JP2000102387A - 発光蛋白質発現組換えベクター、及びこの組換えベクターにより形質転換された酵母 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 発光蛋白質を酵母の細胞表面に発現させるこ
とのできる発光蛋白質発現組換えベクターを得る。 【解決手段】 発光蛋白質発現組換えベクターは、サッ
カロミセス属などの酵母由来のアグルチニン遺伝子断片
領域及び発光蛋白質をコードする遺伝子を含有する。ア
グルチニン遺伝子断片は、サッカロミセス属由来のα−
アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸をコードする
配列と４４６塩基からなる３′−非翻訳領域とを含むＤ
ＮＡ断片であってもよい。前記発光蛋白質には、オワン
クラゲ由来のグリーンフルオロセント蛋白質などが含ま
れる。前記組換えベクターにより形質転換された酵母で
は、細胞表面に発光蛋白質が発現する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、酵母の細胞表面上
に発光蛋白質を発現可能な組換えベクター、および該ベ
クターにより形質転換された酵母に関する。発光蛋白質
の発現する酵母はバイオセンサーや発酵時の計測等に利
用することができる。

【０００２】

【従来の技術】従来、組換えＤＮＡ技術を用いて酵母に
異種遺伝子を発現させ、種々の分野で利用することは行
われている。しかし、このような異種遺伝子が導入され
た酵母を物質変換やバイオセンサーなどに利用した場
合、物質の細胞透過が律速となり、十分な感度が得られ
なかったり、反応速度が遅いという問題があった。

【０００３】このような問題を解決するため、本発明者
らは 酵母の細胞表面にグルコアミラーゼやセルラーゼ
を組換えＤＮＡ技術を用いて発現させることに成功して
いる（Murai, T. et al., Applied and Environmental
Microbiology, 63, 1362-1366(1997)およびMurai, T. e
t al., Appl. Microbiol. Biotechnol, 48, 499-50
3）。

【０００４】一方、異種遺伝子として発光蛋白質を酵母
の細胞内で発現させる手法が報告されている（Terry,
B., R. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 21
7, 21-27(1995)）。しかし、この技術をバイオセンサー
などに利用するためには、細胞内から発光蛋白質を抽出
などで取り出し、さらに固定化する等の必要があった。
なお、発光蛋白質の固定化については特開平３−１５３
６９９号公報に開示されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、発光蛋白質を細胞内から取り出すことなく直接利用
可能とすべく、該発光蛋白質を酵母の細胞表面に発現さ
せることのできる発光蛋白質発現組換えベクターを提供
することにある。本発明の他の目的は、細胞表面に発光
蛋白質を発現する酵母を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
を達成するため鋭意検討を重ねた結果、組換えＤＮＡ技
術により特定の遺伝子を組み入れた組換えベクターを酵
母に導入すると、細胞表層部に発光蛋白質を発現する形
質転換体が得られることを見出し、本発明を完成した。

【０００７】すなわち、本発明は、酵母由来のアグルチ
ニン遺伝子断片領域及び発光蛋白質をコードする遺伝子
を含有する発光蛋白質発現組換えベクターを提供する。
前記アグルチニン遺伝子として、例えば、サッカロミセ
ス属由来のα−アグルチニン遺伝子を使用できる。アグ
ルチニン遺伝子断片は、サッカロミセス属由来のα−ア
グルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸をコードする配
列と４４６塩基からなる３′−非翻訳領域とを含むＤＮ
Ａ断片であってもよい。また、前記発光蛋白質には、オ
ワンクラゲ由来のグリーンフルオロセント蛋白質が含ま
れる。本発明は、また、前記の組換えベクターにより形
質転換された酵母を提供する。前記酵母には、サッカロ
ミセス属に属する酵母が含まれる。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明の発光蛋白質発現組換えベ
クターは、酵母由来のアグルチニン遺伝子断片領域及び
発光蛋白質をコードする遺伝子を含有している。

【０００９】アグルチニン遺伝子を取得するための酵母
としては、例えば、長谷川武治編著「微生物の分類と同
定」（学会出版センター、1975年）に酵母として記載さ
れている微生物群が挙げられる。なかでも、好適な酵母
はサッカロミセス属に属する酵母であり、例として、サ
ッカロミセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisia
e）ＭＴ８−１などを挙げることができる。酵母の詳細
な性質については、Tajima, M. et al., Yeast 1, 67-7
7(1985)に記載されている。

【００１０】前記アグルチニンはａ−アグルチニン及び
α−アグルチニンの何れであってもよい。なお、α−ア
グルチニンの分子構造は、Ｎ末端から順に、分泌シグナ
ル配列、アグルチニン活性領域、細胞表層内在領域及び
ＧＰＩアンカー（グリコシルホスファチジルイノシトー
ル）付着シグナル領域という構成を有する。

【００１１】アグルチニン遺伝子領域断片は、酵母の細
胞表層に異種蛋白を発現できる部分（細胞表層内在領域
を含む部分）であればよいが、特に好ましい例として、
サッカロミセス属由来のαーアグルチニンのＣ末端から
３２０アミノ酸をコードする遺伝子配列と４４６塩基か
らなる３′−非翻訳領域とを含むＤＮＡ断片を挙げるこ
とができる。このＤＮＡ断片にはＧＰＩアンカー付着シ
グナル領域が含まれている。このＤＮＡ断片は、Murai,
T. et al. Applied and Environmental Microbiology,
63, 1362-1366(1997)に記載されている該断片を含むプ
ラスミドｐＧＡ１１を制限酵素により切り出すことで得
ることもできる。

【００１２】前記発光蛋白質は発光、蛍光を発する蛋白
質であれば特に限定されず、例えば、ルシフェラーゼ、
エクオリン、グリーンフルオレセント蛋白質（ＧＦＰ）
などを例示できる。特に、オワンクラゲ由来のグリーン
フルオレセント蛋白質は、基質やコファクターを必要と
せず、生理機能を損なうことなく、生きている細胞や組
織中でも、また固定化された細胞や組織中でも、励起光
だけで蛍光を発することができるため好適である。オワ
ンクラゲ由来のグリーンフルオレセント蛋白質として
は、野生型グリーンフルオレセント蛋白質（wtＧＦ
Ｐ）、および励起光、蛍光の各々をシフトさせた変異体
の何れも利用することができる。該変異体の例として、
紫外シフト型グリーンフルオレセント蛋白質（ＧＦＰu
v）、レッドシフトグリーンフルオレセント蛋白質（rs
ＧＦＰ）およびブルーフルオレセント蛋白質（ＢＦＰ）
を挙げることができる。励起スペクトルと蛍光スペクト
ルがそれぞれ重なり合わない複数の変異体を利用して二
重染色を行うことも可能である。

【００１３】アグルチニン遺伝子断片領域および発光蛋
白質をコードする遺伝子を含む発光蛋白質発現ベクター
は、通常酵母で利用する発現ベクターに前記遺伝子を導
入することにより得ることができる。上記発現ベクター
の好適な例として、例えば、ｐＹＥ２２Ｍ（Sawani-Hat
anaka, H., T. et al., Biosci. Biotechnol. Bioche
m., 59, 1221-1228(1995)）、ｐＲＳ４０４（Robert,
S., S. and Philip Hieter, Genetics, 122, 19-27(198
9)）等を挙げることができる。

【００１４】本発明の発光蛋白質発現組換えベクター
は、通常、プロモーターおよび分泌シグナル領域（例え
ば、カビ由来の分泌シグナル領域）を含んでいる。前記
プロモーターとしては、通常酵母での発現に利用される
プロモーターであれば特に限定されないが、好適な例と
して、サッカロミセス セレビシエ（Saccharomyces ce
revisiae）のグリセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナ
ーゼ（ＧＡＰＤＨ）のプロモーター（Sawani-Hatanaka,
H., T. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 59,
1221-1228(1995)）を挙げることができる。また、前記
分泌シグナル領域としては、通常酵母での発現、分泌に
利用されるシグナル領域、例えば、リゾプス オリザエ
（Rhizopus oryzae）由来のグルコアミラーゼ遺伝子の
分泌シグナル領域を使用できる。上記プロモーターおよ
び分泌シグナル領域は、既知の方法により、例えば、プ
ラスミドｐＹＧＡ２２６９（Ashikari, T., N. et al.,
Agric. Biol. Chem., 50, 957-964）から得ることがで
きる。

【００１５】本発明の発光蛋白質発現組換えベクターの
好ましい態様では、分泌シグナル領域、発光蛋白質（例
えば、グリーンフルオレセント蛋白質）の構造遺伝子、
酵母由来のアグルチニン遺伝子断片領域（例えば、αー
アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸をコードする
遺伝子配列と４４６塩基からなる３′−非翻訳領域とを
含むＤＮＡ断片）をこの順序で有している。

【００１６】このような発光蛋白質発現組換えベクター
は、例えば、前記ｐＲＳ４０４などのプラスミドベクタ
ーに、前記プロモーター、分泌シグナル領域、マルチク
ローニングサイト及びアグルチニン遺伝子断片領域を、
この順に配列するように導入した後、前記分泌シグナル
領域とマルチクローニングサイトとの間に、発光蛋白質
の構造遺伝子を導入することにより構築できる。ベクタ
ーの構築には慣用の組換えＤＮＡ技術を利用できる。

【００１７】本発明において、上記発光蛋白質発現組換
えベクターによる形質転換の対象とされる酵母として
は、例えば、長谷川武治編著「微生物の分類と同定」
（学会出版センター、1975年）に酵母として記載されて
いる微生物群が挙げられる。なかでも、サッカロミセス
属に属する酵母が好ましく、その例として、サッカロミ
セス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＭＴ８
−１などを挙げることができる。酵母の詳細な性質につ
いては、Tajima, M. et al., Yeast 1, 67-77(1985)に
記載されている。

【００１８】酵母の形質転換は慣用の手法により行うこ
とができる。例えば、酵母から染色体ＤＮＡを単離し、
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法により、上記発光蛋
白質発現組換えベクターの遺伝子を導入できる。こうし
て得られた形質転換体は、細胞の表層部において発光蛋
白質を発現する。そのため、例えば、バイオセンサーや
発酵槽の計測に利用できる。

【００１９】

【実施例】以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細
に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定
されるものではない。

【００２０】実施例１（発光蛋白質発現組換えベクター
の作製） （１）ベクターｐＩＣＳＡ１の作製 プラスミドｐＹＧＡ２２６９（Ashikari, T., N. et a
l., Appl. Microbiol.Biotechnol., 30, 515-520(198
9)）を鋳型にして、下記の２つのプライマーＳＩＧ及び
ＳＩＧＲを用いてＰＣＲを行い、サッカロミセス セレ
ビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のグリセロ３リン
酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のプロモーターと、
リゾプス オリザエ（Rhizopus oryzae）のグルコアミ
ラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列からなるＤＮＡ断片を
増幅した。なお、下記の塩基配列において、ＳＩＧの下
線部はＳａｃＩ切断部位を示し、ＳＩＧＲの下線部はＳ
ａｃII切断部位を示す。

【００２１】SIG ：5′-CCGAGCTCAC CAGTTCTCAC ACGGAA
CA-3′（配列番号：１） SIGR：5′-GCCCGCGGCA GAAACGAGCA AAGAAAA-3′（配列
番号：２） 上記のＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｃＩとＳａｃIIとで切
断し、ＳａｃＩ−ＳａｃII断片を得た。

【００２２】次に、プラスミドにＳａｃIIサイトを導入
するために、以下に示す２つのオリゴヌクレオチドを合
成し、この２つのオリゴヌクレオチドをアニールさせ
て、ＳａｃII−ＸｈｏＩＤＮＡ断片を作製した。

【００２３】 5′-GGAGATCTCCATGGC-3′（配列番号：３） 5′-TCGAGCCATGGAGATCTCCGC-3′（配列番号：４） さらに、αーアグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸
をコードする遺伝子と、４４６塩基からなる３′−非翻
訳領域を含むＤＮＡ断片を得るために、プラスミドｐＧ
Ａ１１（Murai, T. et al. Applied and Environmental
Microbiology,63, 1362-1366(1997)）から、XhoＩとKp
nＩの２つの制限酵素でＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ断片を切り
出した。

【００２４】上記で得られたＳａｃＩ−ＳａｃII断片と
ＳａｃII− ＸｈｏＩ断片とＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ断片と
を、プラスミドｐＲＳ４０４（Robert, S., S. and Phi
lipHieter, Genetics, 122, 19-27(1989)）のそれぞれ
のサイトに順次導入し、ベクターｐＩＣＳＡ１を得た。
プラスミドｐＲＳ４０４に挿入されたＤＮＡ断片の塩基
配列（配列番号：５）を下記に示す。

【００２５】なお、この塩基配列において、第１番目の
塩基Ｔから第６７６番目の塩基Ｃまでの配列はプロモー
ター部位を示し、第６７７番目の塩基Ａから第７４９番
目の塩基Ｇまでの配列はグルコアミラーゼ遺伝子の分泌
シグナル配列を示し、第７５０番目の塩基Ｃから第７７
１番目の塩基Ｇまでの配列は導入したＳａｃIIを含む断
片を示し、第７７２番目の塩基Ａから第２１８６番目の
塩基Ｃまでの配列は３′側の半分のα−アグルチニン遺
伝子を示す。また、第６７１番目の塩基Ｇから第６７６
番目の塩基ＣまではＥｃｏＲＩ切断部位、第７５０番目
の塩基Ｃから第７５５番目の塩基ＧまではＳａｃII切断
部位、第２１８１番目の塩基Ｇから第２１８６番目の塩
基ＣまではＫｐｎＩ切断部位を示す。

【００２６】 5′- TCGAGTTTAT CATTATCAAT ACTCGCCATT TCAAAGAATA CGTAAATAAT TAATAGTAGT 60 GATTTTCCTA ACTTTATTTA GTCAAAAAAT TAGCCTTTTA ATTCTGCTGT AACCCGTACA 120 TGCCAAAATA GGGGGCGGGT TACACAGAAT ATATAACACT GATGGTGCTT GGGTGAACAG 180 GTTTATTCCT GGCATCCACT AAATATAATG GAGCCCGCTT TTTAAGCTGG CATCCAGAAA 240 AAAAAAGAAT CCCAGCACCA AAATATTGTT TTCTTCACCA ACCATCAGTT CATAGGTCCA 300 TTCTCTTAGC GCAACTACAG AGAACAGGGC ACAAACAGGC AAAAAACGGG CACAACCTCA 360 ATGGAGTGAT GCAACCTGCC TGGAGTAAAT GATGACACAA GGCAATTGAC CCACGCATGT 420 ATCTATCTCA TTTTCTTACA CCTTCTATTA CCTTCTGCTC TCTCTGATTT GGAAAAAGCT 480 GAAAAAAAAG GTTTAAACCA GTTCCCTGAA ATTATTCCCC TACTTGACTA ATAAGTATAT 540 AAAGACGGTA GGTATTGATT GTAATTCTGT AAATCTATTT CTTAAACTTC TTAAATTCTA 600 CTTTTATAGT TAGTCTTTTT TTTAGTTTTA AAACACCAAG AACTTAGTTT CGAATAAACA 660 CACATAAATA GAATTCATGC AACTGTTCAA TTTGCCATTG AAAGTTTCAT TCTTTCTCGT 720 CCTCTCTTAC TTTTCTTTGC TCGTTTCTGC CGCGGAGATC TCCATGGCTC GAGCGCCAAA 780 AGCTCTTTTA TCTCAACCAC TACTACTGAT TTAACAAGTA TAAACACTAG TGCGTATTCC 840 ACTGGATCCA TTTCCACAGT AGAAACAGGC AATCGAACTA CATCAGAAGT GATCAGTCAT 900 GTGGTGACTA CCAGCACAAA ACTGTCTCCA ACTGCTACTA CCAGCCTGAC AATTGCACAA 960 ACCAGTATCT ATTCTACTGA CTCAAATATC ACAGTAGGAA CAGATATTCA CACCACATCA 1020 GAAGTGATTA GTGATGTGGA AACCATTAGC AGAGAAACAG CTTCGACCGT TGTAGCCGCT 1080 CCAACCTCAA CAACTGGATG GACAGGCGCT ATGAATACTT ACATCCCGCA ATTTACATCC 1140 TCTTCTTTCG CAACAATCAA CAGCACACCA ATAATCTCTT CATCAGCAGT ATTTGAAACC 1200 TCAGATGCTT CAATTGTCAA TGTGCACACT GAAAATATCA CGAATACTGC TGCTGTTCCA 1260 TCTGAAGAGC CCACTTTTGT AAATGCCACG AGAAACTCCT TAAATTCCTT CTGCAGCAGC 1320 AAACAGCCAT CCAGTCCCTC ATCTTATACG TCTTCCCCAC TCGTATCGTC CCTCTCCGTA 1380 AGCAAAACAT TACTAAGCAC CAGTTTTACG CCTTCTGTGC CAACATCTAA TACATATATC 1440 AAAACGGAAA ATACGGGTTA CTTTGAGCAC ACGGCTTTGA CAACATCTTC AGTTGGCCTT 1500 AATTCTTTTA GTGAAACAGC ACTCTCATCT CAGGGAACGA AAATTGACAC CTTTTTAGTG 1560 TCATCCTTGA TCGCATATCC TTCTTCTGCA TCAGGAAGCC AATTGTCCGG TATCCAACAG 1620 AATTTCACAT CAACTTCTCT CATGATTTCA ACCTATGAAG GTAAAGCGTC TATATTTTTC 1680 TCAGCTGAGC TCGGTTCGAT CATTTTTCTG CTTTTGTCGT ACCTGCTATT CTAAAACGGG 1740 TACTGTACAG TTAGTACATT GAGTCGAAAT ATACGAAATT ATTGTTCATA ATTTTCATCC 1800 TGGCTCTTTT TTTCTTCAAC CATAGTTAAA TGGACAGTTC ATATCTTAAA CTCTAATAAT 1860 ACTTTTCTAG TTCTTATCCT TTTCCGTCTC ACCGCAGATT TTATCATAGT ATTAAATTTA 1920 TATTTTGTTC GTAAAAAGAA AAATTTGTGA GCGTTACCGC TCGTTTCATT ACCCGAAGGC 1980 TGTTTCAGTA GACCACTGAT TAAGTAAGTA GATGAAAAAA TTTCATCACC ATGAAAGAGT 2040 TCGATGAGAG CTACTTTTTC AAATGCTTAA CAGCTAACCG CCATTCAATA ATGTTACGTT 2100 CTCTTCATTC TGCGGCTACG TTATCTAACA AGAGGTTTTA CTCTCTCATA TCTCATTCAA 2160 ATAGAAAGAA CATAATCAAA GGTACC-3′ 2186（配列番号：５）。

【００２７】（２）発光蛋白質発現組換えベクターｐＩ
ＣＳ：ＧＦＰの作製 上記で得られたベクターｐＩＣＳＡ１に、３つの異なっ
た励起並びに発光波長を持つＧＦＰ遺伝子、すなわち、
紫外シフト型グリーンフルオレセント蛋白質（ＧＦＰu
v）遺伝子、レッドシフトグリーンフルオレセント蛋白
質（rsＧＦＰ）遺伝子及びブルーフルオレセント蛋白質
（ＢＦＰ）遺伝子を以下のようにして導入し、発光蛋白
質発現組換えベクターｐＩＣＳ：ＧＦＰを得た。その構
築図を図１に示す。なお、各ＧＦＰ変異体の変異部位を
表１に、励起波長及び蛍光波長を表２に示した。表中、
wtＧＦＰは野生型グリーンフルオレセント蛋白質を意味
する。

【００２８】

【表１】

【表２】 プラスミドｐＧＦＰuv（ＧＦＰuv遺伝子を含む；クロー
ンテック社製）、プラスミドｐＱＢ１６３（rsＧＦＰ遺
伝子を含む；Ｔａｋａｒａ社製）、プラスミドｐＱＢ１
６７（ＢＦＰ遺伝子を含む；Ｔａｋａｒａ社製）の各プ
ラスミドから、それぞれのＧＦＰ遺伝子を増幅するため
に、下記の２つのプライマーを合成し、この２つのプラ
イマーを用いてＰＣＲを行った。なお、下記塩基配列の
下線部は、何れもＳａｃII切断部位を示す。

【００２９】5′-GTAGCCGCGG GGAGTAAAGG AGAAGACTTT T
CAC-3′（配列番号：６） 5′-GTAGCCGCGG CCTTTGTAGA GCTCATCATG C-3′（配列番
号：７） 得られた断片をＳａｃIIで切断し、得られたＳａｃII−
ＳａｃII断片をＧＦＰ遺伝子として用いた。

【００３０】次に、上記（１）で得られたプラスミドｐ
ＩＣＡＳ１をＳａｃIIで切断し、アルカリフォスファタ
ーゼ処理した後、ＤＮＡリガーゼで各ＧＦＰ遺伝子と結
合させて、発光蛋白質ＧＦＰを細胞表面に発現するプラ
スミドベクターｐＩＣＳ：ＧＦＰを完成した。この組換
えベクターは、分泌シグナル配列、ＧＦＰの構造遺伝子
配列、αーアグルチニンの一部の配列およびＧＰＩアン
カー付着シグナル配列をこの順で有している。

【００３１】ＧＦＰ遺伝子としてＧＦＰuv遺伝子を導入
したプラスミドｐＩＣＳ：ＧＦＰの一部の塩基配列（配
列番号：８）を以下に示す。なお、この塩基配列におい
て、第１番目の塩基Ｔから第６７６番目の塩基Ｃまでの
配列はプロモーター部位を示し、第６７７番目の塩基Ａ
から第７４９番目の塩基Ｇまでの配列はグルコアミラー
ゼ遺伝子の分泌シグナル配列を示し、第７５８番目の塩
基Ａから第１４７１番目の塩基Ａまでの配列はＧＦＰuv
遺伝子を示し、第１４９６番目の塩基Ａから第２９１０
番目の塩基Ｃまでの配列は３′側の半分のα−アグルチ
ニン遺伝子を示す。

【００３２】 5′- TCGAGTTTAT CATTATCAAT ACTCGCCATT TCAAAGAATA CGTAAATAAT TAATAGTAGT 60 GATTTTCCTA ACTTTATTTA GTCAAAAAAT TAGCCTTTTA ATTCTGCTGT AACCCGTACA 120 TGCCAAAATA GGGGGCGGGT TACACAGAAT ATATAACACT GATGGTGCTT GGGTGAACAG 180 GTTTATTCCT GGCATCCACT AAATATAATG GAGCCCGCTT TTTAAGCTGG CATCCAGAAA 240 AAAAAAGAAT CCCAGCACCA AAATATTGTT TTCTTCACCA ACCATCAGTT CATAGGTCCA 300 TTCTCTTAGC GCAACTACAG AGAACAGGGC ACAAACAGGC AAAAAACGGG CACAACCTCA 360 ATGGAGTGAT GCAACCTGCC TGGAGTAAAT GATGACACAA GGCAATTGAC CCACGCATGT 420 ATCTATCTCA TTTTCTTACA CCTTCTATTA CCTTCTGCTC TCTCTGATTT GGAAAAAGCT 480 GAAAAAAAAG GTTTAAACCA GTTCCCTGAA ATTATTCCCC TACTTGACTA ATAAGTATAT 540 AAAGACGGTA GGTATTGATT GTAATTCTGT AAATCTATTT CTTAAACTTC TTAAATTCTA 600 CTTTTATAGT TAGTCTTTTT TTTAGTTTTA AAACACCAAG AACTTAGTTT CGAATAAACA 660 CACATAAATA GAATTCATGC AACTGTTCAA TTTGCCATTG AAAGTTTCAT TCTTTCTCGT 720 CCTCTCTTAC TTTTCTTTGC TCGTTTCTGC CGCGGGG ATG AGT AAA GGA GAA GAA 775 Met Ser Lys Gly Glu Glu CTT TTC ACT GGA GTT GTC CCA ATT CTT GTT GAA TTA GAT GGT GAT GTT 823 Thr Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Thr Val Glu Leu Asp Gly Asp Val AAT GGG CAC AAA TTT TCT GTC AGT GGA GAG GGT GAA GGT GAT GCA ACA 871 Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr TAC GGA AAA CTT ACC CTT AAA TTT ATT TGC ACT ACT GGA AAA CTA CCT 919 Tyr Gly Lys Thr Thr Thr Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Thr Pro GTT CCA TGG CCA ACA CTT GTC ACT ACT TTC TCT TAT GGT GTT CAA TGC 967 Val Pro Trp Pro Thr Thr Val Thr Thr Phe Ser Tyr Gly Val Gln Cys TTT TCC CGT TAT CCG GAT CAT ATG AAA CGG CAT GAC TTT TTC AAG AGT 1015 Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg His Asp Phe Phe Lys Ser GCC ATG CCC GAA GGT TAT GTA CAG GAA CGC ACT ATA TCT TTC AAA GAT 1063 Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Met Ser Phe Lys Asp GAC GGG AAC TAC AAG ACG CGT GCT GAA GTC AAG TTT GAA GGT GAT ACC 1111 Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr CTT GTT AAT CGT ATC GAG TTA AAA GGT ATT GAT TTT AAA GAA GAT GGA 1159 Thr Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly AAC ATT CTC GGA CAC AAA CTC GAG TAC AAC TAT AAC TCA CAC AAT GTA 1207 Asn Ile Thr Gly His Lys Thr Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val TAC ATC ACG GCA GAC AAA CAA AAG AAT GGA ATC AAA GCT AAC TTC AAA 1255 Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys ATT CGC CAC AAC ATT GAA GAT GGA TCC GTT CAA CTA GCA GAC CAT TAT 1303 Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Thr Ala Asp His Tyr CAA CAA AAT ACT CCA ATT GGC GAT GGC CCT GTC CTT TTA CCA GAC AAC 1351 Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Thr Leu Pro Asp Asn CAT TAC CTG TCG ACA CAA TCT GCC CTT TCG AAA GAT CCC AAC GAA AAG 1399 His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Thr Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys CGT GAC CAC ATG GTC CTT CTT GAG TTT GTA ACT GCT GCT GGG ATT ACA 1447 Arg Asp His Met Val Thr Thr Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr CAT GGC ATG GAT GAG CTC TAC AAA GGCCGCGGAG ATCTCCATGG CTCGAGCGCC 1501 His Gly Met Asp Glu Thr Tyr Lys AAAAGCTCTT TTATCTCAAC CACTACTACT GATTTAACAA GTATAAACAC TAGTGCGTAT 1561 TCCACTGGAT CCATTTCCAC AGTAGAAACA GGCAATCGAA CTACATCAGA AGTGATCAGT 1621 CATGTGGTGA CTACCAGCAC AAAACTGTCT CCAACTGCTA CTACCAGCCT GACAATTGCA 1681 CAAACCAGTA TCTATTCTAC TGACTCAAAT ATCACAGTAG GAACAGATAT TCACACCACA 1741 TCAGAAGTGA TTAGTGATGT GGAAACCATT AGCAGAGAAA CAGCTTCGAC CGTTGTAGCC 1801 GCTCCAACCT CAACAACTGG ATGGACAGGC GCTATGAATA CTTACATCCC GCAATTTACA 1861 TCCTCTTCTT TCGCAACAAT CAACAGCACA CCAATAATCT CTTCATCAGC AGTATTTGAA 1921 ACCTCAGATG CTTCAATTGT CAATGTGCAC ACTGAAAATA TCACGAATAC TGCTGCTGTT 1981 CCATCTGAAG AGCCCACTTT TGTAAATGCC ACGAGAAACT CCTTAAATTC CTTCTGCAGC 2041 AGCAAACAGC CATCCAGTCC CTCATCTTAT ACGTCTTCCC CACTCGTATC GTCCCTCTCC 2101 GTAAGCAAAA CATTACTAAG CACCAGTTTT ACGCCTTCTG TGCCAACATC TAATACATAT 2161 ATCAAAACGG AAAATACGGG TTACTTTGAG CACACGGCTT TGACAACATC TTCAGTTGGC 2221 CTTAATTCTT TTAGTGAAAC AGCACTCTCA TCTCAGGGAA CGAAAATTGA CACCTTTTTA 2281 GTGTCATCCT TGATCGCATA TCCTTCTTCT GCATCAGGAA GCCAATTGTC CGGTATCCAA 2341 CAGAATTTCA CATCAACTTC TCTCATGATT TCAACCTATG AAGGTAAAGC GTCTATATTT 2401 TTCTCAGCTG AGCTCGGTTC GATCATTTTT CTGCTTTTGT CGTACCTGCT ATTCTAAAAC 2461 GGGTACTGTA CAGTTAGTAC ATTGAGTCGA AATATACGAA ATTATTGTTC ATAATTTTCA 2521 TCCTGGCTCT TTTTTTCTTC AACCATAGTT AAATGGACAG TTCATATCTT AAACTCTAAT 2581 AATACTTTTC TAGTTCTTAT CCTTTTCCGT CTCACCGCAG ATTTTATCAT AGTATTAAAT 2641 TTATATTTTG TTCGTAAAAA GAAAAATTTG TGAGCGTTAC CGCTCGTTTC ATTACCCGAA 2701 GGCTGTTTCA GTAGACCACT GATTAAGTAA GTAGATGAAA AAATTTCATC ACCATGAAAG 2761 AGTTCGATGA GAGCTACTTT TTCAAATGCT TAACAGCTAA CCGCCATTCA ATAATGTTAC 2821 GTTCTCTTCA TTCTGCGGCT ACGTTATCTA ACAAGAGGTT TTACTCTCTC ATATCTCATT 2881 CAAATAGAAA GAACATAATC AAAGGTACC-3′ 2910（配列番号：８）。

【００３３】実施例２（細胞表層にＧＦＰを発現提示す
る酵母の作製） 実施例１で得られた各プラスミドｐＩＣＳ：ＧＦＰをＸ
ｂａＩで切断し、直鎖状にしてエレクトロポレーション
法により酵母サッカロミセス セレビシエ（Saccharomy
ses cerevisiae）ＭＴ８−１に導入した。これを、ウラ
シル、ヒスチジン、アデニン、ロイシンを含む下記のＳ
Ｄ−Ｗ寒天培地で培養し、生育した酵母を選択した。

【００３４】 酵母−nitrogen base W/O/amino acid ６．７g/l グルコース ２０g/l アガロース ２０g/l ウラシル ２０mg/l ヒスチジン ２０mg/l アデニン ２０mg/l ロイシン ３０mg/l この酵母はｐＩＣＳ：ＧＦＰの遺伝子を有しており、サ
ッカロミセス セレビシエ（Saccharomyses cerevisia
e）ＭＴ８−１（ｐＩＣＳ：ＧＦＰ）と名づけた。得ら
れた酵母をＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ペプ
トン、２％グルコース）で培養し、遠心分離して培地と
菌体とに分離し、それぞれのＧＦＰの蛍光を測定した。
なお、コントロールとしてサッカロミセス セレビシエ
（Saccharomyses cerevisiae）ＭＴ８−１を用いた。

【００３５】その結果、コントロールでは、培地及び菌
体にＧＦＰの蛍光が認められなかったのに対し、形質転
換された酵母サッカロミセス セレビシエ（Saccharomy
sescerevisiae）ＭＴ８−１（ｐＩＣＳ：ＧＦＰ）で
は、培地中にはＧＦＰは認められず、菌体にＧＦＰの蛍
光が認められた。同様の結果は共焦点レーザー顕微鏡で
も確認され、各ＧＦＰが酵母の細胞表層で発現している
ことが確かめられた。

【００３６】

【発明の効果】本発明の発光蛋白質発現組換えベクター
によれば、発光蛋白質を酵母の細胞表面に発現させるこ
とができ、発光蛋白質を細胞内から取り出すことなく直
接利用できる。また、本発明の酵母によれば、前記発光
蛋白質発現組換えベクターにより形質転換されているの
で、細胞表面に発光蛋白質が発現する。

【００３７】

【配列表】 ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ <110> DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES, LTD. <120> Luminescence Protein Expression Recombinant Vector and Yeast tran- sformed with Said Recombinant Vector <130> P98DC059 <160> 8 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> primer bind <222> (1)...(28) <400> 1 ccgagctcac cagttctcac acggaaca 28 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> primer bind <222> (1)...(27) <400> 2 gcccgcggca gaaacgagca aagaaaa 27 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_recomb <222> (1)...(15) <400> 3 ggagatctcc atggc 15 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_recomb <222> (1)...(21) <400> 4 tcgagccatg gagatctccg c 21 <210> 5 <211> 2186 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> CDS <222> (772)...(2186) <400> 5 tcgagtttat cattatcaat actcgccatt tcaaagaata cgtaaataat taatagtagt 60 gattttccta actttattta gtcaaaaaat tagcctttta attctgctgt aacccgtaca 120 tgccaaaata gggggcgggt tacacagaat atataacact gatggtgctt gggtgaacag 180 gtttattcct ggcatccact aaatataatg gagcccgctt tttaagctgg catccagaaa 240 aaaaaagaat cccagcacca aaatattgtt ttcttcacca accatcagtt cataggtcca 300 ttctcttagc gcaactacag agaacagggc acaaacaggc aaaaaacggg cacaacctca 360 atggagtgat gcaacctgcc tggagtaaat gatgacacaa ggcaattgac ccacgcatgt 420 atctatctca ttttcttaca ccttctatta ccttctgctc tctctgattt ggaaaaagct 480 gaaaaaaaag gtttaaacca gttccctgaa attattcccc tacttgacta ataagtatat 540 aaagacggta ggtattgatt gtaattctgt aaatctattt cttaaacttc ttaaattcta 600 cttttatagt tagtcttttt tttagtttta aaacaccaag aacttagttt cgaataaaca 660 cacataaata gaattcatgc aactgttcaa tttgccattg aaagtttcat tctttctcgt 720 cctctcttac ttttctttgc tcgtttctgc cgcggagatc tccatggctc gagcgccaaa 780 agctctttta tctcaaccac tactactgat ttaacaagta taaacactag tgcgtattcc 840 actggatcca tttccacagt agaaacaggc aatcgaacta catcagaagt gatcagtcat 900 gtggtgacta ccagcacaaa actgtctcca actgctacta ccagcctgac aattgcacaa 960 accagtatct attctactga ctcaaatatc acagtaggaa cagatattca caccacatca 1020 gaagtgatta gtgatgtgga aaccattagc agagaaacag cttcgaccgt tgtagccgct 1080 ccaacctcaa caactggatg gacaggcgct atgaatactt acatcccgca atttacatcc 1140 tcttctttcg caacaatcaa cagcacacca ataatctctt catcagcagt atttgaaacc 1200 tcagatgctt caattgtcaa tgtgcacact gaaaatatca cgaatactgc tgctgttcca 1260 tctgaagagc ccacttttgt aaatgccacg agaaactcct taaattcctt ctgcagcagc 1320 aaacagccat ccagtccctc atcttatacg tcttccccac tcgtatcgtc cctctccgta 1380 agcaaaacat tactaagcac cagttttacg ccttctgtgc caacatctaa tacatatatc 1440 aaaacggaaa atacgggtta ctttgagcac acggctttga caacatcttc agttggcctt 1500 aattctttta gtgaaacagc actctcatct cagggaacga aaattgacac ctttttagtg 1560 tcatccttga tcgcatatcc ttcttctgca tcaggaagcc aattgtccgg tatccaacag 1620 aatttcacat caacttctct catgatttca acctatgaag gtaaagcgtc tatatttttc 1680 tcagctgagc tcggttcgat catttttctg cttttgtcgt acctgctatt ctaaaacggg 1740 tactgtacag ttagtacatt gagtcgaaat atacgaaatt attgttcata attttcatcc 1800 tggctctttt tttcttcaac catagttaaa tggacagttc atatcttaaa ctctaataat 1860 acttttctag ttcttatcct tttccgtctc accgcagatt ttatcatagt attaaattta 1920 tattttgttc gtaaaaagaa aaatttgtga gcgttaccgc tcgtttcatt acccgaaggc 1980 tgtttcagta gaccactgat taagtaagta gatgaaaaaa tttcatcacc atgaaagagt 2040 tcgatgagag ctactttttc aaatgcttaa cagctaaccg ccattcaata atgttacgtt 2100 ctcttcattc tgcggctacg ttatctaaca agaggtttta ctctctcata tctcattcaa 2160 atagaaagaa cataatcaaa ggtacc 2186 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> primer bind <222> (1)...(34) <400> 6 gtagccgcgg ggagtaaagg agaagacttt tcac <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> primer bind <222> (1)...(31) <400> 7 gtagccgcgg cctttgtaga gctcatcatg c <210> 8 <211> 2910 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> CDS <222> (758)...(1471) <400> 8 tcgagtttat cattatcaat actcgccatt tcaaagaata cgtaaataat taatagtagt 60 gattttccta actttattta gtcaaaaaat tagcctttta attctgctgt aacccgtaca 120 tgccaaaata gggggcgggt tacacagaat atataacact gatggtgctt gggtgaacag 180 gtttattcct ggcatccact aaatataatg gagcccgctt tttaagctgg catccagaaa 240 aaaaaagaat cccagcacca aaatattgtt ttcttcacca accatcagtt cataggtcca 300 ttctcttagc gcaactacag agaacagggc acaaacaggc aaaaaacggg cacaacctca 360 atggagtgat gcaacctgcc tggagtaaat gatgacacaa ggcaattgac ccacgcatgt 420 atctatctca ttttcttaca ccttctatta ccttctgctc tctctgattt ggaaaaagct 480 gaaaaaaaag gtttaaacca gttccctgaa attattcccc tacttgacta ataagtatat 540 aaagacggta ggtattgatt gtaattctgt aaatctattt cttaaacttc ttaaattcta 600 cttttatagt tagtcttttt tttagtttta aaacaccaag aacttagttt cgaataaaca 660 cacataaata gaattcatgc aactgttcaa tttgccattg aaagtttcat tctttctcgt 720 cctctcttac ttttctttgc tcgtttctgc cgcgggg atg agt aaa gga gaa gaa 775 Met Ser Lys Gly Glu Glu ctt ttc act gga gtt gtc cca att ctt gtt gaa tta gat ggt gat gtt 823 Thr Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Thr Val Glu Leu Asp Gly Asp Val aat ggg cac aaa ttt tct gtc agt gga gag ggt gaa ggt gat gca aca 871 Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr tac gga aaa ctt acc ctt aaa ttt att tgc act act gga aaa cta cct 919 Tyr Gly Lys Thr Thr Thr Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Thr Pro gtt cca tgg cca aca ctt gtc act act ttc tct tat ggt gtt caa tgc 967 Val Pro Trp Pro Thr Thr Val Thr Thr Phe Ser Tyr Gly Val Gln Cys ttt tcc cgt tat ccg gat cat atg aaa cgg cat gac ttt ttc aag agt 1015 Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg His Asp Phe Phe Lys Ser gcc atg ccc gaa ggt tat gta cag gaa cgc act ata tct ttc aaa gat 1063 Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Met Ser Phe Lys Asp gac ggg aac tac aag acg cgt gct gaa gtc aag ttt gaa ggt gat acc 1111 Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr ctt gtt aat cgt atc gag tta aaa ggt att gat ttt aaa gaa gat gga 1159 Thr Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly aac att ctc gga cac aaa ctc gag tac aac tat aac tca cac aat gta 1207 Asn Ile Thr Gly His Lys Thr Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val tac atc acg gca gac aaa caa aag aat gga atc aaa gct aac ttc aaa 1255 Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys att cgc cac aac att gaa gat gga tcc gtt caa cta gca gac cat tat 1303 Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Thr Ala Asp His Tyr caa caa aat act cca att ggc gat ggc cct gtc ctt tta cca gac aac 1351 Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Thr Leu Pro Asp Asn cat tac ctg tcg aca caa tct gcc ctt tcg aaa gat ccc aac gaa aag 1399 His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Thr Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys cgt gac cac atg gtc ctt ctt gag ttt gta act gct gct ggg att aca 1447 Arg Asp His Met Val Thr Thr Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr cat ggc atg gat gag ctc tac aaa ggccgcggag atctccatgg ctcgagcgcc 1501 His Gly Met Asp Glu Thr Tyr Lys aaaagctctt ttatctcaac cactactact gatttaacaa gtataaacac tagtgcgtat 1561 tccactggat ccatttccac agtagaaaca ggcaatcgaa ctacatcaga agtgatcagt 1621 catgtggtga ctaccagcac aaaactgtct ccaactgcta ctaccagcct gacaattgca 1681 caaaccagta tctattctac tgactcaaat atcacagtag gaacagatat tcacaccaca 1741 tcagaagtga ttagtgatgt ggaaaccatt agcagagaaa cagcttcgac cgttgtagcc 1801 gctccaacct caacaactgg atggacaggc gctatgaata cttacatccc gcaatttaca 1861 tcctcttctt tcgcaacaat caacagcaca ccaataatct cttcatcagc agtatttgaa 1921 acctcagatg cttcaattgt caatgtgcac actgaaaata tcacgaatac tgctgctgtt 1981 ccatctgaag agcccacttt tgtaaatgcc acgagaaact ccttaaattc cttctgcagc 2041 agcaaacagc catccagtcc ctcatcttat acgtcttccc cactcgtatc gtccctctcc 2101 gtaagcaaaa cattactaag caccagtttt acgccttctg tgccaacatc taatacatat 2161 atcaaaacgg aaaatacggg ttactttgag cacacggctt tgacaacatc ttcagttggc 2221 cttaattctt ttagtgaaac agcactctca tctcagggaa cgaaaattga caccttttta 2281 gtgtcatcct tgatcgcata tccttcttct gcatcaggaa gccaattgtc cggtatccaa 2341 cagaatttca catcaacttc tctcatgatt tcaacctatg aaggtaaagc gtctatattt 2401 ttctcagctg agctcggttc gatcattttt ctgcttttgt cgtacctgct attctaaaac 2461 gggtactgta cagttagtac attgagtcga aatatacgaa attattgttc ataattttca 2521 tcctggctct ttttttcttc aaccatagtt aaatggacag ttcatatctt aaactctaat 2581 aatacttttc tagttcttat ccttttccgt ctcaccgcag attttatcat agtattaaat 2641 ttatattttg ttcgtaaaaa gaaaaatttg tgagcgttac cgctcgtttc attacccgaa 2701 ggctgtttca gtagaccact gattaagtaa gtagatgaaa aaatttcatc accatgaaag 2761 agttcgatga gagctacttt ttcaaatgct taacagctaa ccgccattca ataatgttac 2821 gttctcttca ttctgcggct acgttatcta acaagaggtt ttactctctc atatctcatt 2881 caaatagaaa gaacataatc aaaggtacc 2910

【図面の簡単な説明】

【図１】発光蛋白質発現組換えベクターｐＩＣＳ：ＧＦ
Ｐの構築図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA04 CA07 DA12 EA04 HA11 4B065 AA79X AA79Y AA90Y AB01 AC20 BA02 CA24 CA46

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 酵母由来のアグルチニン遺伝子断片領域
   及び発光蛋白質をコードする遺伝子を含有する発光蛋白
   質発現組換えベクター。
2. 【請求項２】 アグルチニン遺伝子がサッカロミセス属
   由来のα−アグルチニン遺伝子である請求項１記載の組
   換えベクター。
3. 【請求項３】 アグルチニン遺伝子断片が、サッカロミ
   セス属由来のα−アグルチニンのＣ末端から３２０アミ
   ノ酸をコードする配列と４４６塩基からなる３′−非翻
   訳領域とを含むＤＮＡ断片である請求項１記載の組換え
   ベクター。
4. 【請求項４】 発光蛋白質がオワンクラゲ由来のグリー
   ンフルオロセント蛋白質である請求項１記載の組換えベ
   クター。
5. 【請求項５】 請求項１〜４の何れかの項に記載の組換
   えベクターにより形質転換された酵母。
6. 【請求項６】 サッカロミセス属に属する請求項５記載
   の酵母。