JP3681385B2 - 融合タンパク質の製造によって酵素を微生物細胞の細胞壁に固定化する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、遺伝子工学によって製造した固定化酵素を用いる変換処理に係わる。
発明の背景
洗剤、パーソナルケア用品及び食品の製造分野では、これらの製品の成分として天然物質を指向する傾向、及び環境的に許容可能な工程を用いる傾向が強い。酵素変換処理は全く天然で行ない得るので、上記のような消費者の要求を満たすうえで非常に重要である。そのうえ、酵素処理は非常に特異的であり、従って最少量の副産物しか生成させない。このような処理は、温和な温度及び大気圧の下で水中で実施し得る。しかし、遊離酵素に基づく酵素処理は酵素の損失に起因してきわめて高価となるか、または酵素を捕捉するウルトラメンブランシステムのような高価な設備を必要とする。
あるいは他の場合には、酵素を物理的または化学的に固定化することができる。化学的固定化法にはしばしば、非天然の化学薬剤を用い、かつ環境の観点から好ましくない方法で結合を実現するという欠点が存在する。そのうえ、酵素の化学的改変はほぼ常にさほど特異的でなく、このことは結合が酵素の活性に悪影響を及ぼす恐れが有ることを意味する。
物理的固定化は消費者の要求に適い得るが、やはり酵素の活性に悪影響を及ぼしかねない。しかも、物理的に固定化した酵素は遊離酵素と平衡し、このことは連続反応容器内では熱力学の法則に従って酵素の相当の損失が不可避であることを意味する。
微生物細胞への酵素の固定化に関する刊行物が幾つか存在する（参考文献１参照）。本発明は、酵素を微生物細胞の細胞壁に非常に正確に固定化する方法を提供する。加えて、本発明の固定化方法は何等の化学的または物理的結合ステップも必要とせず、かつ非常に効率的である。或る種の細胞外タンパク質は、該タンパク質が宿主細胞の細胞壁に結合している場合にのみ発揮し得る特別の機能を有することが知られている。この種のタンパク質はしばしば、細胞壁に固定（ａｎｃｈｏｒ）された長いＣ末端部を有する。このＣ末端部は非常に特殊なアミノ酸配列を有する。一典型例はプロリンに富んだＣ末端配列を介して固定されている（参考文献２参照）。タンパク質を細胞壁に固定させる別の機構に、タンパク質がグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを有するというもの（参考文献３参照）、及びタンパク質のＣ末端部が相当数の潜在的セリン及びトレオニングリコシル化部位を有するというものが有る。前記部位のＯ−グリコシル化は当該タンパク質のＣ末端部に棒状のコンホーメーションを付与する。このようなマンノタンパク質には、下等真核生物の細胞壁からＳＤＳで抽出できないので前記細胞壁中のグルカンに連結すると考えられるがグルカナーゼ処理によって解離し得るという特徴も有る。
発明の概要
本発明は、酵素を固定化する方法であって、組み換え体ＤＮＡ技術を用いて酵素または酵素の機能部を宿主細胞、好ましくは微生物細胞の細胞壁に連結することを含み、その際酵素または酵素の機能フラグメントを細胞壁の外側に位置させる方法を提供する。好ましくは、酵素または酵素の機能部を、細胞壁への固定を保証するタンパク質のＣ末端部への連結によって固定化する。
本発明はその一実施態様において、触媒活性を具えたタンパク質をコードする構造遺伝子と、真核または原核細胞の細胞壁に固定し得るタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも一部分とを含み、前記一部分は前記固定（またはアンカー）タンパク質の少なくともＣ末端部をコードする組み換え体ポリヌクレオチドを提供する。好ましくはこのポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの発現産物の分泌を保証するシグナルペプチドをコードする配列も含む。上記のようなシグナルペプチドは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカータンパク質、α因子、α−アグルチニン、インベルターゼもしくはイヌリナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属のα−アミラーゼ、または乳酸菌のプロテイナーゼに由来し得る。細胞壁に固定し得るタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、α−アグルチニン、ＡＧＡ１、ＦＬＯ１、もしくは下等真核生物の主要細胞壁タンパク質（Ｍａｊｏｒ Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、または乳酸菌のプロテイナーゼをコードし得る。本発明の組み換え体ポリヌクレオチドはプロモーター、好ましくは誘導可能なプロモーターに作動的に連結されている。触媒活性を具えたタンパク質をコードするＤＮＡ配列は加水分解酵素、例えばリパーゼかオキシドレダクターゼ、例えばオキシダーゼをコードし得る。
本発明はその別の実施態様において、上述のポリヌクレオチドを含む組み換え体ベクターも提供する。このベクターは、触媒活性を具えたタンパク質でマルチマー形態（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ ｆｏｒｍ）で存在する時にその触媒活性を呈示するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む場合、触媒活性を具えた同じタンパク質をコードする構造遺伝子を含む第二のポリヌクレオチドもこの第二のポリヌクレオチドの発現産物の分泌を保証するシグナルペプチドをコードする配列と組み合わせて含み得、その際第二のポリヌクレオチドは調節可能なプロモーター、好ましくは誘導または抑制可能なプロモーターに作動的に連結されている。
本発明は更に別の実施態様において、先に述べたポリヌクレオチドによってコードされたキメラタンパク質も提供する。
先に述べたポリヌクレオチドまたは先に述べたベクターを保持する宿主細胞、好ましくは微生物も本発明の一態様である。触媒活性を具えたタンパク質がマルチマー形態で存在する時にその触媒活性を呈示する場合、上記宿主細胞または微生物は触媒活性を具えた同じタンパク質をコードする構造遺伝子を含む第二のポリヌクレオチドもこの第二のポリヌクレオチドの発現産物の分泌を保証するシグナルペプチドをコードする配列と組み合わせて保持し得、その際第二のポリヌクレオチドは調節可能なプロモーター、好ましくは誘導または抑制可能なプロモーターに作動的に連結されており、かつ別のベクター中にか、または微生物の染色体中に存在する。好ましくは、上記宿主細胞または微生物は上述のポリヌクレオチドのうちの少なくとも一つをその染色体中に組み込まれている。そのような宿主細胞または微生物を培養することによって本発明は、先に述べたタンパク質がその細胞壁に固定化された宿主細胞、好ましくは微生物を提供する。宿主細胞または微生物は下等真核生物、特に酵母であり得る。
本発明は、固定化した触媒活性タンパク質を用いて酵素処理を行なう方法であって、前記触媒活性タンパク質の基質を本発明による宿主細胞または微生物と接触させる方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
第１図はＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの完全なＡＧα１遺伝子を含む６０５７ｂｐのＨｉｎｄIII断片のＤＮＡ配列示す（配列番号１及び２参照）。本明細書に説明した構築に用いる非反復ＮｈｅＩ部位及びＨｉｎｄIII部位の位置をヘッダにおいて特定する。
第２図はｐＵＲ２９６９の構築の概略的説明図である。用いたエンドヌクレアーゼの制限部位を示す。
使用略号：
ＡＧ−ａｌｐｈａ−１：Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のα−アグルチニンを発現する遺伝子。
ａｍｐ：β−ラクタマーゼ耐性遺伝子。
ＰＧＫｐ：ホスホグリセレートキナーゼプロモーター。
ＰＧＫｔ：同遺伝子のターミネーター。
第３図はバッチ培養の間にｐＳＹ１３で形質転換したＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＴ３０２／１Ｃ細胞及び培養液のα−ガラクトシダーゼ活性を示す。
Ａ：単位時間当たりのＵ／ｌα−ガラクトシダーゼ。ＯＤ530も示す。
Ｂ：Ｕ／ＯＤ530で表わした遊離及び結合酵素のα−ガラクトシダーゼ活性。
第４図はバッチ培養の間にｐＵＲ２９６９で形質転換したＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＴ３０２／１Ｃ細胞及び培養液のα−ガラクトシダーゼ活性を示す。
Ａ：単位時間当たりのＵ／ｌα−ガラクトシダーゼ。ＯＤ530も示す。
Ｂ：Ｕ／ＯＤ530で表わした遊離及び結合酵素のα−ガラクトシダーゼ活性。
第５図は指数増殖期の細胞（ＯＤ530＝２）の細胞外画分を抗α−ガラクトシダーゼ血清でウェスタン分析した結果を示す。分析した画分はいずれも４ｍｇ細胞壁（新鮮重量）に相当する。
Ａ：α−ガラクトシダーゼを発現させるＭＴ３０２／１Ｃ。
レーン１；増殖培地
レーン２；単離した細胞壁のＳＤＳ抽出物
レーン３；ＳＤＳ抽出細胞壁のグルカナーゼ抽出物
Ｂ：α−Ｇａｌ−ＡＧα１融合タンパク質を発現させるＭＴ３０２／１Ｃ。
レーン１；増殖培地
レーン２；単離した細胞壁のＳＤＳ抽出物
レーン３；ＳＤＳ抽出細胞壁のグルカナーゼ抽出物
レーン４；Ｅｎｄｏ−Ｈ処理したグルカナーゼ抽出物
第６図はα−Ｇａｌ−α−アグルチニン融合タンパク質を発現させる指数増殖期のＭＴ３０２／１Ｃ細胞（ＯＤ530＝２）の免疫蛍光標識（抗α−ガラクトシダーゼ）を示す完全細胞の位相差顕微鏡写真である。
Ａ：概観。
Ｂ：細部。
第７図はｐＵＲ２９７０Ａ、ｐＵＲ２９７１Ａ、ｐＵＲ２９７２Ａ及びｐＵＲ２９７３の構築の概略的説明図である。用いたエンドヌクレアーゼの制限部位を図示する。ＰＣＲオリゴヌクレオチド配列については本文中で言及する。
使用略号：
ＡＧａ１ ｃｄｓ：α−アグルチニンのコーディング配列。ａ−ＡＧＧ＝ＡＧａ１：Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のα−アグルチニンを発現する遺伝子。
ａｍｐ：β−ラクタマーゼ耐性遺伝子。
Ｐｇａ１７＝ＧＡＬ７：ＧＡＬ７プロモーター。
ｌｉｐｏｌａｓｅ：Ｈｕｍｉｃｏｌａ属のリパーゼ遺伝子。
ｉｎｖＳＳ：ＳＵＣ２シグナル配列。
ａ−ＭＦ：プレプロ−α−接合因子配列。
ａ−ｇａｌ：α−ガラクトシダーゼ遺伝子。
ＬＥＵ２ｄ：ＬＥＵ２遺伝子の截頭（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）プロモーター。
ＬＥＵ２：完全なプロモーター配列を伴ったＬＥＵ２遺伝子。
第８図はＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ株３３５４２６のリパーゼＢの完全なコーディング配列を含む断片のＤＮＡ配列を示す（配列番号１１及び１２参照）。成熟リパーゼＢの配列は、図示した配列の９７位のヌクレオチドから始まる。コーディング配列は４０位のヌクレオチド（ＡＴＧ）から始まる。
第９図はｐＵＲ２９７５及びｐＵＲ２９７６の構築の概略的説明図である。用いたエンドヌクレアーゼの制限部位を示す。
使用略号：
ａ−ＡＧＧ：Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のα−アグルチニンを発現する遺伝子。
ａｍｐ：β−ラクタマーゼ耐性遺伝子。
Ｐｇａ１７＝ＧＡＬ７：ＧＡＬ７プロモーター。
ｉｎｖＳＳ：ＳＵＣ２シグナル配列。
ａ−ＭＦ：プレプロ−α−接合因子配列。
ＬＥＵ２ｄ：ＬＥＵ２遺伝子の截頭プロモーター。
ｌｉｐｏｌａｓｅ：Ｈｕｍｉｃｏｌａ属のリパーゼ遺伝子。
ｌｉｐａｓｅＢ：Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍのリパーゼＢ遺伝子。
第１０図はｐＵＲ２９８１及びｐＵＲ２９８２の構築の概略的説明図である。用いたエンドヌクレアーゼの制限部位を示す。
使用略号：
ａ−ＡＧＧ＝ＡＧ−ａｌｐｈａ１：Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のα−アグルチニンを発現する遺伝子。
ｍｕｃｏｒ ｌｉｐａｓｅ：Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉのリパーゼ遺伝子。
２ｕ：２μｍ配列。
Ｐｇａ１７＝ＧＡＬ７：ＧＡＬ７プロモーター。
ｉｎｖＳＳ：ＳＵＣ２シグナル配列。
ａ−ＭＦ：プレプロ−α−接合因子配列。
ｌｉｐｏｌａｓｅ：Ｈｕｍｉｃｏｌａ属のリパーゼ遺伝子。
ａｍｐ：β−ラクタマーゼ耐性遺伝子。
ＬＥＵ２ｄ：ＬＥＵ２遺伝子の截頭プロモーター。
ＬＥＵ２：完全なプロモーター配列を伴ったＬＥＵ２遺伝子。
第１１図はＦＬＯ１遺伝子の８９４アミノ酸コーディング部のＤＮＡ配列（２６８５塩基）を示す（配列番号２１及び２２参照）。図示した配列は、最初のアミノ酸のコドンで始まり、終結コドンで終わる。
第１２図はプラスミドｐＵＲ２９９０を示す概略的説明図である。図中に記したクローニング手順に関連するエンドヌクレアーゼの幾つかの制限部位を示す。
第１３図はプラスミドｐＵＲ７０３４を示す概略的説明図である。
第１４図はプラスミドｐＵＲ２９７２Ｂを示す概略的説明図である。
第１５図はｌｉｐｏｌａｓｅ／α−アグルチニン融合タンパク質を発現させる指数増殖期のＳＵ１０細胞（ＯＤ530＝０．５）の免疫蛍光標識（抗ｌｉｐｏｌａｓｅ）を示す。
Ａ：位相差顕微鏡写真。
Ｂ：整合蛍光顕微鏡写真。
発明の詳細な説明
本発明は、酵素を固定化する方法であって、組み換え体ＤＮＡ技術を用いて酵素または酵素の機能部を宿主細胞、好ましくは微生物細胞の細胞壁に固定化することを含む方法を提供する。特に、酵素または酵素の機能部を、細胞壁への固定を保証するタンパク質のＣ末端部に、酵素が細胞表面上または細胞表面の僅かに上方に位置するように結合する。このようにして酵素を細胞の表面に固定化する。上記結合は遺伝子レベルで行ない、この遺伝子レベルの結合は、酵素をコードする構造遺伝子をアンカータンパク質をコードする遺伝子の少なくとも一部に、発現産物において酵素のＣ末端がアンカータンパク質のＣ末端部に結合するように結合させるという特徴を有する。好ましくはキメラ酵素の上流に、キメラタンパク質の効率的な分泌を保証するシグナル配列を配置する。
即ち本発明は、触媒活性を具えたタンパク質をコードする構造遺伝子と、真核または原核細胞の細胞壁に固定し得るタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも一部分とを含む組み換え体ポリヌクレオチドを提供し、その際前記一部分は前記固定（即ちアンカー）タンパク質の少なくともＣ末端部をコードする。アンカータンパク質のＣ末端部の長さは様々であり得る。この構造タンパク質の全体を用いることは可能であるが、一部しか用いない方が好ましく、その場合細胞を取り巻く培地中での酵素タンパク質のより効率的な暴露が実現する。アンカータンパク質の固定部は、好ましくはその全体が存在するべきである。一例として、アンカータンパク質のＣ末端部のおよそ半分を用い得る。
好ましくは、上記ポリヌクレオチドは更に、該ポリヌクレオチドの発現産物の分泌を保証するシグナルペプチドをコードする配列も含む。シグナルペプチドはＧＰＩアンカータンパク質、α因子、α−アグルチニン、インベルターゼもしくはイヌリナーゼ、ｂａｃｉｌｌｕｓ属のα−アミラーゼ、または乳酸菌のプロテイナーゼに由来し得る。
細胞壁に固定し得るタンパク質は好ましくは、α−アグルチニン、ＡＧＡ１、ＦＬＯ１（凝集タンパク質）、下等真核生物の主要細胞壁タンパク質、及び乳酸菌のプロテイナーゼの中から選択する。本発明のポリヌクレオチドは好ましくは、プロモーター、好ましくは調節可能なプロモーターで特に誘導可能なプロモーターに作動的に連結されている。
本発明は、上述のポリヌクレオチドを含み組み換え体ベクター、及び前記ポリヌクレオチドまたは前記ベクターを保有する宿主細胞も提供する。オキシドレダクターゼに関してあり得るような、触媒活性を具えたタンパク質がマルチマー形態で存在する時にその触媒活性を呈示するという特別の場合には、モノマーのダイマー化またはマルチマー化が活性の必要条件となり得る。その場合、ベクター及び／または宿主細胞は触媒活性を具えた同じタンパク質をコードする構造遺伝子を含む第二のポリヌクレオチドも、この第二のポリヌクレオチドの発現産物の分泌を保証するシグナルペプチドをコードする配列と組み合わせて有し得、その際第二のポリヌクレオチドは調節可能なプロモーター、好ましくは誘導または抑制可能なプロモーターに作動的に連結されている。第一のポリヌクレオチドの発現及び分泌の後に第二のポリヌクレオチドの発現及び分泌が起こることによって、細胞壁の外側に活性なマルチマーが生成する。宿主細部または微生物は先に述べた本発明のポリヌクレオチドを、または組み合わせの場合は上記ポリヌクレオチドのうちの少なくとも一つを、好ましくはその染色体中に組み込まれた状態で保持する。
本発明は特に、非常に安定な細胞壁を有し、かつ細胞壁に固定されていることが知られているタンパク質、例えばα−アグルチニンや遺伝子ＦＬＯ１の産物を有する酵母のような下等真核生物に係わる。適当な酵母は、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属する。真菌、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属及びＲｈｉｚｏｐｕｓ属も用い得る。用途によっては原核生物も適用可能である。
酵母の場合、本発明は特に、
ａ．例えばα因子遺伝子、インベルターゼ遺伝子、α−アグルチニン遺伝子またはイヌリナーゼ遺伝子に由来するシグナル配列と、
ｂ．α−ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ペクチナーゼ、ペクチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、エステラーゼ及びリパーゼなどの加水分解酵素、またはオキシダーゼなどの非加水分解酵素をコードする構造遺伝子と、
ｃ．α−アグルチニン（参考文献４参照）、ＡＧＡ１（参考文献５参照）及びＦＬＯ１（本願出願前未公表の参考文献６参照）などの典型的な細胞壁結合タンパク質のＣ末端と
から成るキメラ酵素をコードする遺伝子に係わる。
このような遺伝子の発現は構成プロモーターの制御下に置くことができるが、プロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属ではＧＡＬ７プロモーター、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属ではイヌリナーゼプロモーター、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属ではメタノール−オキシダーゼプロモーターといった調節可能な、即ち抑制または誘導可能なプロモーターの方がより好ましい。
構築物は好ましくは、新しい遺伝情報が宿主細胞の染色体中に安定に組み込まれるように形成される。
本発明は、上述のキメラタンパク質が細胞壁に固定化された宿主細胞、特に微生物も提供する。本発明はまた、そのような微生物の、酵素の基質を当該微生物と接触させることによる酵素処理の実施への使用も提供する。前記処理は、例えば充填カラム内で微生物を固体粒子に支持させて実施するか、または反応容器内で攪拌下に実施し得る。反応は水性であっても非水性であってもよい。必要であれば、酵素の機能に必要な添加物、例えば補因子を反応媒質中に導入し得る。
自然に固定化された酵素系を処理において繰り返し用いると、系の性能が低下する恐れが有る。これは、酵素が物理的に変性するか、または化学的に有毒化したり、脱着したりすることによる。本発明は特に、使用した系を反応媒質から単なる遠心または膜濾過技術によって回収できること、及びそのようにして集めた細胞を回復媒質に移し得、この媒質中で細胞は急速に再生し、それと共にキメラタンパク質が生成し、このようにして細胞の表面が完全に活性な固定化酵素によって覆われることが保証されることを特徴とする。上記再生法は単純かつ安価であり、従って酵素処理の経済性を改善し、固定化酵素系に基づく処理の用途をはるかに拡張し得る。
しかし、本発明は決して固定化酵素の再利用性に限定されない。
本発明を、本発明の範囲を限定しない以下の実施例によって詳述する。
実施例１
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの表面に固定したα−ガラクトシダーゼ／α−アグルチニン
α−アグルチニンをコードする遺伝子についてはＬｉｐｋｅ等が述べている（参考文献４参照）。ＡＧα１遺伝子の全体を含む、ｐＴＺ１８Ｒ中の６０５７ｂｐのＨｉｎｄIII挿入体の配列を第１図に示す。コーディング配列は６５０アミノ酸を越えて伸張し、３６５３位のヌクレオチドからＡＴＧをもって始まる推定シグナル配列を含む。非反復ＮｈｅＩ部位がこのＤＮＡを、アミノ酸３３０をコードする部分内で上記コーディング配列の９８８位において切断し、それによってα−アグルチニンをほぼ同寸法のＮ末端部とＣ末端部とに分割する。
ｐＵＲ２９６８（第２図参照）をＮｈｅＩ／ＨｉｎｄIIIで消化することによって、推定される細胞壁アンカーの配列情報を担った１．４ｋｂ断片を放出させた。α−ガラクトシダーゼへの融合のために、ＳＵＣ２インベルターゼシグナル配列に後続するα−ガラクトシダーゼ配列を含む、ＹＥｐｌａｃ１８１に基づくエピソームベクターであるプラスミドｐＳＹ１６を用い、これを構成ＰＧＫプロモーターとＰＧＫターミネーターとの間に配置した。α−ガラクトシダーゼ遺伝子の読み取り枠の最後の９塩基対中に存在するＳｔｙＩ部位をＡＧα１遺伝子断片のＮｈｅＩ部位に連結した。枠内融合を確実にするため、ＳｔｙＩ／ＨｉｎｄIIIで消化したｐＳＹ１３への連結前にＳｔｙＩ部位を充填し、かつＮｈｅＩ部位の５′オーバーハングを除去した（第２図参照）。
新しいプラスミドの適正構築を確認するため、大腸菌ＪＭ１０９（ｒｅｃＡ１ ｓｕｐＥ４４ ｅｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１ ｔｈｉ ▲（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ） Ｆ′［ｔｒａＤ３６ ｐｒｏＡＢ + ｌａｃＩ q ｌａｃＺ▲Ｍ１５］）（参考文献７参照）をシャトルベクターで、Ｃｈｕｎｇ等が述べている形質転換プロトコル（参考文献８参照）により形質転換した。陽性クローンのうちの、記号ｐＵＲ２９６９を付した一つを更に特性付け、ＤＮＡをＱｕｉａｇｅｎプロトコルに従って単離及び精製し、その後ＤＮＡ配列決定によって特性付けた。ＤＮＡ配列決定は主としてＳａｎｇｅｒ等（参考文献９参照）及びＨｓｉａｏ（参考文献１０参照）が述べているようにして行ない、その際ここではＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｌｃ）及び［35Ｓ］ｄＡＴＰαＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｌｃ：３７０ ＭＢｑ／ｍｌ；２２ ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）を用いるプロトコルに従いＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ＣｏｍｐａｎｙのＳｅｑｕｅｎａｓｅバージョン２．０キットを用いた。
次に、このプラスミドでＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＭＴ３０２／１Ｃを、Ｋｌｅｂｅ等のプロトコル（参考文献１１参照）に従って形質転換した。
酵母形質転換細胞を、ロイシンを存在させない選択プレート上に４０μｌ（ＤＭＦ ２０ｍｇ／ｍｌ）載せて選択した。Ｘ−α−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコース；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を塗り広げ、α−ガラクトシダーゼ活性について直接試験した（参考文献１２参照）。キメラタンパク質の発現、分泌、局在及び活性を証明するべく、次の分析を行なった。
１．発現及び分泌
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＭＴ３０２／１Ｃを、Ｃｙａｍｏｐｓｉｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂａのα−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＳＹ１３か、またはα−ガラクトシダーゼ／α−アグルチニン融合構築物を含むプラスミドｐＵＲ２９６９で形質転換した。バッチ培養の間α−ガラクトシダーゼ活性を、洗浄した細胞と増殖培地とにおいて測定した。結果を第３図及び第４図に示す。プラスミドｐＳＹ１３を保持する酵母細胞から発現されたα−ガラクトシダーゼは大部分が専ら増殖培地中に存在した（第３図のＡ）が、α−ガラクトシダーゼ−α−アグルチニン融合タンパク質の方は大部分が専ら細胞に結合していた（第４図のＡ）。そのうえ、固定化された、細胞壁に結合したα−ガラクトシダーゼ−α−アグルチニン融合酵素は全インキュベーション時間にわたって完全な活性を維持したが、分泌及び放出された酵素は６５時間のインキュベーション後に約９０％の活性を失った。このことは、上述の酵素を酵母の細胞壁に固定化すれば該酵素を、おそらくはプロテイナーゼによる不活性化から保護することになり、それによって安定性が著しく向上することを示している。更に、様々な遺伝子産物の局在に関してウェスタン分析により考察した。即ち、細胞を遠心によって集収し、０℃においてｐＨ７．８の１０ｍＭトリス・ＨＣ１、及び１ｍＭ ＰＭＳＦで洗浄し、後の諸ステップは前記と同じ温度で実施した。細胞１ｇ（湿潤重量）当たり３ｍｌの単離緩衝液と１０ｇのガラスビーズとを添加した。混合物をＧｒｉｆｆｉｎ振盪機において、該振盪機の最高速度の５０％の速度で３０分間振盪した。上清を単離し、ガラスビーズを１Ｍ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＰＭＳＦで洗液が澄むまで洗浄した。上清及び洗液をプールした。細胞壁を遠心によって回収し、その後１ｍＭ ＰＭＳＦで洗浄した。
２％ ＳＤＳ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ及び４０ｍＭ β−メルカプトエタノールを含有するｐＨ７．８の５０ｍＭトリス・ＨＣｌ中での５分間の煮沸によって細胞壁に、共有結合以外で結合したタンパク質、またはジスルフィド架橋を介して結合したタンパク質を放出させた。１０ｍｇ（湿潤重量）の細胞壁を、１ｍＭ ＰＭＳＦを含有するｐＨ５．０の１００ｍＭ酢酸ナトリウム２０ｌ中に取り上げた。これに０．５ｍＵのβ−１，３−グルカナーゼ（Ｌａｍｉｎａｒａｓｅ；Ｓｉｇｍａ Ｌ５１４４）を添加し、続いて３７℃で２時間インキュベーションした。その後、再び０．５ｍＵのβ−１，３−グルカナーゼを添加してから３７℃で更に２時間インキュベートした。
タンパク質を、５分間煮沸してからＥｎｄｏ−Ｈ処理を施すことによって変性させた。２ｍｇのタンパク質を、１００ｍＭ β−メルカプトエタノール及び０．５ｍＭ ＰＭＳＦを含有するｐＨ５．５の５０ｍＭリン酸カリウム１ｍｌ中で４０ｍＵのＥｎｄｏ−Ｈ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）と共に３７℃で４８時間インキュベートした。その後、２０ｍＵのＥｎｄｏ−Ｈを添加してから３７℃で２４時間インキュベートした。
タンパク質を、２．２−２０％勾配ゲルにおいてＬａｅｍｍｌｉ（参考文献１３参照）に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ゲルを、Ｔｏｗｂｉｎ等が述べているＩｍｍｏｂｉｌｏｎポリビニリデン−ジフルオリド膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上への電気泳動転移によってブロッティングした（参考文献１４参照）。高度にグリコシル化したタンパク質の場合は、その後、５０ｍＭ過ヨウ酸、ｐＨ４．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム中で４℃で数時間、温和な過ヨウ酸塩処理を施した。後のインキュベーションは総て室温で行なった。ブロットを、０．５％のゼラチン及び０．５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中で１時間ブロックし、続いて１：２００に稀釈した血清を含有するプローブ緩衝液（ＰＢＳ； ０．２％ゼラチン、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で１時間インキュベーションを行なった。その後、ブロットを洗浄緩衝液（ＰＢＳ； ０．２％ゼラチン、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で数回洗浄し、続いて125Ｉ標識タンパク質Ａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含有するプローブ緩衝液中で１時間インキュベーションを行なった。洗浄緩衝液中で数回洗浄後、ブロットを風乾し、Ｓａｒａｎ（Ｄｏｗ）に包み、これを用いて−７０℃において、増感スクリーンを具備したＸ−ｏｍａｔ Ｓフィルム（Ｋｏｄａｋ）を露光した。Ｏｍｎｉｍｅｄｉａ ６ｃｘスキャナ及びＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐプログラムを用いて、標識されたタンパク質を定量した。両形質転換細胞からタンパク質を単離した様々な操作の結果を第５図に示す。プラスミドｐＳＹ１３を保持する形質転換細胞の場合、酵素は全般に培地中に局在し、その際少量の酵素のみが細胞壁に、結合したというよりは捕捉された（第５図のＡ）−この酵素はＳＤＳ抽出によって完全に除去可能−が、融合タンパク質の方は細胞壁に強固に結合し、少量のα−ガラクトシダーゼ／α−アグルチニンのみが周囲の培養液中に放出され、またはＳＤＳ抽出可能であった。遊離α−ガラクトシダーゼを発現させる細胞からの細胞壁のラミナリナーゼ抽出ではそれ以上の酵素解離は観察されなかったことに対して、融合酵素発現細胞に同じ処理を施すと融合酵素は全般に解離した。このことは、融合タンパク質はα−アグルチニン同様Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞壁グルカンと強固に結合するが、α−ガラクトシダーゼ単独ではそのようなことはないということを示している。後から行なったＥｎｄｏ−Ｈ処理は融合タンパク質の著しいグリコシル化を示したが、これは先に説明した、α−アグルチニンのＣ末端部の拡大グリコシル化と完全に一致する結果であった。
２．局在
抗α−ガラクトシダーゼ血清での免疫蛍光標識を完全細胞に対して行ない、それによって細胞壁におけるα−ガラクトシダーゼ／α−アグルチニン融合タンパク質の存在及び分布を測定した。免疫蛍光標識は、Ｗａｔｚｅｌｅ等による固定（参考文献５参照）はせずに行なった。ＯＤ530＝２の細胞を単離し、ＴＢＳ（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ及び２０μｇ／ｍｌシクロヘキシミドを含有するｐＨ７．８の１０ｍＭトリス・ＨＣｌ）中で洗浄した。細胞をＴＢＳ＋抗α−ガラクトシダーゼ血清中で１時間インキュベートし、続いてＴＢＳ中で数回洗浄した。その後、ＦＩＴＣと結合させた抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を添加して３０分間、インキュベーションを行なった。ＴＢＳ中で洗浄後、細胞を、１ｍｇ／ｍｌのｐ−フェニレンジアミン及び０．１％のアジドを含有するｐＨ９．０の１０ｍＭトリス・ＨＣｌ中に取り、Ｚｅｉｓｓ ６８０００顕微鏡において写真撮影した。この分析の結果を示す第６図からは、α−ガラクトシダーゼ／α−アグルチニンキメラが酵母細胞の表面に局在することが明らかである。非常に小さいものまで非常に均一に標識された様々な大きさのバッド（ｂｕｄｓ）が、融合酵素が全細胞周期を通じて連続的に細胞壁中に取り込まれ、かつ瞬時に強固に結合することを明示している。
３．活性
α−ガラクトシダーゼ活性を定量的に評価するべく、ｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸ナトリウム及び１０ｍＭ ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｓｉｇｍａ）を含有する２００μｌ試料を３７℃で正確に５分間インキュベートした。１ｍｌの２％炭酸ナトリウムの添加によって反応を停止させた。先に述べたように遠心によって分離し、かつ単離及び洗浄した完全細胞及び細胞壁からα−ガラクトシダーゼ活性を、４１０ｎｍにおいて１８．４ｃｍ2／ｍｏｌであるｐ−ニトロフェノールの消衰係数を用いて算出した。１単位を、３７℃における１分間当たりの基質１μｍｏｌの加水分解と定義した。
結果を表１にまとめる。大部分のα−ガラクトシダーゼは培養液中に分布し、一方融合物はそのほとんどが細胞、主として細胞壁に結合していた。第３図〜第６図及び表１に示した結果を勘案すれば、キメラ酵素の酵素α−ガラクトシダーゼ活性は遊離酵素のものに劣らないと推測できる。そのうえ、定常期の間に増殖培地中のα−ガラクトシダーゼの活性は低下したが、細胞壁に結合したα−ガラクトシダーゼ／α−アグルチニン融合タンパク質の活性は不変のままであり、このことは細胞に結合した融合タンパク質が失活またはタンパク質分解から保護されることを示している。
注記：本実施例の主旨は優先権主張年中にＭ．Ｐ．Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ等によって公表された（参考文献２５参照）。
実施例２Ａ
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの表面に固定化したＨｕｍｉｃｏｌａ属リパーゼ／α−アグルチニン（固定化酵素系の誘導発現）
α−アグルチニンのＣ末端部を含む１．４ｋｂのＮｈｅＩ／ＨｉｎｄIII断片の構築及び単離は実施例１に述べた。プラスミドｐＵＲ７０２１は、市販ベクターｐＴＺ１８ＲのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII制限部位にクローニングされた長さ８９４ｂｐの、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属のリパーゼをコードする合成ＤＮＡ断片（参考文献１６並びに配列番号７及び８参照）を含む（第７図参照）。成熟リパーゼをコードするＤＮＡ部分の５′末端と３′末端との両方を１ステップで適正に改変するのにＰＣＲ技術を適用し得る。従って、標準的ＰＣＲプロトコルにおいてＤＮＡオリゴヌクレオチドｌｉｐｏ１（配列番号３参照）及びｌｉｐｏ２（配列番号６参照）をプライマーとして用いて、両末端にＥａｇＩ制限部位及びＨｉｎｄIII制限部位をそれぞれ有する長さ８２６ｂｐのＤＮＡ断片を生じさせ得、この断片を、本明細書中で先に述べたインベルターゼシグナル配列に後続するα−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミドであるＥａｇＩ／ＨｉｎｄIII消化ｐＵＲ２６５０の大きい方の部分と組み合わせることによりプラスミドｐＵＲ２９７０Ａを生じさせ得る（第７図参照）。
Humicola属リパーゼとα−アグルチニンのC末端との枠内連結のためのPCRオリゴヌクレオチド
a．SUC2シグナル配列とリパーゼのN末端との間の転移（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）のためのPCRオリゴヌクレオチド
b．リパーゼのC末端とα−アグルチニンのC末端部との間の枠内転移のためのPCRオリゴヌクレオチド
ＰＣＲ法によりリパーゼのコーディング配列の末端にＮｈｅＩ部位を創出して、リパーゼをコードするＤＮＡとα−アグルチニンのＣ末端部をコードするＤＮＡとの枠内連結を可能にする。そうすれば、プラスミドｐＵＲ２９７０ＡをＮｈｅＩ及びＨｉｎｄIIIで消化し得、プラスミドｐＵＲ２９６８に由来する、α−アグルチニンのＣ末端部を含む１．４ｋｂのＮｈｅＩ／ＨｉｎｄIII断片をＮｈｅＩ及びＨｉｎｄIIIで処理したプラスミドｐＵＲ２９７０Ａの大きい方の部分と組み合わせてプラスミドｐＵＲ２９７１Ａを得ることができる。このプラスミドから２．２ｋｂのＥａｇＩ／ＨｉｎｄIII断片を単離して、ＥａｇＩ及びＨｉｎｄIIIで処理したｐＵＲ２７４１中に連結し得、その際プラスミドｐＵＲ２７４１はｐＵＲ２７４０の、既に不活性なＴｅｔ耐性遺伝子の第二のＥａｇＩ制限部位がＮｒｕＩ／ＳａｌＩ消化によって欠失した誘導体である。（参考文献１７参照）。ＳａｌＩ部位は再連結前に充填された。連結によって、ＧＡＬ７プロモーター、インベルターゼシグナル配列、リパーゼ／α−アグルチニンキメラ遺伝子、２μｍ配列、欠陥Ｌｅｕ２プロモーター及びＬｅｕ２遺伝子を含むｐＵＲ２９７２Ａが得られる。このプラスミドを用いてＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを形質転換し得、得られる形質転換細胞は、リパーゼ／α−アグルチニンキメラ遺伝子の発現を惹起する誘導物質としてガラクトースを抑制量のグルコースの不在下に含有するＹＰ培地中で培養することができる。
リパーゼ／α−アグルチニンキメラの発現、分泌、局在及び活性の分析は、実施例１に述べたのと同様の操作を用いて可能である。
同様にして、ｒＤＮＡ技術を介して得られるＨｕｍｉｃｏｌａ属リパーゼの変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）をα−アグルチニンのＣ末端部に結合することも可能であり、前記変異体はエステル化反応またはエステル交換反応の間、より高い安定性を有し得る。
実施例２Ｂ
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの表面に固定化したＨｕｍｉｃｏｌａ属リパーゼ／α−アグルチニン（固定化酵素系の誘導発現）
実施例２Ａでは、特定構築物を製造するプロトコルを説明する。研究を行なう前、本実施例２Ｂでの構築手順が実施例２Ａでの構築手順と僅かな点でしか異ならず、しかも得られるプラスミドは実施例２Ａに述べたものと同等でないように実施例１に述べた発現ベクターを用いることが好ましいと考えられた。しかし、プロモーターと、シグナル配列と、融合タンパク質をコードする構造遺伝子とを含む実質的な遺伝子構築物は実施例２Ａと実施例２Ｂとで同じである。
１．構築
α−アグルチニン細胞壁タンパク質のＣ末端部をコードする１．４ｋｂのＮｈｅＩ／ＨｉｎｄIII断片の構築及び単離は実施例１に述べた。市販のベクターｐＴＺ１８ＲをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIIIで処理し、得られるベクター断片を、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属のリパーゼをコードする長さ８９４ｂｐの合成ＤＮＡ ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII断片と連結することによって、（実施例２ＡのｐＵＲ７０２１に類似する）プラスミドｐＵＲ７０３３を調製した（配列番号７及び８並びに参考文献１６参照）。
リパーゼをα−アグルチニンのＣ末端の、細胞壁アンカーを含む領域に融合させるために、プラスミドｐＵＲ７０３３をＥａｇＩ及びＨｉｎｄIIIで消化し、リパーゼコーディング配列を単離して、ＥａｇＩ及びＨｉｎｄIIIで消化した酵母発現ベクターｐＳＹ１（参考文献２７参照）中に連結し、それによってｐＵＲ７０３４を生じさせた（第１３図参照）。これは実施例１に述べた、誘導可能なＧＡ１７プロモーターの制御下にインベルターゼ（ＳＵＣ２）シグナル配列に後続するα−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む２μｍエピゾーム発現ベクターである。
上述の消化に並行して、ｐＵＲ７０３３をＥｃｏＲＶ及びＨｉｎｄIIIでも消化し、それによって最後の１５個のカルボキシル末端アミノ酸のためのコドンを有する長さ５７ｂｐのＤＮＡ断片を解離させた。この断片を配列番号９及び１０の、化学的に合成した２個のデオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって生じさせた小さいＤＮＡ断片に対して交換した。両ＤＮＡ鎖のアニーリング後、これら２個のオリゴヌクレオチドは最初のリパーゼ遺伝子の３′コーディング配列の残部を実質的に再構成するが、リパーゼ遺伝子の下流に新たなＮｈｅＩ制限部位を導入し、これにＨｉｎｄIII部位が近接して続き、その際ＮｈｅＩ部位の最初の３個のヌクレオチドはリパーゼの最後のアミノ酸のコドンを構成する。得られたプラスミドに記号“ｐＵＲ２９７０Ｂ”を付した。次に、この構築中間体をＥａｇＩ及びＮｈｅＩで消化し、リパーゼコーディング断片を単離してｐＵＲ２９６８の１．４ｋｂのＮｈｅＩ／ＨｉｎｄIII断片と共にＥａｇＩ及びＨｉｎｄIII切断ｐＳＹ１ベクター中に連結した。この三点連結によって得られた最終的なｌｉｐｏｌａｓｅ−α−アグルチニン酵母発現ベクターを“ｐＵＲ２９７２Ｂ”と命名した（第１４図参照）。
このプラスミドを用いて、参考文献１７に記載されたＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＳＵ１０を形質転換し、形質転換細胞を、リパーゼ／α−アグルチニンキメラ遺伝子の発現を惹起する誘導物質としてガラクトースを抑制量のグルコースの不在下に含有するＹＰ培地中で培養した。
２．活性
リパーゼ活性を定量するべく、２種の別個の基質に関して２種の活性測定を行なった。いずれの場合も、プラスミドｐＵＲ７０３４またはｐＳＹ１で形質転換したＳＵ１０酵母細胞を対照として用いた。従って、プラスミドｐＳＹ１、プラスミドｐＵＲ７０３４またはプラスミドｐＵＲ２９７２Ｂを保持する形質転換酵母細胞を、ヒスチジン及びウラシルを添加したＹＮＢ−グルコース培地中で２４時間増殖させ、その後５％ガラクトースを添加したＹＰ培地中で１：１０に稀釈し、再び培養した。３０℃で２４時間のインキュベーション後、上記両アッセイのための第一の測定を行なった。
適用した第一のアッセイはｐＨスタット法であった。このアッセイではリパーゼ活性の１単位を、ラジオメーターｐＨスタット装置（ｐＨＭ ８４メーター、ＡＢＵ ８０自動ビュレット、ＴＴＡ ６０滴定アセンブリー）において標準的なアッセイ条件（１：１ ｗ／ｗアラビアゴムで乳化した純粋なトリオレエートと看做される３８ｍＭのオリーブ油と、２０ｍＭの塩化カルシウムと、４０ｍＭの塩化ナトリウムと、５ｍＭのトリスとを含有する３０ｍｌアッセイ溶液、ｐＨ９．０、３０℃）下にトリグリセリド基質から毎分１μｍｏｌの脂肪酸を遊離させ得る酵素量と定義する。生じた脂肪酸を０．０５Ｎ ＮａＯＨで滴定し、測定した活性は推定酵素バッチの添加後１〜２分間隔でのアルカリ消費に基づくものであった。固定化リパーゼ活性について試験するべく、１ｍｌの各培養物を遠心し、上清を取り分け、ペレットを１ｍｌの１Ｍソルビトール中に再懸濁させて洗浄し、その後再び遠心し、かつ２００μｌの１Ｍソルビトール中に再懸濁させた。各種の酵母細胞から得た最初の上清及び洗浄した細胞をリパーゼ活性について試験した。
Ａ: 24時間後のリパーゼ活性(LU/ml)
残りの酵母培養物を更にインキュベートし、４８時間後に実質的に同じ分離操作を行なった。測定した初期活性に応じて、測定試料の実際量は２５μｌから１５０μｌまで様々とした。
この一連の測定は、リパーゼ−α−アグルチニン融合タンパク質をコードするプラスミドを保持する酵母細胞が実際上、酵母細胞に関係付けられる幾分かのリパーゼ活性を呈することを示している。
リパーゼの活性が酵母細胞表面に固定化されることを更に確認するべく、付加的な第二のアッセイを行なった。手短に言えばこのアッセイでは、ＰＮＰ（＝パラニトロフェニル）のＰＮＰ−ブチレートからの遊離の反応速度を４００ｎｍにおけるＯＤの測定によって決定する。従って、ｐＳＹ１、ｐＵＲ７０３４またはｐＵＲ２９７２Ｂを保持する酵母細胞を含有する培養物１０ｍｌを遠心し、ペレットを４ｍｌの緩衝液Ａ（ｐＨ５．０の０．１Ｍ ＮａＯＡｃ、及び１ｍＭ ＰＭＳＦ）中に再懸濁させ、この４ｍｌのうちの５００μｌを再び遠心し、かつ５００μｌのＰＮＢ緩衝液（ｐＨ９．０の２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２０ｍＭ ＣａＣｌ2、２５ｍＭ ＮａＣｌ）中に再懸濁させ、再度遠心し、最後に４００μｌのＰＮＢ緩衝液中に再懸濁させた。この画分を用いて、リパーゼの細胞結合部位を測定した。
残りの３５００μｌを遠心し、ペレットを４ｍｌのＡ中に再懸濁させ、得られた各懸濁液に４０μｌのラミナリナーゼ（ｅｘ ｍｏｌｌｕｓｃ， １．２５ｍＵ／μｌ）を添加し、最初３７℃で３時間、続いて２０℃で一晩インキュベートした。次に、完全細胞をなお含有する反応混合物を再び遠心し、上清を用いて、本来細胞壁に結合していたがラミナリナーゼインキュベーションにより遊離した物質の量を測定した。最終ペレットを４００μｌのＰＮＰ緩衝液中に再懸濁させ、細胞になお結合している部分を算定した。４ｍｌのアッセイ緩衝液に加えた所定量の特定培養物画分のブランク反応を測定し、その後８０μｌの基質溶液（メタノール中に１００ｍＭ ＰＮＰ−ブチレート）の添加によって反応を開始させ、分光光度計において２５℃及び４００ｎｍで観察した。
この結果は、プラスミドｐＵＲ２９７２Ｂを保持する酵母細胞の表面に相当量のリパーゼ活性が固定化されることを明示している。ここでも、完全細胞の細胞壁に挿入されたリパーゼによって反応が触媒されるように導入が実現したが、このことは外向きの固定化を示唆する。そのうえ、ラミナリナーゼと共にインキュベートした後に相当量のリパーゼ活性が呈示されることも、α−アグルチニンのＣ末端部との遺伝子操作融合により異種酵素がおそらくは共有結合によって導入されることを明示する。
３．局在
リパーゼ−α−アグルチニン融合タンパク質の発現、分泌、及び酵母細胞壁へのその後の導入も、実質的に実施例１の２“局在”に述べた、抗ｌｉｐｏｌａｓｅ血清を用いる免疫蛍光標識によって確認した。
第１５図から知見され得るように、ここでの免疫蛍光染色はα−ガラトシダーゼ免疫染色と実質的に類似する像を示し、反応性は細胞表面外側に明らかに検出できる（細胞を取り巻く明瞭な光輪を示す第１５図のＡ、及び細胞表面のより明るい円を示す第１５図のＢ参照）が、培地中や細胞内部には検出できない。ｐＵＲ２９７２ＢにＨｕｍｉｃｏｌａ属リパーゼ−α−アグルチニン融合タンパク質を発現させる酵母細胞は表面を均一に染色されるようになり、このことはα−アグルチニンＣ末端を有するキメラ酵素の実質的に総てが酵母細胞の外側に固定化されたことを示す。行なった対照実験では、プラスミドｐＵＲ７０３４を保持するＳＵ１０酵母細胞を対照として用い、この実験で適用した抗リパーゼ血清に対する細胞表面結合反応性は検出できなかった。
同様にして、ｒＤＮＡ技術を介して得られるＨｕｍｉｃｏｌａ属リパーゼの変異体をα−アグルチニンのＣ末端部に結合することも可能であり、前記変異体はエステル化反応またはエステル交換反応の間、より高い安定性を有し得る。
実施例３
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの表面に固定化したＨｕｍｉｃｏｌａ属リパーゼ／α−アグルチニン（固定化酵素系の構成発現）
実施例２に述べたプラスミドｐＵＲ２９７２はＥａｇＩ及びＨｉｎｄIIIで処理し得、リパーゼ／α−アグルチニン遺伝子を含む約２．２ｋｂの断片を単離することができる。プラスミドｐＳＹ１６をＥａｇＩ及びＨｉｎｄIIIで制限し、前記２酵素の制限部位間に、リパーゼ／α−アグルチニン断片を含む２．２ｋｂ断片を連結してｐＵＲ２９７３を得ることができる。このプラスミドの、キメラ酵素の産生に関与する部分はｐＵＲ２９７２に類似し、ただしシグナル配列は異なる。ｐＵＲ２９７２はＳＵＣ２インベルターゼシグナル配列を含むが、ｐＵＲ２９７３はα−接合因子配列を含む（参考文献１８参照）。そのうえ、プラスミドｐＵＲ２９７３はｐＵＲ２９７２の截頭プロモーターに替えて、完全なプロモーター配列を伴ったＬｅｕ２マーカー遺伝子を含む。
実施例４
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの表面に固定化したＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍ属リパーゼ／α−アグルチニン
ＡＧα−１（α−アグルチニン）のＣ末端部を含む１．４ｋｂのＮｈｅＩ／ＨｉｎｄIII断片の構築及び単離は実施例１に述べた。α−アグルチニンのＣ末端膜アンカーをコードするＤＮＡの、株ＣＭＩＣＣ ３３５４２６に由来するＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍリパーゼＢの完全コーディング配列への枠内遺伝子融合（第８図並びに配列番号１１及び１２参照）のためにプラスミドｐＵＲ２９７４を用い得る。市販のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫプラスミドに由来するこのプラスミドは長さ１８５０ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ挿入体上に、完全なＧ． ｃａｎｄｉｄｕｍリパーゼIIをコードするｃＤＮＡを含む（第９図参照）。
相同なシグナル配列を伴ったＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのための発現ベクターを開発するために、成熟リパーゼＢのＮ末端を標準的な技術で実験により決定した。得られたアミノ酸配列“Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−……”は、Ｇ． ｃａｎｄｉｄｕｍリパーゼIIのシグナルペプチダーゼ切断部位と完全に一致する（参考文献１９参照）。
成熟リパーゼＢを、一方ではＳＵＣ２（インベルターゼ）またはα−接合因子（プレプロ−αＭＦ）のＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシグナル配列に融合させ、他方ではＡＧα１遺伝子の３′末端部に枠内融合させるのにＰＣＲ技術を用い得る。ＰＣＲプライマーｌｉｐｏ３（配列番号１３参照）は、（成熟タンパク質のコドン５〜７にわたる）コーディング配列の５′末端部に本来存在するＥａｇＩ部位がアミノ酸配列を何等変化させることなく不活性となるように構築することができる。後のクローニング操作を容易にするべく、ＰＣＲプライマーの５′末端に、ＳＵＣ２シグナル配列やプレプロ−αＭＦ配列への枠内連結のための新たなＥａｇＩ部位を付与することも可能である。対応するＰＣＲプライマーｌｉｐｏ４（配列番号１６参照）は、リパーゼＢのＣ末端をコードするヌクレオチドの後方に位置する余分なＮｈｅＩ部位を含み、それによってα−アグルチニンのＣ末端部への適正な融合を確実化する。
G. candidumリパーゼIIと、SUC2シグナル配列及びα−アグルチニンのC末端部との枠内連結のためのPCRオリゴヌクレオチド
ａ．プレプロαMF配列またはSUC2シグナル配列へのN末端転移
ｂ．α−アグルチニンのC末端部へのC末端融合
改変された末端を有するＰＣＲ産物は、やはり校正活性を示してエラーの無いＤＮＡ鋳型を保証する新規な熱安定性ＶＥＮＴポリメラーゼを通常のＡｍｐｌｉ−Ｔａｑポリメラーゼの替わりに用いて標準的なＰＣＲプロトコルにより生成させ得る。先に述べたプラスミドｐＵＲ２９７２をＥａｇＩ（完全）及びＮｈｅＩ（部分）で消化することにより、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属リパーゼ断片をリパーゼＢをコードするＤＮＡ断片に対し交換し、それによって最終的なＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＵＲ２９７５を調製することができる（第９図参照）。
先に述べたベクターｐＵＲ２９７３をＥａｇＩ／ＨｉｎｄIIIで消化することによりＨｕｍｉｃｏｌａ属リパーゼ−α−アグルチニン融合タンパク質コーディング配列を上述のリパーゼＢ／α−アグルチニン融合構築物に対し交換すれば、ｐＵＲ２９７６が得られる（第９図参照）。
実施例５
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの表面に固定化したＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ／α−アグルチニン
α−アグルチニンのＣ末端部をコードする１．４ｋｂのＮｈｅＩ／ＨｉｎｄIII断片の構築及び単離は実施例１に述べた。プラスミドｐＵＲ２９８０は市販のｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位にクローニングされた１．２５ｋｂのｃＤＮＡ断片を含み、（人工的な合成可能な）この断片は、トリアシルグリセロールをエステル交換する（参考文献２１参照）か、またはバイオサーファクタントを製造する（参考文献２２参照）幾つかの方法において用いられる酵素であるＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉのトリグリセリドリパーゼの完全なコーディング配列をコードする（参考文献２０参照）。この断片は成熟リパーゼ分子の２６９コドンの外に、２４アミノ酸シグナルペプチドのためのコドン、並びにプロペプチドの７０アミノ酸のためのコドンも含む。成熟リパーゼをコードする遺伝子断片のＳＵＣ２シグナル配列またはＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのプレプロα−接合因子配列との適正な融合、並びに先に述べたＮｈｅＩ／ＨｉｎｄIII断片との枠内融合を確実にするべくＰＣＲを容易に適用し得る。次の２個のプライマーｌｉｐｏ５（配列番号１７参照）及びｌｉｐｏ６（配列番号２０参照）は８３３ｂｐのＤＮＡ断片をもたらし、この断片はプロテイナーゼＫ処理並びにＥａｇＩ及びＮｈｅＩでの消化後に長さ８１６ｂｐの断片として、ＥａｇＩ／ＮｈｅＩで消化したプラスミドｐＵＲ２９７２及びｐＵＲ２９７３それぞれにクローニングすることができる（第７図参照）。
これらの新規なＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現プラスミドはＧＡＬ７プロモーターと、インベルターゼシグナル配列（ｐＵＲ２９８１）またはプレプロ−α−接合因子配列（ｐＵＲ２９８２）と、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ／α−アグルチニンキメラ遺伝子と、２μｍ配列と、欠陥（截頭）Ｌｅｕ２プロモーターと、Ｌｅｕ２遺伝子とを含む。これらのプラスミドでＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを形質転換して増殖させ、先の諸実施例に述べたプロトコルを用いて分析することができる。
実施例６
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの表面に固定化したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコースオキシダーゼ／ＧＰＩ固定細胞壁タンパク質
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のグルコースオキシダーゼ（β−Ｄ：酸素１−オキシドレダクターゼ；ＥＣ １．１．３．４）は、β−Ｄ−グルコースのグルコノ−δ−ラクトンへの酸化とそれに伴う酸素分子の過酸化水素への還元とを触媒する。この真菌酵素は、強固に結合した２個のＦＡＤ補因子を含む分子量１５０，０００のホモダイマーから成る。この酵素はグルコース検出キットで用いられるほか、食物の保存における過酸化水素源として有用でもある。遺伝子はｃＤＮＡとゲノムライブラリーとの両方からクローニングした。ただ１個の読み取り枠は介在配列を含まず、６０５アミノ酸のタンパク質をコードする（参考文献２３参照）。
２個の適正なオリゴヌクレオチドを用いて、配列のコーディング部をＰＣＲでのワンステップ改変操作において、グルコースオキシダーゼ、並びにＦＬＯ１遺伝子産物またはα−アグルチニンのＣ末端細胞壁アンカーをコードする融合遺伝子産物が得られるように調節する。即ち、先の諸実施例に述べたプラスミドのうちの幾つかを用いて対応する配列を、先の諸実施例で用いたシグナル配列のうちの一つとＡＧα１遺伝子のＮｈｅＩ／ＨｉｎｄIII部分との間に枠内で組み込むことができる。
２個のモノマーのダイマー化が活性の必要条件となり得るので、別のアプローチではＧＰＩアンカーを伴わないグルコースオキシダーゼのための完全なコーディング配列を、融合構築物を既に保持するＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ形質転換細胞において発現させ得る。このような発現は、ＧＰＩアンカーを有する融合構築物の、例えばＧＡＰＤＨまたはＰＧＫプロモーターの補助下での構成発現によって実現し得る。例えばＧＡＬ７プロモーターなどの誘導可能なプロモーターを含むＤＮＡ構築物を用いることにより、固定しない未結合モノマーを製造することが可能である。
実施例７
ダイズ抽出物中のラフィノース、スタキオース及び類似糖質を、酵母に固定化したα−ガラクトシダーゼ／α−アグルチニンで変換する方法
プラスミドｐＵＲ２９６９で形質転換した酵母は大規模に培養できる。培養の間一定の時間間隔で、洗浄した細胞をその表面におけるα−ガラクトシダーゼ活性の存在に関し、実施例１に述べた方法で分析するべきである。細胞密度と単位生物量当たりのα−ガラクトシダーゼ活性との両方がその最大値に達したら、酵母細胞を遠心によって回収し、洗浄し得る。洗浄した細胞はダイズ抽出物に添加し得る。酵母細胞の最終濃度は０．１ｇ／ｌから１０ｇ／ｌまでとし得るが、好ましくは前記濃度は１ｇ／ｌを上回るべきである。ダイズ抽出物の温度は酵母細胞の代謝活性を低減するべく８℃より低くするべきである。ラフィノース及びスタキオースの変換はＨＰＬＣ法で分析し得、前記糖質の９５％変換後、酵母細胞を遠心によって分離して、その生物量１ｇ当たりのα−ガラクトシダーゼ活性を測定し得る。優れた活性を有する遠心分離物は後の変換過程で用い得、一方本来の活性の５０％未満の活性しか有しない遠心分離物は増殖培地中で蘇生させ得、その際細胞は２〜４時間掛けて回復させ得る。その後、細胞を遠心し、洗浄してから、後の変換過程で用い得る。
実施例８
酵母に固定化したＨｕｍｉｃｏｌａ属リパーゼ／α−アグルチニンを用いてのバイオサーファクタントの製造
プラスミドｐＵＲ２９７２または２９７３で形質転換した酵母は大規模に培養できる。培養の間一定の時間間隔で、洗浄した細胞をその表面におけるリパーゼ活性の存在に関し、実施例１に述べた方法で分析し得る。細胞密度と単位生物量当たりのリパーゼとの両方がその最大値に達したら、酵母細胞を遠心によって回収し、洗浄し得る。洗浄した細胞は、少量の水中に懸濁させて、好ましくは炭素原子１２〜１８個の鎖長を有する脂肪酸と、好ましくはグルコース、ガラクトースまたはスクロースである糖質との混合物を収容した反応容器に加え得る。（酵母細胞中の水を除いた）水の総量は０．１％未満であり得る。酵母細胞の最終濃度は０．１ｇ／ｌから１０ｇ／ｌまでとし得るが、好ましくは前記濃度は１ｇ／ｌを上回る。反応容器は、（不飽和）脂肪酸の酸化を回避し、かつ酵母の代謝活性を最小限に留めるべくＮ2及びＣＯ2の雰囲気下に保持しなければならない。容器内の混合物の温度は、用いる脂肪酸の種類に応じて３０〜６０℃とするべきである。脂肪酸の変換はＧＬＣ法で分析し得、脂肪酸の９５％変換後、酵母細胞を遠心によって分離して、その生物量１ｇ当たりのリパーゼ活性を測定し得る。優れた活性を有する遠心分離物は後の変換過程で用い得、一方本来の活性の５０％未満の活性しか有しない遠心分離物は増殖培地中で蘇生させ得、その際細胞は２〜８時間掛けて回復させ得る。その後、細胞を再び遠心し、洗浄し、後の変換過程で用い得る。
実施例９
酵母に固定化したＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ／α−アグルチニンを用いての特定種類のトリアシルグリセロールの製造
プラスミドｐＵＲ２９８１または２９８２で形質転換した酵母は大規模に培養できる。培養の間一定の時間間隔で、洗浄した細胞をその表面におけるリパーゼ活性の存在に関し、実施例１に述べた方法で分析し得る。細胞密度と単位生物量当たりのリパーゼとの両方がその最大値に達したら、酵母細胞を遠心によって回収し、洗浄し得る。洗浄した細胞は、少量の水中に懸濁させて、様々なトリアシルグリセロール及び脂肪酸の混合物を収容した反応容器に加え得る。（酵母細胞中の水を除いた）水の総量は０．１％未満であり得る。酵母細胞の最終濃度は０．１ｇ／ｌから１０ｇ／ｌまでとし得るが、好ましくは前記濃度は１ｇ／ｌを上回る。反応容器は、（不飽和）脂肪酸の酸化を回避し、かつ酵母の代謝活性を最小限に留めるべくＮ2及びＣＯ2の雰囲気下に保持しなければならない。容器内の混合物の温度は、用いるトリアシルグリセロール及び脂肪酸の種類に応じて３０〜７０℃とするべきである。エステル交換の程度はＧＬＣ／ＭＳ法で分析し得、所望種類のトリアシルグリセロールが理論値の８０％以上生成した後、酵母細胞を遠心によって分離して、その生物量１ｇ当たりのリパーゼ活性を測定し得る。優れた活性を有する遠心分離物は後の変換過程で用い得、一方本来の活性の５０％未満の活性しか有しない遠心分離物は増殖培地中で蘇生させ得、その際細胞は２〜８時間掛けて回復させるべきである。その後、細胞を遠心し、洗浄し、後のエステル交換反応過程で用い得る。
（実施例１に述べた）プラスミドｐＳＹ１３またはプラスミドｐＵＲ２９６９で形質転換した株ＭＴ３０２／１Ｃのパン酵母はブダペスト条約に従い、それぞれ仮番号３３０．９２及び３２９．９２の下に１９９２年７月３日付でＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）に寄託した。
実施例１０
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの表面に固定化したＨｕｍｉｃｏｌａ属リパーゼ／ＦＬＯ１融合物
“分散する酵素細胞のフロックへの（可逆的）凝集”と定義されるフロキュレーション（参考文献２４参照）は、工業的発酵における酵素株の最も重要な特徴である。フロキュレーションは、細胞壁タンパク質に関連する特性であること、また定量的特性であることでも重要である。Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのフロキュレーション表現型に関連する遺伝子の一つにＦＬＯ１遺伝子が有る。この遺伝子は染色体Ｉの右端から約２４ｋｂのところに位置し、ＦＬＯ１遺伝子の主要部を含むクローンのＤＮＡ配列がつい最近決定された（参考文献２６参照）。この配列を第１１図並びに配列番号２１及び２２に示す。クローン化断片は、サザン及びノザンハイブリダイゼーションから判断してゲノムコピーより約２ｋｂ短いと考えられるが、ＦＬＯ１遺伝子の両端を含む。ＤＮＡ配列データの解析によって、推定されるタンパク質がＮ末端に、分泌のためのシグナル配列を保証する疎水性領域を有し、またＧＰＩアンカーの結合のためのシグナルとして機能し得る疎水性Ｃ末端を有し、かつ特にＣ末端に多くのグリコシル化部位を有し、任意に定義したＣ末端（アミノ酸２７１〜８９４）の４６．６％はセリン及びトレオニンであることが判明している。これらのことから、ＦＬＯ１遺伝子産物が酵母細胞壁に配向して局在し、隣接細胞との相互作用過程に直接関与し得ると考えることができる。従って、クローニングしたＦＬＯ１配列は、タンパク質またはペプチドを細胞表面に、異なる種類の細胞壁アンカーによって固定化するのに適当であり得る。
組み換え体ＤＮＡ構築物は、例えばＦＬＯ１遺伝子産物のアミノ酸２７１〜８９４をコードするＤＮＡ、即ち第１１図のポリヌクレオチド８１１〜２６８２を用いることによって得ることができる。２個のＰＣＲプライマーｐｃｒｆｌｏ１（配列番号２３参照）及びｐｃｒｆｌｏ２（配列番号２６参照）の適用により、ＤＮＡ断片の両端にＮｈｅＩ及びＨｉｎｄIII部位を導入し得る。第二のステップにおいて、ｐＵＲ２９７２（ＡまたはＢ）中に存在する、α−アグルチニンのＣ末端部をコードする１．４ｋｂのＮｈｅＩ／ＨｉｎｄIII断片を、ＦＬＯ１タンパク質のＣ末端部をコードする１．９ｋｂのＤＮＡ断片によって置き換え得、それによって得られるプラスミドｐＵＲ２９９０（第１２図参照）は（ａ）インベルターゼシグナル配列（ＳＵＣ２）と、これに後続する（ｂ）融合タンパク質とをコードするＤＮＡ配列を含み、前記融合タンパク質は（ｂ．１）Ｈｕｍｉｃｏｌａ属のリパーゼ（参考文献１６参照）と、これに後続する（ｂ．２）ＦＬＯ１タンパク質のＣ末端（アミノ酸２７１〜８９４）とから成る。
Ｈｕｍｉｃｏｌａ属リパーゼをコードする遺伝子と、ＦＬＯ１遺伝子産物のＣ末端部をコードする遺伝との枠内連結のためのＰＣＲオリゴヌクレオチド
プラスミドｐＵＲ２９７２（ＡまたはＢ）はＮｈｅＩ（部分）及びＨｉｎｄIIIで制限し得、ベクター主鎖及びリパーゼ遺伝子を含むＮｈｅＩ／ＨｉｎｄIII断片を、ＦＬＯ１配列を含むプラスミドの対応して消化したＰＣＲ生成物に連結して、ＧＡＬ７プロモーターと、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼシグナル配列と、リパーゼ／ＦＬＯ１キメラ遺伝子と、酵母２μｍ配列と、欠陥Ｌｅｕ２プロモーターと、Ｌｅｕ２遺伝子とを含むプラスミドｐＵＲ２９９０を得ることができる。このプラスミドでＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを形質転換し得、形質転換した細胞は誘導物質としてガラクトースを含有するＹＰ培地中で培養することができる。
リパーゼ／ＦＬＯ１キメラタンパク質の発現、分泌、局在及び活性は、実施例１に述べたのと同様の操作を用いて分析可能である。
〔配列表〕
配列番号：1
配列の長さ：6057
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：Saccharomyces cerevisiae(サッカロミセス・セレビシエ)
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：3653..5605
他の情報：／機能＝“有性凝集”/生成物＝“α-凝集素”
配列：
配列番号：2
配列の長さ：650
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
配列番号：3
配列の長さ：29
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：プライマーlipo1
配列：
配列番号：4
配列の長さ：33
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：部分非コーディング鎖リパーゼ
配列：
配列番号：5
配列の長さ：32
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：部分コーディング鎖リパーゼ
配列：
配列番号：6
配列の長さ：40
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：プライマーlipo2
配列：
配列番号：7
配列の長さ：894
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：Humicola lanuginosa
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：72..884
他の情報：／生成物＝“リパーゼ”
配列の特徴
特徴を表す記号：mat peptide
存在位置：72..881
他の情報：／生成物＝“リパーゼ”
配列：
配列番号：8
配列の長さ：270
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
配列番号：9
配列の長さ：55
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：プライマー
配列：
配列番号：10
配列の長さ：59
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：プライマー
配列：
配列番号：11
配列の長さ：1828
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源
生物名：Geotrichum candidum
株名：CMICC 335426
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：40..1731
他の情報：／生成物＝“リパーゼ”
配列の特徴
特徴を表す記号：sig peptide
存在位置：40..96
配列の特徴
特徴を表す記号：mat peptide
存在位置：97..1728
他の情報：／生成物＝“リパーゼ”／遺伝子＝“lipB”
配列：
配列番号：12
配列の長さ：563
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
配列番号：13
配列の長さ：36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：プライマーlipo3
配列：
配列番号：14
配列の長さ：30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：部分非コーディング鎖リパーゼII
配列：
配列番号：15
配列の長さ：38
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：部分コーディング鎖リパーゼII
配列：
配列番号：16
配列の長さ：32
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：プライマーlipo4
配列：
配列番号：17
配列の長さ：30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：プライマーlipo5
配列：
配列番号：18
配列の長さ：18
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：部分非コーディング鎖リパーゼ
配列：
配列番号：19
配列の長さ：18
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：部分コーディング鎖リパーゼ
配列：
配列番号：20
配列の長さ：28
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：プライマーlipo6
配列：
配列番号：21
配列の長さ：2685
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：Saccharomyces cerevisiae(サッカロミセス・セレビシエ)
直接の起源
クローン名：pYY105
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：1..2685
他の情報：／生成物＝“凝集タンパク質”／遺伝子＝“FLO1”
配列：
配列番号：22
配列の長さ：894
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
配列番号：23
配列の長さ：30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：プライマーpcrflol
配列：
配列番号：24
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：部分非コーディング配列FLO1
配列：
配列番号：25
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：部分コーディング配列FLO1
配列：
配列番号：26
配列の長さ：31
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：プライマーpcrflo2
配列：
発明の背景
洗剤、パーソナルケア用品及び食品の製造分野では、これらの製品の成分として天然物質を指向する傾向、及び環境的に許容可能な工程を用いる傾向が強い。酵素変換処理は全く天然で行ない得るので、上記のような消費者の要求を満たすうえで非常に重要である。そのうえ、酵素処理は非常に特異的であり、従って最少量の副産物しか生成させない。このような処理は、温和な温度及び大気圧の下で水中で実施し得る。しかし、遊離酵素に基づく酵素処理は酵素の損失に起因してきわめて高価となるか、または酵素を捕捉するウルトラメンブランシステムのような高価な設備を必要とする。
あるいは他の場合には、酵素を物理的または化学的に固定化することができる。化学的固定化法にはしばしば、非天然の化学薬剤を用い、かつ環境の観点から好ましくない方法で結合を実現するという欠点が存在する。そのうえ、酵素の化学的改変はほぼ常にさほど特異的でなく、このことは結合が酵素の活性に悪影響を及ぼす恐れが有ることを意味する。
物理的固定化は消費者の要求に適い得るが、やはり酵素の活性に悪影響を及ぼしかねない。しかも、物理的に固定化した酵素は遊離酵素と平衡し、このことは連続反応容器内では熱力学の法則に従って酵素の相当の損失が不可避であることを意味する。
微生物細胞への酵素の固定化に関する刊行物が幾つか存在する（参考文献１参照）。本発明は、酵素を微生物細胞の細胞壁に非常に正確に固定化する方法を提供する。加えて、本発明の固定化方法は何等の化学的または物理的結合ステップも必要とせず、かつ非常に効率的である。或る種の細胞外タンパク質は、該タンパク質が宿主細胞の細胞壁に結合している場合にのみ発揮し得る特別の機能を有することが知られている。この種のタンパク質はしばしば、細胞壁に固定（ａｎｃｈｏｒ）された長いＣ末端部を有する。このＣ末端部は非常に特殊なアミノ酸配列を有する。一典型例はプロリンに富んだＣ末端配列を介して固定されている（参考文献２参照）。タンパク質を細胞壁に固定させる別の機構に、タンパク質がグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを有するというもの（参考文献３参照）、及びタンパク質のＣ末端部が相当数の潜在的セリン及びトレオニングリコシル化部位を有するというものが有る。前記部位のＯ−グリコシル化は当該タンパク質のＣ末端部に棒状のコンホーメーションを付与する。このようなマンノタンパク質には、下等真核生物の細胞壁からＳＤＳで抽出できないので前記細胞壁中のグルカンに連結すると考えられるがグルカナーゼ処理によって解離し得るという特徴も有る。
発明の概要
本発明は、酵素を固定化する方法であって、組み換え体ＤＮＡ技術を用いて酵素または酵素の機能部を宿主細胞、好ましくは微生物細胞の細胞壁に連結することを含み、その際酵素または酵素の機能フラグメントを細胞壁の外側に位置させる方法を提供する。好ましくは、酵素または酵素の機能部を、細胞壁への固定を保証するタンパク質のＣ末端部への連結によって固定化する。
本発明はその一実施態様において、触媒活性を具えたタンパク質をコードする構造遺伝子と、真核または原核細胞の細胞壁に固定し得るタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも一部分とを含み、前記一部分は前記固定（またはアンカー）タンパク質の少なくともＣ末端部をコードする組み換え体ポリヌクレオチドを提供する。好ましくはこのポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの発現産物の分泌を保証するシグナルペプチドをコードする配列も含む。上記のようなシグナルペプチドは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカータンパク質、α因子、α−アグルチニン、インベルターゼもしくはイヌリナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属のα−アミラーゼ、または乳酸菌のプロテイナーゼに由来し得る。細胞壁に固定し得るタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、α−アグルチニン、ＡＧＡ１、ＦＬＯ１、もしくは下等真核生物の主要細胞壁タンパク質（Ｍａｊｏｒ Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、または乳酸菌のプロテイナーゼをコードし得る。本発明の組み換え体ポリヌクレオチドはプロモーター、好ましくは誘導可能なプロモーターに作動的に連結されている。触媒活性を具えたタンパク質をコードするＤＮＡ配列は加水分解酵素、例えばリパーゼかオキシドレダクターゼ、例えばオキシダーゼをコードし得る。
本発明はその別の実施態様において、上述のポリヌクレオチドを含む組み換え体ベクターも提供する。このベクターは、触媒活性を具えたタンパク質でマルチマー形態（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ ｆｏｒｍ）で存在する時にその触媒活性を呈示するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む場合、触媒活性を具えた同じタンパク質をコードする構造遺伝子を含む第二のポリヌクレオチドもこの第二のポリヌクレオチドの発現産物の分泌を保証するシグナルペプチドをコードする配列と組み合わせて含み得、その際第二のポリヌクレオチドは調節可能なプロモーター、好ましくは誘導または抑制可能なプロモーターに作動的に連結されている。
本発明は更に別の実施態様において、先に述べたポリヌクレオチドによってコードされたキメラタンパク質も提供する。
先に述べたポリヌクレオチドまたは先に述べたベクターを保持する宿主細胞、好ましくは微生物も本発明の一態様である。触媒活性を具えたタンパク質がマルチマー形態で存在する時にその触媒活性を呈示する場合、上記宿主細胞または微生物は触媒活性を具えた同じタンパク質をコードする構造遺伝子を含む第二のポリヌクレオチドもこの第二のポリヌクレオチドの発現産物の分泌を保証するシグナルペプチドをコードする配列と組み合わせて保持し得、その際第二のポリヌクレオチドは調節可能なプロモーター、好ましくは誘導または抑制可能なプロモーターに作動的に連結されており、かつ別のベクター中にか、または微生物の染色体中に存在する。好ましくは、上記宿主細胞または微生物は上述のポリヌクレオチドのうちの少なくとも一つをその染色体中に組み込まれている。そのような宿主細胞または微生物を培養することによって本発明は、先に述べたタンパク質がその細胞壁に固定化された宿主細胞、好ましくは微生物を提供する。宿主細胞または微生物は下等真核生物、特に酵母であり得る。
本発明は、固定化した触媒活性タンパク質を用いて酵素処理を行なう方法であって、前記触媒活性タンパク質の基質を本発明による宿主細胞または微生物と接触させる方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
第１図はＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの完全なＡＧα１遺伝子を含む６０５７ｂｐのＨｉｎｄIII断片のＤＮＡ配列示す（配列番号１及び２参照）。本明細書に説明した構築に用いる非反復ＮｈｅＩ部位及びＨｉｎｄIII部位の位置をヘッダにおいて特定する。
第２図はｐＵＲ２９６９の構築の概略的説明図である。用いたエンドヌクレアーゼの制限部位を示す。
使用略号：
ＡＧ−ａｌｐｈａ−１：Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のα−アグルチニンを発現する遺伝子。
ａｍｐ：β−ラクタマーゼ耐性遺伝子。
ＰＧＫｐ：ホスホグリセレートキナーゼプロモーター。
ＰＧＫｔ：同遺伝子のターミネーター。
第３図はバッチ培養の間にｐＳＹ１３で形質転換したＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＴ３０２／１Ｃ細胞及び培養液のα−ガラクトシダーゼ活性を示す。
Ａ：単位時間当たりのＵ／ｌα−ガラクトシダーゼ。ＯＤ530も示す。
Ｂ：Ｕ／ＯＤ530で表わした遊離及び結合酵素のα−ガラクトシダーゼ活性。
第４図はバッチ培養の間にｐＵＲ２９６９で形質転換したＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＴ３０２／１Ｃ細胞及び培養液のα−ガラクトシダーゼ活性を示す。
Ａ：単位時間当たりのＵ／ｌα−ガラクトシダーゼ。ＯＤ530も示す。
Ｂ：Ｕ／ＯＤ530で表わした遊離及び結合酵素のα−ガラクトシダーゼ活性。
第５図は指数増殖期の細胞（ＯＤ530＝２）の細胞外画分を抗α−ガラクトシダーゼ血清でウェスタン分析した結果を示す。分析した画分はいずれも４ｍｇ細胞壁（新鮮重量）に相当する。
Ａ：α−ガラクトシダーゼを発現させるＭＴ３０２／１Ｃ。
レーン１；増殖培地
レーン２；単離した細胞壁のＳＤＳ抽出物
レーン３；ＳＤＳ抽出細胞壁のグルカナーゼ抽出物
Ｂ：α−Ｇａｌ−ＡＧα１融合タンパク質を発現させるＭＴ３０２／１Ｃ。
レーン１；増殖培地
レーン２；単離した細胞壁のＳＤＳ抽出物
レーン３；ＳＤＳ抽出細胞壁のグルカナーゼ抽出物
レーン４；Ｅｎｄｏ−Ｈ処理したグルカナーゼ抽出物
第６図はα−Ｇａｌ−α−アグルチニン融合タンパク質を発現させる指数増殖期のＭＴ３０２／１Ｃ細胞（ＯＤ530＝２）の免疫蛍光標識（抗α−ガラクトシダーゼ）を示す完全細胞の位相差顕微鏡写真である。
Ａ：概観。
Ｂ：細部。
第７図はｐＵＲ２９７０Ａ、ｐＵＲ２９７１Ａ、ｐＵＲ２９７２Ａ及びｐＵＲ２９７３の構築の概略的説明図である。用いたエンドヌクレアーゼの制限部位を図示する。ＰＣＲオリゴヌクレオチド配列については本文中で言及する。
使用略号：
ＡＧａ１ ｃｄｓ：α−アグルチニンのコーディング配列。ａ−ＡＧＧ＝ＡＧａ１：Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のα−アグルチニンを発現する遺伝子。
ａｍｐ：β−ラクタマーゼ耐性遺伝子。
Ｐｇａ１７＝ＧＡＬ７：ＧＡＬ７プロモーター。
ｌｉｐｏｌａｓｅ：Ｈｕｍｉｃｏｌａ属のリパーゼ遺伝子。
ｉｎｖＳＳ：ＳＵＣ２シグナル配列。
ａ−ＭＦ：プレプロ−α−接合因子配列。
ａ−ｇａｌ：α−ガラクトシダーゼ遺伝子。
ＬＥＵ２ｄ：ＬＥＵ２遺伝子の截頭（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）プロモーター。
ＬＥＵ２：完全なプロモーター配列を伴ったＬＥＵ２遺伝子。
第８図はＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ株３３５４２６のリパーゼＢの完全なコーディング配列を含む断片のＤＮＡ配列を示す（配列番号１１及び１２参照）。成熟リパーゼＢの配列は、図示した配列の９７位のヌクレオチドから始まる。コーディング配列は４０位のヌクレオチド（ＡＴＧ）から始まる。
第９図はｐＵＲ２９７５及びｐＵＲ２９７６の構築の概略的説明図である。用いたエンドヌクレアーゼの制限部位を示す。
使用略号：
ａ−ＡＧＧ：Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のα−アグルチニンを発現する遺伝子。
ａｍｐ：β−ラクタマーゼ耐性遺伝子。
Ｐｇａ１７＝ＧＡＬ７：ＧＡＬ７プロモーター。
ｉｎｖＳＳ：ＳＵＣ２シグナル配列。
ａ−ＭＦ：プレプロ−α−接合因子配列。
ＬＥＵ２ｄ：ＬＥＵ２遺伝子の截頭プロモーター。
ｌｉｐｏｌａｓｅ：Ｈｕｍｉｃｏｌａ属のリパーゼ遺伝子。
ｌｉｐａｓｅＢ：Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍのリパーゼＢ遺伝子。
第１０図はｐＵＲ２９８１及びｐＵＲ２９８２の構築の概略的説明図である。用いたエンドヌクレアーゼの制限部位を示す。
使用略号：
ａ−ＡＧＧ＝ＡＧ−ａｌｐｈａ１：Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のα−アグルチニンを発現する遺伝子。
ｍｕｃｏｒ ｌｉｐａｓｅ：Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉのリパーゼ遺伝子。
２ｕ：２μｍ配列。
Ｐｇａ１７＝ＧＡＬ７：ＧＡＬ７プロモーター。
ｉｎｖＳＳ：ＳＵＣ２シグナル配列。
ａ−ＭＦ：プレプロ−α−接合因子配列。
ｌｉｐｏｌａｓｅ：Ｈｕｍｉｃｏｌａ属のリパーゼ遺伝子。
ａｍｐ：β−ラクタマーゼ耐性遺伝子。
ＬＥＵ２ｄ：ＬＥＵ２遺伝子の截頭プロモーター。
ＬＥＵ２：完全なプロモーター配列を伴ったＬＥＵ２遺伝子。
第１１図はＦＬＯ１遺伝子の８９４アミノ酸コーディング部のＤＮＡ配列（２６８５塩基）を示す（配列番号２１及び２２参照）。図示した配列は、最初のアミノ酸のコドンで始まり、終結コドンで終わる。
第１２図はプラスミドｐＵＲ２９９０を示す概略的説明図である。図中に記したクローニング手順に関連するエンドヌクレアーゼの幾つかの制限部位を示す。
第１３図はプラスミドｐＵＲ７０３４を示す概略的説明図である。
第１４図はプラスミドｐＵＲ２９７２Ｂを示す概略的説明図である。
第１５図はｌｉｐｏｌａｓｅ／α−アグルチニン融合タンパク質を発現させる指数増殖期のＳＵ１０細胞（ＯＤ530＝０．５）の免疫蛍光標識（抗ｌｉｐｏｌａｓｅ）を示す。
Ａ：位相差顕微鏡写真。
Ｂ：整合蛍光顕微鏡写真。
発明の詳細な説明
本発明は、酵素を固定化する方法であって、組み換え体ＤＮＡ技術を用いて酵素または酵素の機能部を宿主細胞、好ましくは微生物細胞の細胞壁に固定化することを含む方法を提供する。特に、酵素または酵素の機能部を、細胞壁への固定を保証するタンパク質のＣ末端部に、酵素が細胞表面上または細胞表面の僅かに上方に位置するように結合する。このようにして酵素を細胞の表面に固定化する。上記結合は遺伝子レベルで行ない、この遺伝子レベルの結合は、酵素をコードする構造遺伝子をアンカータンパク質をコードする遺伝子の少なくとも一部に、発現産物において酵素のＣ末端がアンカータンパク質のＣ末端部に結合するように結合させるという特徴を有する。好ましくはキメラ酵素の上流に、キメラタンパク質の効率的な分泌を保証するシグナル配列を配置する。
即ち本発明は、触媒活性を具えたタンパク質をコードする構造遺伝子と、真核または原核細胞の細胞壁に固定し得るタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも一部分とを含む組み換え体ポリヌクレオチドを提供し、その際前記一部分は前記固定（即ちアンカー）タンパク質の少なくともＣ末端部をコードする。アンカータンパク質のＣ末端部の長さは様々であり得る。この構造タンパク質の全体を用いることは可能であるが、一部しか用いない方が好ましく、その場合細胞を取り巻く培地中での酵素タンパク質のより効率的な暴露が実現する。アンカータンパク質の固定部は、好ましくはその全体が存在するべきである。一例として、アンカータンパク質のＣ末端部のおよそ半分を用い得る。
好ましくは、上記ポリヌクレオチドは更に、該ポリヌクレオチドの発現産物の分泌を保証するシグナルペプチドをコードする配列も含む。シグナルペプチドはＧＰＩアンカータンパク質、α因子、α−アグルチニン、インベルターゼもしくはイヌリナーゼ、ｂａｃｉｌｌｕｓ属のα−アミラーゼ、または乳酸菌のプロテイナーゼに由来し得る。
細胞壁に固定し得るタンパク質は好ましくは、α−アグルチニン、ＡＧＡ１、ＦＬＯ１（凝集タンパク質）、下等真核生物の主要細胞壁タンパク質、及び乳酸菌のプロテイナーゼの中から選択する。本発明のポリヌクレオチドは好ましくは、プロモーター、好ましくは調節可能なプロモーターで特に誘導可能なプロモーターに作動的に連結されている。
本発明は、上述のポリヌクレオチドを含み組み換え体ベクター、及び前記ポリヌクレオチドまたは前記ベクターを保有する宿主細胞も提供する。オキシドレダクターゼに関してあり得るような、触媒活性を具えたタンパク質がマルチマー形態で存在する時にその触媒活性を呈示するという特別の場合には、モノマーのダイマー化またはマルチマー化が活性の必要条件となり得る。その場合、ベクター及び／または宿主細胞は触媒活性を具えた同じタンパク質をコードする構造遺伝子を含む第二のポリヌクレオチドも、この第二のポリヌクレオチドの発現産物の分泌を保証するシグナルペプチドをコードする配列と組み合わせて有し得、その際第二のポリヌクレオチドは調節可能なプロモーター、好ましくは誘導または抑制可能なプロモーターに作動的に連結されている。第一のポリヌクレオチドの発現及び分泌の後に第二のポリヌクレオチドの発現及び分泌が起こることによって、細胞壁の外側に活性なマルチマーが生成する。宿主細部または微生物は先に述べた本発明のポリヌクレオチドを、または組み合わせの場合は上記ポリヌクレオチドのうちの少なくとも一つを、好ましくはその染色体中に組み込まれた状態で保持する。
本発明は特に、非常に安定な細胞壁を有し、かつ細胞壁に固定されていることが知られているタンパク質、例えばα−アグルチニンや遺伝子ＦＬＯ１の産物を有する酵母のような下等真核生物に係わる。適当な酵母は、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属する。真菌、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属及びＲｈｉｚｏｐｕｓ属も用い得る。用途によっては原核生物も適用可能である。
酵母の場合、本発明は特に、
ａ．例えばα因子遺伝子、インベルターゼ遺伝子、α−アグルチニン遺伝子またはイヌリナーゼ遺伝子に由来するシグナル配列と、
ｂ．α−ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ペクチナーゼ、ペクチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、エステラーゼ及びリパーゼなどの加水分解酵素、またはオキシダーゼなどの非加水分解酵素をコードする構造遺伝子と、
ｃ．α−アグルチニン（参考文献４参照）、ＡＧＡ１（参考文献５参照）及びＦＬＯ１（本願出願前未公表の参考文献６参照）などの典型的な細胞壁結合タンパク質のＣ末端と
から成るキメラ酵素をコードする遺伝子に係わる。
このような遺伝子の発現は構成プロモーターの制御下に置くことができるが、プロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属ではＧＡＬ７プロモーター、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属ではイヌリナーゼプロモーター、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属ではメタノール−オキシダーゼプロモーターといった調節可能な、即ち抑制または誘導可能なプロモーターの方がより好ましい。
構築物は好ましくは、新しい遺伝情報が宿主細胞の染色体中に安定に組み込まれるように形成される。
本発明は、上述のキメラタンパク質が細胞壁に固定化された宿主細胞、特に微生物も提供する。本発明はまた、そのような微生物の、酵素の基質を当該微生物と接触させることによる酵素処理の実施への使用も提供する。前記処理は、例えば充填カラム内で微生物を固体粒子に支持させて実施するか、または反応容器内で攪拌下に実施し得る。反応は水性であっても非水性であってもよい。必要であれば、酵素の機能に必要な添加物、例えば補因子を反応媒質中に導入し得る。
自然に固定化された酵素系を処理において繰り返し用いると、系の性能が低下する恐れが有る。これは、酵素が物理的に変性するか、または化学的に有毒化したり、脱着したりすることによる。本発明は特に、使用した系を反応媒質から単なる遠心または膜濾過技術によって回収できること、及びそのようにして集めた細胞を回復媒質に移し得、この媒質中で細胞は急速に再生し、それと共にキメラタンパク質が生成し、このようにして細胞の表面が完全に活性な固定化酵素によって覆われることが保証されることを特徴とする。上記再生法は単純かつ安価であり、従って酵素処理の経済性を改善し、固定化酵素系に基づく処理の用途をはるかに拡張し得る。
しかし、本発明は決して固定化酵素の再利用性に限定されない。
本発明を、本発明の範囲を限定しない以下の実施例によって詳述する。
実施例１
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの表面に固定したα−ガラクトシダーゼ／α−アグルチニン
α−アグルチニンをコードする遺伝子についてはＬｉｐｋｅ等が述べている（参考文献４参照）。ＡＧα１遺伝子の全体を含む、ｐＴＺ１８Ｒ中の６０５７ｂｐのＨｉｎｄIII挿入体の配列を第１図に示す。コーディング配列は６５０アミノ酸を越えて伸張し、３６５３位のヌクレオチドからＡＴＧをもって始まる推定シグナル配列を含む。非反復ＮｈｅＩ部位がこのＤＮＡを、アミノ酸３３０をコードする部分内で上記コーディング配列の９８８位において切断し、それによってα−アグルチニンをほぼ同寸法のＮ末端部とＣ末端部とに分割する。
ｐＵＲ２９６８（第２図参照）をＮｈｅＩ／ＨｉｎｄIIIで消化することによって、推定される細胞壁アンカーの配列情報を担った１．４ｋｂ断片を放出させた。α−ガラクトシダーゼへの融合のために、ＳＵＣ２インベルターゼシグナル配列に後続するα−ガラクトシダーゼ配列を含む、ＹＥｐｌａｃ１８１に基づくエピソームベクターであるプラスミドｐＳＹ１６を用い、これを構成ＰＧＫプロモーターとＰＧＫターミネーターとの間に配置した。α−ガラクトシダーゼ遺伝子の読み取り枠の最後の９塩基対中に存在するＳｔｙＩ部位をＡＧα１遺伝子断片のＮｈｅＩ部位に連結した。枠内融合を確実にするため、ＳｔｙＩ／ＨｉｎｄIIIで消化したｐＳＹ１３への連結前にＳｔｙＩ部位を充填し、かつＮｈｅＩ部位の５′オーバーハングを除去した（第２図参照）。
新しいプラスミドの適正構築を確認するため、大腸菌ＪＭ１０９（ｒｅｃＡ１ ｓｕｐＥ４４ ｅｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１ ｔｈｉ ▲（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ） Ｆ′［ｔｒａＤ３６ ｐｒｏＡＢ + ｌａｃＩ q ｌａｃＺ▲Ｍ１５］）（参考文献７参照）をシャトルベクターで、Ｃｈｕｎｇ等が述べている形質転換プロトコル（参考文献８参照）により形質転換した。陽性クローンのうちの、記号ｐＵＲ２９６９を付した一つを更に特性付け、ＤＮＡをＱｕｉａｇｅｎプロトコルに従って単離及び精製し、その後ＤＮＡ配列決定によって特性付けた。ＤＮＡ配列決定は主としてＳａｎｇｅｒ等（参考文献９参照）及びＨｓｉａｏ（参考文献１０参照）が述べているようにして行ない、その際ここではＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｌｃ）及び［35Ｓ］ｄＡＴＰαＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｌｃ：３７０ ＭＢｑ／ｍｌ；２２ ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）を用いるプロトコルに従いＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ＣｏｍｐａｎｙのＳｅｑｕｅｎａｓｅバージョン２．０キットを用いた。
次に、このプラスミドでＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＭＴ３０２／１Ｃを、Ｋｌｅｂｅ等のプロトコル（参考文献１１参照）に従って形質転換した。
酵母形質転換細胞を、ロイシンを存在させない選択プレート上に４０μｌ（ＤＭＦ ２０ｍｇ／ｍｌ）載せて選択した。Ｘ−α−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコース；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を塗り広げ、α−ガラクトシダーゼ活性について直接試験した（参考文献１２参照）。キメラタンパク質の発現、分泌、局在及び活性を証明するべく、次の分析を行なった。
１．発現及び分泌
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＭＴ３０２／１Ｃを、Ｃｙａｍｏｐｓｉｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂａのα−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＳＹ１３か、またはα−ガラクトシダーゼ／α−アグルチニン融合構築物を含むプラスミドｐＵＲ２９６９で形質転換した。バッチ培養の間α−ガラクトシダーゼ活性を、洗浄した細胞と増殖培地とにおいて測定した。結果を第３図及び第４図に示す。プラスミドｐＳＹ１３を保持する酵母細胞から発現されたα−ガラクトシダーゼは大部分が専ら増殖培地中に存在した（第３図のＡ）が、α−ガラクトシダーゼ−α−アグルチニン融合タンパク質の方は大部分が専ら細胞に結合していた（第４図のＡ）。そのうえ、固定化された、細胞壁に結合したα−ガラクトシダーゼ−α−アグルチニン融合酵素は全インキュベーション時間にわたって完全な活性を維持したが、分泌及び放出された酵素は６５時間のインキュベーション後に約９０％の活性を失った。このことは、上述の酵素を酵母の細胞壁に固定化すれば該酵素を、おそらくはプロテイナーゼによる不活性化から保護することになり、それによって安定性が著しく向上することを示している。更に、様々な遺伝子産物の局在に関してウェスタン分析により考察した。即ち、細胞を遠心によって集収し、０℃においてｐＨ７．８の１０ｍＭトリス・ＨＣ１、及び１ｍＭ ＰＭＳＦで洗浄し、後の諸ステップは前記と同じ温度で実施した。細胞１ｇ（湿潤重量）当たり３ｍｌの単離緩衝液と１０ｇのガラスビーズとを添加した。混合物をＧｒｉｆｆｉｎ振盪機において、該振盪機の最高速度の５０％の速度で３０分間振盪した。上清を単離し、ガラスビーズを１Ｍ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＰＭＳＦで洗液が澄むまで洗浄した。上清及び洗液をプールした。細胞壁を遠心によって回収し、その後１ｍＭ ＰＭＳＦで洗浄した。
２％ ＳＤＳ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ及び４０ｍＭ β−メルカプトエタノールを含有するｐＨ７．８の５０ｍＭトリス・ＨＣｌ中での５分間の煮沸によって細胞壁に、共有結合以外で結合したタンパク質、またはジスルフィド架橋を介して結合したタンパク質を放出させた。１０ｍｇ（湿潤重量）の細胞壁を、１ｍＭ ＰＭＳＦを含有するｐＨ５．０の１００ｍＭ酢酸ナトリウム２０ｌ中に取り上げた。これに０．５ｍＵのβ−１，３−グルカナーゼ（Ｌａｍｉｎａｒａｓｅ；Ｓｉｇｍａ Ｌ５１４４）を添加し、続いて３７℃で２時間インキュベーションした。その後、再び０．５ｍＵのβ−１，３−グルカナーゼを添加してから３７℃で更に２時間インキュベートした。
タンパク質を、５分間煮沸してからＥｎｄｏ−Ｈ処理を施すことによって変性させた。２ｍｇのタンパク質を、１００ｍＭ β−メルカプトエタノール及び０．５ｍＭ ＰＭＳＦを含有するｐＨ５．５の５０ｍＭリン酸カリウム１ｍｌ中で４０ｍＵのＥｎｄｏ−Ｈ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）と共に３７℃で４８時間インキュベートした。その後、２０ｍＵのＥｎｄｏ−Ｈを添加してから３７℃で２４時間インキュベートした。
タンパク質を、２．２−２０％勾配ゲルにおいてＬａｅｍｍｌｉ（参考文献１３参照）に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ゲルを、Ｔｏｗｂｉｎ等が述べているＩｍｍｏｂｉｌｏｎポリビニリデン−ジフルオリド膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上への電気泳動転移によってブロッティングした（参考文献１４参照）。高度にグリコシル化したタンパク質の場合は、その後、５０ｍＭ過ヨウ酸、ｐＨ４．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム中で４℃で数時間、温和な過ヨウ酸塩処理を施した。後のインキュベーションは総て室温で行なった。ブロットを、０．５％のゼラチン及び０．５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中で１時間ブロックし、続いて１：２００に稀釈した血清を含有するプローブ緩衝液（ＰＢＳ； ０．２％ゼラチン、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で１時間インキュベーションを行なった。その後、ブロットを洗浄緩衝液（ＰＢＳ； ０．２％ゼラチン、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で数回洗浄し、続いて125Ｉ標識タンパク質Ａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含有するプローブ緩衝液中で１時間インキュベーションを行なった。洗浄緩衝液中で数回洗浄後、ブロットを風乾し、Ｓａｒａｎ（Ｄｏｗ）に包み、これを用いて−７０℃において、増感スクリーンを具備したＸ−ｏｍａｔ Ｓフィルム（Ｋｏｄａｋ）を露光した。Ｏｍｎｉｍｅｄｉａ ６ｃｘスキャナ及びＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐプログラムを用いて、標識されたタンパク質を定量した。両形質転換細胞からタンパク質を単離した様々な操作の結果を第５図に示す。プラスミドｐＳＹ１３を保持する形質転換細胞の場合、酵素は全般に培地中に局在し、その際少量の酵素のみが細胞壁に、結合したというよりは捕捉された（第５図のＡ）−この酵素はＳＤＳ抽出によって完全に除去可能−が、融合タンパク質の方は細胞壁に強固に結合し、少量のα−ガラクトシダーゼ／α−アグルチニンのみが周囲の培養液中に放出され、またはＳＤＳ抽出可能であった。遊離α−ガラクトシダーゼを発現させる細胞からの細胞壁のラミナリナーゼ抽出ではそれ以上の酵素解離は観察されなかったことに対して、融合酵素発現細胞に同じ処理を施すと融合酵素は全般に解離した。このことは、融合タンパク質はα−アグルチニン同様Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞壁グルカンと強固に結合するが、α−ガラクトシダーゼ単独ではそのようなことはないということを示している。後から行なったＥｎｄｏ−Ｈ処理は融合タンパク質の著しいグリコシル化を示したが、これは先に説明した、α−アグルチニンのＣ末端部の拡大グリコシル化と完全に一致する結果であった。
２．局在
抗α−ガラクトシダーゼ血清での免疫蛍光標識を完全細胞に対して行ない、それによって細胞壁におけるα−ガラクトシダーゼ／α−アグルチニン融合タンパク質の存在及び分布を測定した。免疫蛍光標識は、Ｗａｔｚｅｌｅ等による固定（参考文献５参照）はせずに行なった。ＯＤ530＝２の細胞を単離し、ＴＢＳ（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ及び２０μｇ／ｍｌシクロヘキシミドを含有するｐＨ７．８の１０ｍＭトリス・ＨＣｌ）中で洗浄した。細胞をＴＢＳ＋抗α−ガラクトシダーゼ血清中で１時間インキュベートし、続いてＴＢＳ中で数回洗浄した。その後、ＦＩＴＣと結合させた抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を添加して３０分間、インキュベーションを行なった。ＴＢＳ中で洗浄後、細胞を、１ｍｇ／ｍｌのｐ−フェニレンジアミン及び０．１％のアジドを含有するｐＨ９．０の１０ｍＭトリス・ＨＣｌ中に取り、Ｚｅｉｓｓ ６８０００顕微鏡において写真撮影した。この分析の結果を示す第６図からは、α−ガラクトシダーゼ／α−アグルチニンキメラが酵母細胞の表面に局在することが明らかである。非常に小さいものまで非常に均一に標識された様々な大きさのバッド（ｂｕｄｓ）が、融合酵素が全細胞周期を通じて連続的に細胞壁中に取り込まれ、かつ瞬時に強固に結合することを明示している。
３．活性
α−ガラクトシダーゼ活性を定量的に評価するべく、ｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸ナトリウム及び１０ｍＭ ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｓｉｇｍａ）を含有する２００μｌ試料を３７℃で正確に５分間インキュベートした。１ｍｌの２％炭酸ナトリウムの添加によって反応を停止させた。先に述べたように遠心によって分離し、かつ単離及び洗浄した完全細胞及び細胞壁からα−ガラクトシダーゼ活性を、４１０ｎｍにおいて１８．４ｃｍ2／ｍｏｌであるｐ−ニトロフェノールの消衰係数を用いて算出した。１単位を、３７℃における１分間当たりの基質１μｍｏｌの加水分解と定義した。
注記：本実施例の主旨は優先権主張年中にＭ．Ｐ．Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ等によって公表された（参考文献２５参照）。
実施例２Ａ
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの表面に固定化したＨｕｍｉｃｏｌａ属リパーゼ／α−アグルチニン（固定化酵素系の誘導発現）
α−アグルチニンのＣ末端部を含む１．４ｋｂのＮｈｅＩ／ＨｉｎｄIII断片の構築及び単離は実施例１に述べた。プラスミドｐＵＲ７０２１は、市販ベクターｐＴＺ１８ＲのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII制限部位にクローニングされた長さ８９４ｂｐの、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属のリパーゼをコードする合成ＤＮＡ断片（参考文献１６並びに配列番号７及び８参照）を含む（第７図参照）。成熟リパーゼをコードするＤＮＡ部分の５′末端と３′末端との両方を１ステップで適正に改変するのにＰＣＲ技術を適用し得る。従って、標準的ＰＣＲプロトコルにおいてＤＮＡオリゴヌクレオチドｌｉｐｏ１（配列番号３参照）及びｌｉｐｏ２（配列番号６参照）をプライマーとして用いて、両末端にＥａｇＩ制限部位及びＨｉｎｄIII制限部位をそれぞれ有する長さ８２６ｂｐのＤＮＡ断片を生じさせ得、この断片を、本明細書中で先に述べたインベルターゼシグナル配列に後続するα−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミドであるＥａｇＩ／ＨｉｎｄIII消化ｐＵＲ２６５０の大きい方の部分と組み合わせることによりプラスミドｐＵＲ２９７０Ａを生じさせ得る（第７図参照）。
Humicola属リパーゼとα−アグルチニンのC末端との枠内連結のためのPCRオリゴヌクレオチド
a．SUC2シグナル配列とリパーゼのN末端との間の転移（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）のためのPCRオリゴヌクレオチド
リパーゼ／α−アグルチニンキメラの発現、分泌、局在及び活性の分析は、実施例１に述べたのと同様の操作を用いて可能である。
同様にして、ｒＤＮＡ技術を介して得られるＨｕｍｉｃｏｌａ属リパーゼの変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）をα−アグルチニンのＣ末端部に結合することも可能であり、前記変異体はエステル化反応またはエステル交換反応の間、より高い安定性を有し得る。
実施例２Ｂ
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの表面に固定化したＨｕｍｉｃｏｌａ属リパーゼ／α−アグルチニン（固定化酵素系の誘導発現）
実施例２Ａでは、特定構築物を製造するプロトコルを説明する。研究を行なう前、本実施例２Ｂでの構築手順が実施例２Ａでの構築手順と僅かな点でしか異ならず、しかも得られるプラスミドは実施例２Ａに述べたものと同等でないように実施例１に述べた発現ベクターを用いることが好ましいと考えられた。しかし、プロモーターと、シグナル配列と、融合タンパク質をコードする構造遺伝子とを含む実質的な遺伝子構築物は実施例２Ａと実施例２Ｂとで同じである。
１．構築
α−アグルチニン細胞壁タンパク質のＣ末端部をコードする１．４ｋｂのＮｈｅＩ／ＨｉｎｄIII断片の構築及び単離は実施例１に述べた。市販のベクターｐＴＺ１８ＲをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIIIで処理し、得られるベクター断片を、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属のリパーゼをコードする長さ８９４ｂｐの合成ＤＮＡ ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII断片と連結することによって、（実施例２ＡのｐＵＲ７０２１に類似する）プラスミドｐＵＲ７０３３を調製した（配列番号７及び８並びに参考文献１６参照）。
リパーゼをα−アグルチニンのＣ末端の、細胞壁アンカーを含む領域に融合させるために、プラスミドｐＵＲ７０３３をＥａｇＩ及びＨｉｎｄIIIで消化し、リパーゼコーディング配列を単離して、ＥａｇＩ及びＨｉｎｄIIIで消化した酵母発現ベクターｐＳＹ１（参考文献２７参照）中に連結し、それによってｐＵＲ７０３４を生じさせた（第１３図参照）。これは実施例１に述べた、誘導可能なＧＡ１７プロモーターの制御下にインベルターゼ（ＳＵＣ２）シグナル配列に後続するα−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む２μｍエピゾーム発現ベクターである。
上述の消化に並行して、ｐＵＲ７０３３をＥｃｏＲＶ及びＨｉｎｄIIIでも消化し、それによって最後の１５個のカルボキシル末端アミノ酸のためのコドンを有する長さ５７ｂｐのＤＮＡ断片を解離させた。この断片を配列番号９及び１０の、化学的に合成した２個のデオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって生じさせた小さいＤＮＡ断片に対して交換した。両ＤＮＡ鎖のアニーリング後、これら２個のオリゴヌクレオチドは最初のリパーゼ遺伝子の３′コーディング配列の残部を実質的に再構成するが、リパーゼ遺伝子の下流に新たなＮｈｅＩ制限部位を導入し、これにＨｉｎｄIII部位が近接して続き、その際ＮｈｅＩ部位の最初の３個のヌクレオチドはリパーゼの最後のアミノ酸のコドンを構成する。得られたプラスミドに記号“ｐＵＲ２９７０Ｂ”を付した。次に、この構築中間体をＥａｇＩ及びＮｈｅＩで消化し、リパーゼコーディング断片を単離してｐＵＲ２９６８の１．４ｋｂのＮｈｅＩ／ＨｉｎｄIII断片と共にＥａｇＩ及びＨｉｎｄIII切断ｐＳＹ１ベクター中に連結した。この三点連結によって得られた最終的なｌｉｐｏｌａｓｅ−α−アグルチニン酵母発現ベクターを“ｐＵＲ２９７２Ｂ”と命名した（第１４図参照）。
このプラスミドを用いて、参考文献１７に記載されたＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＳＵ１０を形質転換し、形質転換細胞を、リパーゼ／α−アグルチニンキメラ遺伝子の発現を惹起する誘導物質としてガラクトースを抑制量のグルコースの不在下に含有するＹＰ培地中で培養した。
２．活性
リパーゼ活性を定量するべく、２種の別個の基質に関して２種の活性測定を行なった。いずれの場合も、プラスミドｐＵＲ７０３４またはｐＳＹ１で形質転換したＳＵ１０酵母細胞を対照として用いた。従って、プラスミドｐＳＹ１、プラスミドｐＵＲ７０３４またはプラスミドｐＵＲ２９７２Ｂを保持する形質転換酵母細胞を、ヒスチジン及びウラシルを添加したＹＮＢ−グルコース培地中で２４時間増殖させ、その後５％ガラクトースを添加したＹＰ培地中で１：１０に稀釈し、再び培養した。３０℃で２４時間のインキュベーション後、上記両アッセイのための第一の測定を行なった。
適用した第一のアッセイはｐＨスタット法であった。このアッセイではリパーゼ活性の１単位を、ラジオメーターｐＨスタット装置（ｐＨＭ ８４メーター、ＡＢＵ ８０自動ビュレット、ＴＴＡ ６０滴定アセンブリー）において標準的なアッセイ条件（１：１ ｗ／ｗアラビアゴムで乳化した純粋なトリオレエートと看做される３８ｍＭのオリーブ油と、２０ｍＭの塩化カルシウムと、４０ｍＭの塩化ナトリウムと、５ｍＭのトリスとを含有する３０ｍｌアッセイ溶液、ｐＨ９．０、３０℃）下にトリグリセリド基質から毎分１μｍｏｌの脂肪酸を遊離させ得る酵素量と定義する。生じた脂肪酸を０．０５Ｎ ＮａＯＨで滴定し、測定した活性は推定酵素バッチの添加後１〜２分間隔でのアルカリ消費に基づくものであった。固定化リパーゼ活性について試験するべく、１ｍｌの各培養物を遠心し、上清を取り分け、ペレットを１ｍｌの１Ｍソルビトール中に再懸濁させて洗浄し、その後再び遠心し、かつ２００μｌの１Ｍソルビトール中に再懸濁させた。各種の酵母細胞から得た最初の上清及び洗浄した細胞をリパーゼ活性について試験した。
Ａ: 24時間後のリパーゼ活性(LU/ml)
この一連の測定は、リパーゼ−α−アグルチニン融合タンパク質をコードするプラスミドを保持する酵母細胞が実際上、酵母細胞に関係付けられる幾分かのリパーゼ活性を呈することを示している。
リパーゼの活性が酵母細胞表面に固定化されることを更に確認するべく、付加的な第二のアッセイを行なった。手短に言えばこのアッセイでは、ＰＮＰ（＝パラニトロフェニル）のＰＮＰ−ブチレートからの遊離の反応速度を４００ｎｍにおけるＯＤの測定によって決定する。従って、ｐＳＹ１、ｐＵＲ７０３４またはｐＵＲ２９７２Ｂを保持する酵母細胞を含有する培養物１０ｍｌを遠心し、ペレットを４ｍｌの緩衝液Ａ（ｐＨ５．０の０．１Ｍ ＮａＯＡｃ、及び１ｍＭ ＰＭＳＦ）中に再懸濁させ、この４ｍｌのうちの５００μｌを再び遠心し、かつ５００μｌのＰＮＢ緩衝液（ｐＨ９．０の２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２０ｍＭ ＣａＣｌ2、２５ｍＭ ＮａＣｌ）中に再懸濁させ、再度遠心し、最後に４００μｌのＰＮＢ緩衝液中に再懸濁させた。この画分を用いて、リパーゼの細胞結合部位を測定した。
残りの３５００μｌを遠心し、ペレットを４ｍｌのＡ中に再懸濁させ、得られた各懸濁液に４０μｌのラミナリナーゼ（ｅｘ ｍｏｌｌｕｓｃ， １．２５ｍＵ／μｌ）を添加し、最初３７℃で３時間、続いて２０℃で一晩インキュベートした。次に、完全細胞をなお含有する反応混合物を再び遠心し、上清を用いて、本来細胞壁に結合していたがラミナリナーゼインキュベーションにより遊離した物質の量を測定した。最終ペレットを４００μｌのＰＮＰ緩衝液中に再懸濁させ、細胞になお結合している部分を算定した。４ｍｌのアッセイ緩衝液に加えた所定量の特定培養物画分のブランク反応を測定し、その後８０μｌの基質溶液（メタノール中に１００ｍＭ ＰＮＰ−ブチレート）の添加によって反応を開始させ、分光光度計において２５℃及び４００ｎｍで観察した。
３．局在
リパーゼ−α−アグルチニン融合タンパク質の発現、分泌、及び酵母細胞壁へのその後の導入も、実質的に実施例１の２“局在”に述べた、抗ｌｉｐｏｌａｓｅ血清を用いる免疫蛍光標識によって確認した。
第１５図から知見され得るように、ここでの免疫蛍光染色はα−ガラトシダーゼ免疫染色と実質的に類似する像を示し、反応性は細胞表面外側に明らかに検出できる（細胞を取り巻く明瞭な光輪を示す第１５図のＡ、及び細胞表面のより明るい円を示す第１５図のＢ参照）が、培地中や細胞内部には検出できない。ｐＵＲ２９７２ＢにＨｕｍｉｃｏｌａ属リパーゼ−α−アグルチニン融合タンパク質を発現させる酵母細胞は表面を均一に染色されるようになり、このことはα−アグルチニンＣ末端を有するキメラ酵素の実質的に総てが酵母細胞の外側に固定化されたことを示す。行なった対照実験では、プラスミドｐＵＲ７０３４を保持するＳＵ１０酵母細胞を対照として用い、この実験で適用した抗リパーゼ血清に対する細胞表面結合反応性は検出できなかった。
同様にして、ｒＤＮＡ技術を介して得られるＨｕｍｉｃｏｌａ属リパーゼの変異体をα−アグルチニンのＣ末端部に結合することも可能であり、前記変異体はエステル化反応またはエステル交換反応の間、より高い安定性を有し得る。
実施例３
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの表面に固定化したＨｕｍｉｃｏｌａ属リパーゼ／α−アグルチニン（固定化酵素系の構成発現）
実施例２に述べたプラスミドｐＵＲ２９７２はＥａｇＩ及びＨｉｎｄIIIで処理し得、リパーゼ／α−アグルチニン遺伝子を含む約２．２ｋｂの断片を単離することができる。プラスミドｐＳＹ１６をＥａｇＩ及びＨｉｎｄIIIで制限し、前記２酵素の制限部位間に、リパーゼ／α−アグルチニン断片を含む２．２ｋｂ断片を連結してｐＵＲ２９７３を得ることができる。このプラスミドの、キメラ酵素の産生に関与する部分はｐＵＲ２９７２に類似し、ただしシグナル配列は異なる。ｐＵＲ２９７２はＳＵＣ２インベルターゼシグナル配列を含むが、ｐＵＲ２９７３はα−接合因子配列を含む（参考文献１８参照）。そのうえ、プラスミドｐＵＲ２９７３はｐＵＲ２９７２の截頭プロモーターに替えて、完全なプロモーター配列を伴ったＬｅｕ２マーカー遺伝子を含む。
実施例４
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの表面に固定化したＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍ属リパーゼ／α−アグルチニン
ＡＧα−１（α−アグルチニン）のＣ末端部を含む１．４ｋｂのＮｈｅＩ／ＨｉｎｄIII断片の構築及び単離は実施例１に述べた。α−アグルチニンのＣ末端膜アンカーをコードするＤＮＡの、株ＣＭＩＣＣ ３３５４２６に由来するＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍリパーゼＢの完全コーディング配列への枠内遺伝子融合（第８図並びに配列番号１１及び１２参照）のためにプラスミドｐＵＲ２９７４を用い得る。市販のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫプラスミドに由来するこのプラスミドは長さ１８５０ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ挿入体上に、完全なＧ． ｃａｎｄｉｄｕｍリパーゼIIをコードするｃＤＮＡを含む（第９図参照）。
相同なシグナル配列を伴ったＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのための発現ベクターを開発するために、成熟リパーゼＢのＮ末端を標準的な技術で実験により決定した。得られたアミノ酸配列“Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−……”は、Ｇ． ｃａｎｄｉｄｕｍリパーゼIIのシグナルペプチダーゼ切断部位と完全に一致する（参考文献１９参照）。
成熟リパーゼＢを、一方ではＳＵＣ２（インベルターゼ）またはα−接合因子（プレプロ−αＭＦ）のＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシグナル配列に融合させ、他方ではＡＧα１遺伝子の３′末端部に枠内融合させるのにＰＣＲ技術を用い得る。ＰＣＲプライマーｌｉｐｏ３（配列番号１３参照）は、（成熟タンパク質のコドン５〜７にわたる）コーディング配列の５′末端部に本来存在するＥａｇＩ部位がアミノ酸配列を何等変化させることなく不活性となるように構築することができる。後のクローニング操作を容易にするべく、ＰＣＲプライマーの５′末端に、ＳＵＣ２シグナル配列やプレプロ−αＭＦ配列への枠内連結のための新たなＥａｇＩ部位を付与することも可能である。対応するＰＣＲプライマーｌｉｐｏ４（配列番号１６参照）は、リパーゼＢのＣ末端をコードするヌクレオチドの後方に位置する余分なＮｈｅＩ部位を含み、それによってα−アグルチニンのＣ末端部への適正な融合を確実化する。
G. candidumリパーゼIIと、SUC2シグナル配列及びα−アグルチニンのC末端部との枠内連結のためのPCRオリゴヌクレオチド
ａ．プレプロαMF配列またはSUC2シグナル配列へのN末端転移
先に述べたベクターｐＵＲ２９７３をＥａｇＩ／ＨｉｎｄIIIで消化することによりＨｕｍｉｃｏｌａ属リパーゼ−α−アグルチニン融合タンパク質コーディング配列を上述のリパーゼＢ／α−アグルチニン融合構築物に対し交換すれば、ｐＵＲ２９７６が得られる（第９図参照）。
実施例５
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの表面に固定化したＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ／α−アグルチニン
α−アグルチニンのＣ末端部をコードする１．４ｋｂのＮｈｅＩ／ＨｉｎｄIII断片の構築及び単離は実施例１に述べた。プラスミドｐＵＲ２９８０は市販のｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位にクローニングされた１．２５ｋｂのｃＤＮＡ断片を含み、（人工的な合成可能な）この断片は、トリアシルグリセロールをエステル交換する（参考文献２１参照）か、またはバイオサーファクタントを製造する（参考文献２２参照）幾つかの方法において用いられる酵素であるＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉのトリグリセリドリパーゼの完全なコーディング配列をコードする（参考文献２０参照）。この断片は成熟リパーゼ分子の２６９コドンの外に、２４アミノ酸シグナルペプチドのためのコドン、並びにプロペプチドの７０アミノ酸のためのコドンも含む。成熟リパーゼをコードする遺伝子断片のＳＵＣ２シグナル配列またはＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのプレプロα−接合因子配列との適正な融合、並びに先に述べたＮｈｅＩ／ＨｉｎｄIII断片との枠内融合を確実にするべくＰＣＲを容易に適用し得る。次の２個のプライマーｌｉｐｏ５（配列番号１７参照）及びｌｉｐｏ６（配列番号２０参照）は８３３ｂｐのＤＮＡ断片をもたらし、この断片はプロテイナーゼＫ処理並びにＥａｇＩ及びＮｈｅＩでの消化後に長さ８１６ｂｐの断片として、ＥａｇＩ／ＮｈｅＩで消化したプラスミドｐＵＲ２９７２及びｐＵＲ２９７３それぞれにクローニングすることができる（第７図参照）。
実施例６
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの表面に固定化したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコースオキシダーゼ／ＧＰＩ固定細胞壁タンパク質
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のグルコースオキシダーゼ（β−Ｄ：酸素１−オキシドレダクターゼ；ＥＣ １．１．３．４）は、β−Ｄ−グルコースのグルコノ−δ−ラクトンへの酸化とそれに伴う酸素分子の過酸化水素への還元とを触媒する。この真菌酵素は、強固に結合した２個のＦＡＤ補因子を含む分子量１５０，０００のホモダイマーから成る。この酵素はグルコース検出キットで用いられるほか、食物の保存における過酸化水素源として有用でもある。遺伝子はｃＤＮＡとゲノムライブラリーとの両方からクローニングした。ただ１個の読み取り枠は介在配列を含まず、６０５アミノ酸のタンパク質をコードする（参考文献２３参照）。
２個の適正なオリゴヌクレオチドを用いて、配列のコーディング部をＰＣＲでのワンステップ改変操作において、グルコースオキシダーゼ、並びにＦＬＯ１遺伝子産物またはα−アグルチニンのＣ末端細胞壁アンカーをコードする融合遺伝子産物が得られるように調節する。即ち、先の諸実施例に述べたプラスミドのうちの幾つかを用いて対応する配列を、先の諸実施例で用いたシグナル配列のうちの一つとＡＧα１遺伝子のＮｈｅＩ／ＨｉｎｄIII部分との間に枠内で組み込むことができる。
２個のモノマーのダイマー化が活性の必要条件となり得るので、別のアプローチではＧＰＩアンカーを伴わないグルコースオキシダーゼのための完全なコーディング配列を、融合構築物を既に保持するＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ形質転換細胞において発現させ得る。このような発現は、ＧＰＩアンカーを有する融合構築物の、例えばＧＡＰＤＨまたはＰＧＫプロモーターの補助下での構成発現によって実現し得る。例えばＧＡＬ７プロモーターなどの誘導可能なプロモーターを含むＤＮＡ構築物を用いることにより、固定しない未結合モノマーを製造することが可能である。
実施例７
ダイズ抽出物中のラフィノース、スタキオース及び類似糖質を、酵母に固定化したα−ガラクトシダーゼ／α−アグルチニンで変換する方法
プラスミドｐＵＲ２９６９で形質転換した酵母は大規模に培養できる。培養の間一定の時間間隔で、洗浄した細胞をその表面におけるα−ガラクトシダーゼ活性の存在に関し、実施例１に述べた方法で分析するべきである。細胞密度と単位生物量当たりのα−ガラクトシダーゼ活性との両方がその最大値に達したら、酵母細胞を遠心によって回収し、洗浄し得る。洗浄した細胞はダイズ抽出物に添加し得る。酵母細胞の最終濃度は０．１ｇ／ｌから１０ｇ／ｌまでとし得るが、好ましくは前記濃度は１ｇ／ｌを上回るべきである。ダイズ抽出物の温度は酵母細胞の代謝活性を低減するべく８℃より低くするべきである。ラフィノース及びスタキオースの変換はＨＰＬＣ法で分析し得、前記糖質の９５％変換後、酵母細胞を遠心によって分離して、その生物量１ｇ当たりのα−ガラクトシダーゼ活性を測定し得る。優れた活性を有する遠心分離物は後の変換過程で用い得、一方本来の活性の５０％未満の活性しか有しない遠心分離物は増殖培地中で蘇生させ得、その際細胞は２〜４時間掛けて回復させ得る。その後、細胞を遠心し、洗浄してから、後の変換過程で用い得る。
実施例８
酵母に固定化したＨｕｍｉｃｏｌａ属リパーゼ／α−アグルチニンを用いてのバイオサーファクタントの製造
プラスミドｐＵＲ２９７２または２９７３で形質転換した酵母は大規模に培養できる。培養の間一定の時間間隔で、洗浄した細胞をその表面におけるリパーゼ活性の存在に関し、実施例１に述べた方法で分析し得る。細胞密度と単位生物量当たりのリパーゼとの両方がその最大値に達したら、酵母細胞を遠心によって回収し、洗浄し得る。洗浄した細胞は、少量の水中に懸濁させて、好ましくは炭素原子１２〜１８個の鎖長を有する脂肪酸と、好ましくはグルコース、ガラクトースまたはスクロースである糖質との混合物を収容した反応容器に加え得る。（酵母細胞中の水を除いた）水の総量は０．１％未満であり得る。酵母細胞の最終濃度は０．１ｇ／ｌから１０ｇ／ｌまでとし得るが、好ましくは前記濃度は１ｇ／ｌを上回る。反応容器は、（不飽和）脂肪酸の酸化を回避し、かつ酵母の代謝活性を最小限に留めるべくＮ2及びＣＯ2の雰囲気下に保持しなければならない。容器内の混合物の温度は、用いる脂肪酸の種類に応じて３０〜６０℃とするべきである。脂肪酸の変換はＧＬＣ法で分析し得、脂肪酸の９５％変換後、酵母細胞を遠心によって分離して、その生物量１ｇ当たりのリパーゼ活性を測定し得る。優れた活性を有する遠心分離物は後の変換過程で用い得、一方本来の活性の５０％未満の活性しか有しない遠心分離物は増殖培地中で蘇生させ得、その際細胞は２〜８時間掛けて回復させ得る。その後、細胞を再び遠心し、洗浄し、後の変換過程で用い得る。
実施例９
酵母に固定化したＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ／α−アグルチニンを用いての特定種類のトリアシルグリセロールの製造
プラスミドｐＵＲ２９８１または２９８２で形質転換した酵母は大規模に培養できる。培養の間一定の時間間隔で、洗浄した細胞をその表面におけるリパーゼ活性の存在に関し、実施例１に述べた方法で分析し得る。細胞密度と単位生物量当たりのリパーゼとの両方がその最大値に達したら、酵母細胞を遠心によって回収し、洗浄し得る。洗浄した細胞は、少量の水中に懸濁させて、様々なトリアシルグリセロール及び脂肪酸の混合物を収容した反応容器に加え得る。（酵母細胞中の水を除いた）水の総量は０．１％未満であり得る。酵母細胞の最終濃度は０．１ｇ／ｌから１０ｇ／ｌまでとし得るが、好ましくは前記濃度は１ｇ／ｌを上回る。反応容器は、（不飽和）脂肪酸の酸化を回避し、かつ酵母の代謝活性を最小限に留めるべくＮ2及びＣＯ2の雰囲気下に保持しなければならない。容器内の混合物の温度は、用いるトリアシルグリセロール及び脂肪酸の種類に応じて３０〜７０℃とするべきである。エステル交換の程度はＧＬＣ／ＭＳ法で分析し得、所望種類のトリアシルグリセロールが理論値の８０％以上生成した後、酵母細胞を遠心によって分離して、その生物量１ｇ当たりのリパーゼ活性を測定し得る。優れた活性を有する遠心分離物は後の変換過程で用い得、一方本来の活性の５０％未満の活性しか有しない遠心分離物は増殖培地中で蘇生させ得、その際細胞は２〜８時間掛けて回復させるべきである。その後、細胞を遠心し、洗浄し、後のエステル交換反応過程で用い得る。
（実施例１に述べた）プラスミドｐＳＹ１３またはプラスミドｐＵＲ２９６９で形質転換した株ＭＴ３０２／１Ｃのパン酵母はブダペスト条約に従い、それぞれ仮番号３３０．９２及び３２９．９２の下に１９９２年７月３日付でＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）に寄託した。
実施例１０
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの表面に固定化したＨｕｍｉｃｏｌａ属リパーゼ／ＦＬＯ１融合物
“分散する酵素細胞のフロックへの（可逆的）凝集”と定義されるフロキュレーション（参考文献２４参照）は、工業的発酵における酵素株の最も重要な特徴である。フロキュレーションは、細胞壁タンパク質に関連する特性であること、また定量的特性であることでも重要である。Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのフロキュレーション表現型に関連する遺伝子の一つにＦＬＯ１遺伝子が有る。この遺伝子は染色体Ｉの右端から約２４ｋｂのところに位置し、ＦＬＯ１遺伝子の主要部を含むクローンのＤＮＡ配列がつい最近決定された（参考文献２６参照）。この配列を第１１図並びに配列番号２１及び２２に示す。クローン化断片は、サザン及びノザンハイブリダイゼーションから判断してゲノムコピーより約２ｋｂ短いと考えられるが、ＦＬＯ１遺伝子の両端を含む。ＤＮＡ配列データの解析によって、推定されるタンパク質がＮ末端に、分泌のためのシグナル配列を保証する疎水性領域を有し、またＧＰＩアンカーの結合のためのシグナルとして機能し得る疎水性Ｃ末端を有し、かつ特にＣ末端に多くのグリコシル化部位を有し、任意に定義したＣ末端（アミノ酸２７１〜８９４）の４６．６％はセリン及びトレオニンであることが判明している。これらのことから、ＦＬＯ１遺伝子産物が酵母細胞壁に配向して局在し、隣接細胞との相互作用過程に直接関与し得ると考えることができる。従って、クローニングしたＦＬＯ１配列は、タンパク質またはペプチドを細胞表面に、異なる種類の細胞壁アンカーによって固定化するのに適当であり得る。
組み換え体ＤＮＡ構築物は、例えばＦＬＯ１遺伝子産物のアミノ酸２７１〜８９４をコードするＤＮＡ、即ち第１１図のポリヌクレオチド８１１〜２６８２を用いることによって得ることができる。２個のＰＣＲプライマーｐｃｒｆｌｏ１（配列番号２３参照）及びｐｃｒｆｌｏ２（配列番号２６参照）の適用により、ＤＮＡ断片の両端にＮｈｅＩ及びＨｉｎｄIII部位を導入し得る。第二のステップにおいて、ｐＵＲ２９７２（ＡまたはＢ）中に存在する、α−アグルチニンのＣ末端部をコードする１．４ｋｂのＮｈｅＩ／ＨｉｎｄIII断片を、ＦＬＯ１タンパク質のＣ末端部をコードする１．９ｋｂのＤＮＡ断片によって置き換え得、それによって得られるプラスミドｐＵＲ２９９０（第１２図参照）は（ａ）インベルターゼシグナル配列（ＳＵＣ２）と、これに後続する（ｂ）融合タンパク質とをコードするＤＮＡ配列を含み、前記融合タンパク質は（ｂ．１）Ｈｕｍｉｃｏｌａ属のリパーゼ（参考文献１６参照）と、これに後続する（ｂ．２）ＦＬＯ１タンパク質のＣ末端（アミノ酸２７１〜８９４）とから成る。
Ｈｕｍｉｃｏｌａ属リパーゼをコードする遺伝子と、ＦＬＯ１遺伝子産物のＣ末端部をコードする遺伝との枠内連結のためのＰＣＲオリゴヌクレオチド
リパーゼ／ＦＬＯ１キメラタンパク質の発現、分泌、局在及び活性は、実施例１に述べたのと同様の操作を用いて分析可能である。
配列番号：1
配列の長さ：6057
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：Saccharomyces cerevisiae(サッカロミセス・セレビシエ)
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：3653..5605
他の情報：／機能＝“有性凝集”/生成物＝“α-凝集素”
配列：
配列の長さ：650
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
配列の長さ：29
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：プライマーlipo1
配列：
配列の長さ：33
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：部分非コーディング鎖リパーゼ
配列：
配列の長さ：32
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：部分コーディング鎖リパーゼ
配列：
配列の長さ：40
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：プライマーlipo2
配列：
配列の長さ：894
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：Humicola lanuginosa
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：72..884
他の情報：／生成物＝“リパーゼ”
配列の特徴
特徴を表す記号：mat peptide
存在位置：72..881
他の情報：／生成物＝“リパーゼ”
配列：
配列の長さ：270
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
配列の長さ：55
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：プライマー
配列：
配列の長さ：59
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：プライマー
配列：
配列の長さ：1828
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源
生物名：Geotrichum candidum
株名：CMICC 335426
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：40..1731
他の情報：／生成物＝“リパーゼ”
配列の特徴
特徴を表す記号：sig peptide
存在位置：40..96
配列の特徴
特徴を表す記号：mat peptide
存在位置：97..1728
他の情報：／生成物＝“リパーゼ”／遺伝子＝“lipB”
配列：
配列の長さ：563
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
配列の長さ：36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：プライマーlipo3
配列：
配列の長さ：30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：部分非コーディング鎖リパーゼII
配列：
配列の長さ：38
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：部分コーディング鎖リパーゼII
配列：
配列の長さ：32
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：プライマーlipo4
配列：
配列の長さ：30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：プライマーlipo5
配列：
配列の長さ：18
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：部分非コーディング鎖リパーゼ
配列：
配列の長さ：18
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：部分コーディング鎖リパーゼ
配列：
配列の長さ：28
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：プライマーlipo6
配列：
配列の長さ：2685
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：Saccharomyces cerevisiae(サッカロミセス・セレビシエ)
直接の起源
クローン名：pYY105
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：1..2685
他の情報：／生成物＝“凝集タンパク質”／遺伝子＝“FLO1”
配列：
配列の長さ：894
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
配列の長さ：30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：プライマーpcrflol
配列：
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：部分非コーディング配列FLO1
配列：
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：部分コーディング配列FLO1
配列：
配列の長さ：31
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
直接の起源
クローン名：プライマーpcrflo2
配列：
Claims (22)
- 酵母の細胞壁に連結された酵素または酵素の機能性フラグメントを産生するために組換えＤＮＡ技術を用いることを含む酵素を固定化する方法であって、その際酵素または酵素の機能性フラグメントをアンカータンパク質の固定部に連結することによって細胞壁の外側に位置させ、前記固定部は前記アンカータンパク質のＣ末端部から誘導し得ることを特徴とする、前記方法。
- 前記酵母がＣａｎｄｉｄａ属、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 触媒活性を具えたタンパク質をコードする構造遺伝子と、酵母の細胞壁に固定し得るアンカータンパク質をコードする遺伝子の少なくとも一部分を含み、前記一部分は前記アンカータンパク質の少なくとも固定部をコードし、この固定部は前記アンカータンパク質のＣ末端部から誘導し得ることを特徴とする、組換えポリヌクレオチド。
- ポリヌクレオチドの発現産物を分泌するシグナルペプチドをコードする配列を更に含むことを特徴とする、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
- シグナルペプチドがグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカータンパク質、α因子、α−アグルチニン、インベルターゼまたはイヌリナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属のα−アミラーゼ、及び乳酸菌のプロテイナーゼからなる群から選択されたタンパク質から得られることを特徴とする、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
- 細胞壁に固定し得るタンパク質がα−アグルチニン、ＡＧＡ１、ＦＬＯ１、酵母の主要細胞壁タンパク質からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３から５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- プロモーターに作動的に連結されていることを特徴とする、請求項３から６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 誘導可能なプロモーターに作動的に連結されていることを特徴とする請求項７に記載のポリヌクレオチド。
- 触媒活性を具えたタンパク質が加水分解酵素であることを特徴とする請求項３から８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 加水分解酵素がリパーゼであることを特徴とする、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
- 触媒活性を具えたタンパク質がオキシドレダクターゼであることを特徴とする、請求項３から８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- オキシドレダクターゼがオキシダーゼであることを特徴とする、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項３から１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、組換えベクター。
- 触媒活性を具えたタンパク質がマルチマーとして存在する場合に前記触媒活性を呈し、その際触媒活性を具えた同一のタンパク質をコードする構造遺伝子を含む第２ポリヌクレオチドもこの第２ポリヌクレオチドの発現産物を分泌するシグナルペプチドをコードする配列と組み合わせて含み、前記第２ポリヌクレオチドは調節可能なプロモーターに作動的に連結されていることを特徴とする、請求項１３に記載の組換えベクター。
- 調節可能なプロモーターが誘導または抑制可能なプロモーターであることを特徴とする、請求項１４に記載の組換えベクター。
- 請求項３から１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによってコードされたキメラタンパク質。
- 請求項３から１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１３もしくは１５に記載のベクターを保持する酵母。
- 請求項３から１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１３に記載のベクターを保持する酵母であって、触媒活性を具えたタンパク質がマルチマーとして存在する場合に前記触媒活性を呈し、その際触媒活性を具えた同一のタンパク質をコードする構造遺伝子を含む第２ポリヌクレオチドもこの第２ポリヌクレオチドの発現産物を分泌するシグナルペプチドをコードする配列と組み合わせて保持し、前記第２ポリヌクレオチドは調節可能なプロモーターに作動的に連結されており、かつ他のベクター中、または酵母の染色体中に存在することを特徴とする、前記酵母。
- 調節可能なプロモーターが誘導または抑制可能なプロモーターである、請求項１８に記載の酵母。
- 染色体中に組み込まれている少なくとも一つの前記ポリヌクレオチドを有する、請求項１７または１９に記載の酵母。
- 請求項１６に記載のタンパク質が細胞壁に固定化された酵母。
- 固定化した触媒活性タンパク質を用いて酵素処理を行なう方法であって、前記触媒活性タンパク質の基質を請求項１７から２１のいずれか１項に記載の酵母と接触させることを特徴とする、前記方法。
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