KR101924139B1

KR101924139B1 - 스쿠알레인 유도체 및 이를 포함하는 종양 진단용 근적외선 또는 광음향 이미징용 조성물

Info

Publication number: KR101924139B1
Application number: KR1020170030214A
Authority: KR
Inventors: 박용대; 박승환; 민정준; 허민구
Original assignee: 한국원자력연구원
Priority date: 2017-03-09
Filing date: 2017-03-09
Publication date: 2018-11-30
Also published as: KR20180103364A

Abstract

본 발명은 스쿠알레인 유도체 및 이를 포함하는 종양 진단용 근적외선 또는 광음향 이미징용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 스쿠알레인 유도체는 근적외선 이미징 또는 광음향 이미징을 통해서 검출할 수 있으며, 특히 종래 알려진 스쿠알레인 염료에 비해서 광음향 신호가 현저히 향상되는 효과가 있어, RGD 등의 표적 리간드를 도입하여 사용할 경우 진단을 위한 근적외선 이미징 또는 광음향 이미징 조성물로 유용할 수 있다.

Description

스쿠알레인 유도체 및 이를 포함하는 종양 진단용 근적외선 또는 광음향 이미징용 조성물 {Squaraine deravatives and NIR or photoacoustic imaging agent for detecting tumors having the same}

본 발명은 스쿠알레인 유도체 및 이를 포함하는 종양 진단용 근적외선 또는 광음향 이미징용 조성물에 관한 것이다.

광음향 효과에 기초한 광음향 영상화는 멜라닌 및 헤모글로빈과 같은 내재적 생물학적 분자를 가시화함으로써 생물학적 정보를 제공하는 생물의학적 영상화 양식(modality)으로서 많은 관심을 받고 있다. 생물의학적 영상화로서 광음향 영상화의 높은 잠재력은 높은 민감성, 다중모드 영상화 및 영상-유도(image-guided) 치료법을 갖는 실시간 및 표적화된 영상화를 아우르는 진단 및 치료의 관점에서 나노물질의 광음향 반응에 기초한 외생 조영제(exogenous contrast agent)의 개발에 의해 보다 가속화되고 있다.

이와 관련하여, 광음향 효과를 나타내는 적합한 나노 탐침의 개발은 광음향 영상화의 효율성을 향상시키고 다양한 생물의학적 적용을 최적화하기 위한 나노기법에 있어서 중요한 기술적 이슈이다. 게다가, 광음향 효과를 나타내는 나노 탐침의 개발 및 인공적 조작은 나노물질에 기반한 광음향 영상화의 기본적인 이해에 대한 다른 중요한 통찰력을 제공할 수 있다. 원칙적으로, 광음향 효과는 표적을 국부적으로 가열하여 결과로서 열팽창을 유발하는 짧은 펄스 방사(short-pulsed radiation)의 흡수를 통한 음파의 생성에 기인한다. 흡광계수와 흡수된 광자를 열로 전환하는 전환효율은 분자수준 흡수체와 같은 나노물질에 기초한 광음향 영상화에 있어서 광음향 신호를 생성하는 주요 인자임에도 불구하고, 나노물질의 표면환경은 광음향 효과의 효율을 결정하는 다른 변수를 제공한다. 열적 팽창을 수반하는 광음향 효과는 나노물질로부터 주위 매질로의 열적 변환을 통해 국부적으로 가열된 주변 매질로부터 생성되므로, 열적 전달 및 발산 다이나믹스와 관련된 표면 환경은 나노물질에 기초한 광음향 효과를 생성하는 민감한 인자이다.

따라서, 새로운 광음향 진단제에 기초한 광음향 반응에 대한 기본적인 이해를 위한 새로운 형태의 광음향 진단제의 개발 및 조작은 광음향 영상화를 일으키는 조영제를 고안하고 최적화하는 것에 대한 중요한 단서를 제공할 수 있다.

암은 모든 연령의 사람들에게 영향을 줄 수 있는 종류의 질환이다. 따라서, 환자에게서 암을 치료하거나 진단할 수 있는 요법을 제공하기 위한 상당한 노력이 존재한다. 최근에는, 약물 전달 및 진단 영상화 기술에 있어서의 가능성 있는 새로운 수단으로서, 신체에서의 나노입자의 표적화된 전달이 논의되고 있다. 불행히도, 암을 효과적으로 치료하거나 진단할 수 있는 나노입자 기재-생성물을 제조하는 데에는 여전히 장애가 존재한다. 따라서, 암을 치료하거나 진단하며 개별화된 환자 관리를 용이하게 하는 방법을 제공할 수 있는 새로운 표적화 전달 접근법에 대한 필요성이 있다.

표적화제로는 표적 리간드의 소형 분자 모방체(예컨대 펩티드 모방 리간드), 표적 리간드(예컨대 펩티드 또는 폴레이트 아미드를 함유하는 RGD 펩티드), 또는 특정 표적에 특이적인 항체 또는 항체 단편이 포함될 수 있다. 표적화제에는 또한 엽산 유도체, B-12 유도체, 인테그린 RGD 펩티드, NGR 유도체, 소마토스타틴 유도체, 또는 소마토스타틴 수용체에 결합하는 펩티드, 예컨대 옥트레오티드 및 옥트레오테이트 등이 사용될 수 있다. 또한, 압타머 역시 표적화제로 사용할 수 있음이 알려져 있다. 압타머는 해당 표적과 조합되거나 거기에 결합하도록 설계될 수 있다. 압타머는 예를 들면 DNA, RNA 및/또는 펩티드로 구성될 수 있는데, 압타머의 소정 양태에 대해서는 업계에 잘 알려져 있다[Klussman, S., Ed., The Aptamer Handbook, Wiley-VCH (2006)]; [Nissenbaum, E.T., Trends in Biotech. 26(8): 442-449 (2008)]. 압타머는 선형이거나 고리화된 것일 수 있으며, 약 150개 미만의 염기를 가지는 (즉 약 150 mer 미만) 올리고뉴클레오티드가 포함될 수 있다.

스쿠아레인 염료는 모두 가시영역에서 흡수대를 가지며, 박막상태에서 파장 650 nm 부근의 가시광선을 실질적으로 흡수하기 때문에 분해점이 높고, 내열성이 큰 특징이 있다. 따라서, 이들 스쿠아레인 염료는 기입광으로서 파장 650 nm부근의 레이저광을 사용하는 광기록 매체, 특히 기입광으로서 파장 635 ~ 660 nm의 레이저광을 사용하는 DVD-R 등의 고밀도 광기록 매체에서의 광흡수제로서 매우 유용한 것으로 알려져 있다.

이에, 본 발명자들은 종양 조직에 선택적인 결합력이 우수하고, 근적외선 이미징 또는 광음향 이미징을 통해서 검출할 수 있으며, 특히 광음향 신호가 현저히 향상된 화합물을 연구하던 중, 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 스쿠알레인 유도체가 광음향 신호가 현저히 향상되고, 상기 스쿠알레인 유도체에 cRGD 등의 표적 리간드를 결합하면 진단을 위한 근적외선 이미징 및 광음향 이미징 조성물로 유용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

공개특허공보 10-2016-0051995호

본 발명의 목적은 신규한 스쿠알레인 유도체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 스쿠알레인 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 스쿠알레인 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근적외선 형광 이미징용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 스쿠알레인 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 광음향 이미징용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 스쿠알레인 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 1 당량에 고리형 RGD 2 당량이 결합된 복합체를 포함하는 종양 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 스쿠알레인 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

n 및 m은 독립적으로 0-10의 정수이고,

R¹, R², R³ 및 R⁴는 독립적으로 수소, 하이드록시, C_1-6의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 C_1-6의 직쇄 또는 측쇄 알콕시이다.

또한, 본 발명은 유기용매에서 스쿠아릭산(squaric acid) 1 당량과 카르복시C1-11알킬 벤조인돌리움 브로마이드 2 당량을 반응시키는 것을 특징으로 하는 상기 화학식 1로 표시되는 스쿠알레인 염료의 제조방법을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 스쿠알레인 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근적외선 형광 이미징용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 스쿠알레인 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 광음향 이미징용 조성물을 제공한다.

나아가, 상기 스쿠알레인 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 1 당량에 고리형 RGD 2 당량이 결합된 복합체를 포함하는 종양 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 스쿠알레인 유도체는 근적외선 이미징 또는 광음향 이미징을 통해서 검출할 수 있으며, 특히 종래 알려진 스쿠알레인 염료에 비해서 광음향 신호가 현저히 향상되는 효과가 있어, RGD 등의 표적 리간드를 도입하여 사용할 경우 진단을 위한 근적외선 이미징 또는 광음향 이미징 조성물로 유용할 수 있다.

도 1은 종래 염료감응형 태양전지의 증감제로 알려진 스쿠알레인 염료(JJ22)의 화학구조식과, 실시예 1의 스쿠알레인 염료(JJ25), 그리고 실시예 2의 RGD 도입 스쿠알레인 염료(JJ25-RGD)의 화학구조식이다.
도 2 (A)는 실시예 2(JJ25-RGD) 1 μM을 포함한 PBS 버퍼에서 흡광 스펙트럼을 측정한 그래프이다.
도 2 (B)는 실시예 2(JJ25-RGD) 1 μM을 포함한 PBS 버퍼에서 발광 스펙트럼을 측정한 그래프이다
도 2 (C)는 실시예 2(JJ25-RGD)의 멀티스펙트럼 광음향 신호세기를 측정한 그래프이다.
도 2 (D)는 JJ25-RGD 100 μM을 포함한 PBS 버퍼를 함유한 아가로스 팬텀을 680, 700 및 750 nm 여기파장에서 측정한 광음향 이미지를 나타낸다.
도 3은 M21(α_vβ₃ 인테그린 과발현) 또는 M21L(α_vβ₃ 인테그린 비발현) 사람 흑생종 세포주에 실시예 1(JJ25) 또는 실시예 2(JJ25-RGD)를 2시간 처치한 후에 공초점 형광현미경으로 관찰한 이미지이다. (스케일바 50μm)
도 4 (A)는 M21 또는 M21L 사람 흑생종 세포주를 이종이식한 마우스에 실시예 1(JJ25) 또는 실시예 2(JJ25-RGD)를 투여한 후에 0, 4, 6시간, 1일, 3일, 5일째에 in vivo 근적외선 형광이미지를 관찰한 결과이다.
도 4 (B)는 도 4 (A)에서 촬영한 형광이미지에서 형광신호비율[F(treated)/F(pre)]을 나타낸 그래프이다.
도 5 (A)는 M21 또는 M21L 사람 흑생종 세포주를 이종이식한 마우스에 실시예 1(JJ25) 또는 실시예 2(JJ25-RGD)를 투여한 1일 후에 적출한 장기들의 형광이미지이다. T는 종양, H는 심장, L은 간, K는 신장, S는 비장, Lung은 폐이다.
도 5 (B)는 종양 조직의 형광이미지이다.
도 5 (C)는 도 5(A)에서 얻은 형광이미지에서 형광 세기를 노멀라이징한 수치를 나타낸 그래프이다.
도 6은 M21 또는 M21L 사람 흑생종 세포주를 이종이식한 마우스에 적출한 종양 조직의 절편을 면역형광 분석한 이미지이다.
도 7 (A)는 M21 또는 M21L 사람 흑생종 세포주를 이종이식한 마우스에 실시예 1(JJ25) 또는 실시예 2(JJ25-RGD)를 투여한 0, 1, 2, 4, 6시간 후의 3D 광음향 이미지이다.
도 7 (B)는 도 7 (A)의 광음향 이미지에서 광음향 신호세기를 정량화하여 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

신규한 스쿠알레인 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

n 및 m은 독립적으로 0-10의 정수이고,

바람직하게는,

상기 n 및 m은 독립적으로 2-6의 정수이고,

R¹, R², R³ 및 R⁴는 독립적으로 수소 또는 하이드록시일 수 있다.

더욱 바람직하게는,

상기 n 및 m은 3-5이고,

R¹, R², R³ 및 R⁴는 수소일 수 있다.

더욱 더 바람직하게는,

상기 n 및 m은 4이고,

R¹, R², R³ 및 R⁴는 수소일 수 있다.

본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 스쿠알레인 유도체는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 다이카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 아세트산, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산등과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염의 종류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 나이트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 다이하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-다이오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등을 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 상기 화학식 1로 표시되는 스쿠알레인 유도체를 메탄올, 에탄올, 아세톤, 다이클로로메탄, 아세토나이트릴 등과 같은 유기용매에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조시켜 제조하거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조시켜 유기용매 하에서 결정화시켜셔 제조할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 스쿠알레인 유도체 및 이의 약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 용매화물, 수화물 등을 모두 포함한다.

제조방법

본 발명은 유기용매에서 스쿠아릭산(squaric acid) 1 당량과 카르복시C₁ _- ₁₁알킬 벤조인돌리움 브로마이드 2 당량을 반응시키는 것을 특징으로 하는 상기 화학식 1로 표시되는 스쿠알레인 염료의 제조방법을 제공한다.

상기 유기용매로는 톨루엔, n-부탄올, 에틸아세테이트, 테트라하이드로퓨란, 다이옥산, 다이클로로메탄, 1,2-다이메톡시에탄, 다이메틸포름아미드(DMF), 다이메틸설폭사이드(DMSO), 아세토나이트릴 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있고, 바람직하게는 톨루엔 및 n-부탄올을 혼합한 용매를 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 톨루엔 및 n-부탄올을 2:1로 혼합한 용매를 사용할 수 있다.

상기 카르복시C₁ _- ₁₁알킬 벤조인돌리움 브로마이드의 일례로는 카르복시펜틸 벤조인돌리움 브로마이드를 사용할 수 있다.

반응은 환류 분위기에서 3-24 시간 동안 실시할 수 있고, 바람직한 일례로는 딘스탁 장치 (Dean Stark apparatus)를 이용하여 환류 분위기에서 3-12시간 반응시켜 화학식 1로 표시되는 스쿠알레인 염료를 제조할 수 있다.

부가적인 정제 과정으로는, 상기 환류 분위기에서의 반응 종료 후에, n-부톡실로 치환된 중간체를 컬럼크로마토그래피를 이용하여 분리하고, n-부톡실로 치환된 중간체를 제거하기 위해 메탄올에 중간체를 녹이고 수산화나트륨을 첨가한 후 30-80℃에서 3-12시간 동안 반응 후, 염화수소를 사용하여 중화시킨 다음, 용매를 제거하고 컬럼크로마토그래피를 이용하여 목적의 화학식 1로 표시되는 스쿠알레인 염료를 분리 정제할 수 있다.

이미징용 조성물

본 발명은 상기 스쿠알레인 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근적외선 형광 이미징용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 스쿠알레인 유도체는 근적외선 이미징 또는 광음향 이미징을 통해서 검출할 수 있으며, 특히 종래 알려진 스쿠알레인 염료에 비해서 광음향 신호가 현저히 향상되는 효과가 있다.

종양 진단용 조성물

본 발명은 상기 스쿠알레인 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 1 당량에 고리형 RGD 2 당량이 결합된 복합체를 포함하는 종양 진단용 조성물을 제공한다.

일 실시예에서, 본 발명은 상기 스쿠알레인 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 1 당량에 펜티노익(pentynoic) 고리형 RGD 2 당량이 결합된 복합체를 포함하는 종양 진단용 조성물을 제공한다.

상기 고리형 RGD는 표적 리간드로서 αvβ3 인테그린 과발현 종양에 선택적 결합력을 갖는 것을 특징으로 한다.

표적 리간드는 표적 대상 세포 또는 조직에 따라서, 다양한 펩티드, 압타머 등을 사용할 수 있다.

상기 종양 진단용 조성물은 근적외선 형광 이미징 또는 광음향 이미징에 모두 사용될 수 있다.

상기 복합체의 바람직한 일례로는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 들 수 있다.

[화학식 2]

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 스쿠알레인 염료의 제조 (JJ25)

톨루엔 및 n-부탄올 2:1 혼합용액에서 스쿠아릭산(squaric acid)과 2 당량의 카르복시펜틸 벤조인돌리움 브로마이드를 반응시켜, JJ25를 합성하였다.

구체적으로, 카르복시펜틸 벤조인돌리움 브로마이드 (0.7 g, 1.74 mmol)과 스쿠아릭산 (0.1 g, 0.87 mmol)을 톨루엔 및 n-부탄올 2:1 혼합용액에 용해 시키고 딘스탁 장치 (Dean Stark apparatus)를 설치후 12시간 동안 환류시켰다. 반응 종결 후 n-부톡실로 치환된 중간체를 컬럼크로마토그라피(silica, chloroform: MeOH = 95: 5)를 사용하여 분리하였다. n-부톡실 그룹을 제거하기 위해 메탄올 (50 ml)에 중간체를 녹이고 2N 수산화나트룸 (5 mL)을 첨가후 50℃에서 6시간 동안 반응 후, 2 N 염화수소를 사용하여 중화시켰다. 용매를 제거하고 JJ-25를 컬럼크로마토그라피(silica, EtOAc: MeOH = 90: 10)를 사용하여 620 mg (49%)을 분리하였다.

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d ₆, δ, ppm): 1.38-1.43 (4H, m), 1.51-1.56 (4H, m), 1.73-1.76 (4H, m), 1.92 (12H, s), 2.18 (4H, t, J = 7.6 Hz), 2.46 (4H, t, J = 6.9 Hz), 5.84 (2H, s), 7.42 (2H, t, J = 7.6 Hz), 7.59 (2H, t, J = 7.4 Hz), 7.66 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.98 (4H, d, J = 9.2 Hz), 8.2 (2H, d, J = 8.4 Hz); ¹³C NMR (125 MHz, DMSO-d₆, d, ppm): 24.7, 26.3, 26.7, 27.1, 34.0, 43.5, 51.0, 86.4, 111.8, 122.7, 124.7, 127.9, 128.4, 130.3, 131.4, 133.6, 140.3, 170.8, 174.9, 177.8. HRMS (FAB): [M⁺] Calcd. For C₄₆H₄₈,N₂O₆ (M⁺): 724.3512, found: 724.3514.

< 실시예 2> RGD 결합 스쿠알레인 염료의 제조 (JJ25- RGD )

단계 1: JJ25- azide의 준비

JJ25-azide 합성을 위해 NHS ester 중간체를 활용하였다. JJ-25 (50 mg, 0.069 mmol)을 DMF (5 mL)에 녹이고 N-하이드록시숙신이미드 (hydroxylsuccinimide)와 (32 mg, 0.28 mmol) EDC (75 mg, 0.4 mmol)를 첨가 후 상온에서 12시간 교반하였다. 반응 종결 후 용매를 제거하고 NHS ester 중간체를 컬럼크로마토그라피(silica, CHCl₃: MeOH = 95: 5)를 사용하여 55 mg (87%)을 분리하였다.

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d ₆, δ, ppm): 1.61-1.64 (8H, m), 1.84-1.92 (8H, m), 2.06 (12H, s), 2.64 (4H, t, J = 6.9 Hz), 2.85 (8H, s), 5.98 (2H, s), 7.29 (2H, d, J = 9.2 Hz), 7.41 (2H, t, J = 6.9 Hz), 7.56 (2H, t, J = 6.9 Hz), 7.86 (2H, d, J = 9.2 Hz), 7.89 (2H, d, J = 7.6 Hz), 8.18 (2H, d, J = 8.4 Hz);

¹³C NMR (125 MHz, DMSO-d₆, d, ppm): 24.4, 25.7, 25.9, 26.7, 26.9, 30.7, 43.6, 51.3, 86.4, 110.2, 122.7, 124.4, 127.4, 128.8, 128.9, 129.8, 131.3, 134.3, 139.6, 168.5, 169.3, 171.4, 178.4.

다음으로, NHS ester 중간체 (100 mg, 0.1 mmol)을 DMF (5 mL)에 녹이고 3-azidopropan-1-amine (30 μL, 0.3 mmol)을 첨가 후 상온에서 12시간 동안 교반하였다. 용매를 제거 후 JJ25-azide를 컬럼크로마토그라피(silica, CHCl₃: MeOH = 90: 10)를 사용하여 86 mg (89%)을 분리하였다.

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d ₆, δ, ppm): 1.58-1.61 (8H, m), 1.90-1.95 (12H, m), 2.07 (12H, s), 2.34 (4H, t, J = 7.6 Hz), 3.43-3.46 (8H, m), 5.97 (2H, s), 7.29 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.43 (2H, t, J = 7.5 Hz), 7.59 (2H, t, J = 6.9 Hz), 7.88 (2H, d, J = 9.2 Hz), 7.90 (2H, d, J = 7.6 Hz), 8.18 (2H, d, J = 8.4 Hz);

¹³C NMR (125 MHz, DMSO-d₆, d, ppm): 24.8, 25.6, 26.7, 29.3, 36.3, 37.2, 38.8, 42.9, 49.7, 51.3, 85.9, 110.1, 122.5, 124.6, 127.6, 128.7, 129.9, 130.0, 131.4, 134.3, 139.4, 171.7, 173.3, 176.7. HRMS (FAB): [M⁺] Calcd. For C₅₂H₆₀N₁₀O₄(M⁺): 888.4799, found: 888.4796.

단계 2: JJ25- RGD의 제조

Cu(I)는 클릭화학을 이용하여 1,2,3-트리아졸을 형성하기 위한 유기 아자이드와 말단 알카인의 위스헨(Huisgen) 1,3-dipolar cycloaddition을 촉진한다. 목적의 α_vβ₃-타겟팅 근적외선 형광 및 광음향 이미징 프로브(JJ25-RGD)를 제조하기 위하여, Cu(I) 이온 존재하에서 JJ25-azide와 펜티노익 고리 RGD를 클릭 결합시켰다.

구체적으로, 상기 단계 1에서 준비한 JJ25-azide (2 mg, 2.2 μmol)을 DMF:물 = 2:1에 녹이고 pentynoic cyclic RGDyK (5 mg, 6 μmol), CuSO₄(1.0 M in water, 5 μL) 그리고 sodium ascorbate (1.0 M in water, 10 νL)를 첨가 하였다. 상기 혼합물은 50℃에서 2시간 교반 후 HPLC를 사용하여 JJ25-RGD를 52% 수율(2.82 mg, 1.15 νmol)로 분리하였다.

MALDI-TOF spectrometry: Calculated: 2259.1; Found: 2259.8.

하기 표 1에 실시예 1 및 비교예 1-4의 화학구조식을 나타내었다.

	화학구조식
실시예 1 (JJ25)
실시예 2 (JJ25-RGD)
비교예 1 (JJ22)
비교예 2 (JJ23)
비교예 3 (JJ24)
비교예 4 (JJ26)

실험재료 및 실험방법

부착 평가(Adhesion assay)

사람 흑색종 세포주 M21(α_vβ₃ 인테그린 과발현 흑생종 세포주) 및 M21L(α_vβ₃ 인테그린 비발현 흑색종 세포주)을 커버 슬립이 구비된 6-웰 플레이트에 각각 분주하고, 하루가 지난 다음 실시예 1(JJ25) 또는 실시예 2(JJ25-RGD)와 함께 37℃에서 2시간 배양하였다. 다음으로, M21 및 M21L 사람 흑생종 세포주에 결합되지 않은 실시예 1(JJ25) 또는 실시예 2(JJ25-RGD)를 제거하기 위해 PBS 버퍼로 3회 세척하였다. 처리된 사람 흑생종 세포주를 후술할 형광항체법(immunofluorescence staining)으로 실험하였다. 모든 실험은 3회 실시하여 결과를 얻었다.

면역형광 분석( Immunofluorescence analysis)

M21 및 M21L 사람 흑생종 세포주를 실시예 1(JJ25) 또는 실시예 2(JJ25-RGD)로 처리하고 PBS 버퍼로 세척한 후에, 상온에서 10분간 3.7% 파라포름알데히드로 고정하였다. PBS 버퍼로 3회 더 세척한 후에, 5% BSA가 포함된 PBS-T (0.1% Triton X-100을 함유한 PBS 버퍼; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 처리하였다. 관찰을 위해서, 사람 흑생종 세포주를 5 ㎍/mL phalloidin-555 (Molecular Probes, CA) 및 1 ㎍/mL DAPI (Molecular Probes, CA)로 1시간 동안 상온에서 염색하였다. 염색된 사람 흑생종 세포주를 PBS-T 버퍼로 3회 세척한 후에, PBS 버퍼로 다시 세척하고, 유리 슬라이드에 올리고 공초점레이져현미경(모델명: FV1000D, 제조사: Olympus, Tokyo, Japan)으로 분석하였다.

동물모델(Animal models)

5-6주령 수컷 누드(nu^-/nu^-) 마우스(20-25 g)를 (주)중앙실험동물에서 구입하여 사용하였다. 동물의 관리, 실험 및 안락사는 전남대학교 동물실험윤리위원회(CNU IACUC-H-2014-1)에서 허가받은 프로토콜에 따라 수행하였다. 마우스 우측 넓적다리에 피하주사하기 전에, M21 및 M21L 사람 흑색종 세포주 (1×10⁷ cells)를 100 μL의 PBS 버퍼에 현탁하였다. 종양 부피가 약 150 mm³에 도달했을 때, 실시예 1(JJ25) 또는 실시예 2(JJ25-RGD)를 50 μM 농도로 정맥주사로 투여하였다. 마우스는 형광 이미징을 위해 2% 이소풀루란으로 마취시키거나 종양 이식 및 광음향이미징을 위해 케타민 및 자일라진 혼합물 200 mg/kg로 마취시켰다. 마우스는 1일 후에 희생시켰고, ex- vivo 실험을 위해서 종양 및 다른 장기들을 적출하였다. 마우스에서 장기들과 종양 조직을 제거한 후에 마우스에 형광이 남아 있음을 관찰하였다. 특히, 종양 조직은 슬라이스하고, 형광현미경을 통해 관찰하였다.

In vivo 근적외선 형광 이미징( In vivo NIR fluorescence imaging)

근적외선 형광 실험을 위해서, 마우스를 1.5% 이소풀루란이 포함된 아산화질소/산소(2:1)로 마취시켰다. 실시예 1(JJ25) 또는 실시예 2(JJ25-RGD) 50 nM을 PBS 버퍼에 희석하여 마우스 꼬리 혈관 정맥주사로 투여하였다. 근적외선 형광이미지는 투여 후에 기록하였다. 광학 데이터 수집 및 분석은 150 W 할로겐 램프가 구비된 빛샘방지 박스 및 635 nm 여기(excitation)필터로 구성된 Maestro 2.0 in vivo imaging system (Cambridge Research & Instrumentation, Woburn, MA)으로 수행하였다. 형광은 C-mount 렌즈 및 배출(emission)필터 (680 nm long pass)로 구성된 CCD 카메라를 통해 검출하였다. 형광이미지 확인, 분리 및 분석 이미지에서 자가형광 기여분을 제거하기 위하여, commercial software (Maestro^TM 2.4)를 이용하여 실험결과 데이터를 얻었다.

In vivo 광음향이미징 ( In vivo PA imaging)

광음향 신호는 Nexus 128 (ENDRA Lifesciences)를 이용하여 얻었다. 각 파장에서 광음향 신호를 측정하기 위하여, 실시예 1(JJ25)의 광음향 신호는 680-900 nm 파장에서 수집하였다. 실시예 1(JJ25) 또는 실시예 2(JJ25-RGD)를 500 nM 농도로 PBS에 희석하여, 종양 이식된 마우스에 꼬리 혈관 정맥주사로 투여하였다. 광음향 신호는 0(투여전), 1, 2, 4 및 6시간마다 680, 750 및 900 nm 파장에서 수집하였다. 종양에서, 광음향 신호는 공지된 방법을 이용하여 HbO₂, HbR, 및 실시예 1(JJ25)로 분리하였다.

< 실험예 1> 스쿠알레인 염료의 광음향 신호 세기 평가

실시예 1 및 비교예 1-4에서 준비한 스쿠알레인 염료의 광음향 신호세기를 알아보기 위하여 다음과 같이 실험하였다.

구체적으로, 형광분석은 Infinite M200 Pro Microplate reader (Tecan, Switzerland)을 사용하였고, 광음향 신호측정은 Nexus 128 (ENDRA Lifesciences)을 사용하였다.

실시예 1 및 비교예 1-4에서 준비한 프로브를 포함한 PBS 버퍼를 pH 7.4로 맞추어 팬텀 내부에 로딩하고, 680-800 nm 여기 파장 범위에서 10 nm 단위로 광음향 신호세기를 측정하였다.

	실시예 1 (JJ25)	비교예 1 (JJ22)	비교예 2 (JJ23)	비교예 3 (JJ24)	비교예 4 (JJ26)
분자량 (Da)	720	580	588	588	768
Max 흡광 (nm)	684	636	628	636	740
광음향 신호세기 (100μM)	25320 [700 nm]	1768 [680 nm]	2018 [680 nm]	2841 [680 nm]	5320 [720 nm]

상기 표 2에 나타난 바와 같이, 여러 스쿠알레인 염료 중에서 본 발명에 따른 실시예 1(JJ25)의 스쿠알레인 염료는 광음향 신호세기가 비교예 1-4에 비해 현저히 향상되는 것을 알 수 있었다.

< 실험예 2> JJ25- RGD의 광물리 ( photophysical ) 특성 평가

실시예 2(JJ25-RGD)의 PBS 버퍼에서의 광물리 특성을 알아보기 위하여 다음과 같이 실험하였다.

구체적으로, PBS 버퍼에서 JJ25-RGD의 흡광 및 발광 스펙트럼을 측정하였다(도 2 (A) 및 (B) 참조).

또한, 비흡수 및 비산란 아가로스 팬텀을 이용하여 JJ25-RGD의 광음향 능력을 연구하였다. pH 7.4의 PBS 버퍼에 JJ25-RGD를 첨가하고 팬텀에 로딩하였다. 680-900 nm 여기파장 범위에서 10 nm 간격으로 광음향 신호를 측정하였다(도 2 (C) 참조).

나아가, JJ25-RGD 100 μM을 포함한 PBS 버퍼를 함유한 아가로스 팬텀을 680, 700 및 750 nm 여기파장에서 광음향 이미지를 측정하였다.

도 2 (A)는 실시예 2(JJ25-RGD) 1 μM을 포함한 PBS 버퍼에서 흡광 스펙트럼을 측정한 그래프이다.

도 2 (B)는 실시예 2(JJ25-RGD) 1 μM을 포함한 PBS 버퍼에서 발광 스펙트럼을 측정한 그래프이다

도 2 (C)는 실시예 2(JJ25-RGD)의 멀티스펙트럼 광음향 신호세기를 측정한 그래프이다.

도 2 (D)는 JJ25-RGD 100 μM을 포함한 PBS 버퍼를 함유한 아가로스 팬텀을 680, 700 및 750 nm 여기파장에서 측정한 광음향 이미지를 나타낸다.

도 2에 나타난 바와 같이, 도 2 (A)에서 JJ25-RGD는 600 nm 이상에서 흡광을 나타내며 665 nm에서 최대 흡광을 나타냈고, 도 2 (B)에서 15 nm의 스토크스 시프트(Stokes shift)와 함께 680 nm에서 최대 발광을 나타냈다. 도 2 (C)에서 광음향 신호는 680-700 nm 파장 범위에서 최대 신호세기를 나타내었다. 도 2 (D)에서 680, 700, 750 nm 파장 중에서 680 nm에서 가장 선명한 광음향 이미지를 얻음을 알 수 있었다.

< 실험예 3> 암세포 결합력 평가

실시예 2(JJ25-RGD)가 α_vβ₃ 인테그린 과발현 사람 흑생종 세포주(M21)에 선택적 결합력을 나타내는지 알아보기 위하여 다음과 같이 실험하였다.

구체적으로, α_vβ₃ 인테그린 과발현 사람 흑생종 세포주(M21) 및 α_vβ₃ 인테그린 비발현 사람 흑생종 세포주(M21L)에 실시예 1(JJ25) 또는 실시예 2(JJ25-RGD)를 1 μM 농도로 투여하고 2시간 동안 배양한 후에, 타겟-선택성을 공초점 형광현미경을 통해 확인하였다. 공초점 형광현미경에서 시각화를 위해, 세포핵(파란색) 및 F-액틴(빨강색)을 각각 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 및 phalloidin으로 각각 염색하였다.

도 3은 M21(α_vβ₃ 인테그린 과발현) 또는 M21L(α_vβ₃ 인테그린 비발현) 사람 흑생종 세포주에 실시예 1(JJ25) 또는 실시예 2(JJ25-RGD)를 2시간 처치한 후에 공초점 형광현미경으로 관찰한 이미지이다. (스케일바 50μm)

도 3에 나타난 바와 같이, α_vβ₃ 인테그린 과발현된 M21 사람 흑생종 세포주에서는 실시예 2(JJ25-RGD)의 강한 형광 신호가 관찰되었지만 실시예 1(JJ25)의 경우 신호가 거의 관찰되지 않았다. α_vβ₃ 인테그린 비발현 M21L 사람 흑생종 세포주에서는 실시예 1(JJ25) 및 실시예 2(JJ25-RGD) 모두 신호가 거의 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 실시예 2(JJ25-RGD)가 α_vβ₃ 인테그린 과발현된 암세포에 선택적 결합력을 나타냄을 의미한다.

< 실험예 4> 이종이식 마우스 모델에서 JJ25- RGD의 in vivo 근적외선 형광 이미징

M21 또는 M21L 사람 흑생종 세포주를 이종이식한 마우스 모델에 실시예 1(JJ25) 또는 실시예 2(JJ25-RGD)를 투여한 후에 in vivo 근적외선 형광이미지를 관찰하였다.

도 4 (A)는 M21 또는 M21L 사람 흑생종 세포주를 이종이식한 마우스에 실시예 1(JJ25) 또는 실시예 2(JJ25-RGD)를 투여한 후에 0, 4, 6시간, 1일, 3일, 5일째에 in vivo 근적외선 형광이미지를 관찰한 결과이다.

도 4 (B)는 도 4 (A)에서 촬영한 형광이미지에서 형광신호비율[F(treated)/F(pre)]을 나타낸 그래프이다.

도 4 (A) 및 (B)에 나타난 바와 같이, M21 사람 흑생종 세포주 이종이식 마우스에서는 JJ25-RGD의 형광이 확연하게 증가하였지만, M21L 사람 흑생종 세포주 이종이식 마우스에서는 형광이 약하였다. 투여 4시간 후, M21 사람 흑생종 세포주 이종이식 마우스에서 JJ25-RGD의 형광 신호가 약하게 관찰되었고, 투여 6시간 후에 형광 신호는 최대치에 도달하였고, 투여 5일 후까지 형광 신호를 유지하였고, 투여 1일 후에 백그라운드 액티비티가 확연히 줄어드는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는, 종양에서 관심있는 부위(region of interest, ROI) 선택 및 투여 전 백그라운드 형광 세기[F(pre)]에 대한 투여 후 형광 세기[F(t)]의 노멀라이징(normalizing)을 수행하여 얻는 이미지의 반-정량적인 분석과 관련있다(도 4 (B) 참조). M21 이종이식 마우스에 JJ25-RGD 투여 6시간 후에 F(t)/F(pre) 비율은 4.19 ± 0.16이었다. 반면에, JJ25 투여의 경우 M21 및 M21L 이종이식 마우스 모두에서 확연한 형광 신호가 나타나지 않았고, M21 및 M21L 이종이식 마우스에서 JJ25의 F(t)/F(pre) 비율은 투여 6시간 후에 각각 2.33 ± 0.14 및 2.21 ± 0.15으로 비슷하게 나타났다. 본 실험결과는 JJ25-RGD가 α_vβ₃ 인테그린 의존적 방법으로 높은 선택성으로 in vivo 타겟팅 가능함을 나타낸다.

< 실험예 5> 이종이식 마우스 모델에서 JJ25- RGD의 ex vivo 근적외선 형광 이미징

M21 또는 M21L 사람 흑생종 세포주를 이종이식한 마우스 모델에 실시예 1(JJ25) 또는 실시예 2(JJ25-RGD)를 투여한 1일 후에 희생시키고 장기들을 적출하여 ex vivo 근적외선 형광이미지를 관찰하였다.

도 5 (A)는 M21 또는 M21L 사람 흑생종 세포주를 이종이식한 마우스에 실시예 1(JJ25) 또는 실시예 2(JJ25-RGD)를 투여한 1일 후에 적출한 장기들의 형광이미지이다. T는 종양, H는 심장, L은 간, K는 신장, S는 비장, Lung은 폐이다.

도 5 (B)는 종양 조직의 형광이미지이다.

도 5 (C)는 도 5(A)에서 얻은 형광이미지에서 형광 세기를 노멀라이징한 수치를 나타낸 그래프이다.

도 5 (A)-(C)에 나타난 바와 같이, M21 종양 조직 및 간에서 JJ25-RGD의 강한 형광이 관찰되었고, 폐와 신장에서는 약한 형광 신호가 관찰되었다(도 5 (A) 참조). 종양 조직 전체에서 JJ25-RGD의 형광 신호는 M21L에 비해 M21에서 더욱 높게 나타난 반면에, M21L 종양 조직에서는 JJ25 또는 JJ25-RGD 모두 형광 신호가 약하게 나타났다(도 5 (B) 참조).

< 실험예 6> Ex vivo 면역형광 분석

α_vβ₃ 인테그린 과발현 종양에서 JJ25-RGD가 선택적 결합력을 나타냄을 확인하기 위해서, 도 5 (B)에서 적줄한 종양 조직을 얼린 다음 절편을 만들어 면역형광 분석을 실시하였다.

도 6은 M21 또는 M21L 사람 흑생종 세포주를 이종이식한 마우스에 적출한 종양 조직의 절편을 면역형광 분석한 이미지이다.

도 6에 나타난 바와 같이, JJ25-RGD를 투여한 M21 이종이식 마우스에서 적출한 종양 조직의 절편에서 강한 형광 신호가 나타났고, M21L 이종이식 마우스에서 적출한 종양 조직의 절편에서는 형광 신호가 거의 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 상술한 근적외선 형광 이미징 결과와 유사하게, JJ25-RGD는 종양의 신생혈관 생성을 시각화할 수 있음을 의미한다.

< 실험예 7> In vivo 광음향 이미징

M21 또는 M21L 사람 흑생종 세포주를 이종이식한 마우스 모델에 실시예 1(JJ25) 또는 실시예 2(JJ25-RGD) 500 nM을 투여 0, 1, 2, 4, 6시간 후에 광음향 이미지를 관찰하였다.

도 7 (A)는 M21 또는 M21L 사람 흑생종 세포주를 이종이식한 마우스에 실시예 1(JJ25) 또는 실시예 2(JJ25-RGD)를 투여한 0, 1, 2, 4, 6시간 후의 3D 광음향 이미지이다.

도 7 (B)는 도 7 (A)의 광음향 이미지에서 광음향 신호세기를 정량화하여 나타낸 그래프이다.

도 7에 나타난 바와 같이, JJ25-RGD는 JJ25에 비해서 종양 조직에서 높은 광음향 신호(초록 형광)를 나타냈다. JJ25-RGD는 시간이 지날수록 꾸준히 광음향 신호가 증가하였으나, JJ25의 경우는 그렇지 않았다(도 5 (A) 참조). 광음향 신호를 정량화하여 나타낸 도 5 (B)에서 역시 동일한 경향이 나타났다. 투여 2시간 후에 광음향 신호는 최대치에 근접하는 것으로 나타났고, 투여 6시간 후까지 광음향 신호 세기가 유지되었다. 투여 6시간 후의 광음향 신호 세기는 JJ25-RGD가 JJ25에 비해 약 5배 이상 강하게 나타났다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 스쿠알레인 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 1]

(상기 화학식 1에서,
n 및 m은 독립적으로 2-6의 정수이고,
R¹, R², R³ 및 R⁴는 독립적으로 수소, 하이드록시, C_1-6의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 C_1-6의 직쇄 또는 측쇄 알콕시이다).
제1항에 있어서,
상기 R¹, R², R³ 및 R⁴는 독립적으로 수소 또는 하이드록시인 것을 특징으로 하는 스쿠알레인 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항에 있어서,
상기 n 및 m은 3-5이고,
R¹, R², R³ 및 R⁴는 수소인 것을 특징으로 하는 스쿠알레인 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
유기용매에서 스쿠아릭산(squaric acid) 1 당량과 카르복시C₁ _- ₁₁알킬 벤조인돌리움 브로마이드 2 당량을 반응시키는 것을 특징으로 하는 제1항의 화학식 1로 표시되는 스쿠알레인 염료의 제조방법.
제4항에 있어서,
상기 유기용매는 톨루엔, n-부탄올, 에틸아세테이트, 테트라하이드로퓨란, 다이옥산, 다이클로로메탄, 1,2-다이메톡시에탄, 다이메틸포름아미드(DMF), 다이메틸설폭사이드(DMSO) 및 아세토나이트릴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항의 스쿠알레인 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근적외선 형광 이미징용 조성물.
제1항의 스쿠알레인 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 광음향 이미징용 조성물.
제1항의 스쿠알레인 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 1 당량에 고리형 RGD 2 당량이 결합된 복합체를 포함하는 종양 진단용 조성물.
제8항에 있어서,
상기 고리형 RGD는 α_vβ₃ 인테그린 과발현 종양에 선택적 결합력을 갖는 것을 특징으로 하는 종양 진단용 조성물.
제8항에 있어서,
상기 종양 진단용 조성물은 근적외선 형광 이미징 또는 광음향 이미징에 사용되는 것을 특징으로 하는 종양 진단용 조성물.
제8항에 있어서,
상기 복합체는 하기 화학식 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 종양 진단용 조성물.
[화학식 2]