JP7149614B2 - in vivo画像化のためのプロテアーゼ活性化コントラスト剤 - Google Patents
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Description
本願は、2017年3月30日に出願された米国仮出願第62/478,639号の利益を主張し、その開示の全体が、参照によって本明細書中に組み込まれる。
本発明は、国立衛生研究所によって授与された、契約EB005011およびHL116307のもとの政府支援により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
外科的介入は、現在、実質的にすべての種類の固形腫瘍のための最も一般的な治療法である。Siegelら、(2012年)CA Cancer J. Clin. 62巻:220~41頁;DeSantisら、(2014年)CA Cancer J. Clin. 64巻:252~71頁。したがって、首尾よい結果は、冒されている原発臓器および潜在的な転移部位の両方からのすべてのがん細胞の、外科手術中での完全な除去を条件とする。Vahrmeijerら、(2013年)Nat. Rev. Clin. Oncol. 10巻:507~18頁。治療結果を改善するために、がんにおける特異的なバイオマーカーを標的とするコントラスト剤を、術中コントラスト剤として使用して、固形腫瘍の外科的切除を誘導することができる。Miwaら、(2014年)J. Orthop. Res. 32巻:1596~601頁;Fujita(2012年)J. Am. Coll. Surg. 215巻:591頁。多様な画像化手法の中で、蛍光コントラスト剤を利用する光学をベースとした技術は、大きな潜在能力を有している。RudinおよびWeissleder(2003年)Nat. Rev. Drug Discov. 2巻:123~31頁;Bednarら、(2007年)Expert Opin. Drug Discov. 2巻:65~85頁。インドシアニングリーン(ICG)、フルオレセイン、メチレンブルーおよび5-アミノレブリン酸(5-aminolevuliric acid)(5-ALA)は、すべて、種々の腫瘍の可視化のための注入可能な増進剤として現在承認されている非標的化コントラスト剤である。Schaafsmaら、(2011年)J. Surg. Oncol. 104巻:323~32頁;Tanakaら、(2006年)Ann. Surg. Oncol. 13巻:1671~81頁。さらに、いくつかの標的化コントラスト剤が、臨床開発の様々な段階にある。Kovarら、(2007年)Anal. Biochem. 367巻:1~12頁。とりわけ、葉酸受容体αを標的とするFITCプローブは、卵巣がんの治療のための術中蛍光誘導外科手術(FGS)の価値を実証するための臨床試験において使用された。van Damら、(2011年)Nat. Med. 17巻:1315~9頁。さらに、クロロトキシン-Cy5.5などの他の腫瘍標的化剤は、がんの種々のマウスモデルを使用して悪性がん細胞の光学的画像化について確認されている。しかし、この薬剤についての腫瘍選択性の機序は十分に理解されてはいない。Veisehら、(2007年)Cancer Res. 67巻:6882~8頁。
カスパーゼおよび他のシステインプロテアーゼの、活性ベースの他の阻害剤が、PCT国際公開番号WO2012/021800、米国特許出願公開第2002/0052323号、米国特許出願公開第2002/0028774号、PCT国際公開番号WO96/41638、および欧州特許出願公開第EP0272671号に報告されている。
これらの開示にも関わらず、高い細胞取り込み能を有し、広範囲の動物プロテアーゼを標的とし、様々な波長で、特に、病変組織を透過することができる波長での検出感度の増大を提供する新規な活性ベースコントラスト剤に対する必要性が、当該分野において依然としてある。
本発明は、動物プロテアーゼを標的とする化合物、組成物、ならびにその化合物および組成物の使用方法を提供することによって上記およびその他の必要性に対処する。特に、本発明の一態様によれば、構造式(I):
Dは、ベンゾインドール色素を含む検出可能な要素であり;
Qはクエンチャーであり;
L0およびL1はリンカーであり;
AA2はアミノ酸側鎖であり;
UはO、NHまたはSであり;
Rは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキルまたは保護基であり、1~3個のA基で任意選択で置換されており;
各Aは独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルカノイル、アルキルアミノ、アリール、アリールオキシ、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、アラルカノイル、アラルカミノ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアミノ、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルコキシ、ヘテロアラルカノイル、ヘテロアラルカミノ、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクロアルコキシ、シクロアルカノイル、シクロアルカミノ、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルアミノ、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルコキシ、ヘテロシクリルアルカノイル、ヘテロシクリルアルカミノ、ヒドロキシル、チオ、アミノ、アルカノイルアミノ、アロイルアミノ、アラルカノイルアミノ、アルキルカルボキシ、カルボネート、カルバメート、グアニジニル、尿素、ハロ、トリハロメチル、シアノ、ニトロ、ホスホリル、スルホニル、スルホンアミド、またはアジドである)
によって表される通りの化合物が提供される。
R1は、任意選択で、スルホネートまたはカーボネートで置換されたC2-C8アルキル基であり;
各R2は独立に、C1-C6アルキル基であり;
L2は、任意選択で置換されたアルキルリンカーであり、各炭素原子はヘテロ原子で任意選択で置換されている)
を有する。
n’およびn”はそれぞれ独立に、2~8の整数であり;
R1はQSYクエンチャーまたはQC-1であり;
R2はベンゾインドール色素である)
を有する。
Dはベンゾインドール色素を含む検出可能な要素であり;
L0はリンカーであり;
Tは、任意選択でクエンチャーを含むプロテアーゼ標的化要素であり;
ただし、L0はエトキシエトキシスペーサーを含まないものとする)
によって表される通りの化合物が提供される。
AA1およびAA2は、それぞれ独立にアミノ酸側鎖であり;
UはO、NHまたはSであり;
Rは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキルまたは保護基であり、1~3個のA基で任意選択で置換されており;
各Aは独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルカノイル、アルキルアミノ、アリール、アリールオキシ、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、アラルカノイル、アラルカミノ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアミノ、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルコキシ、ヘテロアラルカノイル、ヘテロアラルカミノ、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクロアルコキシ、シクロアルカノイル、シクロアルカミノ、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルアミノ、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルコキシ、ヘテロシクリルアルカノイル、ヘテロシクリルアルカミノ、ヒドロキシル、チオ、アミノ、アルカノイルアミノ、アロイルアミノ、アラルカノイルアミノ、アルキルカルボキシ、カルボネート、カルバメート、グアニジニル、尿素、ハロ、トリハロメチル、シアノ、ニトロ、ホスホリル、スルホニル、スルホンアミド、またはアジドである。
この方法は、
上記組成物のいずれかを動物に投与するステップ;および
動物において、組成物のカテプシンシステインプロテアーゼとの反応から発生した検出可能なシグナルを測定するステップ;
を含み、検出可能なシグナルは動物における病変組織と関係している。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される:
(項目1)
式(I)
(式中、Dはベンゾインドール色素を含む検出可能な要素であり;
Qはクエンチャーであり;
L 0 およびL 1 はリンカーであり;
AA 2 はアミノ酸側鎖であり;
UはO、NH、またはSであり;
Rは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、または保護基であり、1~3個のA基で任意選択で置換されており;
各A基は独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルカノイル、アルキルアミノ、アリール、アリールオキシ、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、アラルカノイル、アラルカミノ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアミノ、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルコキシ、ヘテロアラルカノイル、ヘテロアラルカミノ、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクロアルコキシ、シクロアルカノイル、シクロアルカミノ、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルアミノ、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルコキシ、ヘテロシクリルアルカノイル、ヘテロシクリルアルカミノ、ヒドロキシル、チオ、アミノ、アルカノイルアミノ、アロイルアミノ、アラルカノイルアミノ、アルキルカルボキシ、カーボネート、カルバメート、グアニジニル、尿素、ハロ、トリハロメチル、シアノ、ニトロ、ホスホリル、スルホニル、スルホンアミド、またはアジドである)
を有する化合物。
(項目2)
前記ベンゾインドール色素が、構造:
(式中、oは1~4の整数であり;
R 1 はC 2 -C 8 アルキル基であり、任意選択で、スルホネートまたはカーボネートで置換されており;
各R 2 は独立に、C 1 -C 6 アルキル基であり;
L 2 は、任意選択で置換されたアルキルリンカーであり、各炭素原子はヘテロ原子で任意選択で置換されている)
を有する、項目1に記載の化合物。
(項目3)
前記ベンゾインドール色素が、構造:
を有する、項目2に記載の化合物。
(項目4)
AA 2 が、1~3個のA基で任意選択で置換されたアラルキルアミノ酸側鎖である、項目1に記載の化合物。
(項目5)
UがOである、項目1に記載の化合物。
(項目6)
L 0 およびL 1 が、それぞれ独立に、任意選択で置換されたアルキルリンカーであり、各炭素原子はヘテロ原子で任意選択で置き換えられている、項目1に記載の化合物。
(項目7)
L 0 およびL 1 が、それぞれ独立にC 2~8 アルキルリンカーである、項目6に記載の化合物。
(項目8)
L 1 がC 4 アルキルリンカーである、項目7に記載の化合物。
(項目9)
QがQSYクエンチャーである、項目1に記載の化合物。
(項目10)
前記QSYクエンチャーが親水性QSYクエンチャーである、項目9に記載の化合物。
(項目11)
前記親水性QSYクエンチャーがスルホ-QSYクエンチャーである、項目10に記載の化合物。
(項目12)
QがQC-1である、項目1に記載の化合物。
(項目13)
式(II):
(式中、
n’およびn”はそれぞれ独立に、2~8の整数であり;
R 1 はQSYクエンチャーまたはQC-1であり;
R 2 はベンゾインドール色素である)
を有する、項目1に記載の化合物。
(項目14)
n”が4である、項目13に記載の化合物。
(項目15)
n’が2、4または6である、項目14に記載の化合物。
(項目16)
以下の構造式:
による、項目1に記載の化合物。
(項目17)
式(III):
(式中、Dは、ベンゾインドール色素を含む検出可能な要素であり;
L 0 はリンカーであり;
Tは、クエンチャーを任意選択で含む、プロテアーゼ標的化要素であり;
ただし、L 0 はエトキシエトキシスペーサーを含まないものとする)
を有する化合物。
(項目18)
Tがクエンチャーを含む、項目17に記載の化合物。
(項目19)
L 0 が、任意選択で置換されたアルキルリンカーであり、各炭素原子はヘテロ原子で任意選択で置き換えられている、項目18に記載の化合物。
(項目20)
L 0 がC 2~8 アルキルリンカーである、項目19に記載の化合物。
(項目21)
前記クエンチャーがQSYクエンチャーである、項目18に記載の化合物。
(項目22)
前記QSYクエンチャーが親水性QSYクエンチャーである、項目21に記載の化合物。
(項目23)
前記親水性QSYクエンチャーがスルホ-QSYクエンチャーである、項目22に記載の化合物。
(項目24)
前記クエンチャーがQC-1である、項目18に記載の化合物。
(項目25)
Tがペプチド性標的化要素である、項目17に記載の化合物。
(項目26)
Tが4つ以下のアミノ酸残基を含む、項目25に記載の化合物。
(項目27)
Tが、クエンチャーを任意選択で含む、カテプシン標的化要素である、項目17に記載の化合物。
(項目28)
Tが、カテプシンLまたはカテプシンVに対して選択的である、項目27に記載の化合物。
(項目29)
Tが、
であり、
AA 1 およびAA 2 が、それぞれ独立にアミノ酸側鎖であり;
UがO、NHまたはSであり;
Rが、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキルまたは保護基であり、1~3個のA基で任意選択で置換されており;
各Aが、独立にアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルカノイル、アルキルアミノ、アリール、アリールオキシ、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、アラルカノイル、アラルカミノ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアミノ、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルコキシ、ヘテロアラルカノイル、ヘテロアラルカミノ、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクロアルコキシ、シクロアルカノイル、シクロアルカミノ、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルアミノ、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルコキシ、ヘテロシクリルアルカノイル、ヘテロシクリルアルカミノ、ヒドロキシル、チオ、アミノ、アルカノイルアミノ、アロイルアミノ、アラルカノイルアミノ、アルキルカルボキシ、カルボネート、カルバメート、グアニジニル、尿素、ハロ、トリハロメチル、シアノ、ニトロ、ホスホリル、スルホニル、スルホンアミド、またはアジド
である、項目17に記載の化合物。
(項目30)
AA 1 が塩基性アミノ酸側鎖であり、AA 2 がアラルキルアミノ酸側鎖であり、それぞれが1~3個のA基で任意選択で置換されている、項目29に記載の化合物。
(項目31)
UがOである、項目29に記載の化合物。
(項目32)
Tがクエンチャーを含む、項目29に記載の化合物。
(項目33)
AA 1 がクエンチャーを含む、項目32に記載の化合物。
(項目34)
AA 1 が-L 1 -Q;
(式中、L 1 はリンカーであり;
Qはクエンチャーである)
である、項目33に記載の化合物。
(項目35)
L 1 が、任意選択で置換されたアルキルリンカーであり、各炭素原子はヘテロ原子で任意選択で置き換えられている、項目34に記載の化合物。
(項目36)
L 1 がC 2~8 アルキルリンカーである、項目35に記載の化合物。
(項目37)
L 1 がC 4 アルキルリンカーである、項目36に記載の化合物。
(項目38)
AA 2 が、1~3個のA基で任意選択で置換された、アラルキルアミノ酸側鎖である、項目34に記載の化合物。
(項目39)
UがOである、項目34に記載の化合物。
(項目40)
QがQSYクエンチャーである、項目34に記載の化合物。
(項目41)
前記QSYクエンチャーが親水性QSYクエンチャーである、項目40に記載の化合物。
(項目42)
前記親水性QSYクエンチャーがスルホ-QSYクエンチャーである、項目41に記載の化合物。
(項目43)
項目1~42のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体を含む、動物における組織の標識において使用するための組成物。
(項目44)
動物における組織を標識化する方法であって、
項目43に記載の組成物を前記動物に投与するステップ
を含む方法。
(項目45)
動物における腫瘍を可視化する方法であって、
項目43に記載の組成物を前記動物に投与するステップ;および
前記動物において、前記組成物のカテプシンシステインプロテアーゼとの反応から発生した検出可能なシグナルを測定するステップ
を含み、前記検出可能なシグナルが前記動物における病変組織と関係している、
方法。
(項目46)
前記検出可能なシグナルが蛍光シグナルである、項目45に記載の方法。
(項目47)
前記蛍光シグナルが近赤外シグナルである、項目46に記載の方法。
(項目48)
前記検出可能なシグナルが腫瘍周辺で発生する、項目45に記載の方法。
(項目49)
前記検出可能なシグナルが、画像誘導型外科装置を使用して測定される、項目45に記載の方法。
本明細書は、とりわけ、非侵襲的画像化用途で使用するためのクエンチされた蛍光基質プローブの設計および最適化を開示する。特に、クエンチャーとフルオロフォアとの対、または放射性同位体標識を含む、修飾ペプチドが提供される。これらの化合物は、レポーター(クエンチされていないフルオロフォアまたは放射性同位体)およびプロトン化可能なアミンを含むプロテアーゼ切断によって断片を放出し、それによって、放出された断片の増進したリソソームでの保持をもたらす。
したがって、一態様では、本開示は、プロテアーゼ活性、特に動物組織でのカテプシンの活性の検出および画像化における画像化剤として使用するための新規な化合物を提供する。一部の実施形態では、化合物は式(I):
Dは蛍光標識を含む検出可能な要素であり;
Qはクエンチャーであり;
L0およびL1はリンカーであり;
AA2はアミノ酸側鎖であり;
UはO、NHまたはSであり;
Rは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキルまたは保護基であり、1~3個のA基で任意選択で置換されており;
各Aは、独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルカノイル、アルキルアミノ、アリール、アリールオキシ、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、アラルカノイル、アラルカミノ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアミノ、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルコキシ、ヘテロアラルカノイル、ヘテロアラルカミノ、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクロアルコキシ、シクロアルカノイル、シクロアルカミノ、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルアミノ、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルコキシ、ヘテロシクリルアルカノイル、ヘテロシクリルアルカミノ、ヒドロキシル、チオ、アミノ、アルカノイルアミノ、アロイルアミノ、アラルカノイルアミノ、アルキルカルボキシ、カルボネート、カルバメート、グアニジニル、尿素、ハロ、トリハロメチル、シアノ、ニトロ、ホスホリル、スルホニル、スルホンアミド、またはアジドである)
を有する。
を指す。
によって表すことができる部分を指す。
を指す。
」という用語は、置換または非置換の非芳香族環構造、ある特定の実施形態では3~10員環、より具体的には3~7員環を指し、それらの環構造は、少なくとも1個のヘテロ原
子、いくつかの実施形態では1~4個のヘテロ原子、より具体的な実施形態では1または2個のヘテロ原子を含む。「ヘテロシクリル」および「複素環式」という用語は、2つまたはそれ超の環状環を有する多環式環系であって、2つまたはそれ超の炭素が、2つの隣接環で共有されており、その環のうちの少なくとも1つが複素環式であり、例えばその他の環状環がシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよび/またはヘテロシクリルであり得る、多環式環系も含む。ヘテロシクリル基には、例えばピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、モルホリン、ラクトン、ラクタムなどが含まれる。
ルキニルまたはアルコキシなどの化学的部分と一緒に使用される場合、その置換基中に10個またはそれ未満、ある特定の実施形態では、6個またはそれ未満の非水素原子がある基を含むことを意味する。「低級アルキル」は、例えば10個またはそれ未満の炭素原子、特定の実施形態では、6個またはそれ未満の炭素原子を含むアルキル基を指す。ある特定の実施形態では、本明細書で定義されるアシル、アシルオキシ、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアルコキシ置換基は、それらが単独で現れても、または、ヒドロキシアルキルおよびアラルキルといった記載などの他の置換基との組合せで現れても(その場合、例えば、アルキル置換基中の炭素原子をカウントする場合、アリール基中の原子はカウントされない)、それぞれ、低級アシル、低級アシルオキシ、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニルおよび低級アルコキシである。
キル基である。より具体的には、R基は、それ自体任意選択で置換されているアリールで置換されたアルキル基であってよい。より一層具体的には、R基は、例えばベンジル基などの任意選択で置換されたアラルキル基であってよい。
Scientific Pierce Protein Biology Products、Rockford、ILから入手できるベンゾピリリウムおよびベンゾシアニン化合物のDyLightシリーズである。これらの色素の非限定的な例は、DyLight675-B1、DyLight675-B2、DyLight675-B3、DyLight675-B4、DyLight679-C5、DyLight690-B1、DyLight690-B2、DyLight700-B1、DyLight700-B2、DyLight730-B1、DyLight730-B2、DyLight730-B3、DyLight730-B4、DyLight747-B1、DyLight747-B2、DyLight747-B3、DyLight747-B4、DyLight775-B2、DyLight775-B3、DyLight775-B4、DyLight780-B1、DyLight780-B2、DyLight780-B3、DyLight800およびDyLight830-B2である。好ましい近IRフルオロフォアは、以下の構造:
れたい。
R1は、任意選択で、スルホネートまたはカーボネートで置換されたC2-C8アルキル基であり;
各R2は独立に、C1-C6アルキル基であり;
L2は、任意選択で置換されたアルキルリンカーであり、各炭素原子はヘテロ原子で任意選択で置換されている)
を有するベンゾインドール色素を含む。
R1はQSYクエンチャーまたはQC-1であり;
R2はベンゾインドール色素である)
を有する化合物を提供する。
Dは検出可能な要素であり;
L0はリンカーであり;
Tは、任意選択でクエンチャーを含むプロテアーゼ標的化要素であり;
ただし、L0はエトキシエトキシスペーサーを含まないものとする)
を有する。
UはO、NHまたはSであり、
Rは、式(I)の化合物について上記に定義した通りである)
である。
別の態様では、本発明は、本発明の化合物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。このような組成物は、例えば、動物における組織の画像化において有用であり、動物における酵素、例えばプロテアーゼ酵素の活性を評価するのにさらに有用である。特に、プロテアーゼ基質、特にカテプシン基質である本発明の化合物について、医薬組成物は、がん細胞の非侵襲的な光学的画像化用の薬剤としての役目を有用に果たし得る。
別の態様では、本開示は、本発明の組成物を動物に投与するステップを含む、動物における組織を標識化する方法を提供する。
強力で選択的なABP(以下、化合物1として例示される)の最近報告されているシリーズの化学構造を、本明細書で報告されるクエンチされた蛍光基質プローブを設計するための出発点として使用した。Verdoesら、(2013年)J. Am. Chem. Soc. 135巻:14726~30頁およびPCT国際公開番号WO2014/145257を参照されたい。
6つすべての基質の活性および選択性を、種々の組換えシステインプロテアーゼ、特にカテプシンL、S、K、BおよびVの存在下で、それぞれの内部でクエンチされたプローブのターンオーバー曲線を監視することによって決定した。等濃度(5nM)の各酵素を、異なるプローブと共に50mMクエン酸緩衝液(pH=5.5、5mM DTT、0.1%トリトンX、0.5%CHAPS)中、37℃でインキュベートした。使用した種々のカテプシンの正確な濃度は、共有結合性のシステインプロテアーゼ阻害剤ZFK-PMK、ならびにカテプシンS、L、BおよびVに対する市販の基質Z-VVR-AMCまたはカテプシンKに対するZ-KR-AMCを使用して、活性部位滴定によって確認した(Boucherら、(2014年)Methods Mol. Biol. 1133巻:3~39頁)。Cy5蛍光の増加速度(これはカテプシンによるプローブ切断を示す)を、プローブのそれぞれについて測定した。
察されなかった(図2)。試験したカテプシンの中で、Cat Lは、すべてのプローブで最も高い蛍光の増大をもたらした。これは、このライブラリーのシステインカテプシンLに対する強い選択性を示唆している(図2、各パネル中の上部のトレース)。興味深いことに、nCQプローブとnQCプローブとの両方が種々のカテプシンによって同じ程度に切断されたので(図2、左パネルを右パネルと比較して)、基質の切断は、フルオロフォアとクエンチャーとの対の方向性によって影響を受けなかった。対照的に、酵素による触媒/切断効率(Kcat/KM)と基質のp1位に隣接するアルキルスペーサーの長さの間に強い相関関係があるようである(図3A)。例えば、Cat Lに関して、2CQと6CQとの間で触媒効率において4倍の増大が観察され、2QC基質と6QC基質との間で6倍の増大が観察された(表1および図3A)。この観察は、それぞれスペーサーの長さnが2と6との間で、8倍および4倍の効率の増大が観察されたCat Vと一致していた(表2)。すべての基質のKmがCat Lについて有意に同じままであるので、触媒効率におけるこれらの差は、もっぱらターンオーバー数(kcat)の差からもたらされた(表1)。より高いターンオーバー数は、非侵襲的画像化の間の細胞中でのこのようなプローブのより速い活性化を示している可能性があるので、in vitroでの基質のより高い酵素ターンオーバーは特に注目に値する。
in vitroおよび細胞ベースのアッセイでの基質の活性が実証されたので、次にこの基質を、乳がんの同種の同所性マウスモデルで評価した。このモデルでは、4T1細胞を、マウスの左の番号1および10の乳腺脂肪体に接種して腫瘍を発生させる。LLEの影響を決定するために、リソソーム向性プローブ2QC(化合物5)および6QC(化合物7)の画像化シグナルを、非リソソーム向性類似体2CQ(化合物2)および6CQ(化合物4)のものと直接比較した。基質を静脈内で腫瘍担持マウスに投与し、マウスを、投与に続く種々の時点で画像化した。クエンチされた基質プローブのターンオーバーからのCy5蛍光の急速な蓄積が、投与後30分未満で腫瘍中および腫瘍周りで観察され、周囲の正常組織から腫瘍を分界する十分なコントラストが1時間以内に観察された(図4A)。蛍光シグナルの強度は投与後4時間で最大値に達し、続いてシグナル強度は低下した(図4B)。腫瘍中での全体的な絶対蛍光強度は、非リソソーム向性基質2CQおよび6CQと比較して、LLE基質2QCおよび6QCを注射されたマウスについて、より高く、より明かった。さらに、シグナルの強度は、LLE基質を投与されたマウスの腫瘍中で24時間にわたって一定に留まったのに対して、非LLE基質からのシグナルは、24時間後にほとんど完全に消失した(図4Aおよび4B)。同様の傾向は、4時間後および24時間後に安楽死させたマウスから切除された腫瘍のex vivoでの画像化によって観察された(図4C)。これらのデータは、低分子量の可逆的に結合するコントラスト剤の設計における、潜在的なリソソーム向性効果の価値を実証している。
Da Vinci外科手術システムは、現在世界中のクリニックにおいて、腹腔鏡外科手術のために使用されている、Intuitive Surgical Inc.によって製造されたロボット外科手術システムである。このシステムを使用した外科的手順は現在白色光照明のもとで実施されているが、これは、周囲の正常組織から腫瘍の縁を分界するための十分なコントラストを提供していない。したがって、既存のDa Vinciシステムにも適合する腫瘍標的化コントラスト剤の開発に高い価値があり、それは、蛍光誘導外科手術(FGS)における治療結果の大幅な改善をもたらすはずである。
一般
すべての樹脂および試薬は、商業的供給業者から購入し、さらに精製することなく使用した。反応および水系での後処理のために使用した水は、脱イオン水フィードからガラス蒸留したものであった。試薬グレードの溶媒を、すべての非水系抽出のために使用した。すべての水分感受性反応は、アルゴン陽圧下、無水溶媒中で実施した。反応物は、API 150EXシングル四重極質量分析計(Applied Biosystems)を使用したLC-MSにより分析した。合成した化合物は、C18カラムを使用して、ÅKTA explorer 100(Amersham Pharmacia Biotech)を用いた逆相HPLCにより精製した。化合物を、溶媒として、二段蒸留水および1%トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの勾配液で溶出させた。NMRスペクトルは、パルス磁場勾配アクセサリーを備えたVarian 400MHz(400/100)、Varian 500MHz(500/125)で記録した。1H NMRスペクトルは、Bruker Avance 400(400MHz)またはBruker Avance 500(500MHz)装置で、25℃で記録し、MestReNova NMRプロセッシングソフトウェアを使用して処理した。化学シフト(δ)は、テトラメチルシランからのパーツパーミリオン(ppm)でのダウンフィールドで報告され、NMR溶媒(CDCl3、δ=7.25)中の残留プロチウムシグナルが参照された。データを以下の通り報告する:化学シフト、多重度(s=一重項、d=二重項、t=三重項、m=多重項およびq=四重項)、ヘルツ(Hz)および積分での結合定数(J)。細胞は、10%FBSおよび1% pen-strepを補足したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM(GIBCOカタログ番号11995))中で培養した。
0.5gの2-クロロトリチルクロリド(2-chlorortrityl chloride)樹脂(0.84mmol/gローディング)を3つの別個の固相反応容器に量り込んだ。反応容器に、aからcまでラベルを付けた。ジクロロメタン(DCM)を加えて樹脂を懸濁させ、次いで反応物を、実験室用振とう器を使用して15分間撹拌した。DCMで2回洗浄した後、3mLのDCM中のモノ-Fmoc-1,3-エタンジアミン(0.35g、1.26mmol)、モノ-Fmoc-1,4-ブタンジアミン(0.39g、1.26mmol)およびモノ-Fmoc1,6-ヘキサンジアミン(0.43g、1.26mmol)を、それぞれ容器a、bおよびcの中の樹脂に加えた。次いで、ジイソプロピルエチルアミン(Diisopropylthylamine)(DIPEA、3eq)をそれぞれに加え、反応物を室温で30分間撹拌した。次いで、樹脂をDCMで洗浄し、次に、未反応トリチルクロリドを不活性化させるために、メタノール中に10分間懸濁させた。Fmoc脱保護を、樹脂をDMF中20%のピペリジン溶液中に1時間懸濁させ、続いてそれぞれDCMおよびDMFで3回洗浄することによって遂行した。次に、第1のアミノ酸Fmoc-Lys(Boc)-OH(0.58g、1.26mmol)を、3mLのDMF中のHBTU(0.48g、1.26mmol)およびDIPEA(0.17g、1.26mmol)を使用して樹脂に結合させ、その混合物を2時間回転させた。洗浄サイクルに続いて、Fmoc脱保護を、5mLのDMF中の20%ピペリジンを使用して1時間かけて遂行し、続いて洗浄サイクルを再度行った。残留するアミノ酸Cbz-Phe-OHを、同様に、樹脂上のペプチドと結合させた。次いで、樹脂を、DCM中の1%トリフルオロ酢酸(trifluoroactic acid)溶液で処理して、樹脂からペプチドを選択的に切断した(Boc保護リシンが得られる)。トルエンとの共蒸発により、溶媒を各切断生成物から除去し、それぞれ中間体基質1a、1bおよび1cを得た(スキーム1)。次いで、各生成物を逆相分取HPLCによりさらに精製して最終ペプチドを95%超の純度で得た。
別々の1mLエッペンドルフ管中で、中間体1a(2.0mg、μmol)、1b(2.0mg、μmol)および1c(2.0mg、μmol)を100μLのDMSOに溶解した。DIPEA(3μL、μmol)を加え、続いてQSY21-スルホ-NHS(1.2mmol)を加えた。反応物を室温で1時間撹拌し、続いてHPLCにより生成物を精製した。溶媒をロータリーエバポレーションで除去し、その後、DCM中の30%TFAでの30分間の処理により、リシン上のBoc保護を除去した。溶媒の除去に続いて、生成物を凍結乾燥し、次いで、DMSO中のCy5-NHSおよび3当量のDIPEAと反応させた(スキーム1)。最終生成物をそれぞれ逆相HPLCにより精製して非リソソーム向性のクエンチされた蛍光基質nCQ(それぞれn=2、4および6)を得た。
別々の1mLエッペンドルフ管中で、中間体1a(2.0mg、μmol)、1b(2.0mg、μmol)および1c(2.0mg、μmol)を100μLのDMSOに溶解した。DIPEA(3μL、μmol)を加え、続いてCy5-NHS(1.2mmol)を加えた。反応物を室温で1時間撹拌し、続いて、HPLCにより生成物を精製した。溶媒をロータリーエバポレーションで除去し、その後DCM中の30%TFAでの30分間の処理により、リシン上のBoc保護を除去した。溶媒の除去に続いて、生成物を凍結乾燥し、次いで、DMSO中のQSY21-スルホ-NHSおよび3当量のDIPEAと反応させた(スキーム1)。最終生成物をそれぞれ逆相HPLCにより精製して、潜在的なリソソーム向性効果のクエンチされた蛍光基質nQC(それぞれn=2、4および6)を得た。
簡単に述べると、64Cu-LO263を、90μL酢酸ナトリウム緩衝液(0.1M、pH5.5)中の10μLのLO263(10mM)(図8A)を、100μL酢酸ナトリウム緩衝液(0.1M、pH5.5)中の4mCiの64CuCl2と共に、37℃で1時間インキュベーションすることによって調製した。室温に冷却した後、反応混合物をRP-HPLCにより分析した。次いで、64Cu-LO263を、3分で95%溶媒A(0.1%TFAを含む蒸留水(di-water))および5%溶媒B(0.1%TFAを含むアセトニトリル)から出発して、23分で5%溶媒Aおよび95%溶媒Bへの移動相を用いたRP-HPLCにより精製した。次いで、64Cu-LO263を含む溶出画分(保持時間18.9分)を収集し、ロータリーエバポレーターを使用して乾燥した。放射性標識収率は(HPLCから計算して)90%であった。他のピークに対する主生成物ピークの比で定義される放射化学純度は、放射性(radio)HPLCにより>95%と決定され、プローブの比放射能(specific activity)は3~4Ci/mmolと決定された。次いで、64Cu-LO263を0.9%生理食塩水中で再構成し、0.22μm Milliporeフィルターを通過させ、動物PET/CT画像化用の滅菌バイアルに入れた。
マウスに、100μCiの64Cu-LO263を静脈内注射し、Inveon小動物PET/CT(Siemens)を使用して2時間および24時間後に画像化させた(図8B)。簡単に述べると、CT解剖学的画像スキャンを、約0.1mmの画素サイズで獲得した(80kV、500μA)。CT画像化後、全身PET画像化を5分の静止スキャンで実施した。PET画像を、CT減衰をもとにしたサブセット化による期待値最大化法(ordered-subsets expectation maximization)3次元アルゴリズムを使用して再構成し、Inveon Research Workplace(IRW)ソフトウェア(Siemens)を使用して解析した。PETボクセルサイズは、0.796×0.861×0.861mmであり、合計で128×128×159ボクセルであった。次いで、PET/CT定量化アッセイを実施し、組織の放射能を計算し、組織のグラム当たりの減衰補正注射用量パーセンテージ(%ID/g)で表した。どのグループが画像化されているかについて、試験を行う研究者にはブラインドにした。
2CQ(2)
LCMS:C99H108N10O21S5 2+についての計算値:966.81;実験値(found);966.8、HRMS:C99H108N10O21S5 2+について
の計算値:966.8159;実験値:966.8121。
LCMS:C101H112N10O21S5 2+についての計算値:980.8;実験値;980.6、HRMS:C101H112N10O21S5 2+についての計算値:980.8315;実験値:980.8264。
LCMS:C103H116N10O21S5 2+についての計算値:994.8;実験値;994.8、HRMS:C103H116N10O21S5 2+についての計算値:994.8472;実験値:994.8444。
LCMS:C99H108N10O21S5 2+についての計算値:966.81;実験値;966.8、HRMS:C99H108N10O21S5 2+についての計算値:966.8159;実験値:966.8122。
LCMS:C101H112N10O21S5 2+についての計算値:980.8;実験値;980.8、HRMS:C101H112N10O21S5 2+についての計算値:980.8315;実験値:980.8267。
LCMS:C103H116N10O21S5 2+についての計算値:994.8;実験値;994.8、HRMS:C103H116N10O21S5 2+についての計算値:994.8472;実験値:994.8429。
上記に示すICG標識プローブ(ex/em:805/835nm)を、マウス腫瘍モデルシステムにおいて、Dylight780-B1標識プローブ(ex/em:783/799nm)と比較した。簡単に述べると、4T1乳がん細胞を対象マウスの脂肪体に注射した。腫瘍を10~12日間成長させ、その後、プローブを尾静脈から注射した(3用量:マウス当たり10、50、100nmol)。その後、対象マウスをLicor PEARL(785/820nm)で画像化した。
Claims (21)
- 式(I)
Qはクエンチャーであり;
L0およびL1はリンカーであり;
AA2はアミノ酸側鎖であり;
UはO、NH、またはSであり;
Rは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、または保護基であり、1~3個のA基で任意で置換されており;
各A基は独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルカノイル、アルキルアミノ、アリール、アリールオキシ、アリールアミノ、アラルキル、アラルコキシ、アラルカノイル、アラルカミノ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアミノ、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルコキシ、ヘテロアラルカノイル、ヘテロアラルカミノ、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクロアルコキシ、シクロアルカノイル、シクロアルカミノ、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルアミノ、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルコキシ、ヘテロシクリルアルカノイル、ヘテロシクリルアルカミノ、ヒドロキシル、チオ、アミノ、アルカノイルアミノ、アロイルアミノ、アラルカノイルアミノ、アルキルカルボキシ、カーボネート、カルバメート、グアニジニル、尿素、ハロ、トリハロメチル、シアノ、ニトロ、ホスホリル、スルホニル、スルホンアミド、またはアジドである)
を有する化合物であって、
ここで、前記ベンゾインドール色素が、構造:
(式中、oは1~4の整数であり;
R 1 はC 2 -C 8 アルキル基であり、任意で、スルホネートまたはカーボネートで置換されており;
各R 2 は独立に、C 1 -C 6 アルキル基であり;
L 2 は、任意で置換されたアルキルリンカーであり、各炭素原子はヘテロ原子で任意で置換されている)
を有する、化合物。
- AA2が、1~3個のA基で任意で置換されたアラルキルアミノ酸側鎖である、請求項1に記載の化合物。
- UがOである、請求項1に記載の化合物。
- L0およびL1が、それぞれ独立に、任意で置換されたアルキルリンカーであり、各炭素原子はヘテロ原子で任意で置き換えられている、請求項1に記載の化合物。
- L0およびL1が、それぞれ独立にC2~8アルキルリンカーである、請求項5に記載の化合物。
- L1がC4アルキルリンカーである、請求項6に記載の化合物。
- QがQSYクエンチャーである、請求項1に記載の化合物。
- 前記QSYクエンチャーが親水性QSYクエンチャーである、請求項8に記載の化合物。
- 前記親水性QSYクエンチャーがスルホ-QSYクエンチャーである、請求項9に記載の化合物。
- QがQC-1である、請求項1に記載の化合物。
- n”が4である、請求項12に記載の化合物。
- n’が2、4または6である、請求項13に記載の化合物。
- 請求項1~15のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体を含む、動物における組織の標識において使用するための組成物。
- 動物における腫瘍を可視化する方法における使用のための、請求項16に記載の組成物であって、前記方法は、
前記組成物を前記動物に投与するステップ;および
前記動物において、前記組成物のカテプシンシステインプロテアーゼとの反応から発生した検出可能なシグナルを測定するステップ
を含み、前記検出可能なシグナルが前記動物における病変組織と関係している、
組成物。 - 前記検出可能なシグナルが蛍光シグナルである、請求項17に記載の組成物。
- 前記蛍光シグナルが近赤外シグナルである、請求項18に記載の組成物。
- 前記検出可能なシグナルが腫瘍周辺で発生する、請求項17に記載の組成物。
- 前記検出可能なシグナルが、画像誘導型外科装置を使用して測定される、請求項17に記載の組成物。
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