JP2004254700A - 融合タンパク質の製造によって酵素を微生物細胞の細胞壁に固定化する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】酵素または酵素の機能部を微生物細胞の細胞壁に、組み換え体DNA技術を用いて固定化することを含む酵素固定化方法を提供する。
【解決手段】酵素は、細胞壁への固定を保証するタンパク質のC末端部に該酵素を連結することによって固定化する。酵素タンパク質をコードする構造遺伝子でその一部が真核または原核細胞の細胞壁に固定し得るタンパク質のC末端部をコードする遺伝子と、シグナル配列とを含む組み換え体ポリヌクレオチド、この組み換え体ポリヌクレオチドによってコードされたキメラタンパク質、ベクター、及び前記ポリヌクレオチドを保持する微生物も提供する。前記微生物は工業的規模での酵素処理の実施に適する。
【選択図】なし
【解決手段】酵素は、細胞壁への固定を保証するタンパク質のC末端部に該酵素を連結することによって固定化する。酵素タンパク質をコードする構造遺伝子でその一部が真核または原核細胞の細胞壁に固定し得るタンパク質のC末端部をコードする遺伝子と、シグナル配列とを含む組み換え体ポリヌクレオチド、この組み換え体ポリヌクレオチドによってコードされたキメラタンパク質、ベクター、及び前記ポリヌクレオチドを保持する微生物も提供する。前記微生物は工業的規模での酵素処理の実施に適する。
【選択図】なし
Description
本発明は、遺伝子工学によって製造した固定化酵素を用いる変換処理に係わる。
洗剤、パーソナルケア用品及び食品の製造分野では、これらの製品の成分として天然物質を指向する傾向、及び環境的に許容可能な工程を用いる傾向が強い。酵素変換処理は全く天然で行ない得るので、上記のような消費者の要求を満たすうえで非常に重要である。そのうえ、酵素処理は非常に特異的であり、従って最少量の副産物しか生成させない。このような処理は、温和な温度及び大気圧の下で水中で実施し得る。しかし、遊離酵素に基づく酵素処理は酵素の損失に起因してきわめて高価となるか、または酵素を捕捉するウルトラメンブランシステムのような高価な設備を必要とする。
あるいは他の場合には、酵素を物理的または化学的に固定化することができる。化学的固定化法にはしばしば、非天然の化学薬剤を用い、かつ環境の観点から好ましくない方法で結合を実現するという欠点が存在する。そのうえ、酵素の化学的改変はほぼ常にさほど特異的でなく、このことは結合が酵素の活性に悪影響を及ぼす恐れが有ることを意味する。
物理的固定化は消費者の要求に適い得るが、やはり酵素の活性に悪影響を及ぼしかねない。しかも、物理的に固定化した酵素は遊離酵素と平衡し、このことは連続反応容器内では熱力学の法則に従って酵素の相当の損失が不可避であることを意味する。
微生物細胞への酵素の固定化に関する刊行物が幾つか存在する(参考文献1参照)。本発明は、酵素を微生物細胞の細胞壁に非常に正確に固定化する方法を提供する。加えて、本発明の固定化方法は何等の化学的または物理的結合ステップも必要とせず、かつ非常に効率的である。或る種の細胞外タンパク質は、該タンパク質が宿主細胞の細胞壁に結合している場合にのみ発揮し得る特別の機能を有することが知られている。この種のタンパク質はしばしば、細胞壁に固定(anchor)された長いC末端部を有する。このC末端部は非常に特殊なアミノ酸配列を有する。一典型例はプロリンに富んだC末端配列を介して固定されている(参考文献2参照)。タンパク質を細胞壁に固定させる別の機構に、タンパク質がグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーを有するというもの(参考文献3参照)、及びタンパク質のC末端部が相当数の潜在的セリン及びトレオニングリコシル化部位を有するというものが有る。前記部位のO−グリコシル化は当該タンパク質のC末端部に棒状のコンホーメーションを付与する。このようなマンノタンパク質には、下等真核生物の細胞壁からSDSで抽出できないので前記細胞壁中のグルカンに連結すると考えられるがグルカナーゼ処理によって解離し得るという特徴も有る。
(発明の概要)
本発明は、酵素を固定化する方法であって、組み換え体DNA技術を用いて酵素または酵素の機能部を宿主細胞、好ましくは微生物細胞の細胞壁に連結することを含み、その際酵素または酵素の機能フラグメントを細胞壁の外側に位置させる方法を提供する。好ましくは、酵素または酵素の機能部を、細胞壁への固定を保証するタンパク質のC末端部への連結によって固定化する。
本発明は、酵素を固定化する方法であって、組み換え体DNA技術を用いて酵素または酵素の機能部を宿主細胞、好ましくは微生物細胞の細胞壁に連結することを含み、その際酵素または酵素の機能フラグメントを細胞壁の外側に位置させる方法を提供する。好ましくは、酵素または酵素の機能部を、細胞壁への固定を保証するタンパク質のC末端部への連結によって固定化する。
本発明はその一実施態様において、触媒活性を具えたタンパク質をコードする構造遺伝子と、真核または原核細胞の細胞壁に固定し得るタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも一部分とを含み、前記一部分は前記固定(またはアンカー)タンパク質の少なくともC末端部をコードする組み換え体ポリヌクレオチドを提供する。好ましくはこのポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの発現産物の分泌を保証するシグナルペプチドをコードする配列も含む。上記のようなシグナルペプチドは、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカータンパク質、α因子、α−アグルチニン、インベルターゼもしくはイヌリナーゼ、Bacillus属のα−アミラーゼ、または乳酸菌のプロテイナーゼに由来し得る。細胞壁に固定し得るタンパク質をコードするDNA配列は、α−アグルチニン、AGA1、FLO1、もしくは下等真核生物の主要細胞壁タンパク質(Major Cell Wall Protein)、または乳酸菌のプロテイナーゼをコードし得る。本発明の組み換え体ポリヌクレオチドはプロモーター、好ましくは誘導可能なプロモーターに作動的に連結されている。触媒活性を具えたタンパク質をコードするDNA配列は加水分解酵素、例えばリパーゼかオキシドレダクターゼ、例えばオキシダーゼをコードし得る。
本発明はその別の実施態様において、上述のポリヌクレオチドを含む組み換え体ベクターも提供する。このベクターは、触媒活性を具えたタンパク質でマルチマー形態(multimeric form)で存在する時にその触媒活性を呈示するタンパク質をコードするDNA配列を含む場合、触媒活性を具えた同じタンパク質をコードする構造遺伝子を含む第二のポリヌクレオチドもこの第二のポリヌクレオチドの発現産物の分泌を保証するシグナルペプチドをコードする配列と組み合わせて含み得、その際第二のポリヌクレオチドは調節可能なプロモーター、好ましくは誘導または抑制可能なプロモーターに作動的に連結されている。
本発明は更に別の実施態様において、先に述べたポリヌクレオチドによってコードされたキメラタンパク質も提供する。
先に述べたポリヌクレオチドまたは先に述べたベクターを保持する宿主細胞、好ましくは微生物も本発明の一態様である。触媒活性を具えたタンパク質がマルチマー形態で存在する時にその触媒活性を呈示する場合、上記宿主細胞または微生物は触媒活性を具えた同じタンパク質をコードする構造遺伝子を含む第二のポリヌクレオチドもこの第二のポリヌクレオチドの発現産物の分泌を保証するシグナルペプチドをコードする配列と組み合わせて保持し得、その際第二のポリヌクレオチドは調節可能なプロモーター、好ましくは誘導または抑制可能なプロモーターに作動的に連結されており、かつ別のベクター中にか、または微生物の染色体中に存在する。好ましくは、上記宿主細胞または微生物は上述のポリヌクレオチドのうちの少なくとも一つをその染色体中に組み込まれている。そのような宿主細胞または微生物を培養することによって本発明は、先に述べたタンパク質がその細胞壁に固定化された宿主細胞、好ましくは微生物を提供する。宿主細胞または微生物は下等真核生物、特に酵母であり得る。
本発明は、固定化した触媒活性タンパク質を用いて酵素処理を行なう方法であって、前記触媒活性タンパク質の基質を本発明による宿主細胞または微生物と接触させる方法も提供する。
(発明の詳細な説明)
本発明は、酵素を固定化する方法であって、組み換え体DNA技術を用いて酵素または酵素の機能部を宿主細胞、好ましくは微生物細胞の細胞壁に固定化することを含む方法を提供する。特に、酵素または酵素の機能部を、細胞壁への固定を保証するタンパク質のC末端部に、酵素が細胞表面上または細胞表面の僅かに上方に位置するように結合する。このようにして酵素を細胞の表面に固定化する。上記結合は遺伝子レベルで行ない、この遺伝子レベルの結合は、酵素をコードする構造遺伝子をアンカータンパク質をコードする遺伝子の少なくとも一部に、発現産物において酵素のC末端がアンカータンパク質のC末端部に結合するように結合させるという特徴を有する。好ましくはキメラ酵素の上流に、キメラタンパク質の効率的な分泌を保証するシグナル配列を配置する。
本発明は、酵素を固定化する方法であって、組み換え体DNA技術を用いて酵素または酵素の機能部を宿主細胞、好ましくは微生物細胞の細胞壁に固定化することを含む方法を提供する。特に、酵素または酵素の機能部を、細胞壁への固定を保証するタンパク質のC末端部に、酵素が細胞表面上または細胞表面の僅かに上方に位置するように結合する。このようにして酵素を細胞の表面に固定化する。上記結合は遺伝子レベルで行ない、この遺伝子レベルの結合は、酵素をコードする構造遺伝子をアンカータンパク質をコードする遺伝子の少なくとも一部に、発現産物において酵素のC末端がアンカータンパク質のC末端部に結合するように結合させるという特徴を有する。好ましくはキメラ酵素の上流に、キメラタンパク質の効率的な分泌を保証するシグナル配列を配置する。
即ち本発明は、触媒活性を具えたタンパク質をコードする構造遺伝子と、真核または原核細胞の細胞壁に固定し得るタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも一部分とを含む組み換え体ポリヌクレオチドを提供し、その際前記一部分は前記固定(即ちアンカー)タンパク質の少なくともC末端部をコードする。アンカータンパク質のC末端部の長さは様々であり得る。この構造タンパク質の全体を用いることは可能であるが、一部しか用いない方が好ましく、その場合細胞を取り巻く培地中での酵素タンパク質のより効率的な暴露が実現する。アンカータンパク質の固定部は、好ましくはその全体が存在するべきである。一例として、アンカータンパク質のC末端部のおよそ半分を用い得る。
好ましくは、上記ポリヌクレオチドは更に、該ポリヌクレオチドの発現産物の分泌を保証するシグナルペプチドをコードする配列も含む。シグナルペプチドはGPIアンカータンパク質、α因子、α−アグルチニン、インベルターゼもしくはイヌリナーゼ、Bacillus属のα−アミラーゼ、または乳酸菌のプロテイナーゼに由来し得る。
細胞壁に固定し得るタンパク質は好ましくは、α−アグルチニン、AGA1、FLO1(凝集タンパク質)、下等真核生物の主要細胞壁タンパク質、及び乳酸菌のプロテイナーゼの中から選択する。本発明のポリヌクレオチドは好ましくは、プロモーター、好ましくは調節可能なプロモーターで特に誘導可能なプロモーターに作動的に連結されている。
本発明は、上述のポリヌクレオチドを含む組み換え体ベクター、及び前記ポリヌクレオチドまたは前記ベクターを保有する宿主細胞も提供する。オキシドレダクターゼに関してあり得るような、触媒活性を具えたタンパク質がマルチマー形態で存在する時にその触媒活性を呈示するという特別の場合には、モノマーのダイマー化またはマルチマー化が活性の必要条件となり得る。その場合、ベクター及び/または宿主細胞は触媒活性を具えた同じタンパク質をコードする構造遺伝子を含む第二のポリヌクレオチドも、この第二のポリヌクレオチドの発現産物の分泌を保証するシグナルペプチドをコードする配列と組み合わせて有し得、その際第二のポリヌクレオチドは調節可能なプロモーター、好ましくは誘導または抑制可能なプロモーターに作動的に連結されている。第一のポリヌクレオチドの発現及び分泌の後に第二のポリヌクレオチドの発現及び分泌が起こることによって、細胞壁の外側に活性なマルチマーが生成する。宿主細胞または微生物は先に述べた本発明のポリヌクレオチドを、または組み合わせの場合は上記ポリヌクレオチドのうちの少なくとも一つを、好ましくはその染色体中に組み込まれた状態で保持する。
本発明は特に、非常に安定な細胞壁を有し、かつ細胞壁に固定されていることが知られているタンパク質、例えばα−アグルチニンや遺伝子FLO1の産物を有する酵母のような下等真核生物に係わる。適当な酵母は、Candida属、Debaryomyces属、Hansenula属、Kluyveromyces属、Pichia属及びSaccharomyces属に属する。真菌、特にAspergillus属、Penicillium属及びRhizopus属も用い得る。用途によっては原核生物も適用可能である。
酵母の場合、本発明は特に、
a.例えばα因子遺伝子、インベルターゼ遺伝子、α−アグルチニン遺伝子またはイヌリナーゼ遺伝子に由来するシグナル配列と、
b.α−ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ペクチナーゼ、ペクチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、エステラーゼ及びリパーゼなどの加水分解酵素、またはオキシダーゼなどの非加水分解酵素をコードする構造遺伝子と、
c.α−アグルチニン(参考文献4参照)、AGA1(参考文献5参照)及びFLO1(本願出願前未公表の参考文献6参照)などの典型的な細胞壁結合タンパク質のC末端と
から成るキメラ酵素をコードする遺伝子に係わる。
a.例えばα因子遺伝子、インベルターゼ遺伝子、α−アグルチニン遺伝子またはイヌリナーゼ遺伝子に由来するシグナル配列と、
b.α−ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ペクチナーゼ、ペクチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、エステラーゼ及びリパーゼなどの加水分解酵素、またはオキシダーゼなどの非加水分解酵素をコードする構造遺伝子と、
c.α−アグルチニン(参考文献4参照)、AGA1(参考文献5参照)及びFLO1(本願出願前未公表の参考文献6参照)などの典型的な細胞壁結合タンパク質のC末端と
から成るキメラ酵素をコードする遺伝子に係わる。
このような遺伝子の発現は構成プロモーターの制御下に置くことができるが、プロモーターは、Saccharomyces属ではGAL7プロモーター、Kluyveromyces属ではイヌリナーゼプロモーター、Hansenula属ではメタノール−オキシダーゼプロモーターといった調節可能な、即ち抑制または誘導可能なプロモーターの方がより好ましい。
構築物は好ましくは、新しい遺伝情報が宿主細胞の染色体中に安定に組み込まれるように形成される。
本発明は、上述のキメラタンパク質が細胞壁に固定化された宿主細胞、特に微生物も提供する。本発明はまた、そのような微生物の、酵素の基質を当該微生物と接触させることによる酵素処理の実施への使用も提供する。前記処理は、例えば充填カラム内で微生物を固体粒子に支持させて実施するか、または反応容器内で攪拌下に実施し得る。反応は水性であっても非水性であってもよい。必要であれば、酵素の機能に必要な添加物、例えば補因子を反応媒質中に導入し得る。
自然に固定化された酵素系を処理において繰り返し用いると、系の性能が低下する恐れが有る。これは、酵素が物理的に変性するか、または化学的に有毒化したり、脱着したりすることによる。本発明は特に、使用した系を反応媒質から単なる遠心または膜濾過技術によって回収できること、及びそのようにして集めた細胞を回復媒質に移し得、この媒質中で細胞は急速に再生し、それと共にキメラタンパク質が生成し、このようにして細胞の表面が完全に活性な固定化酵素によって覆われることが保証されることを特徴とする。上記再生法は単純かつ安価であり、従って酵素処理の経済性を改善し、固定化酵素系に基づく処理の用途をはるかに拡張し得る。
しかし、本発明は決して固定化酵素の再利用性に限定されない。
本発明を、本発明の範囲を限定しない以下の実施例によって詳述する。
(実施例1)
S. cerevisiaeの表面に固定したα−ガラクトシダーゼ/α−アグルチニン
α−アグルチニンをコードする遺伝子についてはLipke等が述べている(参考文献4参照)。AGα1遺伝子の全体を含む、pTZ18R中の6057bpのHindIII挿入体の配列を図1に示す。コーディング配列は650アミノ酸を越えて伸長し、3653位のヌクレオチドからATGをもって始まる推定シグナル配列を含む。非反復NheI部位がこのDNAを、アミノ酸330をコードする部分内で上記コーディング配列の988位において切断し、それによってα−アグルチニンをほぼ同寸法のN末端部とC末端部とに分割する。
S. cerevisiaeの表面に固定したα−ガラクトシダーゼ/α−アグルチニン
α−アグルチニンをコードする遺伝子についてはLipke等が述べている(参考文献4参照)。AGα1遺伝子の全体を含む、pTZ18R中の6057bpのHindIII挿入体の配列を図1に示す。コーディング配列は650アミノ酸を越えて伸長し、3653位のヌクレオチドからATGをもって始まる推定シグナル配列を含む。非反復NheI部位がこのDNAを、アミノ酸330をコードする部分内で上記コーディング配列の988位において切断し、それによってα−アグルチニンをほぼ同寸法のN末端部とC末端部とに分割する。
pUR2968(図2参照)をNheI/HindIIIで消化することによって、推定される細胞壁アンカーの配列情報を担った1.4kb断片を放出させた。α−ガラクトシダーゼへの融合のために、SUC2インベルターゼシグナル配列に後続するα−ガラクトシダーゼ配列を含む、YEplac181に基づくエピソームベクターであるプラスミドpSY16を用い、これを構成PGKプロモーターとPGKターミネーターとの間に配置した。α−ガラクトシダーゼ遺伝子の読み取り枠の最後の9塩基対中に存在するStyI部位をAGα1遺伝子断片のNheI部位に連結した。枠内融合を確実にするため、StyI/HindIIIで消化したpSY13への連結前にStyI部位を充填し、かつNheI部位の5′オーバーハングを除去した(図2参照)。
新しいプラスミドの適正構築を確認するため、
次に、このプラスミドでS. cerevisiae株MT302/1Cを、Klebe等のプロトコル(参考文献11参照)に従って形質転換した。
酵母形質転換細胞を、ロイシンを存在させない選択プレート上に40μl(DMF 20mg/ml)載せて選択した。X−α−Gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−α−D−グルコース;Boehringer Mannheim)を塗り広げ、α−ガラクトシダーゼ活性について直接試験した(参考文献12参照)。キメラタンパク質の発現、分泌、局在及び活性を証明するべく、次の分析を行なった。
1.発現及び分泌
S. cerevisiae株MT302/1Cを、Cyamopsis tetragonolobaのα−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミドpSY13か、またはα−ガラクトシダーゼ/α−アグルチニン融合構築物を含むプラスミドpUR2969で形質転換した。バッチ培養の間α−ガラクトシダーゼ活性を、洗浄した細胞と増殖培地とにおいて測定した。結果を図3及び図4に示す。プラスミドpSY13を保持する酵母細胞から発現されたα−ガラクトシダーゼは大部分が専ら増殖培地中に存在した(図3A)が、α−ガラクトシダーゼ−α−アグルチニン融合タンパク質の方は大部分が専ら細胞に結合していた(図4A)。そのうえ、固定化された、細胞壁に結合したα−ガラクトシダーゼ−α−アグルチニン融合酵素は全インキュベーション時間にわたって完全な活性を維持したが、分泌及び放出された酵素は65時間のインキュベーション後に約90%の活性を失った。このことは、上述の酵素を酵母の細胞壁に固定化すれば該酵素を、おそらくはプロテイナーゼによる不活性化から保護することになり、それによって安定性が著しく向上することを示している。更に、様々な遺伝子産物の局在に関してウェスタン分析により考察した。即ち、細胞を遠心によって集収し、0℃においてpH7.8の10mMトリス・HCl、及び1mM PMSFで洗浄し、後の諸ステップは前記と同じ温度で実施した。細胞1g(湿潤重量)当たり3mlの単離緩衝液と10gのガラスビーズとを添加した。混合物をGriffin振盪機において、該振盪機の最高速度の50%の速度で30分間振盪した。上清を単離し、ガラスビーズを1M NaCl及び1mM PMSFで洗液が澄むまで洗浄した。上清及び洗液をプールした。細胞壁を遠心によって回収し、その後1mM PMSFで洗浄した。
S. cerevisiae株MT302/1Cを、Cyamopsis tetragonolobaのα−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミドpSY13か、またはα−ガラクトシダーゼ/α−アグルチニン融合構築物を含むプラスミドpUR2969で形質転換した。バッチ培養の間α−ガラクトシダーゼ活性を、洗浄した細胞と増殖培地とにおいて測定した。結果を図3及び図4に示す。プラスミドpSY13を保持する酵母細胞から発現されたα−ガラクトシダーゼは大部分が専ら増殖培地中に存在した(図3A)が、α−ガラクトシダーゼ−α−アグルチニン融合タンパク質の方は大部分が専ら細胞に結合していた(図4A)。そのうえ、固定化された、細胞壁に結合したα−ガラクトシダーゼ−α−アグルチニン融合酵素は全インキュベーション時間にわたって完全な活性を維持したが、分泌及び放出された酵素は65時間のインキュベーション後に約90%の活性を失った。このことは、上述の酵素を酵母の細胞壁に固定化すれば該酵素を、おそらくはプロテイナーゼによる不活性化から保護することになり、それによって安定性が著しく向上することを示している。更に、様々な遺伝子産物の局在に関してウェスタン分析により考察した。即ち、細胞を遠心によって集収し、0℃においてpH7.8の10mMトリス・HCl、及び1mM PMSFで洗浄し、後の諸ステップは前記と同じ温度で実施した。細胞1g(湿潤重量)当たり3mlの単離緩衝液と10gのガラスビーズとを添加した。混合物をGriffin振盪機において、該振盪機の最高速度の50%の速度で30分間振盪した。上清を単離し、ガラスビーズを1M NaCl及び1mM PMSFで洗液が澄むまで洗浄した。上清及び洗液をプールした。細胞壁を遠心によって回収し、その後1mM PMSFで洗浄した。
2% SDS、100mM EDTA及び40mM β−メルカプトエタノールを含有するpH7.8の50mMトリス・HCl中での5分間の煮沸によって細胞壁に、共有結合以外で結合したタンパク質、またはジスルフィド架橋を介して結合したタンパク質を放出させた。10mg(湿潤重量)の細胞壁を、1mM PMSFを含有するpH5.0の100mM酢酸ナトリウム20l中に取り上げた。これに0.5mUのβ−1,3−グルカナーゼ(Laminarase;Sigma L5144)を添加し、続いて37℃で2時間インキュベートした。その後、再び0.5mUのβ−1,3−グルカナーゼを添加してから37℃で更に2時間インキュベートした。
タンパク質を、5分間煮沸してからEndo−H処理を施すことによって変性させた。2mgのタンパク質を、100mM β−メルカプトエタノール及び0.5mM PMSFを含有するpH5.5の50mMリン酸カリウム1ml中で40mUのEndo−H(Boehringer)と共に37℃で48時間インキュベートした。その後、20mUのEndo−Hを添加してから37℃で24時間インキュベートした。
タンパク質を、2.2−20%勾配ゲルにおいてLaemmli(参考文献13参照)に従いSDS−PAGEによって分離した。ゲルを、Towbin等が述べているImmobilonポリビニリデン−ジフルオリド膜(Millipore)上への電気泳動転移によってブロッティングした(参考文献14参照)。高度にグリコシル化したタンパク質の場合は、その後、50mM過ヨウ酸、pH4.5の100mM酢酸ナトリウム中で4℃で数時間、温和な過ヨウ酸塩処理を施した。後のインキュベーションは総て室温で行なった。ブロットを、0.5%のゼラチン及び0.5%のTween−20を含有するPBS中で1時間ブロックし、続いて1:200に稀釈した血清を含有するプローブ緩衝液(PBS; 0.2%ゼラチン、0.1%Tween−20)中で1時間インキュベーションを行なった。その後、ブロットを洗浄緩衝液(PBS; 0.2%ゼラチン、0.5%Tween−20)中で数回洗浄し、続いて125I標識タンパク質A(Amersham)を含有するプローブ緩衝液中で1時間インキュベーションを行なった。洗浄緩衝液中で数回洗浄後、ブロットを風乾し、Saran(Dow)に包み、これを用いて−70℃において、増感スクリーンを具備したX−omat Sフィルム(Kodak)を露光した。Omnimedia 6cxスキャナ及びAdobe Photoshopプログラムを用いて、標識されたタンパク質を定量した。両形質転換細胞からタンパク質を単離した様々な操作の結果を図5に示す。プラスミドpSY13を保持する形質転換細胞の場合、酵素は全般に培地中に局在し、その際少量の酵素のみが細胞壁に、結合したというよりは捕捉された(図5A)―この酵素はSDS抽出によって完全に除去可能―が、融合タンパク質の方は細胞壁に強固に結合し、少量のα−ガラクトシダーゼ/α−アグルチニンのみが周囲の培養液中に放出され、またはSDS抽出可能であった。遊離α−ガラクトシダーゼを発現させる細胞からの細胞壁のラミナリナーゼ抽出ではそれ以上の酵素解離は観察されなかったことに対して、融合酵素発現細胞に同じ処理を施すと融合酵素は全般に解離した。このことは、融合タンパク質はα−アグルチニン同様S. cerevisiaeの細胞壁グルカンと強固に結合するが、α−ガラクトシダーゼ単独ではそのようなことはないということを示している。後から行なったEndo−H処理は融合タンパク質の著しいグリコシル化を示したが、これは先に説明した、α−アグルチニンのC末端部の拡大グリコシル化と完全に一致する結果であった。
2.局在
抗α−ガラクトシダーゼ血清での免疫蛍光標識を完全細胞に対して行ない、それによって細胞壁におけるα−ガラクトシダーゼ/α−アグルチニン融合タンパク質の存在及び分布を測定した。免疫蛍光標識は、Watzele等による固定(参考文献5参照)はせずに行なった。OD530=2の細胞を単離し、TBS(140mM NaCl、5mM EDTA及び20μg/mlシクロヘキシミドを含有するpH7.8の10mMトリス・HCl)中で洗浄した。細胞をTBS+抗α−ガラクトシダーゼ血清中で1時間インキュベートし、続いてTBS中で数回洗浄した。その後、FITCと結合させた抗ウサギIgG(Sigma)を添加して30分間、インキュベーションを行なった。TBS中で洗浄後、細胞を、1mg/mlのp−フェニレンジアミン及び0.1%のアジドを含有するpH9.0の10mMトリス・HCl中に取り、Zeiss 68000顕微鏡において写真撮影した。この分析の結果を示す図6からは、α−ガラクトシダーゼ/α−アグルチニンキメラが酵母細胞の表面に局在することが明らかである。非常に小さいものまで非常に均一に標識された様々な大きさのバッド(buds)が、融合酵素が全細胞周期を通じて連続的に細胞壁中に取り込まれ、かつ瞬時に強固に結合することを明示している。
抗α−ガラクトシダーゼ血清での免疫蛍光標識を完全細胞に対して行ない、それによって細胞壁におけるα−ガラクトシダーゼ/α−アグルチニン融合タンパク質の存在及び分布を測定した。免疫蛍光標識は、Watzele等による固定(参考文献5参照)はせずに行なった。OD530=2の細胞を単離し、TBS(140mM NaCl、5mM EDTA及び20μg/mlシクロヘキシミドを含有するpH7.8の10mMトリス・HCl)中で洗浄した。細胞をTBS+抗α−ガラクトシダーゼ血清中で1時間インキュベートし、続いてTBS中で数回洗浄した。その後、FITCと結合させた抗ウサギIgG(Sigma)を添加して30分間、インキュベーションを行なった。TBS中で洗浄後、細胞を、1mg/mlのp−フェニレンジアミン及び0.1%のアジドを含有するpH9.0の10mMトリス・HCl中に取り、Zeiss 68000顕微鏡において写真撮影した。この分析の結果を示す図6からは、α−ガラクトシダーゼ/α−アグルチニンキメラが酵母細胞の表面に局在することが明らかである。非常に小さいものまで非常に均一に標識された様々な大きさのバッド(buds)が、融合酵素が全細胞周期を通じて連続的に細胞壁中に取り込まれ、かつ瞬時に強固に結合することを明示している。
3.活性
α−ガラクトシダーゼ活性を定量的に評価するべく、pH4.5の0.1M酢酸ナトリウム及び10mM p−ニトロフェニル−α−D−ガラクトピラノシド(Sigma)を含有する200μl試料を37℃で正確に5分間インキュベートした。1mlの2%炭酸ナトリウムの添加によって反応を停止させた。先に述べたように遠心によって分離し、かつ単離及び洗浄した完全細胞及び細胞壁からα−ガラクトシダーゼ活性を、410nmにおいて18.4cm2/molであるp−ニトロフェノールの消衰係数を用いて算出した。1単位を、37℃における1分間当たりの基質1μmolの加水分解と定義した。
α−ガラクトシダーゼ活性を定量的に評価するべく、pH4.5の0.1M酢酸ナトリウム及び10mM p−ニトロフェニル−α−D−ガラクトピラノシド(Sigma)を含有する200μl試料を37℃で正確に5分間インキュベートした。1mlの2%炭酸ナトリウムの添加によって反応を停止させた。先に述べたように遠心によって分離し、かつ単離及び洗浄した完全細胞及び細胞壁からα−ガラクトシダーゼ活性を、410nmにおいて18.4cm2/molであるp−ニトロフェノールの消衰係数を用いて算出した。1単位を、37℃における1分間当たりの基質1μmolの加水分解と定義した。
結果を表1にまとめる。大部分のα−ガラクトシダーゼは培養液中に分布し、一方融合物はそのほとんどが細胞、主として細胞壁に結合していた。図3〜図6及び表1に示した結果を勘案すれば、キメラ酵素の酵素α−ガラクトシダーゼ活性は遊離酵素のものに劣らないと推測できる。そのうえ、定常期の間に増殖培地中のα−ガラクトシダーゼの活性は低下したが、細胞壁に結合したα−ガラクトシダーゼ/α−アグルチニン融合タンパク質の活性は不変のままであり、このことは細胞に結合した融合タンパク質が失活またはタンパク質分解から保護されることを示している。
注記:本実施例の主旨は優先権主張年中にM.P.Schreuder等によって公表された(参考文献25参照)。
(実施例2A)
S. cerevisiaeの表面に固定化したHumicola属リパーゼ/α−アグルチニン(固定化酵素系の誘導発現)
α−アグルチニンのC末端部を含む1.4kbのNheI/HindIII断片の構築及び単離は実施例1に述べた。プラスミドpUR7021は、市販ベクターpTZ18RのEcoRI/HindIII制限部位にクローニングされた長さ894bpの、Humicola属のリパーゼをコードする合成DNA断片(参考文献16並びに配列番号7及び8参照)を含む(図7参照)。成熟リパーゼをコードするDNA部分の5′末端と3′末端との両方を1ステップで適正に改変するのにPCR技術を適用し得る。従って、標準的PCRプロトコルにおいてDNAオリゴヌクレオチドlipo1(配列番号3参照)及びlipo2(配列番号6参照)をプライマーとして用いて、両末端にEagI制限部位及びHindIII制限部位をそれぞれ有する長さ826bpのDNA断片を生じさせ得、この断片を、本明細書中で先に述べたインベルターゼシグナル配列に後続するα−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミドであるEagI/HindIII消化pUR2650の大きい方の部分と組み合わせることによりプラスミドpUR2970Aを生じさせ得る(図7参照)。
S. cerevisiaeの表面に固定化したHumicola属リパーゼ/α−アグルチニン(固定化酵素系の誘導発現)
α−アグルチニンのC末端部を含む1.4kbのNheI/HindIII断片の構築及び単離は実施例1に述べた。プラスミドpUR7021は、市販ベクターpTZ18RのEcoRI/HindIII制限部位にクローニングされた長さ894bpの、Humicola属のリパーゼをコードする合成DNA断片(参考文献16並びに配列番号7及び8参照)を含む(図7参照)。成熟リパーゼをコードするDNA部分の5′末端と3′末端との両方を1ステップで適正に改変するのにPCR技術を適用し得る。従って、標準的PCRプロトコルにおいてDNAオリゴヌクレオチドlipo1(配列番号3参照)及びlipo2(配列番号6参照)をプライマーとして用いて、両末端にEagI制限部位及びHindIII制限部位をそれぞれ有する長さ826bpのDNA断片を生じさせ得、この断片を、本明細書中で先に述べたインベルターゼシグナル配列に後続するα−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミドであるEagI/HindIII消化pUR2650の大きい方の部分と組み合わせることによりプラスミドpUR2970Aを生じさせ得る(図7参照)。
PCR法によりリパーゼのコーディング配列の末端にNheI部位を創出して、リパーゼをコードするDNAとα−アグルチニンのC末端部をコードするDNAとの枠内連結を可能にする。そうすれば、プラスミドpUR2970AをNheI及びHindIIIで消化し得、プラスミドpUR2968に由来する、α−アグルチニンのC末端部を含む1.4kbのNheI/HindIII断片をNheI及びHindIIIで処理したプラスミドpUR2970Aの大きい方の部分と組み合わせてプラスミドpUR2971Aを得ることができる。このプラスミドから2.2kbのEagI/HindIII断片を単離して、EagI及びHindIIIで処理したpUR2741中に連結し得、その際プラスミドpUR2741はpUR2740の、既に不活性なTet耐性遺伝子の第二のEagI制限部位がNruI/SalI消化によって欠失した誘導体である(参考文献17参照)。SalI部位は再連結前に充填された。連結によって、GAL7プロモーター、インベルターゼシグナル配列、リパーゼ/α−アグルチニンキメラ遺伝子、2μm配列、欠陥Leu2プロモーター及びLeu2遺伝子を含むpUR2972Aが得られる。このプラスミドを用いてS. cerevisiaeを形質転換し得、得られる形質転換細胞は、リパーゼ/α−アグルチニンキメラ遺伝子の発現を惹起する誘導物質としてガラクトースを抑制量のグルコースの不在下に含有するYP培地中で培養することができる。
リパーゼ/α−アグルチニンキメラの発現、分泌、局在及び活性の分析は、実施例1に述べたのと同様の操作を用いて可能である。
同様にして、rDNA技術を介して得られるHumicola属リパーゼの変異体(variants)をα−アグルチニンのC末端部に結合することも可能であり、前記変異体はエステル化反応またはエステル交換反応の間、より高い安定性を有し得る。
(実施例2B)
S. cerevisiaeの表面に固定化したHumicola属リパーゼ/α−アグルチニン(固定化酵素系の誘導発現)
実施例2Aでは、特定構築物を製造するプロトコルを説明する。研究を行なう前、本実施例2Bでの構築手順が実施例2Aでの構築手順と僅かな点でしか異ならず、しかも得られるプラスミドは実施例2Aに述べたものと同等でないように実施例1に述べた発現ベクターを用いることが好ましいと考えられた。しかし、プロモーターと、シグナル配列と、融合タンパク質をコードする構造遺伝子とを含む実質的な遺伝子構築物は実施例2Aと実施例2Bとで同じである。
S. cerevisiaeの表面に固定化したHumicola属リパーゼ/α−アグルチニン(固定化酵素系の誘導発現)
実施例2Aでは、特定構築物を製造するプロトコルを説明する。研究を行なう前、本実施例2Bでの構築手順が実施例2Aでの構築手順と僅かな点でしか異ならず、しかも得られるプラスミドは実施例2Aに述べたものと同等でないように実施例1に述べた発現ベクターを用いることが好ましいと考えられた。しかし、プロモーターと、シグナル配列と、融合タンパク質をコードする構造遺伝子とを含む実質的な遺伝子構築物は実施例2Aと実施例2Bとで同じである。
1.構築
α−アグルチニン細胞壁タンパク質のC末端部をコードする1.4kbのNheI/HindIII断片の構築及び単離は実施例1に述べた。市販のベクターpTZ18RをEcoRI及びHindIIIで処理し、得られるベクター断片を、Humicola属のリパーゼをコードする長さ894bpの合成DNA EcoRI/HindIII断片と連結することによって、(実施例2AのpUR7021に類似する)プラスミドpUR7033を調製した(配列番号7及び8並びに参考文献16参照)。
α−アグルチニン細胞壁タンパク質のC末端部をコードする1.4kbのNheI/HindIII断片の構築及び単離は実施例1に述べた。市販のベクターpTZ18RをEcoRI及びHindIIIで処理し、得られるベクター断片を、Humicola属のリパーゼをコードする長さ894bpの合成DNA EcoRI/HindIII断片と連結することによって、(実施例2AのpUR7021に類似する)プラスミドpUR7033を調製した(配列番号7及び8並びに参考文献16参照)。
リパーゼをα−アグルチニンのC末端の、細胞壁アンカーを含む領域に融合させるために、プラスミドpUR7033をEagI及びHindIIIで消化し、リパーゼコーディング配列を単離して、EagI及びHindIIIで消化した酵母発現ベクターpSY1(参考文献27参照)中に連結し、それによってpUR7034を生じさせた(図13参照)。これは実施例1に述べた、誘導可能なGAl7プロモーターの制御下にインベルターゼ(SUC2)シグナル配列に後続するα−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む2μmエピゾーム発現ベクターである。
上述の消化に並行して、pUR7033をEcoRV及びHindIIIでも消化し、それによって最後の15個のカルボキシル末端アミノ酸のためのコドンを有する長さ57bpのDNA断片を解離させた。この断片を配列番号9及び10の、化学的に合成した2個のデオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって生じさせた小さいDNA断片に対して交換した。両DNA鎖のアニーリング後、これら2個のオリゴヌクレオチドは最初のリパーゼ遺伝子の3′コーディング配列の残部を実質的に再構成するが、リパーゼ遺伝子の下流に新たなNheI制限部位を導入し、これにHindIII部位が近接して続き、その際NheI部位の最初の3個のヌクレオチドはリパーゼの最後のアミノ酸のコドンを構成する。得られたプラスミドに記号“pUR2970B”を付した。次に、この構築中間体をEagI及びNheIで消化し、リパーゼコーディング断片を単離してpUR2968の1.4kbのNheI/HindIII断片と共にEagI及びHindIII切断pSY1ベクター中に連結した。この三点連結によって得られた最終的なlipolase−α−アグルチニン酵母発現ベクターを“pUR2972B”と命名した(図14参照)。
このプラスミドを用いて、参考文献17に記載されたS. cerevisiae株SU10を形質転換し、形質転換細胞を、リパーゼ/α−アグルチニンキメラ遺伝子の発現を惹起する誘導物質としてガラクトースを抑制量のグルコースの不在下に含有するYP培地中で培養した。
2.活性
リパーゼ活性を定量するべく、2種の別個の基質に関して2種の活性測定を行なった。いずれの場合も、プラスミドpUR7034またはpSY1で形質転換したSU10酵母細胞を対照として用いた。従って、プラスミドpSY1、プラスミドpUR7034またはプラスミドpUR2972Bを保持する形質転換酵母細胞を、ヒスチジン及びウラシルを添加したYNB−グルコース培地中で24時間増殖させ、その後5%ガラクトースを添加したYP培地中で1:10に稀釈し、再び培養した。30℃で24時間のインキュベーション後、上記両アッセイのための第一の測定を行なった。
リパーゼ活性を定量するべく、2種の別個の基質に関して2種の活性測定を行なった。いずれの場合も、プラスミドpUR7034またはpSY1で形質転換したSU10酵母細胞を対照として用いた。従って、プラスミドpSY1、プラスミドpUR7034またはプラスミドpUR2972Bを保持する形質転換酵母細胞を、ヒスチジン及びウラシルを添加したYNB−グルコース培地中で24時間増殖させ、その後5%ガラクトースを添加したYP培地中で1:10に稀釈し、再び培養した。30℃で24時間のインキュベーション後、上記両アッセイのための第一の測定を行なった。
適用した第一のアッセイはpHスタット法であった。このアッセイではリパーゼ活性の1単位を、ラジオメーターpHスタット装置(pHM 84メーター、ABU 80自動ビュレット、TTA 60滴定アセンブリー)において標準的なアッセイ条件(1:1 w/wアラビアゴムで乳化した純粋なトリオレエートと看做される38mMのオリーブ油と、20mMの塩化カルシウムと、40mMの塩化ナトリウムと、5mMのトリスとを含有する30mlアッセイ溶液、pH9.0、30℃)下にトリグリセリド基質から毎分1μmolの脂肪酸を遊離させ得る酵素量と定義する。生じた脂肪酸を0.05N NaOHで滴定し、測定した活性は推定酵素バッチの添加後1〜2分間隔でのアルカリ消費に基づくものであった。固定化リパーゼ活性について試験するべく、1mlの各培養物を遠心し、上清を取り分け、ペレットを1mlの1Mソルビトール中に再懸濁させて洗浄し、その後再び遠心し、かつ200μlの1Mソルビトール中に再懸濁させた。各種の酵母細胞から得た最初の上清及び洗浄した細胞をリパーゼ活性について試験した。
残りの酵母培養物を更にインキュベートし、48時間後に実質的に同じ分離操作を行なった。測定した初期活性に応じて、測定試料の実際量は25μlから150μlまで様々とした。
この一連の測定は、リパーゼ−α−アグルチニン融合タンパク質をコードするプラスミドを保持する酵母細胞が実際上、酵母細胞に関係付けられる幾分かのリパーゼ活性を呈することを示している。
リパーゼの活性が酵母細胞表面に固定化されることを更に確認するべく、付加的な第二のアッセイを行なった。手短に言えばこのアッセイでは、PNP(=パラニトロフェニル)のPNP−ブチレートからの遊離の反応速度を400nmにおけるODの測定によって決定する。従って、pSY1、pUR7034またはpUR2972Bを保持する酵母細胞を含有する培養物10mlを遠心し、ペレットを4mlの緩衝液A(pH5.0の0.1M NaOAc、及び1mM PMSF)中に再懸濁させ、この4mlのうちの500μlを再び遠心し、かつ500μlのPNB緩衝液(pH9.0の20mMトリス−HCl、20mM CaCl2、25mM NaCl)中に再懸濁させ、再度遠心し、最後に400μlのPNB緩衝液中に再懸濁させた。この画分を用いて、リパーゼの細胞結合部分を測定した。
残りの3500μlを遠心し、ペレットを4mlのA中に再懸濁させ、得られた各懸濁液に40μlのラミナリナーゼ(ex mollusc, 1.25mU/μl)を添加し、最初37℃で3時間、続いて20℃で一晩インキュベートした。次に、完全細胞をなお含有する反応混合物を再び遠心し、上清を用いて、本来細胞壁に結合していたがラミナリナーゼインキュベーションにより遊離した物質の量を測定した。最終ペレットを400μlのPNP緩衝液中に再懸濁させ、細胞になお結合している部分を算定した。4mlのアッセイ緩衝液に加えた所定量の特定培養物画分のブランク反応を測定し、その後80μlの基質溶液(メタノール中に100mM PNP−ブチレート)の添加によって反応を開始させ、分光光度計において25℃及び400nmで観察した。
この結果は、プラスミドpUR2972Bを保持する酵母細胞の表面に相当量のリパーゼ活性が固定化されることを明示している。ここでも、完全細胞の細胞壁に挿入されたリパーゼによって反応が触媒されるように導入が実現したが、このことは外向きの固定化を示唆する。そのうえ、ラミナリナーゼと共にインキュベートした後に相当量のリパーゼ活性が呈示されることも、α−アグルチニンのC末端部との遺伝子操作融合により異種酵素がおそらくは共有結合によって導入されることを明示する。
3.局在
リパーゼ−α−アグルチニン融合タンパク質の発現、分泌、及び酵母細胞壁へのその後の導入も、実質的に実施例1の2“局在”に述べた、抗lipolase血清を用いる免疫蛍光標識によって確認した。
リパーゼ−α−アグルチニン融合タンパク質の発現、分泌、及び酵母細胞壁へのその後の導入も、実質的に実施例1の2“局在”に述べた、抗lipolase血清を用いる免疫蛍光標識によって確認した。
図15から知見され得るように、ここでの免疫蛍光染色はα−ガラトシダーゼ免疫染色と実質的に類似する像を示し、反応性は細胞表面外側に明らかに検出できる(細胞を取り巻く明瞭な光輪を示す図15A、及び細胞表面のより明るい円を示す図15B参照)が、培地中や細胞内部には検出できない。pUR2972BにHumicola属リパーゼ−α−アグルチニン融合タンパク質を発現させる酵母細胞は表面を均一に染色されるようになり、このことはα−アグルチニンC末端を有するキメラ酵素の実質的に総てが酵母細胞の外側に固定化されたことを示す。行なった対照実験では、プラスミドpUR7034を保持するSU10酵母細胞を対照として用い、この実験で適用した抗リパーゼ血清に対する細胞表面結合反応性は検出できなかった。
同様にして、rDNA技術を介して得られるHumicola属リパーゼの変異体をα−アグルチニンのC末端部に結合することも可能であり、前記変異体はエステル化反応またはエステル交換反応の間、より高い安定性を有し得る。
(実施例3)
S. cerevisiaeの表面に固定化したHumicola属リパーゼ/α−アグルチニン(固定化酵素系の構成発現)
実施例2に述べたプラスミドpUR2972はEagI及びHindIIIで処理し得、リパーゼ/α−アグルチニン遺伝子を含む約2.2kbの断片を単離することができる。プラスミドpSY16をEagI及びHindIIIで制限し、前記2酵素の制限部位間に、リパーゼ/α−アグルチニン断片を含む2.2kb断片を連結してpUR2973を得ることができる。このプラスミドの、キメラ酵素の産生に関与する部分はpUR2972に類似し、ただしシグナル配列は異なる。pUR2972はSUC2インベルターゼシグナル配列を含むが、pUR2973はα−接合因子配列を含む(参考文献18参照)。そのうえ、プラスミドpUR2973はpUR2972の截頭プロモーターに替えて、完全なプロモーター配列を伴ったLeu2マーカー遺伝子を含む。
S. cerevisiaeの表面に固定化したHumicola属リパーゼ/α−アグルチニン(固定化酵素系の構成発現)
実施例2に述べたプラスミドpUR2972はEagI及びHindIIIで処理し得、リパーゼ/α−アグルチニン遺伝子を含む約2.2kbの断片を単離することができる。プラスミドpSY16をEagI及びHindIIIで制限し、前記2酵素の制限部位間に、リパーゼ/α−アグルチニン断片を含む2.2kb断片を連結してpUR2973を得ることができる。このプラスミドの、キメラ酵素の産生に関与する部分はpUR2972に類似し、ただしシグナル配列は異なる。pUR2972はSUC2インベルターゼシグナル配列を含むが、pUR2973はα−接合因子配列を含む(参考文献18参照)。そのうえ、プラスミドpUR2973はpUR2972の截頭プロモーターに替えて、完全なプロモーター配列を伴ったLeu2マーカー遺伝子を含む。
(実施例4)
S. cerevisiaeの表面に固定化したGeotrichum属リパーゼ/α−アグルチニン
AGα−1(α−アグルチニン)のC末端部を含む1.4kbのNheI/HindIII断片の構築及び単離は実施例1に述べた。α−アグルチニンのC末端膜アンカーをコードするDNAの、株CMICC 335426に由来するGeotrichum candidumリパーゼBの完全コーディング配列への枠内遺伝子融合(図8並びに配列番号11及び12参照)のためにプラスミドpUR2974を用い得る。市販のpBluescript II SKプラスミドに由来するこのプラスミドは長さ1850bpのEcoRI/XhoI挿入体上に、完全なG. candidumリパーゼIIをコードするcDNAを含む(図9参照)。
S. cerevisiaeの表面に固定化したGeotrichum属リパーゼ/α−アグルチニン
AGα−1(α−アグルチニン)のC末端部を含む1.4kbのNheI/HindIII断片の構築及び単離は実施例1に述べた。α−アグルチニンのC末端膜アンカーをコードするDNAの、株CMICC 335426に由来するGeotrichum candidumリパーゼBの完全コーディング配列への枠内遺伝子融合(図8並びに配列番号11及び12参照)のためにプラスミドpUR2974を用い得る。市販のpBluescript II SKプラスミドに由来するこのプラスミドは長さ1850bpのEcoRI/XhoI挿入体上に、完全なG. candidumリパーゼIIをコードするcDNAを含む(図9参照)。
相同なシグナル配列を伴ったS. cerevisiaeのための発現ベクターを開発するために、成熟リパーゼBのN末端を標準的な技術で実験により決定した。得られたアミノ酸配列“Gln−Ala−Pro−Thr−Ala−Val−……”は、G. candidumリパーゼIIのシグナルペプチダーゼ切断部位と完全に一致する(参考文献19参照)。
成熟リパーゼBを、一方ではSUC2(インベルターゼ)またはα−接合因子(プレプロ−αMF)のS. cerevisiaeシグナル配列に融合させ、他方ではAGα1遺伝子の3′末端部に枠内融合させるのにPCR技術を用い得る。PCRプライマーlipo3(配列番号13参照)は、(成熟タンパク質のコドン5〜7にわたる)コーディング配列の5′末端部に本来存在するEagI部位がアミノ酸配列を何等変化させることなく不活性となるように構築することができる。後のクローニング操作を容易にするべく、PCRプライマーの5′末端に、SUC2シグナル配列やプレプロ−αMF配列への枠内連結のための新たなEagI部位を付与することも可能である。対応するPCRプライマーlipo4(配列番号16参照)は、リパーゼBのC末端をコードするヌクレオチドの後方に位置する余分なNheI部位を含み、それによってα−アグルチニンのC末端部への適正な融合を確実化する。
改変された末端を有するPCR産物は、やはり校正活性を示してエラーの無いDNA鋳型を保証する新規な熱安定性VENTポリメラーゼを通常のAmpli−Taqポリメラーゼの替わりに用いて標準的なPCRプロトコルにより生成させ得る。先に述べたプラスミドpUR2972をEagI(完全)及びNheI(部分)で消化することにより、Humicola属リパーゼ断片をリパーゼBをコードするDNA断片に対し交換し、それによって最終的なS. cerevisiae発現ベクターpUR2975を調製することができる(図9参照)。
先に述べたベクターpUR2973をEagI/HindIIIで消化することによりHumicola属リパーゼ−α−アグルチニン融合タンパク質コーディング配列を上述のリパーゼB/α−アグルチニン融合構築物に対し交換すれば、pUR2976が得られる(図9参照)。
(実施例5)
S. cerevisiaeの表面に固定化したRhizomucor mieheiリパーゼ/α−アグルチニン
α−アグルチニンのC末端部をコードする1.4kbのNheI/HindIII断片の構築及び単離は実施例1に述べた。プラスミドpUR2980は市販のpUC18のSmaI部位にクローニングされた1.25kbのcDNA断片を含み、(人工的な合成可能な)この断片は、トリアシルグリセロールをエステル交換する(参考文献21参照)か、またはバイオサーファクタントを製造する(参考文献22参照)幾つかの方法において用いられる酵素であるRhizomucor mieheiのトリグリセリドリパーゼの完全なコーディング配列をコードする(参考文献20参照)。この断片は成熟リパーゼ分子の269コドンの外に、24アミノ酸シグナルペプチドのためのコドン、並びにプロペプチドの70アミノ酸のためのコドンも含む。成熟リパーゼをコードする遺伝子断片のSUC2シグナル配列またはS. cerevisiaeのプレプロα−接合因子配列との適正な融合、並びに先に述べたNheI/HindIII断片との枠内融合を確実にするべくPCRを容易に適用し得る。次の2個のプライマーlipo5(配列番号17参照)及びlipo6(配列番号20参照)は833bpのDNA断片をもたらし、この断片はプロテイナーゼK処理並びにEagI及びNheIでの消化後に長さ816bpの断片として、EagI/NheIで消化したプラスミドpUR2972及びpUR2973それぞれにクローニングすることができる(図7参照)。
S. cerevisiaeの表面に固定化したRhizomucor mieheiリパーゼ/α−アグルチニン
α−アグルチニンのC末端部をコードする1.4kbのNheI/HindIII断片の構築及び単離は実施例1に述べた。プラスミドpUR2980は市販のpUC18のSmaI部位にクローニングされた1.25kbのcDNA断片を含み、(人工的な合成可能な)この断片は、トリアシルグリセロールをエステル交換する(参考文献21参照)か、またはバイオサーファクタントを製造する(参考文献22参照)幾つかの方法において用いられる酵素であるRhizomucor mieheiのトリグリセリドリパーゼの完全なコーディング配列をコードする(参考文献20参照)。この断片は成熟リパーゼ分子の269コドンの外に、24アミノ酸シグナルペプチドのためのコドン、並びにプロペプチドの70アミノ酸のためのコドンも含む。成熟リパーゼをコードする遺伝子断片のSUC2シグナル配列またはS. cerevisiaeのプレプロα−接合因子配列との適正な融合、並びに先に述べたNheI/HindIII断片との枠内融合を確実にするべくPCRを容易に適用し得る。次の2個のプライマーlipo5(配列番号17参照)及びlipo6(配列番号20参照)は833bpのDNA断片をもたらし、この断片はプロテイナーゼK処理並びにEagI及びNheIでの消化後に長さ816bpの断片として、EagI/NheIで消化したプラスミドpUR2972及びpUR2973それぞれにクローニングすることができる(図7参照)。
これらの新規なS. cerevisiae発現プラスミドはGAL7プロモーターと、インベルターゼシグナル配列(pUR2981)またはプレプロ−α−接合因子配列(pUR2982)と、Rhizomucor mieheiリパーゼ/α−アグルチニンキメラ遺伝子と、2μm配列と、欠陥(截頭)Leu2プロモーターと、Leu2遺伝子とを含む。これらのプラスミドでS. cerevisiaeを形質転換して増殖させ、先の諸実施例に述べたプロトコルを用いて分析することができる。
(実施例6)
S. cerevisiaeの表面に固定化したAspergillus nigerグルコースオキシダーゼ/GPI固定細胞壁タンパク質
Aspergillus niger由来のグルコースオキシダーゼ(β−D:酸素1−オキシドレダクターゼ;EC 1.1.3.4)は、β−D−グルコースのグルコノ−δ−ラクトンへの酸化とそれに伴う酸素分子の過酸化水素への還元とを触媒する。この真菌酵素は、強固に結合した2個のFAD補因子を含む分子量150,000のホモダイマーから成る。この酵素はグルコース検出キットで用いられるほか、食物の保存における過酸化水素源として有用でもある。遺伝子はcDNAとゲノムライブラリーとの両方からクローニングした。ただ1個の読み取り枠は介在配列を含まず、605アミノ酸のタンパク質をコードする(参考文献23参照)。
S. cerevisiaeの表面に固定化したAspergillus nigerグルコースオキシダーゼ/GPI固定細胞壁タンパク質
Aspergillus niger由来のグルコースオキシダーゼ(β−D:酸素1−オキシドレダクターゼ;EC 1.1.3.4)は、β−D−グルコースのグルコノ−δ−ラクトンへの酸化とそれに伴う酸素分子の過酸化水素への還元とを触媒する。この真菌酵素は、強固に結合した2個のFAD補因子を含む分子量150,000のホモダイマーから成る。この酵素はグルコース検出キットで用いられるほか、食物の保存における過酸化水素源として有用でもある。遺伝子はcDNAとゲノムライブラリーとの両方からクローニングした。ただ1個の読み取り枠は介在配列を含まず、605アミノ酸のタンパク質をコードする(参考文献23参照)。
2個の適正なオリゴヌクレオチドを用いて、配列のコーディング部をPCRでのワンステップ改変操作において、グルコースオキシダーゼ、並びにFLO1遺伝子産物またはα−アグルチニンのC末端細胞壁アンカーをコードする融合遺伝子産物が得られるように調節する。即ち、先の諸実施例に述べたプラスミドのうちの幾つかを用いて対応する配列を、先の諸実施例で用いたシグナル配列のうちの一つとAGα1遺伝子のNheI/HindIII部分との間に枠内で組み込むことができる。
2個のモノマーのダイマー化が活性の必要条件となり得るので、別のアプローチではGPIアンカーを伴わないグルコースオキシダーゼのための完全なコーディング配列を、融合構築物を既に保持するS. cerevisiae形質転換細胞において発現させ得る。このような発現は、GPIアンカーを有する融合構築物の、例えばGAPDHまたはPGKプロモーターの補助下での構成発現によって実現し得る。例えばGAL7プロモーターなどの誘導可能なプロモーターを含むDNA構築物を用いることにより、固定しない未結合モノマーを製造することが可能である。
(実施例7)
ダイズ抽出物中のラフィノース、スタキオース及び類似糖質を、酵母に固定化したα−ガラクトシダーゼ/α−アグルチニンで変換する方法
プラスミドpUR2969で形質転換した酵母は大規模に培養できる。培養の間一定の時間間隔で、洗浄した細胞をその表面におけるα−ガラクトシダーゼ活性の存在に関し、実施例1に述べた方法で分析するべきである。細胞密度と単位生物量当たりのα−ガラクトシダーゼ活性との両方がその最大値に達したら、酵母細胞を遠心によって回収し、洗浄し得る。洗浄した細胞はダイズ抽出物に添加し得る。酵母細胞の最終濃度は0.1g/lから10g/lまでとし得るが、好ましくは前記濃度は1g/lを上回るべきである。ダイズ抽出物の温度は酵母細胞の代謝活性を低減するべく8℃より低くするべきである。ラフィノース及びスタキオースの変換はHPLC法で分析し得、前記糖質の95%変換後、酵母細胞を遠心によって分離して、その生物量1g当たりのα−ガラクトシダーゼ活性を測定し得る。優れた活性を有する遠心分離物は後の変換過程で用い得、一方本来の活性の50%未満の活性しか有しない遠心分離物は増殖培地中で蘇生させ得、その際細胞は2〜4時間掛けて回復させ得る。その後、細胞を遠心し、洗浄してから、後の変換過程で用い得る。
ダイズ抽出物中のラフィノース、スタキオース及び類似糖質を、酵母に固定化したα−ガラクトシダーゼ/α−アグルチニンで変換する方法
プラスミドpUR2969で形質転換した酵母は大規模に培養できる。培養の間一定の時間間隔で、洗浄した細胞をその表面におけるα−ガラクトシダーゼ活性の存在に関し、実施例1に述べた方法で分析するべきである。細胞密度と単位生物量当たりのα−ガラクトシダーゼ活性との両方がその最大値に達したら、酵母細胞を遠心によって回収し、洗浄し得る。洗浄した細胞はダイズ抽出物に添加し得る。酵母細胞の最終濃度は0.1g/lから10g/lまでとし得るが、好ましくは前記濃度は1g/lを上回るべきである。ダイズ抽出物の温度は酵母細胞の代謝活性を低減するべく8℃より低くするべきである。ラフィノース及びスタキオースの変換はHPLC法で分析し得、前記糖質の95%変換後、酵母細胞を遠心によって分離して、その生物量1g当たりのα−ガラクトシダーゼ活性を測定し得る。優れた活性を有する遠心分離物は後の変換過程で用い得、一方本来の活性の50%未満の活性しか有しない遠心分離物は増殖培地中で蘇生させ得、その際細胞は2〜4時間掛けて回復させ得る。その後、細胞を遠心し、洗浄してから、後の変換過程で用い得る。
(実施例8)
酵母に固定化したHumicola属リパーゼ/α−アグルチニンを用いてのバイオサーファクタントの製造
プラスミドpUR2972または2973で形質転換した酵母は大規模に培養できる。培養の間一定の時間間隔で、洗浄した細胞をその表面におけるリパーゼ活性の存在に関し、実施例1に述べた方法で分析し得る。細胞密度と単位生物量当たりのリパーゼとの両方がその最大値に達したら、酵母細胞を遠心によって回収し、洗浄し得る。洗浄した細胞は、少量の水中に懸濁させて、好ましくは炭素原子12〜18個の鎖長を有する脂肪酸と、好ましくはグルコース、ガラクトースまたはスクロースである糖質との混合物を収容した反応容器に加え得る。(酵母細胞中の水を除いた)水の総量は0.1%未満であり得る。酵母細胞の最終濃度は0.1g/lから10g/lまでとし得るが、好ましくは前記濃度は1g/lを上回る。反応容器は、(不飽和)脂肪酸の酸化を回避し、かつ酵母の代謝活性を最小限に留めるべくN2及びCO2の雰囲気下に保持しなければならない。容器内の混合物の温度は、用いる脂肪酸の種類に応じて30〜60℃とするべきである。脂肪酸の変換はGLC法で分析し得、脂肪酸の95%変換後、酵母細胞を遠心によって分離して、その生物量1g当たりのリパーゼ活性を測定し得る。優れた活性を有する遠心分離物は後の変換過程で用い得、一方本来の活性の50%未満の活性しか有しない遠心分離物は増殖培地中で蘇生させ得、その際細胞は2〜8時間掛けて回復させ得る。その後、細胞を再び遠心し、洗浄し、後の変換過程で用い得る。
酵母に固定化したHumicola属リパーゼ/α−アグルチニンを用いてのバイオサーファクタントの製造
プラスミドpUR2972または2973で形質転換した酵母は大規模に培養できる。培養の間一定の時間間隔で、洗浄した細胞をその表面におけるリパーゼ活性の存在に関し、実施例1に述べた方法で分析し得る。細胞密度と単位生物量当たりのリパーゼとの両方がその最大値に達したら、酵母細胞を遠心によって回収し、洗浄し得る。洗浄した細胞は、少量の水中に懸濁させて、好ましくは炭素原子12〜18個の鎖長を有する脂肪酸と、好ましくはグルコース、ガラクトースまたはスクロースである糖質との混合物を収容した反応容器に加え得る。(酵母細胞中の水を除いた)水の総量は0.1%未満であり得る。酵母細胞の最終濃度は0.1g/lから10g/lまでとし得るが、好ましくは前記濃度は1g/lを上回る。反応容器は、(不飽和)脂肪酸の酸化を回避し、かつ酵母の代謝活性を最小限に留めるべくN2及びCO2の雰囲気下に保持しなければならない。容器内の混合物の温度は、用いる脂肪酸の種類に応じて30〜60℃とするべきである。脂肪酸の変換はGLC法で分析し得、脂肪酸の95%変換後、酵母細胞を遠心によって分離して、その生物量1g当たりのリパーゼ活性を測定し得る。優れた活性を有する遠心分離物は後の変換過程で用い得、一方本来の活性の50%未満の活性しか有しない遠心分離物は増殖培地中で蘇生させ得、その際細胞は2〜8時間掛けて回復させ得る。その後、細胞を再び遠心し、洗浄し、後の変換過程で用い得る。
(実施例9)
酵母に固定化したRhizomucor mieheiリパーゼ/α−アグルチニンを用いての特定種類のトリアシルグリセロールの製造
プラスミドpUR2981または2982で形質転換した酵母は大規模に培養できる。培養の間一定の時間間隔で、洗浄した細胞をその表面におけるリパーゼ活性の存在に関し、実施例1に述べた方法で分析し得る。細胞密度と単位生物量当たりのリパーゼとの両方がその最大値に達したら、酵母細胞を遠心によって回収し、洗浄し得る。洗浄した細胞は、少量の水中に懸濁させて、様々なトリアシルグリセロール及び脂肪酸の混合物を収容した反応容器に加え得る。(酵母細胞中の水を除いた)水の総量は0.1%未満であり得る。酵母細胞の最終濃度は0.1g/lから10g/lまでとし得るが、好ましくは前記濃度は1g/lを上回る。反応容器は、(不飽和)脂肪酸の酸化を回避し、かつ酵母の代謝活性を最小限に留めるべくN2及びCO2の雰囲気下に保持しなければならない。容器内の混合物の温度は、用いるトリアシルグリセロール及び脂肪酸の種類に応じて30〜70℃とするべきである。エステル交換の程度はGLC/MS法で分析し得、所望種類のトリアシルグリセロールが理論値の80%以上生成した後、酵母細胞を遠心によって分離して、その生物量1g当たりのリパーゼ活性を測定し得る。優れた活性を有する遠心分離物は後の変換過程で用い得、一方本来の活性の50%未満の活性しか有しない遠心分離物は増殖培地中で蘇生させ得、その際細胞は2〜8時間掛けて回復させるべきである。その後、細胞を遠心し、洗浄し、後のエステル交換反応過程で用い得る。
酵母に固定化したRhizomucor mieheiリパーゼ/α−アグルチニンを用いての特定種類のトリアシルグリセロールの製造
プラスミドpUR2981または2982で形質転換した酵母は大規模に培養できる。培養の間一定の時間間隔で、洗浄した細胞をその表面におけるリパーゼ活性の存在に関し、実施例1に述べた方法で分析し得る。細胞密度と単位生物量当たりのリパーゼとの両方がその最大値に達したら、酵母細胞を遠心によって回収し、洗浄し得る。洗浄した細胞は、少量の水中に懸濁させて、様々なトリアシルグリセロール及び脂肪酸の混合物を収容した反応容器に加え得る。(酵母細胞中の水を除いた)水の総量は0.1%未満であり得る。酵母細胞の最終濃度は0.1g/lから10g/lまでとし得るが、好ましくは前記濃度は1g/lを上回る。反応容器は、(不飽和)脂肪酸の酸化を回避し、かつ酵母の代謝活性を最小限に留めるべくN2及びCO2の雰囲気下に保持しなければならない。容器内の混合物の温度は、用いるトリアシルグリセロール及び脂肪酸の種類に応じて30〜70℃とするべきである。エステル交換の程度はGLC/MS法で分析し得、所望種類のトリアシルグリセロールが理論値の80%以上生成した後、酵母細胞を遠心によって分離して、その生物量1g当たりのリパーゼ活性を測定し得る。優れた活性を有する遠心分離物は後の変換過程で用い得、一方本来の活性の50%未満の活性しか有しない遠心分離物は増殖培地中で蘇生させ得、その際細胞は2〜8時間掛けて回復させるべきである。その後、細胞を遠心し、洗浄し、後のエステル交換反応過程で用い得る。
(実施例1に述べた)プラスミドpSY13またはプラスミドpUR2969で形質転換した株MT302/1Cのパン酵母はブダペスト条約に従い、それぞれ仮番号330.92及び329.92の下に1992年7月3日付でCentraalbureau voor Schimmelcultures(CBS)に寄託した。
(実施例10)
S. cerevisiaeの表面に固定化したHumicola属リパーゼ/FLO1融合物
“分散する酵素細胞のフロックへの(可逆的)凝集”と定義されるフロキュレーション(参考文献24参照)は、工業的発酵における酵素株の最も重要な特徴である。フロキュレーションは、細胞壁タンパク質に関連する特性であること、また定量的特性であることでも重要である。S. cerevisiaeのフロキュレーション表現型に関連する遺伝子の一つにFLO1遺伝子が有る。この遺伝子は染色体Iの右端から約24kbのところに位置し、FLO1遺伝子の主要部を含むクローンのDNA配列がつい最近決定された(参考文献26参照)。この配列を図11並びに配列番号21及び22に示す。クローン化断片は、サザン及びノザンハイブリダイゼーションから判断してゲノムコピーより約2kb短いと考えられるが、FLO1遺伝子の両端を含む。DNA配列データの解析によって、推定されるタンパク質がN末端に、分泌のためのシグナル配列を保証する疎水性領域を有し、またGPIアンカーの結合のためのシグナルとして機能し得る疎水性C末端を有し、かつ特にC末端に多くのグリコシル化部位を有し、任意に定義したC末端(アミノ酸271〜894)の46.6%はセリン及びトレオニンであることが判明している。これらのことから、FLO1遺伝子産物が酵母細胞壁に配向して局在し、隣接細胞との相互作用過程に直接関与し得ると考えることができる。従って、クローニングしたFLO1配列は、タンパク質またはペプチドを細胞表面に、異なる種類の細胞壁アンカーによって固定化するのに適当であり得る。
S. cerevisiaeの表面に固定化したHumicola属リパーゼ/FLO1融合物
“分散する酵素細胞のフロックへの(可逆的)凝集”と定義されるフロキュレーション(参考文献24参照)は、工業的発酵における酵素株の最も重要な特徴である。フロキュレーションは、細胞壁タンパク質に関連する特性であること、また定量的特性であることでも重要である。S. cerevisiaeのフロキュレーション表現型に関連する遺伝子の一つにFLO1遺伝子が有る。この遺伝子は染色体Iの右端から約24kbのところに位置し、FLO1遺伝子の主要部を含むクローンのDNA配列がつい最近決定された(参考文献26参照)。この配列を図11並びに配列番号21及び22に示す。クローン化断片は、サザン及びノザンハイブリダイゼーションから判断してゲノムコピーより約2kb短いと考えられるが、FLO1遺伝子の両端を含む。DNA配列データの解析によって、推定されるタンパク質がN末端に、分泌のためのシグナル配列を保証する疎水性領域を有し、またGPIアンカーの結合のためのシグナルとして機能し得る疎水性C末端を有し、かつ特にC末端に多くのグリコシル化部位を有し、任意に定義したC末端(アミノ酸271〜894)の46.6%はセリン及びトレオニンであることが判明している。これらのことから、FLO1遺伝子産物が酵母細胞壁に配向して局在し、隣接細胞との相互作用過程に直接関与し得ると考えることができる。従って、クローニングしたFLO1配列は、タンパク質またはペプチドを細胞表面に、異なる種類の細胞壁アンカーによって固定化するのに適当であり得る。
組み換え体DNA構築物は、例えばFLO1遺伝子産物のアミノ酸271〜894をコードするDNA、即ち図11のポリヌクレオチド811〜2682を用いることによって得ることができる。2個のPCRプライマーpcrflo1(配列番号23参照)及びpcrflo2(配列番号26参照)の適用により、DNA断片の両端にNheI及びHindIII部位を導入し得る。第二のステップにおいて、pUR2972(AまたはB)中に存在する、α−アグルチニンのC末端部をコードする1.4kbのNheI/HindIII断片を、FLO1タンパク質のC末端部をコードする1.9kbのDNA断片によって置き換え得、それによって得られるプラスミドpUR2990(図12参照)は(a)インベルターゼシグナル配列(SUC2)と、これに後続する(b)融合タンパク質とをコードするDNA配列を含み、前記融合タンパク質は(b.1)Humicola属のリパーゼ(参考文献16参照)と、これに後続する(b.2)FLO1タンパク質のC末端(アミノ酸271〜894)とから成る。
プラスミドpUR2972(AまたはB)はNheI(部分)及びHindIIIで制限し得、ベクター主鎖及びリパーゼ遺伝子を含むNheI/HindIII断片を、FLO1配列を含むプラスミドの対応して消化したPCR生成物に連結して、GAL7プロモーターと、S. cerevisiaeインベルターゼシグナル配列と、リパーゼ/FLO1キメラ遺伝子と、酵母2μm配列と、欠陥Leu2プロモーターと、Leu2遺伝子とを含むプラスミドpUR2990を得ることができる。このプラスミドでS. cerevisiaeを形質転換し得、形質転換した細胞は誘導物質としてガラクトースを含有するYP培地中で培養することができる。
リパーゼ/FLO1キメラタンパク質の発現、分泌、局在及び活性は、実施例1に述べたのと同様の操作を用いて分析可能である。
Claims (17)
- 酵素を固定化する方法であって、組み換え体DNA技術を用いて酵素または酵素の機能性フラグメントを真菌の細胞壁に連結することを含み、その際酵素または酵素の機能性フラグメントをアンカータンパク質の固定部に結合することによって細胞壁の外側に位置させ、前記固定部は前記アンカータンパク質のC末端部から誘導可能であることを特徴とする前記方法。
- 真菌を、Aspergillus属、Penicillium属及びRhizopus属の中から選択することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 触媒活性を具えたタンパク質をコードする構造遺伝子と、真菌の細胞壁に固定し得るアンカータンパク質をコードする遺伝子の少なくとも一部分とを含み、前記一部分は前記アンカータンパク質の少なくとも固定部をコードし、この固定部は前記アンカータンパク質のC末端部から誘導可能であることを特徴とする組み換え体ポリヌクレオチド。
- ポリヌクレオチドの発現産物の分泌を保証するシグナルペプチドをコードする配列を更に含むことを特徴とする請求項3に記載のポリヌクレオチド。
- シグナルペプチドがグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカータンパク質、α因子、α−アグルチニン、インベルターゼまたはイヌリナーゼ、Bacillus属のα−アミラーゼ、及び乳酸菌のプロテイナーゼの中から選択されたタンパク質に由来することを特徴とする請求項4に記載のポリヌクレオチド。
- 細胞壁に固定し得るタンパク質がα−アグルチニン、AGA1、FLO1、真菌の主要細胞壁タンパク質の中から選択されることを特徴とする請求項3から5のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- プロモーター、好ましくは誘導可能なプロモーターに作動的に連結されていることを特徴とする請求項3から6のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 触媒活性を具えたタンパク質が加水分解酵素、例えばリパーゼであることを特徴とする請求項3から7のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 触媒活性を具えたタンパク質がオキシドレダクターゼ、例えばオキシダーゼであることを特徴とする請求項3から7のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項3から9のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む組み換え体ベクター。
- 触媒活性を具えたタンパク質がマルチマー形態で存在する時にその触媒活性を呈示し、その際触媒活性を具えた同じタンパク質をコードする構造遺伝子を含む第二のポリヌクレオチドもこの第二のポリヌクレオチドの発現産物の分泌を保証するシグナルペプチドをコードする配列と組み合わせて含み、前記第二のポリヌクレオチドは調節可能なプロモーター、好ましくは誘導または抑制可能なプロモーターに作動的に連結されていることを特徴とする請求項10に記載のベクター。
- 請求項3から9のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドによってコードされたキメラタンパク質。
- 請求項3から9のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項10もしくは11に記載のベクターを保持する真菌。
- 請求項3から9のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項10に記載のベクターを保持する真菌であって、触媒活性を具えたタンパク質がマルチマー形態で存在する時にその触媒活性を呈示し、その際触媒活性を具えた同じタンパク質をコードする構造遺伝子を含む第二のポリヌクレオチドもこの第二のポリヌクレオチドの発現産物の分泌を保証するシグナルペプチドをコードする配列と組み合わせて保持し、前記第二のポリヌクレオチドは調節可能なプロモーター、好ましくは誘導または抑制可能なプロモーターに作動的に連結されており、かつ別のベクター中にか、または真菌の染色体中に存在することを特徴とする前記真菌。
- 前記ポリヌクレオチドのうちの少なくとも一つが染色体中に組み込まれていることを特徴とする請求項13または14に記載の真菌。
- 請求項12に記載のタンパク質が細胞壁に固定化された真菌。
- 固定化した触媒活性タンパク質を用いて酵素処理を行なう方法であって、前記触媒活性タンパク質の基質を請求項13から16のいずれか1項に記載の真菌と接触させることを特徴とする前記方法。
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