に第二の成分
の濃度を決定する。これらの反応は、フィルターホイー
ルかまたはダイオードアレイを用いることにより、同じ
かまたは異なる波長でモニターすることができる。
米国特許第３．９２５．１６２号明細書には、体液流体
中の酵素活性の同時測定が記載されている。この方法で
は、同定しようとするそれぞれの酵素に対する基質を他
の試薬とともに反応媒体に加え、その後の反応システム
の吸光度または蛍光の変化を測定する。本発明は、反応
混合物の電磁シグナルをモニターすることにより、単一
の試薬システムを用いて基質を同時に同定または定量す
る方法を利用するものである。
中の酵素活性の同時測定が記載されている。この方法で
は、同定しようとするそれぞれの酵素に対する基質を他
の試薬とともに反応媒体に加え、その後の反応システム
の吸光度または蛍光の変化を測定する。本発明は、反応
混合物の電磁シグナルをモニターすることにより、単一
の試薬システムを用いて基質を同時に同定または定量す
る方法を利用するものである。
（課題を解決するための手段）
本発明は、反応混合物中で単一の試薬システムを用いて
コレステロールおよびトリグリセリドを同時に決定する
ための方法を提供するものである。
コレステロールおよびトリグリセリドを同時に決定する
ための方法を提供するものである。
本発明の方法は、決定しようとするそれぞれの基質に対
する反応試薬を含有する試薬システムを加えることから
なる。この各反応試薬は、特定の基質について独特の電
磁放射吸光度を得ることができ、両基質の濃度を計算す
ることができるように選択される。各基質は、それぞれ
の化学反応が同時に起こるような条件下でそれぞれの試
薬と反応する。各基質の濃度の決定は、決定しようとす
るそれぞれの基質に特徴的な複数の波長において、その
後の反応混合物の吸光度または蛍光の変化を測定するこ
とにより行う。
する反応試薬を含有する試薬システムを加えることから
なる。この各反応試薬は、特定の基質について独特の電
磁放射吸光度を得ることができ、両基質の濃度を計算す
ることができるように選択される。各基質は、それぞれ
の化学反応が同時に起こるような条件下でそれぞれの試
薬と反応する。各基質の濃度の決定は、決定しようとす
るそれぞれの基質に特徴的な複数の波長において、その
後の反応混合物の吸光度または蛍光の変化を測定するこ
とにより行う。
本発明の他の実施態様において、本発明は、決定しよう
とするそれぞれの基質に対する発色団を含有する試薬シ
ステムを加えることにより、反応混合物中で単一の試薬
システムを用いてコレステロールおよびトリグリセリド
を同時に決定するための方法を提供するものである。こ
の各発色団は、特定の基質について独特の吸光バンドを
得ることができ、他の基質を決定することができるよう
に選択される。各基質は、それぞれの化学反応が同時に
起こるような条件下でそれぞれの発色団と反応する。各
基質の濃度の決定は、決定しようとするそれぞれの基質
に特徴的な複数の波長において、その後の反応混合物の
吸光度または蛍光の変化を測定することにより行う。
とするそれぞれの基質に対する発色団を含有する試薬シ
ステムを加えることにより、反応混合物中で単一の試薬
システムを用いてコレステロールおよびトリグリセリド
を同時に決定するための方法を提供するものである。こ
の各発色団は、特定の基質について独特の吸光バンドを
得ることができ、他の基質を決定することができるよう
に選択される。各基質は、それぞれの化学反応が同時に
起こるような条件下でそれぞれの発色団と反応する。各
基質の濃度の決定は、決定しようとするそれぞれの基質
に特徴的な複数の波長において、その後の反応混合物の
吸光度または蛍光の変化を測定することにより行う。
一般に、本発明の試薬システムは、コレステロールの決
定のためのコレステロールエステラーゼ活性を有する酵
素、色素生成酸素受容体、ミクロペルオキシダーゼおよ
びコレステロールオキシダーゼ；およびトリグリセリド
の決定のためのリパーゼ、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ
）、ホスホエノールピルビン酸（Ｐ Ｅ Ｐ）、グリセ
ロールキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、乳酸デヒドロゲ
ナーゼ（Ｌ、ＤＨ）およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈまたはそれら
の類似体からなる。同時アッセイは、コレステロールの
反応速度または終点決定を行うためのリパーゼ、４−ア
ミノアンチピリン、フェノール、ミクロペルオキシダー
ゼおよびコレステロールオキシダーゼ；およびトリグリ
セリドの終点または反応速度決定を行うに充分な濃度の
リパーゼ、ＡＴＰＳＰＥＰ１グリセロールキナーゼ、ピ
ルビン酸キナーゼ、ＬＤＨおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈからな
る試薬システムを用いて行うことができる。
定のためのコレステロールエステラーゼ活性を有する酵
素、色素生成酸素受容体、ミクロペルオキシダーゼおよ
びコレステロールオキシダーゼ；およびトリグリセリド
の決定のためのリパーゼ、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ
）、ホスホエノールピルビン酸（Ｐ Ｅ Ｐ）、グリセ
ロールキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、乳酸デヒドロゲ
ナーゼ（Ｌ、ＤＨ）およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈまたはそれら
の類似体からなる。同時アッセイは、コレステロールの
反応速度または終点決定を行うためのリパーゼ、４−ア
ミノアンチピリン、フェノール、ミクロペルオキシダー
ゼおよびコレステロールオキシダーゼ；およびトリグリ
セリドの終点または反応速度決定を行うに充分な濃度の
リパーゼ、ＡＴＰＳＰＥＰ１グリセロールキナーゼ、ピ
ルビン酸キナーゼ、ＬＤＨおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈからな
る試薬システムを用いて行うことができる。
（発明の概要）
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
本発明は、生物学的流体中の複数の基質を同時に測定す
る方法に関する。本発明の方法は、幾つかの電磁シグナ
ルを同時にモニターすることにより各基質を測定するた
めに、試料に単一の試薬を加えることを含む。
る方法に関する。本発明の方法は、幾つかの電磁シグナ
ルを同時にモニターすることにより各基質を測定するた
めに、試料に単一の試薬を加えることを含む。
電磁シグナルのモニターは、分光光度計または分光蛍光
計によりモニターすることができる。反応混合物中にお
ける変化の測定は、通常の手順によりいかなる器具を用
いても行うことができる。
計によりモニターすることができる。反応混合物中にお
ける変化の測定は、通常の手順によりいかなる器具を用
いても行うことができる。
系における変化が特別のもの、すなわち波長であること
は重要ではないが、同時にモニターし得るならば波長の
変化または違いはできるだけ大きいことが好ましい。
は重要ではないが、同時にモニターし得るならば波長の
変化または違いはできるだけ大きいことが好ましい。
同時アッセイにおいては、測定しようとする基質と反応
するすべての成分を含有する試薬を試料に加え、反応を
器具によりモニターする。一般に同時アッセイは、単一
の試薬を用いて単一セル中で行うので、第二の試薬を投
入したりする必要性や一般に多基質アッセイに付随する
他の随意の工程を省略することができる。
するすべての成分を含有する試薬を試料に加え、反応を
器具によりモニターする。一般に同時アッセイは、単一
の試薬を用いて単一セル中で行うので、第二の試薬を投
入したりする必要性や一般に多基質アッセイに付随する
他の随意の工程を省略することができる。
同時アッセイを設計するに際してのポイントは、複数の
反応を同時に進行させることができ、しかも臨床学的に
意味のある範囲において両方の分析対象物質を正確に決
定できるような試薬を選択することにある。決定しよう
とする各基質に対する反応試薬は、それぞれの反応試薬
について特定の基質に対し独特の電磁放射吸収が得られ
るように選択する。上記反応試薬は、発色団または指示
染料であってよく、反応はスペクトル波長によりモニタ
ーする。たとえば適当な発色団を選択することにより、
以下に記載するごとく、カルシウムとリンとを同時に測
定できるアッセイ法を開発することができる。
反応を同時に進行させることができ、しかも臨床学的に
意味のある範囲において両方の分析対象物質を正確に決
定できるような試薬を選択することにある。決定しよう
とする各基質に対する反応試薬は、それぞれの反応試薬
について特定の基質に対し独特の電磁放射吸収が得られ
るように選択する。上記反応試薬は、発色団または指示
染料であってよく、反応はスペクトル波長によりモニタ
ーする。たとえば適当な発色団を選択することにより、
以下に記載するごとく、カルシウムとリンとを同時に測
定できるアッセイ法を開発することができる。
適当な反応試薬が選択されたら、該適当な反応試薬を含
有する試薬システムに試料を加える。ついで試薬と試料
とを、反応が同時に起こるような条件下で各基質がそれ
ぞれの反応試薬と接触するように混合する。上記添加お
よび試料と試薬との混合は、起こっている反応に適した
測定器具によりモニターする。たとえば、測定しようと
する各基質に特徴的な複数の波長において、その後得ら
れた反応混合物の吸光度または蛍光の変化を測定するな
どのやり方である。
有する試薬システムに試料を加える。ついで試薬と試料
とを、反応が同時に起こるような条件下で各基質がそれ
ぞれの反応試薬と接触するように混合する。上記添加お
よび試料と試薬との混合は、起こっている反応に適した
測定器具によりモニターする。たとえば、測定しようと
する各基質に特徴的な複数の波長において、その後得ら
れた反応混合物の吸光度または蛍光の変化を測定するな
どのやり方である。
反応混合物のモニターは、試薬と試料とを互いに混合す
るや否や開始するのが好ましい。このことにより、反応
速度の変化かまたは終点の反応変化を特定の電磁シグナ
ルとしてモニターすることができるようになる。
るや否や開始するのが好ましい。このことにより、反応
速度の変化かまたは終点の反応変化を特定の電磁シグナ
ルとしてモニターすることができるようになる。
本発明の方法により、単一の試薬を用いて血清中のコレ
ステロールおよびトリグリセリドを同時に測定すること
ができる。コレステロールおよびトリグリセリドの反応
は同時に進行し、分光光度計により二つの別々の波長に
おいて二つの異なる反応を測定する。分光光度計には、
多数の波長を同時にモニターすることができるダイオー
ドアレイ検出器を用いている。
ステロールおよびトリグリセリドを同時に測定すること
ができる。コレステロールおよびトリグリセリドの反応
は同時に進行し、分光光度計により二つの別々の波長に
おいて二つの異なる反応を測定する。分光光度計には、
多数の波長を同時にモニターすることができるダイオー
ドアレイ検出器を用いている。
一般に、本発明の試薬システムは、コレステロールの決
定のためのコレステロールエステラーゼ活性を有する酵
素、色素生成酸素受容体、ミクロペルオキシダーゼおよ
びコレステロールオキシダーゼ；およびトリグリセリド
の決定のためのリパーゼ、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ
）、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、グリセロー
ルキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、乳酸デヒドロゲナー
ゼ（ＬＤＨ）および還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドまたは還元型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドリン酸（両者を一緒にしてＮＡＤ （Ｐ）Ｈと
称す）またはそれらの類似体からなる。コレステロール
の測定は、過酸化水素と結合させるためのミクロペルオ
キシダーゼ、およびフェノールやジヒドロキシベンゾエ
ートなどを共同基質（ｃｏｓｕｂｓｔｒａｔｅ）とする
キノンイミン染料のような色素生成酸素受容体を用いる
ことにより行い、その吸光度は４００〜５（）Ｏｎｅの
範囲である。色素生成酸素受容体は、最終的に染料を生
じさせるには４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）お
よびフェノールであるのが好ましい。こうすることによ
り、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈまたはそれらの類似体を用いたトリ
グリセリド試薬と上記コレステロール試薬を組み合わせ
ることができるようになる。
定のためのコレステロールエステラーゼ活性を有する酵
素、色素生成酸素受容体、ミクロペルオキシダーゼおよ
びコレステロールオキシダーゼ；およびトリグリセリド
の決定のためのリパーゼ、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ
）、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、グリセロー
ルキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、乳酸デヒドロゲナー
ゼ（ＬＤＨ）および還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドまたは還元型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドリン酸（両者を一緒にしてＮＡＤ （Ｐ）Ｈと
称す）またはそれらの類似体からなる。コレステロール
の測定は、過酸化水素と結合させるためのミクロペルオ
キシダーゼ、およびフェノールやジヒドロキシベンゾエ
ートなどを共同基質（ｃｏｓｕｂｓｔｒａｔｅ）とする
キノンイミン染料のような色素生成酸素受容体を用いる
ことにより行い、その吸光度は４００〜５（）Ｏｎｅの
範囲である。色素生成酸素受容体は、最終的に染料を生
じさせるには４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）お
よびフェノールであるのが好ましい。こうすることによ
り、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈまたはそれらの類似体を用いたトリ
グリセリド試薬と上記コレステロール試薬を組み合わせ
ることができるようになる。
というのは、ミクロペルオキシダーゼは３４０ｎｍにお
いてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを酸化しないからである。
いてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを酸化しないからである。
つぎに実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１（コレステロール／トリグリセリド同時アッセ
イ） 本実施例に記載するのは、コレステロールおよびトリグ
リセリドの両反応の終点をモニターすることによりコレ
ステロールおよびトリグリセリドの同時アッセイを行う
ための方法である。試薬システムの調製は、以下の成分
を混合することにより行った（なおＵ／Ｌは１リツトル
当たりのユニット、ｍＭは１リツトル当たりのミリモル
をそれぞれ表す）。
イ） 本実施例に記載するのは、コレステロールおよびトリグ
リセリドの両反応の終点をモニターすることによりコレ
ステロールおよびトリグリセリドの同時アッセイを行う
ための方法である。試薬システムの調製は、以下の成分
を混合することにより行った（なおＵ／Ｌは１リツトル
当たりのユニット、ｍＭは１リツトル当たりのミリモル
をそれぞれ表す）。
コール酸ナトリウム（３，０ｍＭ）
４−アミノアンチピリン（０，８ｍＭ）フェノール（１
４，０ｍＭ） リパーゼ（２５０，０ＯＯＵ／Ｌ） コレステロールオキシダーゼ（１１７Ｕ／Ｌ）ミクロペ
ルオキシダーゼ（１２１９／Ｌ）ＮＡＤＨ（０，４ｍＭ
） ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）（０，７ｍＭ） アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）（０，０６ｍＭ）ＭｇＳ
Ｏ，（５，５ｍＭ） トリスバッファー（１００ｍＭ） コハク酸（２６ｍＭ） ピルビン酸キナーゼ（１６６７Ｕ／Ｌ）グリセロールキ
ナーゼ（６６７ｔＪ／Ｌ）乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤ
Ｈ）（１００００／Ｌ） 試料を試薬に対して１：ｌＯｌの比で加え、反応を進行
させた。３分後、３４０ｎｍおよび５００ｎｍで吸光度
を読み取った。濃度については標準曲線で比較すること
により計算した。
４，０ｍＭ） リパーゼ（２５０，０ＯＯＵ／Ｌ） コレステロールオキシダーゼ（１１７Ｕ／Ｌ）ミクロペ
ルオキシダーゼ（１２１９／Ｌ）ＮＡＤＨ（０，４ｍＭ
） ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）（０，７ｍＭ） アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）（０，０６ｍＭ）ＭｇＳ
Ｏ，（５，５ｍＭ） トリスバッファー（１００ｍＭ） コハク酸（２６ｍＭ） ピルビン酸キナーゼ（１６６７Ｕ／Ｌ）グリセロールキ
ナーゼ（６６７ｔＪ／Ｌ）乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤ
Ｈ）（１００００／Ｌ） 試料を試薬に対して１：ｌＯｌの比で加え、反応を進行
させた。３分後、３４０ｎｍおよび５００ｎｍで吸光度
を読み取った。濃度については標準曲線で比較すること
により計算した。
実施例２（コレステロール／トリグリセリド同時アッセ
イ） 本実施例に記載するのは、コレステロールの反応速度お
よびトリグリセリドの反応の終点をモニターすることに
よりコレステロールおよびトリグリセリドの同時アッセ
イを行うための方法である。
イ） 本実施例に記載するのは、コレステロールの反応速度お
よびトリグリセリドの反応の終点をモニターすることに
よりコレステロールおよびトリグリセリドの同時アッセ
イを行うための方法である。
試薬システムの調製は、以下の成分を混合することによ
り行った。
り行った。
コール酸ナトリウム（３，０ｍＭ）
４−アミノアンチピリン（０，８ｍＭ）フェノール（１
４，０ｍＭ） リパーゼ（２５０，０００Ｕ／Ｌ） コレステロールオキシダーゼ（１０Ｕ／Ｌ）ミクロペル
オキシダーゼ（１２ｕ／Ｌ）ＮＡＤＨ（０，４ｍＭ） ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）（０，７ｍＭ） ＡＴＰ （０，０６ｍＭ） ＭｇＳＯ，（５，５ｍＭ） トリスバッファー（１００ｍＭ） コハク酸（２６ｍＭ） ピルビン酸キナーゼ（１６６７Ｕ／Ｌ）グリセロールキ
ナーゼ（６６７Ｕ／Ｌ）乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ
）（１００ＯＵ／Ｌ） 試料を試薬に対して１：１０１の比で加え、反応を進行
させた。５００ ｎｍにおいて６０秒からスタートして
各６０秒毎に３分間読み取りを行うことによりコレステ
ロールの反応速度をモニターした。３分後、３４０ｎｍ
で吸光度を読み取った。濃度については標準曲線で比較
することにより計算した。
４，０ｍＭ） リパーゼ（２５０，０００Ｕ／Ｌ） コレステロールオキシダーゼ（１０Ｕ／Ｌ）ミクロペル
オキシダーゼ（１２ｕ／Ｌ）ＮＡＤＨ（０，４ｍＭ） ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）（０，７ｍＭ） ＡＴＰ （０，０６ｍＭ） ＭｇＳＯ，（５，５ｍＭ） トリスバッファー（１００ｍＭ） コハク酸（２６ｍＭ） ピルビン酸キナーゼ（１６６７Ｕ／Ｌ）グリセロールキ
ナーゼ（６６７Ｕ／Ｌ）乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ
）（１００ＯＵ／Ｌ） 試料を試薬に対して１：１０１の比で加え、反応を進行
させた。５００ ｎｍにおいて６０秒からスタートして
各６０秒毎に３分間読み取りを行うことによりコレステ
ロールの反応速度をモニターした。３分後、３４０ｎｍ
で吸光度を読み取った。濃度については標準曲線で比較
することにより計算した。
実施例３（コレステロール／トリグリセリド同時アッセ
イ） 本実施例に記載するのは、コレステロールの反応の終点
およびトリグリセリドの反応速度をモニターすることに
よりコレステロールおよびトリグリセリドの同時アッセ
イを行うための方法である。
イ） 本実施例に記載するのは、コレステロールの反応の終点
およびトリグリセリドの反応速度をモニターすることに
よりコレステロールおよびトリグリセリドの同時アッセ
イを行うための方法である。
試薬システムの調製は、以下の成分を混合することによ
り行った。
り行った。
コール酸ナトリウム（３，０ｍＭ）
４−アミノアンチピリン（０，８ｍＭ）フェノール（１
４，０ｍＭ） リパーゼ（２５０，０ＯＯＵ／Ｌ） コレステロールオキシダーゼ（１１７Ｕ／Ｌ）ミクロペ
ルオキシダーゼ（１２１９／Ｌ）ＮＡＤＨ（０，４ｍＭ
） ホスホエノールピルビン酸（０，７ｍＭ）ＡＴＰ （０
，０６ｍＭ） ＭｇＳＯ，（５，５ｍＭ） トリスバッファ＝（１００ｍＭ） コハク酸（２６ｍＭ） ピルビン酸キナーゼ（１６６７Ｕ／Ｌ）グリセロールキ
ナーゼ（６０Ｕ／Ｌ） ＬＤＨ（１００００／Ｌ） 試料を試薬に対してｌ：１０１の比で加え、反応を進行
させた。３４０ｎｍにおいて各６０秒毎に３分間読み取
りを行うことによりトリグリセリドを追跡した。３分後
、５００ｎｍで吸光度を読み取った。濃度については標
準曲線で比較することにより計算した。
４，０ｍＭ） リパーゼ（２５０，０ＯＯＵ／Ｌ） コレステロールオキシダーゼ（１１７Ｕ／Ｌ）ミクロペ
ルオキシダーゼ（１２１９／Ｌ）ＮＡＤＨ（０，４ｍＭ
） ホスホエノールピルビン酸（０，７ｍＭ）ＡＴＰ （０
，０６ｍＭ） ＭｇＳＯ，（５，５ｍＭ） トリスバッファ＝（１００ｍＭ） コハク酸（２６ｍＭ） ピルビン酸キナーゼ（１６６７Ｕ／Ｌ）グリセロールキ
ナーゼ（６０Ｕ／Ｌ） ＬＤＨ（１００００／Ｌ） 試料を試薬に対してｌ：１０１の比で加え、反応を進行
させた。３４０ｎｍにおいて各６０秒毎に３分間読み取
りを行うことによりトリグリセリドを追跡した。３分後
、５００ｎｍで吸光度を読み取った。濃度については標
準曲線で比較することにより計算した。
実施例４（コレステロール／トリグリセリド同時アッセ
イ） 本実施例に記載するのは、コレステロールの反応速度お
よびトリグリセリドの反応速度をモニターすることによ
りコレステロールおよびトリグリセリドの同時アッセイ
を行うための方法である。
イ） 本実施例に記載するのは、コレステロールの反応速度お
よびトリグリセリドの反応速度をモニターすることによ
りコレステロールおよびトリグリセリドの同時アッセイ
を行うための方法である。
試薬システムの調製は、以下の成分を混合することによ
り行った。
り行った。
コール酸ナトリウム（３，０ｍＭ）
４−アミノアンチピリン（０，８ｍＭ）フェノール（１
４，０ｍＭ） リパーゼ（２５０，０ＯＯＵ／Ｌ） コレステロールオキシダーゼ（１０Ｕ／Ｌ）ミクロペル
オキシダーゼ（１２ｍ９／Ｌ）ＮＡＤＨ（０，４ｍＭ） ホスホエノールピルビン酸（０，７ｍＭ）ＡＴＰ （０
，０６ｍＭ） ＭｇＳ０４ （５，５ｍＭ） トリスバッファー（１００ｍＭ） コハク酸（２６ｍＭ） ピルビン酸キナーゼ（１６６７Ｕ／Ｌ）グリセロールキ
ナーゼ（６０Ｕ／Ｌ） ＬＤＨ（１００ＯＵ／Ｌ） 試料を試薬に対して１：ｌＯｌの比で加え、反応を進行
させた。５００ｎ−および３４０ｒｕｓにおいて各６０
秒毎に３分間吸光度を読み取った。濃度については標準
曲線で比較することにより計算した。
４，０ｍＭ） リパーゼ（２５０，０ＯＯＵ／Ｌ） コレステロールオキシダーゼ（１０Ｕ／Ｌ）ミクロペル
オキシダーゼ（１２ｍ９／Ｌ）ＮＡＤＨ（０，４ｍＭ） ホスホエノールピルビン酸（０，７ｍＭ）ＡＴＰ （０
，０６ｍＭ） ＭｇＳ０４ （５，５ｍＭ） トリスバッファー（１００ｍＭ） コハク酸（２６ｍＭ） ピルビン酸キナーゼ（１６６７Ｕ／Ｌ）グリセロールキ
ナーゼ（６０Ｕ／Ｌ） ＬＤＨ（１００ＯＵ／Ｌ） 試料を試薬に対して１：ｌＯｌの比で加え、反応を進行
させた。５００ｎ−および３４０ｒｕｓにおいて各６０
秒毎に３分間吸光度を読み取った。濃度については標準
曲線で比較することにより計算した。
実施例５ （コレステロール／トリグリセリドの同時蛍
光アッセイ） 本実施例に記載するのは、基質の濃度を決定するために
蛍光を用いたコレステロールおよびトリグリセリドの同
時アッセイを行うための方法である。本方法では、同時
反応をモニターするのに分光蛍光計を用いた。アッセイ
の成分は実施例１に記載したものと本質的に同じである
。本アッセイのコレステロールアッセイに関する部分は
、染料を生成するにつれて蛍光の放射ピークを追跡する
ことにより測定した。本アッセイのトリグリセリドに関
する部分は、ＮＡＤ）（がＮＡＤに酸化されるにつれて
３４０ｎｍでの励起を伴う４４０ｎｍでの蛍光放射を追
跡することにより測定した。
光アッセイ） 本実施例に記載するのは、基質の濃度を決定するために
蛍光を用いたコレステロールおよびトリグリセリドの同
時アッセイを行うための方法である。本方法では、同時
反応をモニターするのに分光蛍光計を用いた。アッセイ
の成分は実施例１に記載したものと本質的に同じである
。本アッセイのコレステロールアッセイに関する部分は
、染料を生成するにつれて蛍光の放射ピークを追跡する
ことにより測定した。本アッセイのトリグリセリドに関
する部分は、ＮＡＤ）（がＮＡＤに酸化されるにつれて
３４０ｎｍでの励起を伴う４４０ｎｍでの蛍光放射を追
跡することにより測定した。
Claims (8)
- （１）反応混合物中で単一の試薬システムを用いてコレ
ステロールおよびトリグリセリド基質を同時に決定する
方法であって、 （ａ）決定しようとする各基質に対する反応試薬を含有
する試薬システムを加え、その際、各反応試薬は、特定
の基質について独特の電磁放射吸光度を得ることができ
、他の基質を決定することができるように選択したもの
であり、 （ｂ）それぞれの反応が同時に起こるような条件下で各
基質をそれぞれの反応試薬と同時に反応させ、ついで （ｃ）決定しようとする各基質に特徴的な複数の波長に
おいて、その後の反応混合物の吸光度または蛍光の変化
を測定する ことを特徴とする方法。 - （２）反応混合物中で単一の試薬システムを用いてコレ
ステロールおよびトリグリセリド基質を同時に決定する
方法であって、 （ａ）決定しようとする各基質に対する発色団を含有す
る試薬システムを加え、その際、各発色団は、特定の基
質について独特の吸光バンドを得ることができ、他の基
質を決定することができるように選択したものであり、 （ｂ）それぞれの反応が同時に起こるような条件下で各
基質をそれぞれの発色団と同時に反応させ、ついで （ｃ）決定しようとする各基質に特徴的な複数の波長に
おいて、その後の反応混合物の吸光度または蛍光の変化
を測定する ことを特徴とする方法。 - （３）前記試薬システムが、コレステロールの決定のた
めのコレステロールエステラーゼ活性を有する酵素、色
素生成酸素受容体、ミクロペルオキシダーゼおよびコレ
ステロールオキシダーゼ；およびトリグリセリドの決定
のためのリパーゼ、ＡＴＰ、ＰＥＰ、グリセロールキナ
ーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ＬＤＨおよびＮＡＤ（Ｐ）
Ｈまたはそれらの類似体からなる特許請求の範囲第（２
）項記載の方法。 - （４）前記試薬システムが、コレステロールの終点決定
を行うに充分な濃度のリパーゼ、４−ＡＡＰ、フェノー
ル、ミクロペルオキシダーゼ、コレステロールオキシダ
ーゼ；およびトリグリセリドの終点決定を行うに充分な
濃度のリパーゼ、ＡＴＰ、ＰＥＰ、グリセロールキナー
ゼ、ピルビン酸キナーゼ、ＬＤＨおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
からなる特許請求の範囲第（３）項記載の方法。 - （５）前記試薬システムが、コレステロールの速度決定
を行うに充分な濃度のリパーゼ、４−ＡＡＰ、フェノー
ル、ミクロペルオキシダーゼ、コレステロールオキシダ
ーゼ；およびトリグリセリドの終点決定を行うに充分な
濃度のリパーゼ、ＡＴＰ、ＰＥＰ、グリセロールキナー
ゼ、ピルビン酸キナーゼ、ＬＤＨおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
からなる特許請求の範囲第（３）項記載の方法。 - （６）前記試薬システムが、コレステロールの終点決定
を行うに充分な濃度のリパーゼ、４−ＡＡＰ、フェノー
ル、ミクロペルオキシダーゼ、コレステロールオキシダ
ーゼ；およびトリグリセリドの速度決定を行うに充分な
濃度のリパーゼ、ＡＴＰ、ＰＥＰ、グリセロールキナー
ゼ、ピルビン酸キナーゼ、ＬＤＨおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
からなる特許請求の範囲第（３）項記載の方法。 - （７）前記試薬システムが、コレステロールの速度決定
を行うに充分な濃度のリパーゼ、４−ＡＡＰ、フェノー
ル、ミクロペルオキシダーゼ、コレステロールオキシダ
ーゼ；およびトリグリセリドの速度決定を行うに充分な
濃度のリパーゼ、ＡＴＰ、ＰＥＰ、グリセロールキナー
ゼ、ピルビン酸キナーゼ、ＬＤＨおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
からなる特許請求の範囲第（３）項記載の方法。 - （８）特許請求の範囲第（３）項、第（４）項、第（５
）項、第（６）項または第（７）項に記載のコレステロ
ールおよびトリグリセリドの同時決定のための試薬シス
テム。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US9989087A | 1987-09-22 | 1987-09-22 | |
| US099890 | 1987-09-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01108998A true JPH01108998A (ja) | 1989-04-26 |
Family
ID=22277116
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63237453A Pending JPH01108998A (ja) | 1987-09-22 | 1988-09-21 | コレステロールおよびトリグリセリドの同時アッセイ法およびそれに用いる試薬システム |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0395654A4 (ja) |
| JP (1) | JPH01108998A (ja) |
| KR (1) | KR890701762A (ja) |
| AU (2) | AU2486388A (ja) |
| CA (1) | CA1323554C (ja) |
| WO (1) | WO1989002925A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6380380B1 (en) * | 1999-01-04 | 2002-04-30 | Specialty Assays, Inc. | Use of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) and nicotinamide adenine dinucliotide phosphate (NADP) analogs to measure enzyme activities metabolites and substrates |
| WO2003025584A2 (en) | 2001-02-05 | 2003-03-27 | The Board Of Regents For Oklahoma State University | Direct serum lipids assays for evaluation of disease states |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4425427A (en) * | 1980-03-13 | 1984-01-10 | Vitafin N.V. | Simultaneous, kinetic, spectrophotometric analysis of blood serum for multiple components |
| EP0133064A1 (fr) * | 1983-06-23 | 1985-02-13 | Laboratoires Biotrol | Procédé pour le dosage successif de divers composants d'un prélèvement biologique à partir d'une même prise d'essai dans une même enceinte de réaction et réactifs utilisés |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2315501C3 (de) * | 1973-03-28 | 1980-02-21 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin |
| US4309502A (en) * | 1980-06-30 | 1982-01-05 | Beckman Instruments, Inc. | Enzymatic assay for glycerol and triglycerides and a reagent for use therein |
-
1988
- 1988-09-20 AU AU24863/88A patent/AU2486388A/en not_active Abandoned
- 1988-09-20 KR KR1019890700883A patent/KR890701762A/ko not_active Application Discontinuation
- 1988-09-20 EP EP19880908629 patent/EP0395654A4/en not_active Ceased
- 1988-09-20 WO PCT/US1988/003169 patent/WO1989002925A1/en not_active Application Discontinuation
- 1988-09-21 CA CA000578065A patent/CA1323554C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-09-21 JP JP63237453A patent/JPH01108998A/ja active Pending
-
1992
- 1992-09-07 AU AU22808/92A patent/AU2280892A/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4425427A (en) * | 1980-03-13 | 1984-01-10 | Vitafin N.V. | Simultaneous, kinetic, spectrophotometric analysis of blood serum for multiple components |
| EP0133064A1 (fr) * | 1983-06-23 | 1985-02-13 | Laboratoires Biotrol | Procédé pour le dosage successif de divers composants d'un prélèvement biologique à partir d'une même prise d'essai dans une même enceinte de réaction et réactifs utilisés |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2486388A (en) | 1989-04-18 |
| KR890701762A (ko) | 1989-12-21 |
| WO1989002925A1 (en) | 1989-04-06 |
| EP0395654A4 (en) | 1991-01-09 |
| AU2280892A (en) | 1992-11-19 |
| CA1323554C (en) | 1993-10-26 |
| EP0395654A1 (en) | 1990-11-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU617108B2 (en) | Simultaneous assay for glucose and urea | |
| US4743561A (en) | Luminescent assay with a reagent to alter transmitive properties of assay solution | |
| Werner et al. | Ultramicro determination of serum triglycerides by bioluminescent assay. | |
| US4425427A (en) | Simultaneous, kinetic, spectrophotometric analysis of blood serum for multiple components | |
| Shephard et al. | Falsely low estimation of triglycerides in lipemic plasma by the enzymatic triglyceride method with modified Trinder's chromogen | |
| Spain et al. | Bilirubin interference with determination of uric acid, cholesterol, and triglycerides in commercial peroxidase-coupled assays, and the effect of ferrocyanide. | |
| US5200325A (en) | Self-indicating analysis employing stoichiometric chemical subtraction | |
| JPH01108998A (ja) | コレステロールおよびトリグリセリドの同時アッセイ法およびそれに用いる試薬システム | |
| EP0327952B1 (en) | Self-indicating and improved resolution analyses employing stoichiometric chemical subtraction | |
| FR2540137A1 (fr) | Procede tres sensible d'analyse quantitative enzymatique | |
| WO2005029038A2 (en) | Detection of potassium ions using ion-sensitive enzymes | |
| Smith et al. | Automated measurement of total cholesterol and triglycerides, in" tandem," on the discrete sample analyzer, Gilford System 3500. | |
| Hearne et al. | Assessment of colorimetric enzymatic determination of triglyceride, by manual and centrifugal analyzer techniques, and comparison with a CDC standardized method | |
| JPS62195297A (ja) | カルシウムイオン定量用試薬 | |
| JP3034984B2 (ja) | Ｄ−ガラクトースの高感度定量法および定量用組成物 | |
| Kusu et al. | Fluorometric determination of pseudocholinesterase activity in postmortem blood samples | |
| JPH03285697A (ja) | 化学発光検定法 | |
| JPH1118798A (ja) | コレステロールの定量方法及び定量用試薬 | |
| JP3034979B2 (ja) | グリセロール、ジヒドロキシアセトンまたはｄ−グリセロアルデヒドの高感度定量法および高感度定量用組成物 | |
| JPH06237794A (ja) | １，５−アンヒドログルシトールの定量法 | |
| JPH06237795A (ja) | １，５−アンヒドログルシトールの定量法 | |
| JPS63116700A (ja) | 微量物質の分析方法 | |
| Axcell | Enzymatic methods of analysis using the oxygen electrode | |
| Massey et al. | Development and clinical evaluation of a microcentrifugal analyzer method for determining creatine kinase MB isoenzyme. | |
| JPH01174399A (ja) | 高感度比色定量法 |