JP2767049B2 - 被分析物の存在を測定する分析方法及び試験組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、試験試料中の所定濃度の被分析物の存在を
測定する分析方法に関する。さらに詳しくは、本発明
は、問題の濃度以上の被分析物の存在を予め選択した分
光光度の応答の出現、例えば発色によって示すような測
定に関する。したがって、このような測定は、対照又は
標準が不必要な自己表示型である。別の態様では、本発
明は、有意な被分析物濃度範囲にわたって指示薬応答の
色の分解の最適化を必要とする目視分析に関する。

問題の被分析物と適切な試薬／指示薬系との間の化学
反応によって生じる分光光度の応答に基づいて、液体試
験試料中の被分析物の濃度を測定する試験方法は、周知
である。分光光度の応答は、通常、機器で又は肉眼で測
定される変色である。従来の試験は、既知濃度の被分析
物によって生じる標準的応答に対する試験応答の比較に
よって試料中の被分析物の量又は濃度を定量する。ま
た、比較を分光光度計を用いて又はカラーチャートとの
目視比較によって行うことができる。

試薬ストリップがこれらの分析方法を実施するための
試験具の共通の形態である。これらの試験具は、乾燥状
態で試薬／指示薬成分を混入した担体材料又はマトリッ
クス、例えば濾紙、ポリマーフィルム等を結合する把手
又は支持手段を有する。液体試験試料との接触は、試験
組成物を再水和し、分析反応を開始する。担体材料から
発生する分光光度の応答を、次に、標準と相関させて、
試験する試料中の被分析物の濃度を示す。

これらの試験方法及び試験具は、液体試料中の物質の
定量又は定性的測定が重要である場合に種々の分野で有
用である。医学及び獣医学的目的の生物学的流体、食物
及び飲料、環境水及び廃水の試験が代表的である。試薬
ストリップは、糖尿病患者による血中グルコース濃度の
自己監視から診療室及び臨床実験室における常用の尿代
謝産物スクリーニング及び定量的血液化学分析まで、医
学的診断に有用な手段として特に良く知られている。

これらの従来方法及び試験具によって得られる試験結
果は、有用な分析手段として利用するのに充分に定量的
であり、試薬ストリップの形状は、その簡単さ並びに貯
蔵及び使用の容易さから特に魅力的であるが、このよう
な試験の精度は標準と比較する必要によって制限され
る。特に、応答が変色であり、比較を肉眼で行う場合に
は、ヒトの目には色の僅かな差異を分解する能力に限り
があり、これが定量に不所望の誤差要因となりうる。さ
らに、問題の被分析物濃度範囲にわたって指示薬反応に
よって発生する色が色相において高度に飽和されてお
り、定量のための目視分解は最適レベルより著しく低く
なることがある。

文献には、自己表示型の定量的試験システムを考案す
る試みが多数ある。このシステムは、所定の被分析物濃
度で比較的に明白なイエス／ノー応答又は表示を生じる
試験システムを意味する。したがって、プログラムした
指示薬応答、例えば発色の目視検出が観察される場合、
被分析物が所定濃度以上で存在することが示される。自
己表示の原理は周知であるが、従来は、実際に自己表示
型であるのに充分に明白なイエス／ノー応答を生じる試
験システムを創成する実際的アプローチに欠けている。

自己表示型試験システムを作製する極めて早期のアプ
ローチでは、指示薬に作用して所定の被分析物濃度以下
で発色を防止する拮抗物質を組成物中に使用した（米国
特許第2,893,844号明細書）。拮抗物質と反応しやすい
指示薬は、試料中の多数の非特異性環境因子、例えば妨
害物質によっても影響されるであろう。したがって、こ
のようなシステムは、定量試験としては充分には信頼性
を有しない。他の早期のアプローチは、試験組成物中の
指示薬の量を制限する原理を使用する（米国特許第3,00
6,735号明細書）か又は半透膜によって試験組成物に到
達する被分析物の量を物理的に制限する原理を使用した
（米国特許第3,723,064号明細書）。

さらに最近になって、多数の異なるアプローチが示唆
された。米国特許第3,964,871号、同第4,042,329号及び
同第4,059,407号明細書は、異なる濃度の被分析物に対
して検出可能な応答を与えるために複数の試験領域を配
列した自己表示型試験具が望ましいことを強調してい
る。しかしながら、自己表示型応答を達成するため提示
された反応図は、著しい欠点を有する。提案された主な
反応図は、試料の妨害物質の問題を起こす指示薬拮抗物
質又は滴定物質を従来公知のとおりに使用することに基
づくものである。指示薬は、環境因子に対して益々安定
な化合物に向かって発展してきた。その結果、現在好ま
しいとされている指示薬は、上記の文献に提案されたよ
うな拮抗化合物によってはほとんど滴定できない。提案
されている別のアプローチは、被分析物を錯体化して指
示薬系との反応を防止することである。提案された系
は、被分析物に対して比較的に非特異的であり、あるも
のは可逆的な錯体を形成し、あるものは不所望の沈殿物
を生じる。また、データはなく、系は全く精製されてい
ない。

さらに最近、米国特許第4,234,313号明細書には、被
分析物と反応すると、有色から無色に移行する指示薬の
使用が提案されている。このアプローチは、検出可能な
変色が起こるには指示薬の完全な消費が必要であるた
め、限定された量の指示薬の使用を要するという主要な
欠点を有する。その結果、指示薬の反応速度は遅い。さ
らに、無色の結果が陽性の結果を示すことは、実験室に
おいて典型的技術者の慣習とは逆である。

米国特許第4,654,310号明細書は、指示薬反応とは競
合的であって、種々の濃度の被分析物で指示薬応答の速
度を有効に減少させる非応答性反応の使用を提案してい
る。この文献は、指示薬反応から競合的量の被分析物を
有効に除去するため、触媒で制御される二次反応の使用
を教示している。触媒量が変動し、応答、例えば色を生
じる指示薬反応の能力が存在する被分析物の量に左右さ
れる程度に過剰量の二次反応の反応体を使用して数個の
試験領域を提供する。このアプローチの最も顕著な制限
は、指示薬及び二次反応が被分析物に対して速度論的に
競合するので、指示薬応答曲線の勾配が、被分析物の全
ての濃度で指示薬応答を区別する能力に対する有害な影
響により低下する。

したがって、試験試料中の妨害物質に対して抵抗性で
あり、安定で、本質的に不可逆的な指示薬応答を生じ、
かつ分解能を犠牲にしない自己表示型試験システムが引
き続いて求められている。

さらに、試薬ストリップ試験具の制限は、分析的に有
意な被分析物濃度の全範囲にわたって均一に良好な機器
又は目視分解を一般的に欠くことである。濃度範囲の下
限での分解は、しばしば全く良好であるが、範囲の上限
での機器又は目視による定量は悪化する。この現象の共
通の原因は、高濃度の被分析物における指示薬応答、例
えば色の過飽和である。

したがって、さらに、問題の被分析物濃度範囲内で指
示薬応答の最適な分解を行うように調節することのでき
る、肉眼で評価するか又は機器で読み取る試験システム
が求められている。

発明の概要 本発明は、極めて有利な自己表示型試験システムを提
供し、所望の被分析物濃度範囲内で最適な色の分解を生
じるように比色試験システムを調節する手段を提供する
ものである。これらの特質は、指示薬反応を実施する前
に化学量論的な被分析物特異性減量反応を有効に実施す
ることにより生じるものである。試験試料中の被分析物
の所定量の消費を制御して、所定の指示薬応答を生じる
被分析物濃度を予め選択して自己表示特性を生じうるよ
うに指示薬応答曲線を移動させる。また、応答曲線の移
動、特に目視評価指示薬反応の応答曲線の移動を使用し
て所望の被分析物濃度範囲内での指示薬の応答の分解を
最適にすることができる。

本質的に指示薬反応が起こる前に反応系から被分析物
を差し引くことによって、指示薬応答によって検出可能
な被分析物の量を有効に減少することができる。減量反
応を制御して反応混合物中の被分析物の所定量を消費さ
せる場合に、その点で特定レベルの応答、例えば発色を
制御することができる。減量反応の制御は、反応混合物
中の被分析物に対して特異的で、調節共反応体、例えば
減量反応において被分析物と共に消費される補助基質が
関係する酵素反応又は反応列を使用することによって達
成される。反応混合物中に存在する共反応体の初期量
を、被分析物の所望量の消費に化学量論的に充分である
ように選択する。

実質的な指示薬反応の前に被分析物を化学量論的に差
し引くことは、減量後に残る被分析物の量に対する指示
薬応答に影響しないという主要な利点を有する。したが
って、指示薬応答曲線の勾配は、その曲線自体が所定の
被分析物濃度で移動しはじめても変化しない。勾配が変
化しないので、自己表示システムにおける閾値レベルで
又は、例えば、目視評価システムにおける被分析物濃度
の全範囲での応答の分解を、使用する指示薬系に対して
最適レベルに維持することができる。従来のアプローチ
は、いずれもこの特長を提示していない。

被分析物は、それ自体が分析上興味のある物質又は一
次反応で興味ある主要物質の反応によって形成される中
間生成物であってもよい。本明細書に使用する場合、被
分析物とは、減量及び指示薬反応が作用する物質であ
り、実際の試験システムにおいてしばしば分析上、興味
ある主物質ではなく、むしろ中間生成物、例えば多数の
有用な指示薬反応及び減量反応に関与する酵素基質又は
補助因子、例えばNADH、NADPH、グリセリン、ATP又は過
酸化水素である。

化学量論的減量反応を使用することから多数の利点が
生じる。

1.化学量論的減量は、最適分解範囲の程度、すなわちそ
の位置を変更しない。したがって、感度（用量応答曲線
の勾配）は、速度論的分配の場合と同様に変動しない。
これにより生じる試薬性能では、系の最適分解範囲が、
系に加えた減量試薬の量に直接依存する漸進的に増加す
る被分析物濃度に不連続的急騰で移動する。この方法で
示される試験システムは、それぞれ、基本的指示薬応答
化学が許す有用な範囲だけを有する試験列、例えば多数
の試薬ストリップパッド又はキュベットを含む。パッド
又はキュベットの総合システムだけが延長された範囲を
有する。

2.自己表示試験（“イエス−ノー”試験）に使用される
ような“悉無”表示は、極めて鮮明であることを示すこ
とができる。この場合に、最適分解範囲は、例えば、極
めて高い分子吸光係数を有する指示薬を用いることによ
って起こるように極めて狭いであろう。したがって、被
分析物の所定の閾値レベルを超えたことを測定するため
に、極めて僅かな判断を必要とするにすぎないであろ
う。

3.本明細書に記載するような化学的減量の酵素的性質
は、単純な化学的錯体形成図よりはるかに優れている特
異性を与える。したがって、他の場合に起こるより妨害
の起こるのが少ないことが予測され、試験システムの信
頼性及び精度が一般的に改良されるであろう。

4.本明細書に記載するように化学的減量が化学量論的で
あるので、温度の変動はシステムに極めて少ししか影響
しないであろう。二つの競合反応の間の速度論的分配に
よる減量は、単に速度の相違に基づくものであるから、
再現性であるには、極めて注意深く制御された条件を必
要とする。温度の変動は、交互の通路に流す被分析物又
は被分析物の均等物の割合を変動すると予測される。し
たがって、速度論的分配は、化学量論的減量ほど本来的
に信頼性のあるものではない。

好ましい実施態様の説明 本発明が作用する原理は、第１図〜第３図を参照して
最も良く理解することができる。これらの図面は、指示
薬応答曲線を説明するグラフである。

自己表示の原理 第１図において、被分析物濃度の増加に対する標準指
示薬応答を上向き勾配を有する破線X₁として示す。説明
の目的で、指示薬応答は変色とする。指示薬応答のR₁レ
ベルは検出可能性の閾値レベル、例えば発色を肉眼で検
出しうる点である。G₁の試験試料中の被分析物濃度は、
この閾値指示薬応答を生じる。標準指示薬応答線を使用
すると、C₂及びC₃の被分析物濃度を定量する能力は、色
R₂及びR₃を正確に区別する目の能力に左右される。R₂及
びR₃の応答が、飽和された色応答のためにほとんど区別
できない場合には、被分析物濃度C₂及びC₃の分解は極め
て誤差を起こしやすくなる。

上向き勾配を有する実線Y₁及びZ₁は、本発明により２
つの異なる減量反応によって移動された指示薬応答線を
示す。これらの応答線は、減量反応に被分析物の量C₂′
及びC₃′が消費されたことから生じる。減量反応の結果
として、C₂及びC₃は、それぞれR₁閾値指示薬応答を得る
のに必要な試料中の被分析物の量となる。したがって、
移動した指示薬応答線Y₁を使用して、発色の観察は、試
験試料中に被分析物がC₂以上の濃度で存在することを意
味する。応答線Z₁及び被分析物濃度C₃についても同様の
関係がある。

指示薬応答線Y₁及びZ₁を用いて別個の分析（被分析物
の量C₂′及びC₃′を減量する別々の反応を行うことによ
って達成される）を行い、単に発色の有無を観察する
（イエス／ノー観察）場合には、濃度レベルC₂及びC₃を
容易に区別することができる。これは、標準指示薬応答
線X₁を使用し、色R₂及びR₃を分解することを試みて可能
な低い分解能とは対照的である。さらに、最高の分解能
は閾値検出レベルにある（目は色の異なる色相を区別す
るより発色をより良く分解することができる）。この検
出レベルR₁が、選択した全被分析物濃度（例えばC₂及び
C₃）での減量−移動指示薬応答線を用いる定量の基礎で
あるから、本発明の自己表示型試験システムは、選択し
た指示薬系を使用する最高の精度を有する。

改良された分解の原理 本発明は、自己表示手段を備えると共に、さらに一つ
の指示薬反応を用いて被分析物濃度範囲にわたって定量
を改善する手段を提供するものである。

第２図には、被分析物の濃度の増加に対する標準指示
薬応答線を上向きの勾配を有する破線X₂として示す。標
準指示薬応答が、レベルR₄及びR₅でほとんど飽和された
色を生じる場合、被分析物濃度C₄及びC₅は区別困難であ
るか又は区別不可能でさえある。このような最適以下の
濃度又は被分析物濃度範囲C₄〜C₅内で分解能を生じない
指示薬応答を、本発明により、問題のこの濃度範囲にわ
たって最適分解能を提供するように調節することができ
る。試料中の被分析物のC₄′量を消費する化学量論的減
量反応を実施することによって、応答曲線は実線Y₂に移
動して、問題の被分析物濃度範囲C₄〜C₅にわたってR₆か
らR₇への指示薬応答を生じる。指示薬応答のR₆〜R₇の範
囲は、変色の最適分解領域を示す。本発明によれば、被
分析物の量C₄′を控除することによってこのような最適
分解能の利点が得られるように指示薬応答を移動させ
る。

従来法との比較 第３図は、米国特許第4,654,310号明細書に教示され
ている自己表示に関する反応速度競合法を示す。指示薬
系の標準応答を線X₃として示す。種々の量の触媒及び過
剰量の二次反応体を添加することによって別々の反応混
合物中で競合的二次反応を起こさせて、指示薬反応の間
に被分析物の消費を進行させる。競合的反応により非反
応性生成物が生じ、これが指示薬応答の勾配を低下させ
る。指示薬応答線Y₃及びZ₃は、指示薬反応混合物中の触
媒の２種の異なるレベルの存在から生じる応答を示す。
その結果、被分析物が濃度C₆で存在すると、指示薬応答
線X₃を示す反応においては閾値発色R₈だけを示すので、
自己表示システムが得られる。同様に、被分析物が濃度
C₇で存在する場合には、反応X₃及びY₃（しかし、Z₃では
ない）で色が見られる。最後に、被分析物濃度C₈は三つ
の反応系すべてにおいて発色を生じる。しかしながら、
容易に見られる問題は、Z₃反応系における閾値指示薬応
答R₃の出現の測定は、指示薬応答の勾配が低下するの
で、誤差を増加することである。応答R₃の出現の検出に
おける僅かな誤差は、定量における大きい誤差を生じ
る。R₃の領域における被分析物濃度範囲が広いと、ほと
んど区別できない指示薬応答を生じる。第１図と比較す
ると、本発明は、高い被分析物濃度、例えばC₃でさえ、
標準指示薬応答の分解能を維持する。

減量反応 本発明の化学量論的減量反応は、例えば指示薬反応の
実施によって指示薬の応答を測定する前に試験試料中の
被分析物の所定量を消費するものである。酵素で触媒さ
れ、被分析物と共反応体の少なくとも１種を含む反応の
使用によって被分析物の消費を制御し、支持する。この
ような共反応体は、消費される被分析物の量が存在する
共反応体の量に左右され、減量反応における被分析物に
対する化学量論的関係に左右されるので、本明細書にお
いては調節共反応体と言う。減量反応は、ただ一つの酵
素反応又はその少なくとも一つが酵素反応である反応列
であってよく、好ましくは最初の反応が被分析物に作用
し、その反応のうちの一つで反応体が調節共反応体とし
て作用することができる。

減量反応は、減量反応が開始したときに存在し、その
後に完全に消費される共反応体の量と化学量論的に同等
な被分析物の量を消費する。したがって、最も簡単に言
えば、本発明は下記の説明図で示すことができる： 減量反応の特徴 本発明の減量反応の主な特徴は、指示薬応答を測定す
る前又は指示薬反応を実施する前に減量反応が実質的に
完了していることである。この方法では、被分析物の減
量は、化学量論的であり、速度論ではなく、したがっ
て、指示薬応答の勾配は本質的に影響されない。顕著な
指示薬応答が起こる前に完了するように減量反応を実施
する方法が多数あることは明らかである。

一つのアプローチは、指示薬反応の試薬の１種以上又
は全部の不存在で減量反応を実施することである。減量
反応が完了したら、不足の指示薬試薬を添加して指示薬
反応を開始させる。１種以上の指示薬試薬が指示薬反応
において不活性な変性された形で存在する場合、指示薬
反応の試薬の全部を存在させて減量反応を実施すること
によって同じ効果を得ることができる。減量反応が完了
したら、変性された指示薬試薬を適切に活性形に変換さ
せて指示薬反応を開始させる。この目的で指示薬試薬を
不活性にする変性は、マイクロカプセル化、化学的誘導
体化又は錯体形成及び従来公知の同様の技法を包含す
る。

通常、減量反応の実施と同時に反応混合物中にすべて
の指示薬試薬が完全に活性な形で存在するのが好まし
い。本発明の目的は、この場合、指示薬反応が相当程度
まで進行する前に本質的に完了しているのに充分に迅速
な減量反応を使用することによって達成される。減量反
応は酵素で触媒されるので、生じる減量反応が指示薬反
応に比べて極めて速くなるように充分に高い回転率及び
／又は反応混合物中で容易に超えられるK_Mを有する酵素
に基づいて酵素反応図を選択する。酵素で触媒される減
量反応における共反応体は、K_Mより過剰、通常K_Mの２倍
以上、好ましくはK_Mの５倍以上で存在し、及び／又は存
在する触媒量は、迅速な反応速度を生じるのに充分に高
いレベルである。

さらに、減量反応を実施する反応混合物中で被分析物
に対して有効に特異的であることが、減量反応の主な特
徴である。減量反応が特異的であることから、被分析物
の化学量論的減量が著しい試料妨害を起こさないことが
確保される。この方法で、減量反応によって消費される
被分析物の量は、存在する調節共反応体の量によって定
量的かつ再現可能に制御される。

減量反応の特異性は、このような反応を触媒する酵素
の特異性によって本質的に説明される。この点で、本発
明に必要な特異性は、性質において他のすべての物質に
対する絶対的特異性ではなく、むしろ反応混合物に存在
する他の物質に対する特異性であることを理解すべきで
ある。被分析物は、本質的には、反応混合物中の、共反
応体との酵素反応によって消費されうる唯一の物質であ
ることだけが必要である。したがって、減量反応として
選択される酵素反応は、試料中に通常存在する他の物質
又は反応のための被分析物と実質的に競合しうる他の分
析試薬が存在しないことを基準として選択される。

減量反応の別の特徴は、被分析物に作用するが、指示
薬反応生成物には作用しないことである。被分析物と
は、減量反応及び指示薬反応の両方に共通の反応体とし
て作用する物質と理解される。したがって、若干の場合
には、被分析物は分析において現実に分析上興味のある
物質ではなく、むしろ最終的に測定すべき物質と一次反
応によって形成される中間生成物であってもよい。被分
析物が中間生成物である場合には、これは種々の潜在的
に有用な減量反応及び指示薬反応系における反応体とし
て公知の物質であるのが好ましい。この方法では、被分
析物に対して最適な減量及び指示薬反応図を多くの分析
に使用することができる。このような反応図は、特異的
な一次反応によって被分析物を包含する生成物に変換さ
れうる物質を測定するのに有用である。この意味で使用
する場合、被分析物は、中心的又は共通の基質と言うこ
とができ、ヌクレオシドリン酸エステル類、すなわち、
ニコチンアミドジヌクレオチド（NAD）及びその還元型
（NADH）、ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸（NAD
P）及びその還元型（NADPH）、フラビンアデニンジヌク
レオチド（FAD）、フラビンモノヌクレオチド（FMN）及
びアデノシンリン酸エステル類（AMP、ADP及びATP）、
過酸化水素、グリセリンなどのような物質を包含する
が、これらに制限されるものではない。

減量反応の別の主な特徴は、生じる生成物が実質的に
指示薬応答を示さないことである。本質的特徴は、減量
反応が実質的指示薬応答を生じることなく、さらに指示
薬応答又はその発生を実質的に妨害することなく所定量
の被分析物を消費することである。指示薬反応及び減量
反応にそれぞれ使用する反応図を示し、評価する際には
上記のことを考慮に入れる必要がある。

また、減量反応が、検出可能な応答を生じる指示薬反
応に必要な時間にわたっ本質的に不可逆的であることは
特に好ましい。そうでなければ、復帰反応によって再生
される被分析物の量を補償するか又はファクターとする
ことが必要となる。前向きの減量反応によって消費され
る被分析物の量を時間とともに逆転させないことが最適
である。不可逆性は、反応生成物の形成の際に自由エネ
ルギーの大きい変化を生じる入手可能な手段によって達
成することができる。これは、例えば、減量反応の生成
物の一つがガス、酸化−還元生成物又は他の顕著な分子
変形である場合に、達成されうる。生成物が任意の復帰
反応に関与するのを有効に阻止する媒染剤又は他の錯体
形成剤を使用することも考えられる。不可逆性は、ま
た、反応体の一つ、例えば、水が大過剰で存在する減量
反応を使用することによって有効に得ることもできる。
酵素反応が関与する場合、前進反応のK_Mが、酵素が前進
反応の基質と有効に結合するような復帰反応よりはるか
に小さい系を選択することができる。

減量及び指示薬反応を含む分析系の具体例を次に記載
する。

A.NADHのピルビン酸塩/LDH減量 NADHは、分析上興味ある物質の酵素測定における共通
の中間生成物である。特に有用な減量反応は、 これをさらに変性して、NADHの減量を下記の反応によっ
て本質的に不可逆的にすることができる。

ここで、LDHは乳酸デヒドロゲナーゼであり、LOXは乳酸
２−モノオキシゲナーゼである。好ましい条件を与える
と、減量反応全体としては、ピルビン酸塩から生成する
と同時に乳酸塩を除去することができ、こうしてLDH反
応の逆転を阻止することができる。

分析上興味のある特定の物質の存在の乾燥としてNADH
を生成する多数の一次反応を、本発明の目的でこの減量
系と結合することができる。例えば、 （式中GDHはグルコースデヒドロゲナーゼである。） （式中CEHはコレステロールエステルヒドロラーゼであ
り、CDHはコレステロールデヒドロゲナーゼである。） （式中GPDHはグリセリン−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
である。） 同様に、NADHは、減量反応からの残留物に対して作用
しうる多数の有用な指示薬反応に関与する。NADH指示薬
は、ヨードニトロテトラゾリウムクロリド（INT）、ニ
トロブルーテトラゾリウムクロリド（NBT）及びジクロ
ロインドフェノール（DCIP）を包含する。NADHを下記の
反応を含むリポアミド系によって測定することもでき
る。

還元型リポアミド＋ジスルフィド指示薬→ リポアミド＋色 （式中LADHはリポアミドデヒドロゲナーゼであり、ジス
ルフィド指示薬はジチオ−（ビス−ニトロベンゼン）
（エルマン（Ellman）氏試薬）のような試薬又はこの種
の他の常用の指示薬を包含する。

B.NADHのα−ケトグルタル酸塩／グルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼ減量 この減量系は下記の反応に基づくものである。

過剰のNH₄ ⁺の存在では、この反応は本質的に不可逆的
になりうる。さらに、不可逆性は、下記の反応を付加す
ることによって得ることもできる。

上記の（Ａ）に記載した一次反応及び指示薬反応は、
この減量系にそのまま適用される。

C.NADHのリポアミド／リポアミドデヒドロゲナーゼ減量 NADHの別の有用な減量反応は、リポアミド（DL−6,8
−チオクチックアセトアミド）反応連鎖に基づくもので
ある： この反応は、リポアミドをその酸化型に変換すること
によって不可逆的にすることができる。例えば、 リポアミド（還元型）＋ジスルフィド受容体→リポア
ミド（酸化型）＋受容体（還元型） ジスルフィド受容体は、リポアミドから変色を生じる
ことなく電子当量を受容する化合物、例えば2,2′−ジ
チオ−ビス（ピリジン−Ｎ−オキシド）（DTPO）から選
択される。

同様の反応は、グルタチオンレダクターゼの存在での
グルタチオンとNADHとの反応である。

D.NADHのグリセルアルデヒド−３−リン酸／α−グリセ
リンリン酸デヒドロゲナーゼ減量 さらに、下記の経路でNADHを減量することもできる。

式中α−GPDはα−グリセリンリン酸デヒドロゲナー
ゼである。上記の反応は、さらに下記の反応によって改
善して不可逆性にすることができる。

また、前記の（Ａ）に記載したようにNADHを製造し、
検出する予備反応及び指示薬反応はそれぞれこの減量系
に適用される。

E.グルコースのATP/ヘキソキナーゼ減量 被分析物としてのグルコースに直接適用することので
きる減量反応は、下記のとおりである： ヘキソキナーゼをグルコキナーゼで置換することもで
きる。ADPの存在が全分析系において可能な妨害物質を
生じうる場合には、これを下記の反応によって有効に除
去することができる。

AMPはATP依存性の反応、例えばバイオルミネッセンス
には、通常、非反応性である。次にグルコースに対する
指示薬反応を下記のように行い、NADHを前記の指示薬反
応によって検出する。

F.ATPのグルコース／ヘキソキナーゼ減量 直前の減量系の逆転、すなわち、調節共反応体として
のグルコースでATPを減量することを使用することもで
きる。

分析上興味のある特定の物質の関数としてATPを生成
し、この減量反応に結合しうる予備反応は、下記のもの
を包含する： ATPに対する指示薬反応は、周知のバイオルミネッセ
ンス図並びに発色系を包含する。例えば NADH→前記のような発色 G.ATPのグリセリン／グリセリンキナーザ減量 ATPを減量する別のアプローチは、下記の反応に基づ
くものである： H.グリセリンのATP/グリセリンキナーザ減量 グリセリンの減量は、上記の（Ｆ）に示した反応によ
り達成することができる。グリセリンは、予備反応にお
いてトリグリセリドから生成され、前記のようなグリセ
リンデヒドロゲナーゼ/NADH指示薬系によって検出する
ことができる。

指示薬応答は、本質的には、分析により検出しうる応
答、特に化学的又は電気的性質の応答であってよい。被
分析物又は指示薬反応の反応生成物の化学的性質は、通
常、指示薬応答、特に物理化学的性質、例えば化合物の
光学的又は電気化学的性質として使用される。有用な光
学的性質は、蛍光、特に可視及び紫外範囲での吸光度、
肉眼で検出しうる変色、例えば、発色又は色相の変化あ
るいは飽和及びルミネッセンス、例えば化学ルミネッセ
ンス又はバイオルミネッセンスである。指示薬応答の検
出は、応答の性質に左右されるであろう。機器による検
出、例えば蛍光計、光度計、分光光度計、比色計などを
用いる検出がしばしば使用される。変色の肉眼での観察
並びに可視及び／又は紫外範囲における吸光度の変化の
機器による測定、特に反射光度計による測定は、特に本
発明によって向上される。

本発明の方法の自己表示型態様に有用な比色指示薬応
答に関して、被分析物の指示薬のレベルに対する閾値発
色の相対的位置を調節するため減量反応を使用すると、
所望生成物を広範な材料から選択することが可能とな
る。他の場合には高い分子吸光係数を有するため定量に
使用するのは適当でない色素又は指示薬は、本発明の自
己表示法には全く有用になり、実際、好ましい。このよ
うな材料は、被分析物に応答して強い色を生じるので、
閾値発色は、全く容易に検出可能となり、したがって、
分析結果の精度が改良される。

本発明の方法は別個の指示薬反応を使用して指示薬応
答を示す生成物を生じる分析系において顕著な利点をも
たらすことが考えられるが、若干の場合には、指示薬応
答としての被分析物自体の物理的性質を測定することが
可能となる。これは、特に、被分析物が特徴的吸収性に
よって直接測定されうる中間生成物、例えばNAD、NAD
H、NADP又はNADPHである場合に適用することができる。

分析方法及び試験構造体 本発明の方法を実施する際には、まず減量反応を実質
的に完了するまで実施し、その後、指示薬反応を行う。
前記のように、これは減量反応が完了するまで指示薬試
薬の添加又は接触を実際に遅延させるか又は相対的速度
により反応を有効に逐次進行させる条件及び反応図を選
択することによって行われる。減量試薬及び指示薬試薬
の時間的に逐次添加すると、もちろん、この目的が達成
されるが、試験試料を単一の試験組成物又は試験具と接
触させればよいように、反応経路を設計するのが好まし
い。

前記のように、反応経路に対する便利なアプローチ
は、同時に開始したときに、指示薬反応が相当な程度に
進行する前に減量反応が本質的に完了している程度に充
分に迅速であるように、減量反応及び指示薬反応を選択
することである。減量反応と指示薬反応との間のこの関
係に基づく分析系は、広範な試験組成物及び試験具の形
で提示することができるが、特に試薬ストリップに使用
するのに適当である。このような試験具は、従来公知の
ように減量試薬及び指示薬試薬を混入した担体材料又は
マトリックスを含む。試験試料と接触させると、反応が
開始され、最終的な検出可能な指示薬応答は本発明の特
徴によって特性決定される。

別の好ましいアプローチは、試薬の区画化を含む。多
くの試験具は、試験試料及び生じる反応混合物が減量試
薬及び指示薬試薬と接触する順序を整理するため利用さ
れる。一般原則として、このような試験具は、流体流動
接触で試薬の別々の区間を含み、これによって接触の順
序及び、したがって反応を制御することができる。区画
は、例えば、毛細管又は他の液体導通手段などによって
連結された特定の液体用量を維持しうる室であってよ
い。

区画化に基づく特に有用な試験具は、それぞれの試薬
を混入した別々の帯域を有する担体マトリックスを含む
試薬ストリップである。一つの形態では、このような試
験具は、試薬を混入した多くの吸収性又は多孔性の層を
含む。試薬と接触する上層は、減量反応の要素を含み、
残りの反応混合物が拡散する下層は指示薬反応の要素を
含む。別の形態では、試験具は、接触させるため所望の
順序で試薬を混入した別個の部分を有する長い吸収性担
体マトリックスを含む。マトリックスの選択された端部
を試験試料と接触させると、場合により展開流体を用い
て、試験具に沿って毛細管により液体が流れるにしたが
って反応を進行する。本発明の目的を達成するため多く
の試験具が可能であり、当業者には明らかであることは
容易に理解されるであろう。

本発明方法の利点は、指示薬反応の前に試験試料から
所定量の被分析物を制御可能に減量しうることによる。
減量反応は、被分析物と共に共反応体が関与する酵素触
媒反応を使用することによって制御される。減量反応の
開始時に存在する共反応体の量及び反応における共反応
体と被分析物との間の化学量論的関係は、消費される被
分析物の量を決定する。所定の減量反応に望ましい共反
応体の量は、通常、実験により決定される。与えられた
試験組成物又は試験系に対して共反応体の臨界的量が決
定されれば、このような組成物又は試験具の製造にその
ような量を定量的にかつ再現可能に添加することは比較
的簡単なことである。

試験組成物中の共反応体の量の選択は、分析における
所望の効果に左右される。基本的には、二つの効果があ
り、その一つは、本発明の減量原理−自己表示及び改良
された目視分解によって得られる。自己表示の場合に
は、共反応体の量を、試料中に被分析物が予め選択した
濃度以上に存在しない限り特定の指示薬応答の発生を阻
止するのに充分な被分析物の量を消費するように選択す
る。使用者のイエス／ノー決定に対するカットオフとし
て役立つ指示薬応答は、目又は使用する機器によって検
出可能な閾値応答である。しかしながら、カットオフ応
答を、このような閾値以上の選択したレベルの応答、例
えば、肉眼で観察する場合にはある色相の発生又は色の
飽和、また、機器で色を検出する場合にはあるレベルの
吸光度に設定することができる。

１種の自己表示試験組成物を使用すると、被分析物が
一つの予め設定した被分析物濃度以上に存在するか否か
だけを使用者に知らせる。広範な定量を行うには、様々
な量の調節共反応体を含む試験組成物列を用いて、多数
の予め設定した被分析物濃度でイエス／ノー指示薬応答
を提供する。任意の数の試験具は、それだけの情報を示
す。例えば、被分析物の濃度を増加したときにカットオ
フレベルの指示薬応答、例えば閾値の検出可能な色を与
える試験組成物は、試験試料中の被分析物の量が増加す
るにしたがって数字又は他の幾何学的形状が現れるよう
に適応させることができる。例えば、予め選択した最初
の被分析物濃度を、試験具上に数字“1"の形で着色部分
を形成させるのに充分にすることができ、第二の被分析
物濃度を数字“1"及び“2"の形で着色部分を形成させる
のに充分にすることができる（米国特許第4,042,329号
明細書）。さらに例えば、増加する被分析物濃度に対し
て感受性のある自己表示試験組成物を、試験具上でピン
ホイール又は温度計効果を与えるように適合することが
できる（米国特許第4,654,310号明細書）。

改良された分解効果は、消費する必要のある被分析物
の量を見つけるため試験組成物中の共反応体の量を変動
させて、被分析物濃度の所望の範囲にわたる最適分解領
域に指示薬応答を移動させることによって得られる。こ
のような試験組成物によって得られる定量は、一つの試
験組成物を使用する状態について向上し、定量は、指示
薬応答の分解レベル、例えば色飽和の程度に左右され
る。

次に、実施例により本発明を説明するが、本発明はこ
れに制限されるものではない。

実施例１ この例は、下記のNADH減量反応の直線性を証明するも
のである： NADHは、診断上重要な被分析物、例えばグルコースの関
与する酵素反応の共通の生成物である。したがって、こ
のような減量反応は、本発明による自己表示又は改良さ
れた分解試験システムの製造に有用な手段として役立
つ。

NAD0.57mM、NADH0.15μＭ、ピルビン酸ナトリウム０
〜0.167mM、ジアホラーゼ0.67単位/ml、LDH0〜67単位/m
l、ヨードニトロテトラゾリウムクロリド（INT）0.5mM
及びpH7.5のHEPES0.1緩衝液を総量3ml中に含む混合物を
25℃でインキュベーションし、その間、ヒューレット・
パッカード・ダイオード・アレー・スペクトロフォトメ
ータ（Hewlett Packard Diode Array Spectrophotomete
r）、8451A型で504nm（セルの路長1cm）で吸光度を監視
した。

減量剤の不存在で発生するように設定した後、３種の
異なる特定濃度のLDH（0.67、6.7及び67単位/ml）を含
む混合物にピルビン酸ナトリウムの量を増加させて添加
した。５分インキュベーションした後の吸光度を減量剤
の不存在で得られた吸光度から控除し、その差をピルビ
ン酸塩濃度の関数としてプロットした（第４図）。

第４図は前記の液体分析計の応答に対する減量剤（ピ
ルビン酸塩）の量を増加する効果を説明するものであ
る。縦座標は、発色反応（INTがホルマザンに変換され
る）によって達成されるプラトー吸光度の減少を示す。
減量反応は、200単位のLDHを用いると、明らかに線状で
ある。分析混合物中のLDHの総量を２単位（ジアホラー
ゼ活性に対して1:1比）に減少すると、減量用量応答の
直線性は極めて悪化した。第４図におけるLDH200単位曲
線から得られる勾配は、理論的効率の約45.3％の減量に
相当する。

実施例２ この例は、本質的に不可逆的な減量反応を使用する利
点を証明するものである。不可逆性は、実施例１に使用
したピルビン酸塩/LDH減量反応に更に下記の反応を実施
することによって得られる： 実施例１の反応条件によるが、この実験においてはピ
ルビン酸塩濃度を0.1mMとし、LDHに対するLOXの量及び
比を第１表に示すように変更した。

結果を第５図及び第６図に示す。LOXの不存在では、L
DHレベルが高い程、プラトー吸光度値の上方移動が増加
した（反応４〜６）。この移動は、おそらく、最初の減
量反応後に発色反応が残りを消費すると、LDH反応が逆
転して付加的NADHを生じることによって起こったもので
ある。しかし、LOX濃度が増加すると、この傾向に反作
用し、移動を減少した（第６図、反応７〜９）。

実施例３ 自己表示分析 この例は、自己表示結果を生じるためグルコースに関
する液体分析システムの調製を説明するものである。

適切なNAD（0.1〜1.0mM）、種々の濃度のピルビン酸
ナトリウム、所望の時間間隔（0.5〜５分）以内に終点
を表示するのに充分な量のグルコースデヒドロゲナーゼ
及びジアホラーゼ、顕著な発色を起こす前に減量を完了
するのに充分な大過剰のLDH（ジアホラーゼ活性に比べ
て）、LDHの少なくとも２倍単位の乳酸モノオキシゲナ
ーゼ、0.1〜1.0mMヨードニトロテトラゾリウムクロリド
及び適切な緩衝液（例えば0.1HEPES、pH7.5）を含む反
応混合物を調製した。ピルビン酸塩濃度を、予め選択し
たグルコース濃度列と同等なNADHの量を除去するのに適
切であるように調節した。

この分析管列を調製する便利な方法は、すべての成分
を2.5mlの流体容量に混合することである。次に、グル
コース含有流体の試料（0.5ml）を各管に添加して総量
を3.0mlにする。混合し、室温で30秒〜５分インキュベ
ーションした後、各管において赤色の有無を観察する。
肉眼で測定して顕著な発色の存在は、試料中のグルコー
ス濃度がその与えられた管について予め選択した値を超
えていることを示す。

代表的結果を以下に示す。

前記の結果から、試料中のグルコース濃度が75〜100m
g/dlであると結論される。予め選択されたグルコース濃
度値は、所望の広さの判別範囲を生じるように選択する
ことができる。

実施例４ 改良された分解分析 この例は、リポアミド／リポアミドデヒドロゲナーゼ
/DTPO減量反応を使用して臨床的グルコーススケールの
異なる部分に最適目視分解領域をいかにして移動させう
るかを示すものである。

３層のゼラチン基質フィルムを用いてグルコース試験
ストリップを製造した。フィルムに下記の化学反応を組
み込んだ： GDH＝グルコースデヒドロゲナーゼ LA_ox＝リポアミド（酸化型） LA_red＝リポアミド（還元型） LADH＝リポアミドデヒドロゲナーゼ DTPO＝2,2′−ジチオ−ビス（ピリジン−Ｎ−オキシ
ド） INT＝２−（ｐ−インドフェニル）−３−（ｐ−ニトロ
フェニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロリド フィルム内で一次反応が起こる間、試料中に存在する
グルコースは、グルコースデヒドロゲナーゼの存在でNA
D⁺と反応してNADH及びグルコノラクトンを生成する。生
成したNADHは、次に減量反応でリポアミドと反応するか
又はINT及びジアホラーゼと反応して発色することがで
きる。フィルム内に存在するDTPOの濃度は、肉眼及び機
器で観察される色レベルの移動を決定する。

フィルムを下記のようにして製造した。

成分 量（ｇ） 第１層：ゼラチン（20％）、pH5.2 3.0 PVP（20％） 1.0 オリン（Olin）10G（４％） 0.5 水 5.5 INT 0.065 PVP＝ポリビニルピロリドン オリン10G＝アルキルフェノールアルコキシレート表面
活性剤〔アメリカ合衆国コネチカット州スタンフォード
のオリン・コーポレーション（Olin Corp.）〕 湿潤厚100μで注型 第２層：ゼラチン（20％）、pH5.2 3.0 PVP（20％） 1.0 オリン10G（４％） 0.5 MES緩衝液、1M、pH6.5 2.5 水 3.0 GDH、64単位/mg 0.060 NAD 0.060 BSA 0.040 LADH、132単位/mg 0.200 ジアホラーゼ、3.6単位/mg 0.200 リポアミド及びDTPO フィルムＡ＝LA0.0;DTPO0.0 フィルムＢ＝LA0.080g;DTPO0.0 フィルムＣ＝LA0.050g;DTPO0.010g フィルムＤ＝LA0.050g;DTPO0.020g フィルムＤ＝LA0.050g;DTPO0.030g MES＝２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸 BSA＝ウシ血清アルブミン 湿潤厚100μで注型 第３層：カルボジイミド 0.125 オリン10G（４％） 0.250 水 9.625 カルボジイミド＝１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド 湿潤厚24μで注型 第１層の成分をフラスコ中で与えられた順序で40〜45
℃で混合し、少なくとも15分攪拌した。次いで、溶液を
脱気し、PETフィルム基材〔アグファ−ゲベールト・ア
クチェン・ゲゼルシャフト（Agfa−Gevaert A.G.）、西
ドイツ国レバークゼン」上に湿潤厚100μで被覆した。
フィルムを40℃の乾燥器で乾燥した。同様に、第２溶液
を混合し、脱気し、湿潤厚100μで第１層上に被覆し
た。次いで、フィルムを40℃の乾燥器で乾燥した。第３
層は、次に、試料をフィルムの表面から除去することを
可能にするゼラチンを架橋する。フィルムをストリップ
に切断し、次に、グルコース試料と15秒反応させた。そ
の表面から試料を除去した後、ストリップを分析のため
マクベス（Macbeth）1500/プラス・クィック・キー・カ
ラー（Plus Quick key Color）分光光度計〔コルモーガ
ン・コーポレーション（Kollmorgan Corp.）、アメリカ
合衆国ニューヨーク州ニューバーグ〕に載せた。

マクベス分光光度計は、16の異なる波長で反応したス
トリップの反射データを集める。これらのデータを次に
各ストリップについて三次元カラースペース座標に変換
する。次いで、各色をカラースペース座標L^*、a^*及びb^*
で表すことができる。CIELABカラースペース〔“カラー
・イン・ビジネス，サイエンス・アンド・インダストリ
ィ（Color in Business,Science,and Industry）”、第
三版、ジュド（Judd）及びワイゼキィ（Wyszecki）（19
75）、320頁〕における二つの色の距離は、下記の式： 〔式中L^* ₁、a^* ₁及びb^* ₁は試料１のカラー座標であり、L
^* ₂、a^* ₂及びb^* ₂は試料２のカラー座標である。〕で表さ
れる。したがって、ΔＥの値が大きくなる程、２つの色
の差は大きくなる。一般的に言って、ほとんどの観察者
が色の差を区別するには、少なくとも５単位のΔＥが必
要である。しかし、これは、色及び観察者によって変動
する。

このΔＥの認識に基づいて、下記の第２表には上記の
各フィルムに関するグルコースレベルの間の色の差を示
す。この表は、最良の目視分解領域をDTPO成分の濃度増
加の関数として移動させる方法を示す。リポアミド及び
LADHが存在するが、DTPOが存在しない場合、フィルムＢ
の目視分解の移動はない。したがって、リポアミド、LA
DH及びDTPO減量法を用いて、最良の目視分解領域を、臨
床的グルコース範囲の異なる領域に移動することができ
る。これをさらに第７図に示す。このグラフにおいて、
各フィルムに関するスペクトル反応性曲線を示す。初期
INT曲線（フィルムＡ）及びリポアミド曲線（フィルム
Ｂ）は同様の経路をとることが判る。DTPOをリポアミド
及びLADHと共に添加すると、スペクトル曲線の移動が見
られる（フィルムＣ、Ｄ、Ｅ）。さらに、この系は不可
逆性になった。この減量化学法は、初期反応の一つにお
いてNADHを生成する他の被分析物に適用することができ
る。

本発明を具体的に説明し、上記の実施例について記載
した。本発明の精神及び範囲を逸脱することなく本発明
の変形及び変更を他に多数行いうることは明らかであ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の自己表示原理を説明するグラフ、第２
図は本発明の改良された分解原理を説明するグラフ、第
３図は自己表示の従来の反応速度法の原理を説明するグ
ラフ、第４図は実施例にさらに詳述した本発明に有用な
特定の減量反応の直線性を示すグラフ、第５図及び第６
図は実施例にさらに詳述した特定の減量反応における不
可逆性の効果を示すグラフ、第７図は発色試薬ストリッ
プの目視分解に対する本発明の減量反応の効果の研究結
果を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 バート・ウォルター アメリカ合衆国、インヂアナ 46635、 サウス・ベンド、ロンドンバリー・レー ン 16881 (72)発明者 マリー・エラン・ワーチャル アメリカ合衆国、インヂアナ 46561、 オセオラ、ジェファーソン・ロード 10272 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12Q 1/26 C12Q 1/527 G01N 31/22 ＷＰＩ／Ｌ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】指示薬の応答を測定することによって試験
   試料中の所定濃度の被分析物の存在を測定する分析方法
   において、 （ａ）試験試料と共に形成した反応混合物中の被分析物
   が調節共反応体との酵素触媒反応に関与して、実質的な
   指示薬応答を示さず、前記指示薬応答又はその発生を実
   質的に妨害しない生成物を形成する減量酵素反応を行
   い、その際、反応混合物中に存在する前記の調節共反応
   体の初期量を、前記減量反応によって所定量の被分析物
   を消費するのに化学量論的に充分なものとし、 （ｂ）その後、減量反応後に試験試料中に残留する被分
   析物と指示薬反応を行って、前記の検出可能な指示薬応
   答を示す生成物を形成させ、その際減量反応に消費され
   る被分析物の前記の所定量を、被分析物が試験試料中に
   前記の所定濃度以上で存在しない限り、前記の検出可能
   な指示薬応答の発生を防止するのに充分なものとし、 （ｃ）前記の指示薬反応が前記の検出可能な指示薬応答
   を生じるか否かを測定する 工程を含む被分析物の存在を測定する分析方法。
2. 【請求項２】前記の減量反応が本質的に不可逆的である
   請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】減量酵素触媒反応が反応混合物中の被分析
   物に対して本質的に特異的である請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】被分析物が試験試料中の測定すべき主物質
   の反応によって形成される中間生成物である請求項１記
   載の方法。
5. 【請求項５】特定の指示薬応答の測定によって試験試料
   中の所定濃度の被分析物の存在を測定するための試験組
   成物において、（ｉ）被分析物が調節共反応体との酵素
   触媒反応に関与して、実質的な指示薬応答を示さず、か
   つ前記指示薬応答又はその生成を実質的に妨害しない生
   成物を形成する減量酵素反応を形成する試薬及び（ii）
   被分析物と指示薬反応を行って、前記の検出可能な指示
   薬応答を示す生成物を形成させる試薬を含み、その際、
   減量反応試薬中に存在する前記の調節共反応体の量が化
   学量論的に充分であり、試験試料と試験組成物との接触
   により被分析物と共に行われる減量反応が充分に速く
   て、顕著な指示薬反応が起こる前に試験試料中の被分析
   物の所定量までが非反応性生成物に変換され、減量反応
   において非反応性生成物に変換される被分析物の前記所
   定量が、被分析物が試験試料中に前記の所定濃度以上に
   存在しない限り、前記の検出可能な指示薬応答の発生を
   防止するのに充分なものである被分析物の存在を測定す
   る試験組成物。
6. 【請求項６】前記の減量反応が本質的に不可逆的である
   請求項５記載の試験組成物。
7. 【請求項７】減量酵素触媒反応が反応混合物中の被分析
   物に対して本質的に特異的である請求項５記載の試験組
   成物。
8. 【請求項８】被分析物が試験試料中の測定すべき主物質
   の反応によって形成される中間生成物である請求項５記
   載の試験組成物。
9. 【請求項９】中間生成物として生じる被分析物がNADH、
   NADPH、グリセリン、ATP又は過酸化水素である請求項８
   記載の試験組成物。