BR112019015588A2

BR112019015588A2 - Composições e métodos para imagiologia e radioterapia de câncer

Info

Publication number: BR112019015588A2
Application number: BR112019015588-0A
Authority: BR
Inventors: Malicet Cédric; Lecorche Pascaline; Nowak Jonathan; David Marion; Temsamani Jamal; Khrestchatisky Michel
Original assignee: Vect-Horus; Centre National De La Recherche Scientifique; Universite D'aix-Marseille
Priority date: 2017-01-30
Filing date: 2018-01-30
Publication date: 2020-03-17
Also published as: US20190351079A1; EP3573668A1; CA3049508A1; AU2018211539A1; JP2020506921A; US11712486B2; EA201991812A1; WO2018138372A1; US20240100204A1; JP2022133357A; CN110536705A; AU2018211539B2

Abstract

a presente invenção se refere a um composto conjugado que compreende um marcador m farmaceuticamente aceitável, e um peptídeo ou pseudopeptídeo p que tem no máximo 30 resíduos de aminoácido e tem capacidade para ligar o receptor de lipoproteína de baixa densidade (ldlr) e a seu uso em um método de identificação e/ou detecção e/ou tratamento de células cancerosas em um indivíduo pela administração do composto conjugado ao indivíduo de uma análise da presença e/ou da quantidade de marcador.

Description

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA IMAGIOLOGIA E RADIOTERAPIA DE CÂNCER

CAMPO DA INVENÇÃO [0001] A invenção se refere a composições e métodos para imagiologia, detecção e radioterapia de câncer. A invenção se refere particularmente a compostos conjugados que contêm um peptídeo de alvejamento de LDLR e um marcador farmaceuticamente aceitável, bem como ao uso dos mesmos para identificação, detecção, estadiamento ou tratamento de cânceres, particularmente cânceres que superexpressam o Receptor de Lipoproteína de Baixa Densidade (LDLR).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0002] Os cânceres figuram entre as principais causas de morbilidade e mortalidade mundialmente, com aproximadamente 14 milhões de novos casos e 8,2 milhões de óbitos relacionados a câncer em 2012 de acordo com a Investigação Oncológica do Reino Unido e OMS.

[0003] Embora muitas formas de câncer possam ser agora tratadas, algumas delas permanecem difíceis de serem tratadas. Por exemplo, o câncer pancreático permanece como um com o maior número de óbitos, com uma taxa de mortalidade de 75 % no primeiro ano e apenas uma sobrevivência de 5 anos de 6 %. Quase 12.000 indivíduos são diagnosticados com câncer pancreático a cada ano na França e cerca de 340.000 no mundo. Espera-se gue esse câncer se torne a segunda causa de óbito de câncer em 2030. O câncer pancreático afeta tanto homens quanto mulheres na faixa de 50 anos e é particularmente difícil de ser tratado. De modo similar, glioblastoma multiforme (GBM), o tumor cerebral primário maligno mais

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 15/116

2/73 comum e mais agressivo, é uma doença rara potencialmente fatal. Cada ano, cerca de 25.000 novos casos são diagnosticados na União Européia (www.pubcan.org/cancer). Isso continua sendo um desafio clinico importante visto que não responde bem aos tratamentos atuais. De fato, atualmente, a sobrevivência após 5 anos é cerca de 3 % e apesar de vantagens significativas referentes a seu entendimento básico de patogênese de tumor, a sobrevivência média geral de pacientes aumentou apenas 3,3 meses (de 11,3 meses a 14,6 meses) nos últimos 25 anos (Patel MA, et al. 29 de setembro de 2014;6(4): 1953-85).

[0004] A maioria dos óbitos observados em cânceres podería ser evitada se um diagnóstico precoce fosse feito. Visto que taxas de sobrevivência de cinco anos para vários cânceres diminuíram drasticamente com o estágio de tumor no momento da detecção, há uma necessidade preocupante referente ao desenvolvimento de ferramentas não invasivas de imagiologia capazes de identificar tumores o mais cedo possível e de identificar pacientes propensos a responder a intervenções terapêuticas. A mortalidade e morbilidade de câncer podem ser consideravelmente aprimoradas pelo desenvolvimento de agentes terapêuticos e de imagiologia eficazes.

[0005] Muitos esforços foram feitos para desenvolver novos métodos para um diagnóstico precoce e preciso de câncer. São usadas várias técnicas de imagiologia incluindo tomografia por emissão de positrons (varredura de PET), tomografia computadorizada de fóton simples (SPECT), tomografia computadorizada de raios-X (varredura de CT), varredura nuclear, conjunto de imagens de ressonância

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 16/116

3/73 magnética e ultrassom (MRI). Embora essas tecnologias de imagiologia sejam bem desenvolvidas, as mesmas se baseiam principalmente em alterações não específicas, macroscópicas e fisiológicas do órgão analisado. Indubitavelmente, o traçador de PET mais amplamente usado em oncologia é 18FFDG, uma sonda que mede a utilização de glicose e ferramenta estabelecida para diagnóstico e estadiamento de câncer. No entanto, 18F-FDG tem limitações importantes, incluindo absorção modesta em alguns tumores (por exemplo, próstata) e absorção anterior elevada em certos tecidos normais (por exemplo, cérebro).

[0006] Agentes com base em peptídeo de alvejamento de receptor seletivo atraíram uma atenção considerável em imagiologia molecular de células tumorais que superexpressam receptores de peptídeo correspondentes devido a suas únicas propriedades, como altas afinidades e especificidades para seus alvos. De fato, o alvejamento de um receptor que é altamente expresso no tumor deve fornecer um diagnóstico de câncer melhor visto que o peptídeo de alvejamento de receptor diferenciará o tecido patológico do tecido normal.

[0007] Em relação ao tratamento de câncer, muitas abordagens foram usadas, sozinhas ou em combinação, como quimioterapia, imunoterapia ou terapia por radiação.

[0008] A terapia por radiação (também chamada de radioterapia, terapia de raios-X ou irradiação) tem como base o uso de radiação ionizante para exterminar células cancerosas e diminuir tumores. Isso é usado em uma ampla variedade de tumores tanto para indicações curativas quanto paliativas. Os efeitos de terapia por radiação são localizados e confinados para a região que é tratada. A

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 17/116 terapia por radiação causa lesões ou destrói células na área que é tratada (o tecido-alvo) danificando-se seu material genético, tornando impossível que essas células continuem crescendo e se dividindo. Enquanto a radiação danifica tanto as células cancerosas quanto as células normais, a maioria das células normais pode se recuperar dos efeitos de radiação e pode funcionar adequadamente. 0 objetivo de terapia por radiação consiste em danificar o maior número possível de células cancerosas, enquanto limita o dano ao tecido saudável adjacente. A radiação ionizante funciona danificando-se o DNA de tecido canceroso levando ao óbito celular.

[0009] Há vários tipos de terapia por radiação entre os quais:

- Radioterapia de Raios Externos (EBRT) que é a forma mais comum de radioterapia. 0 paciente se senta ou se deita em um sofá e uma fonte externa de radiação ionizante é apontada em uma parte particular do corpo. Raios-X e feixes de elétrons são as fontes mais amplamente usadas para radioterapia de raios externos.

- Braquiterapia em que uma fonte de radiação selada é colocada dentro ou próximo da área que exige tratamento.

Radioterapia de fonte selada (ou terapia de radionuclídeo de fonte selada) usa formas sólidas, líquidas, gasosas ou outras formas de substâncias radioativas chamadas de radiofármacos (essencialmente um fármaco radioativo). Esses são introduzidos no corpo por vários meios (injeção ou ingestão principalmente) e se localizem em localizações, órgãos ou tecidos específicos dependendo de suas propriedades e vias de administração. Isso inclui algo a partir de um composto simples, como iodeto de sódio, que se

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 18/116

5/73 localiza na tiroide através do aprisionamento do íon de iodeto, para biofármacos complexos, como anticorpos recombinantes que são fixados a radionuclídeos e procuram antígenos específicos em superfícies de célula. Essa técnica tem como base as propriedades físicas, químicas e biológicas do radiofármaco para alvejar áreas do corpo para tratamento por radiação.

[0010] A radioterapia apresenta vários efeitos colaterais. A natureza, gravidade e longevidade de efeitos colaterais depende dos órgãos que recebem a radiação, o próprio tratamento (tipo de radiação, dose, fracionamento, quimioterapia concomitante) e a situação do paciente. Há efeitos colaterais graves (náusea, vômito, desconforto intestinal, inchaço, infertilidade...) e efeitos colaterais tardios (fibrose, perda de cabelo, secura, doença cardíaca, declínio cognitivo...). Portanto, há uma necessidade de desenvolver radioterapia alvejada que induzirá menos efeitos colaterais.

[0011] A terapia de radionuclídeo de receptor de peptídeo (PRRT) é uma terapia molecular (também chamada de terapia de radioisótopo) usada para tratar certos cânceres, como carcinoma neuroendócrino. Em PRRT, uma proteína de alvejamento de célula (ou peptídeo) é combinada com uma pequena quantidade de material radioativo ou radionuclídeo, criando um tipo especial de radiofármaco chamado de um radiopeptídeo. Quando injetado na corrente sanguínea do paciente, esse radiopeptídeo percorre e se liga a células tumorais específicas, aplicando uma alta dose de radiação no tecido canceroso enquanto preserva o tecido normal.

[0012] Há necessidade médicas claramente desconhecidas no

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 19/116

6/73 campo de agentes de alvejamento e de imagiologia eficazes. 0 alvejamento de um receptor que é altamente expresso no tumor deve fornecer um melhor diagnóstico de câncer e terapia visto que o peptídeo de alvejamento de receptor diferenciará o tecido patológico do tecido normal.

[0013] 0 presente pedido se refere a composições inovadoras e métodos para imagiologia e radioterapia de câncer com base nos agentes de alvejamento de LDLR. A invenção fornece compostos conjugados que ligam LDLR e são otimizados para abordar agentes de radioterapia ou de imagiologia e mostrar tais compostos que permitem a identificação eficaz, confiável e seletiva de células cancerosas que superexpressam LDLR, e são mais adequadas para diagnóstico ou radioterapia eficaz de tais cânceres.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0014] A presente invenção fornece novas composições e métodos para imagiologia, diagnóstico, detecção ou radioterapia eficaz de cânceres que expressam LDLR. A invenção fornece particularmente compostos conjugados com capacidade para se ligar a e diagnosticar por imagem células cancerosas que superexpressam LDLR. A invenção permite a detecção de tais cânceres ín vivo, bem como radioterapia efetiva e seletiva dos mesmos. De fato, a invenção mostra que os agentes conjugados da invenção têm capacidade para discriminar entre as células cancerosas e não cancerosas, e podem ser usados para fornecer nível suficiente de irradiação a células cancerosas, enquanto não afeta os tecidos saudáveis.

[0015] Um objetivo da invenção se refere, então, a um composto conjugado da fórmula (I):

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 20/116

7/73

M-P (I), em que

M representa um marcador farmaceuticamente aceitável, e

P representa urn peptideo ou pseudopeptideo que tem no máximo resíduos de aminoácido e tem capacidade para ligar o LDLR, para uso em um método de identificação e/ou detecção de células cancerosas em um indivíduo pela administração do composto conjugado ao indivíduo e análise da presença e/ou da quantidade de marcador.

[0016] Um objetivo adicional da invenção é um método para identificação ou detecção de um câncer que superexpressa LDLR em um indivíduo, que compreende (i) administrar ao indivíduo um composto da fórmula (I):

M-P (I), em que

M representa um marcador farmaceuticamente aceitável, e

P representa um peptideo ou pseudopeptideo que tem no máximo resíduos de aminoácido e tem capacidade para ligar o LDLR, e (ii) analisar a presença e/ou a quantidade de marcador. [0017] Em uma modalidade particular, o composto conjugado é um composto multimérico que compreende vários monômeros da fórmula (I).

[0018] De acordo com modalidades preferenciais, M representa um radionuclídeo ou um marcador fluorescente, e P compreende a sequência de aminoácidos (II):

Al-Met-A2-Arg-Leu-Arg-A3-A4 (II), em que Al e A4 representam independentemente uma cisteína ou um análogo ou isóstero da mesma, A2 representa uma prolina ou um análogo ou isóstero da mesma, e A3 representa uma glicina ou um análogo ou isóstero da mesma.

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 21/116

8/73 [0019] Além disso, M e P podem ser ligados entre si diretamente ou por um espaçador, de modo covalente ou através de interação não covalente. Em uma modalidade particular, M é ligado a P usando um grupo protético ou é preso usando um agente quelante, como um NODAGA, DOTA, DOTA-GA ou NOTA, ou derivados funcionais dos mesmos.

[0020] Um outro objetivo da invenção se refere a um composto conjugado da fórmula (III) :

M-C-S-P (III), em que

M representa um radionuclideo farmaceuticamente aceitável,

C representa um quelador que forma um quelato com M,

S representa um espaçador, e

P representa um peptideo ou pseudopeptideo que tem no máximo 30 resíduos de aminoácido e tem capacidade para ligar o LDLR.

[0021] Um objetivo adicional da invenção se refere a uma composição que compreende um composto conjugado como descrito acima, bem como os usos do mesmo em imagiologia médico ou radioterapia médica.

[0022] Um objetivo adicional da invenção consiste em um método para tratamento de um câncer que superexpressa LDLR em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo um composto conjugado da fórmula (III) :

M-C-S-P (III), em que

M representa um radionuclideo farmaceuticamente aceitável adequado para uso em radioterapia,

C representa um quelador que forma um quelato com M,

S representa um espaçador, e

P representa um peptideo ou pseudopeptideo que tem no máximo

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 22/116

9/73 resíduos de aminoácido e tem capacidade para ligar o LDLR. [0023] A invenção pode ser usada para detectar ou tratar qualquer câncer que superexpressa LDLR, como câncer pancreático, adrenal, de glioblastoma, de próstata, de cólon, de fígado, do pâncreas, dos ovários, do pulmão ou de estômago. A mesma pode ser usada em qualquer mamífero, como indivíduos humanos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0024] Figura 1: Western Blot que mostra expressão de LDLR de humano e camundongo em várias linhagens de células cancerosas: (A) CH095 (uma linhagem celular que superexpressa LDLR humano em fusão com eGFP), Hela (Câncer de Cérvice), NCI-H295R (Adenocarcinoma de Glândula Adrenal), Capan, BxPC3 e Panei (Câncer Pancreático), MCF-7 e MDA-MB231 (Câncer de Mama). No painel da direita, a expressão de LDLR em uma linhagem celular pancreática de camundongo PK4 é comparada a um pâncreas normal de camundongo. (B) . A linhagem celular de glioblastoma U87MG (duas linhagens), linhagem celular de câncer de próstata PC3 e NCI-H295R são representadas.

[0025] Figura 2: Ligação/endocitose de conjugado A (A), conjugado B (B) , conjugado C (C) e conjugado D (D) em células CHO que expressam LDLR humano acoplado à GFP. 0 sinal de LDLR-GFP é visualizável na coluna 2, o sinal de conjugado é diretamente visualizado na coluna 4 usando a fluorescência A680 ou na coluna 3 usando um anticorpo secundário conjugado anti-hFc-A594. Os núcleos celulares foram manchados de azul com Hoechst e seu sinal pode ser visualizado na coluna 1. A coidentificação de LDLR-GFP e conjugados pode ser visualizada como um sinal destacado na coluna 5 na imagem de

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 23/116

10/73 mesclagem.

[0026] Figura 3: Em A, a biodistribuição de tecido de conjugado A no pâncreas, no tumor do pâncreas e rim (controle) em camundongos implantados com tumor PK4A e injetados na veia da cauda com o conjugado A. Em B, a biodistribuição de tecido de conjugado C no pâncreas e tumor do pâncreas em camundongos injetados com conjugado C. A Biodistribuição foi avaliada usando a quantificação de ELISA.

[0027] Figura 4: Em A, imagiologia de fluorescência de corpo inteiro de camundongos implantados com tumor PK4A e analisados 15 min, 30 min, 60 min e 120 min após injeção intravenosa de conjugado C ou conjugado D (controle). Em B, imagiologia ex-vivo de tumor pancreático, pâncreas saudável e fígado coletado 4h após a injeção intravenosa de conjugado C ou conjugado D (controle).

[0028] Figura 5: Esquema de reação para a síntese de compostos grade-pAla-PEG12-peptídeo-NH2. No presente esquema, a síntese de NODAGA-pAla-PEG12-SEQ ID NO: 1-NH2 é mostrada como um exemplo.

[0029] Figura 6: Imagiologia de PET de camundongos administrados com 18F-FDG (A) , 68Ga-CH44 (B) e 68Ga-CH40 (C) no dia 14 após a implantação com células NCI-H295R. 0 tumor adrenal é indicado por um círculo.

[0030] Figura 7: Imagiologia de PET de camundongos administrados com 68Ga-CH44 (A) e 68Ga-CH40 (B) no dia 32 após a implantação com células NCI-H295R. 0 tumor adrenal é indicado por um círculo.

[0031] Figura 8: Diagnóstico por imagem de PET de camundongos administrados com 68Ga-FG770 (A) e 68Ga-FG769

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 24/116

11/73 (B) no dia 37 após a implantação com células NCI-H295R.

[0032] Figura 9: Diagnóstico por imagem de PET de camundongos administrados com 18F-FDG (A) , 68Ga-CH44 (B) e 68Ga-CH40 (C) no dia 4 após a implantação com células Pk4a. O tumor pancreático é indicado por um círculo.

[0033] Figura 10: Diagnóstico por imagem de PET de camundongos administrados com 68Ga-CH44 (A) e 68Ga-CH40 (B) no dia 12 após a implantação com células Pk4a. O tumor pancreático é indicado por um círculo.

[0034] Figura 11: Imagiologia de PET de camundongos administrados com 68Ga-CH44 no dia 14 (A), 68Ga-CH40 no dia 16 (B), 68Ga-CH44 no dia 21 (C), 68Ga-CH40 no dia 21 (D) e 68Ga-RGD no dia 21 (E) após implantação cerebral com células U87MG.

[0035] Figura 12: Quantificação de 68Ga-CH44, 68Ga-CH40 e 68Ga-RGD em animais implantados com U87MG no dia 21 expressado como tumor na contrarrazão.

[0036] Figura 13: Diagnóstico por imagem de PET de camundongos administrados com 68Ga-CH44 (A) e 68Ga-MG04 (B) no dia 48 após a implantação com células NCI-H295R.

[0037] Figura 14: Estrutura do composto VHd.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0038] A invenção se refere a composições e métodos para imagiologia e radioterapia de câncer com base nos agentes de alvejamento de LDLR. A invenção fornece compostos conjugados que compreendem uma fração de ligação de LDLR e um marcador farmaceuticamente aceitável. A invenção mostra mais particularmente que tais compostos podem identificar de modo eficaz as células cancerosas in vitro e in vivo e permitir o imagiologia, a detecção, o estadiamento ou a radioterapia

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 25/116

12/73 eficaz das mesmas.

[0039] Mais especificamente, um objetivo da invenção se encontra em um método de identificação de cânceres ou tumores ou células cancerosas/tumorais usando um composto de conjugado da fórmula (I):

M-P (I), em que

M representa um marcador farmaceuticamente aceitável, e

P representa um peptídeo ou pseudopeptídeo que tem no máximo 30 resíduos de aminoácido e tem capacidade para ligar o Receptor de Lipoproteína de Baixa Densidade (LDLR).

[0040] LDLR humano é uma proteína de transmembrana de 839 aminoácidos que compreende três regiões: a região extracelular (1-768), a região de transmembrana (768-790) e a região citoplásmica (790-839). A região extracelular é dividida em duas sub-regiões: aquela da ligação de LDL (1322) e aquela fora da região de ligação de LDL (322-768). É relatado que LDLR é expresso por células mais nucleadas e é geralmente aceito que 1000 a 3000 de LDLR estejam presentes na superfície de células não patológicas. A quantidade de LDLR nas células cancerosas pode aumentar drasticamente, até 100.000 ou mais. As células tumorais que foram relatadas para superexpressar LDLR incluem células de câncer de próstata (Chen et ai., 2001, Int. J. Cancer, 91, 41-45), câncer de cólon (Niendorf et ai., 1995, Int. J. Cancer, 61, 461-464), leucemia (Tatidis et ai., 2002, Biochem. Pharmacol., 63, 2169-2180), câncer colorretal (Caruso et ai., 2001, Anticancer Res., 21, 429-433), câncer de mama (Graziani et ai., 2002, Gynecol. Oncol., 85, 493-497), células de tumor cerebral de glioblastoma (Malentiska et

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 26/116

13/73 al., 2000, Cancer Res., 60, 2300-2303; Nikanjam et al., 2007, Int. J. Pharm., 328, 86-94), bem como células de cânceres de fígado, pâncreas, ovários, pulmão e estômago. No entanto, não se sabe se tal expressão aumentada pode afetar a conformação/disponibilidade do receptor, particularmente, a região extracelular 322-768. De fato, foi observado que a alta expressão de receptores pode levar a alterações de agregação ou conformacionais. Tal agregação pode alterar a capacidade de alvejar agentes para tais células usando agentes de alvejamento de LDLR que ligam a região extracelular 322-768.

[0041] De modo interessante e apesar da expressão ubíqua de LDLR, os conjugados da invenção permitem a identificação eficaz de células que superexpressam LDLR, particularmente de células cancerosas que superexpressam LDLR e permitem o alvejamento eficaz de tais células cancerosas que expressam LDLR. Tal efeito pode ser devido à densidade de receptor apropriada, afinidade de ligação de conjugado para LDLR e mecanismo de ação (não competitivo).

[0042] A invenção mostra que os conjugados da invenção retêm a capacidade de ligar de modo eficaz as células cancerosas que superexpressam LDLR.

[0043] A invenção mostra que os conjugados da invenção podem direcionar marcadores farmaceuticamente aceitáveis para células que superexpressam LDLR de uma maneira adequada para discriminar tais células (por exemplo, células cancerosas) das células que têm níveis regulares de LDLR (por exemplo, tecido normal).

[0044] A invenção mostra que os conjugados da invenção podem conferir nível suficiente de identificação a células

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 27/116

14/73 que superexpressam LDLR, apesar da densidade de LDLR e reorganização possível.

[0045] A invenção fornece, então, agentes de radioterapia e de identificação eficazes e seguros e permite o projeto de métodos terapêuticos e de diagnóstico de câncer eficazes.

[0046] Um objetivo da invenção se refere, então, a um composto conjugado da fórmula (I):

M-P (I), em que

M representa um marcador farmaceuticamente aceitável, e

P representa um peptideo ou pseudopeptideo que tem no máximo resíduos de aminoácido e tem capacidade para ligar LDLR, para uso em um método de identificação e/ou detecção de células cancerosas em um indivíduo pela administração do composto conjugado ao indivíduo e análise da presença e/ou da quantidade de marcador.

[0047] A invenção também se refere a um método para identificação, imagiologia, diagnóstico ou estadiamento de câncer em um indivíduo usando um composto de conjugado como definido acima.

[0048] Em uma modalidade particular, os compostos conjugados da invenção compreendem adicionalmente um segundo grupo de alvejamento T que se liga a uma molécula distinta do LDLR. Os exemplos de tais compostos conjugados duplos são compostos da fórmula (IV) abaixo:

M„-P-T-M_m (IV), em que, M e P são como definido acima, T representa um segundo grupo de alvejamento, n é 1 ou 0, m é 1 ou 0. De preferência, m+n=l.

[0049] Em uma modalidade particular adicional, os

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 28/116

15/73 compostos conjugados duplos têm a seguinte estrutura:

(M-C-)nP-T(-C-M)_m em que, M, C e P são como definido acima, T representa um segundo grupo de alvejamento, n é 1 ou 0, m é 1 ou 0. De preferência, m+n=l.

[0050] T pode ser qualquer grupo que se liga a uma molécula-alvo distinta do LDLR (ou a uma célula que expressa tal molécula) . De preferência, tal molécula-alvo é uma molécula expressada por células cancerosas, como por células cancerosas do pâncreas ou células cancerosas da próstata ou células cancerosas do ovário ou células cancerosas adrenals. Os exemplos de tal grupo de alvejamento incluem, sem limitação, PSMA (antígeno de membrana específica da próstata), neurotensina, análogos de somatostatina, bem como derivados dos mesmos.

Conj ugados [0051] A presente invenção revela o uso de conjugados de alvejamento de LDLR particulares, bem como o projeto de novos conjugados. Tais conjugados podem ser monômeros da fórmula (I), ou estruturas multiméricas, como será descrito abaixo. [0052] Em uma modalidade particular, os conjugados são compostos da fórmula M-P (I) como definido acima. De preferência, P compreende a sequência de aminoácidos (II): Al-Met-A2-Arg-Leu-Arg-A3-A4 (II) , em que Al e A4 representam independentemente uma cisteína ou um análogo da mesma ou um isóstero da mesma, A2 representa uma prolina ou um análogo da mesma ou um isóstero da mesma, e A3 representa uma glicina ou um análogo da mesma ou um isóstero da mesma.

[0053] Mais particularmente, Al e A4 representam,

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 29/116

16/73 independentemente entre si, um resíduo de aminoácido selecionado a partir de cisteína (Cys, C) , de configuração D ou L, ou um derivado da mesma selecionado a partir de ácido 2-amino-3-mercaptopropanoico e derivados de S substituído do mesmo, S-acetilcisteína ou ácido 2-amino-3(acetiltio)propanoico, selenocisteína (Sec, U) ou ácido 2amino-3-(seleno)propanoico, cisteinol, ácido 3mercaptopropanoico (Mpa) ou penicilamina (Pen) , de configuração L ou D.

[0054] Em uma modalidade preferencial, Al e A4 são selecionados, independentemente entre si, de cisteína (Cys), (D)-cys, penicilamina (Pen) e (D)-penicilamina ((D)-Pen).

[0055] A2 representa mais preferencialmente um resíduo selecionado a partir de prolina (Pro, P), ácido pirolidina2-carboxílico, homoprolina, ácido 2- (2pirrolidinil)etanoico, 3-hidroxiprolina (3Hyp), 4hidroxiprolina (4Hyp), 3-metilprolina, 3,4-de-hidroprolina, 3,4-metanoprolina, 4-aminoprolina, 4-oxoprolina, tioprolina, ácido tiazolidina-4-carboxílico (Thz), ácido 2oxotiazolidina-4-carboxílico, ácido indolin-2-carboxílico (Ide), ácido pipecólico (Pip), ácido piperidin-2carboxílico, ácido nipecótico (Nip), ácido piperidin-3carboxílico, ácido 4-oxopipecólico, ácido 4hidroxipipecólico, ácido amino-l-eielo-hexanocarboxílico ou prolinol.

[0056] Em uma modalidade preferencial, A2 é selecionado a partir de prolina, ácido pipecólico (Pip) ou ácido tiazolidina-4-carboxílico (Thz).

[0057] A3 representa mais preferencialmente um resíduo selecionado a partir de glicina (Gly, G), ácido 2Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 30/116

17/73 aminoetanoico, sarcosina (Sar), N-metilglicina (MeGly), Netilglicina (EtGly), alilglicina (allylGly), ácido 2aminopent-4-enoico, 2-ciclopentilglicina (Cpg), 2-ciclohexilglicina (Chg), 2,2-dipropilglicina (Dpg), 2-(3indolil)glicina (IndGly), 2-indanilglicina (Igl), 2neopentilglicina (NptGly), 2-octilglicina (OctGly), 2propargilglicina (Era) ou ácido 2-amino pent-4-inoico, 2fenilglicina (Phg), 2-(4-clorofenil)glicina, azaglicina (AzGly), glicinol ou 2-aminoetanol.

[0058]

Em uma modalidade preferencial, A3 é glicina ou [0059]

Em uma modalidade preferencial, P compreende ou consiste essencialmente ou consiste em uma sequencia de aminoácidos selecionados a partir de qualquer uma dentre

SEQ

ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9 abaixo:

SEQ ID NO: 1, (D)-Cys-Met-Thz-Arg-Leu-Arg-Gly-Pen;

SEQ ID NO: 2, (D)-Cys-Met-Thz-Arg-Leu-Arg-Sar-Pen;

SEQ ID NO: 3, (D)-Cys-Met-Pip-Arg-Leu-Arg-Sar-Cys;

SEQ ID NO: 4, (D)-Cys-Met-Pip-Arg-Leu-Arg-Gly-Pen;

SEQ ID NO: 5, (D)-Cys-Met-Pip-Arg-Leu-Arg-Sar-Pen;

SEQ ID NO: 6, Cys-Met-Pro-Arg-Leu-Arg-Gly-Cys;

SEQ ID NO: 7, (D)-Cys-Met-Pro-Arg-Leu-Arg-Gly-Cys;

SEQ ID NO: 8, Asp-Ser-Gly-Leu-Cys-Met-Pro-Arg-Leu-ArgGly-Cys-Asp-Pro-Arg;

SEQ ID NO: 9, (D)-Pen-Met-Thz-Arg-Leu-Arg-Gly-Cys. [0060] Os resultados obtidos pelos inventores mostram que os conjugados da invenção têm uma afinidade aprimorada (KD) para LDLR em comparação a um peptídeo controlado que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 ou 14 (consulte o Exemplo 3). Ademais, os conjugados da invenção

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 31/116

18/73 apresentam um melhor acúmulo em tumor pancreático em comparação ao pâncreas saudável (consulte o Exemplo 4) . Em particular, como mostrado nos exemplos, a identificação do tecido canceroso pode ser 10 a 50 vezes superior à identificação de tecido não canceroso. Esse nível de acúmulo é bem suficiente para permitir uma discriminação confiável e clara no conjunto de imagens. Além disso, isso significa que, no caso de um uso em radioterapia, o conjugado tem uma especificidade muito satisfatória para células tumorais em comparação a células saudáveis.

[0061] Como discutido acima, o marcador M pode ser qualquer radionuclídeo ou marcador fluorescente.

[0062] Os marcadores fluorescentes que podem ser usados são, por exemplo, Alexa Fluor 680, CF680, ATTO680, Fluoroprobes682, Cyanine 5.5, IRDye 680 ou Vivotag. De uma maneira geral, todos os marcadores fluorescentes infravermelhos próximos (IR) podem ser usados para imagiologia visto que permitem a autofluorescência mínima de tecido. Mais especificamente, Alexa Fluor 680 é um corante IR próximo fotoestável e brilhante que é espectralmente similar ao corante Cy5.5. Usado para geração de sinal estável em imagiologia e citometria de fluxo, o corante Alexa Fluor 680 é solúvel em água e pH-insensível de pH 4 a pH 10. O NHS éster (ou succinimidil éster) de Alexa Fluor 680 é a ferramenta mais popular para conjugar esse corante a uma proteína ou um anticorpo. NHS éster de corantes pode ser usado para identificar aminas primárias (R-NH2) de proteínas, oligonucleotídeos de amina modificada e outras moléculas gue contêm amina.

[0063] Em uma modalidade mais preferencial, M é um

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 32/116

19/73 radionuclídeo adaptado para uso em conjunto de imagens médicas, por exemplo, para uso em conjunto de imagens de tomografia por emissão de positrons (PET), cintilografia, tomografia computadorizada-tomografia por emissão de positrons ou tomografia computadorizada por emissão de fóton único. De preferência, M é um radionuclídeo adaptado para uso em PET.

[0064] Os exemplos de radionuclídeos adequados para uso na presente invenção incluem, sem limitação, 18F, 11C, 150, 13N, 68Ga, 82Rb e 89Zr. Os radionuclídeos preferenciais para uso no conjunto de imagens devem ter uma meia-vida curta (por exemplo, de 30 minutos a 3 ou 4 dias) e baixa emissão de energia (por exemplo, inferior a 300 keV de radionuclídeos emissores de gama). De preferência, o radionuclídeo é 68Ga. 68Ga tem uma meia-vida curta (68 minutos) e é um isótopo emissor de positron.

[0065] Para uso em radioterapia, os radionuclídeos são tipicamente radionuclídeos emissores de beta ou radionuclídeos emissores de gama de alta energia, de preferência, com uma meia-vida maior (por exemplo, entre 1 a 75 dias).

[0066] Os radionuclídeos preferenciais para uso em radioterapia são selecionados a partir de 90Y, lllln, 1311 e 177Lu. Em uma modalidade preferencial, 90Y, 177Lu ou lllln são usados.

[0067] Os conjugados da invenção podem ser sintetizados por qualquer técnica conhecida àquele versado na técnica (síntese química, biológica ou genética, etc.). Para síntese química, aparelhos comerciais que podem incorporar aminoácidos naturais bem como aminoácidos não naturais, como

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 33/116

20/73 enantiômeros D e resíduos com cadeias laterais com hidrofobias e obstruções estéricas diferentes daquelas de seus homólogos naturais (chamado de aminoácidos exóticos, isto é, não codificados), ou uma sequência de peptídeos que contêm uma ou mais ligações peptidomiméticas que podem incluir consideravelmente intercalação de um grupo metileno (-CH2-) ou fosfato (-PO2-), uma amina secundária (-NH-) ou um oxigênio (-O-) ou um N-alquilpeptídeo, são usados. Os peptídeos ou pseudopeptídeos ou uma parte proteica dos mesmos, também podem ser obtidos a partir de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica os mesmos. Essas sequências de ácidos nucleicos podem ser DNA ou RNA e ser combinadas com sequências de controle e/ou ser inseridas em vetores de expressão biológica.

[0068] Nos compostos conjugados da invenção, o acoplamento entre M e P (e/ou entre P e T) pode ser executado por qualquer meio aceitável de ligação levando em consideração a natureza química, obstrução e número de agentes associados. Então, o acoplamento pode ser executado por uma ou mais ligações covalentes, iônicas, de hidrogênio, hidrofóbicas ou de Van der Waals. Também, o acoplamento pode ser executado em qualquer sítio do peptídeo ou pseudopeptídeo em que os grupos funcionais, como -OH, -SH, -CO2H, -NH2, SO3H, -CN, -N3, -NCS, -PO2H, alcino, maleimida ou succinimida éster estão naturalmente presentes ou foram introduzidos. Então, M pode ser ligado (acoplado) ao peptídeo ou pseudopeptídeo por uma ligação covalente nas extremidades de terminação N ou terminação C, nos grupos reativos transportados pelas cadeias laterais de aminoácido natural ou não natural dessa sequência de peptídeos ou através de um

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 34/116

21/73 grupo profético. De modo similar, o acoplamento pode ser executado em qualquer sítio do agente radioterapêutico ou imagiologia.

[0069] É preferencial que a interação seja suficientemente forte de modo que M não seja dissociado do peptídeo antes de ter alcançado seu sítio de ação, e que M e o peptídeo permanecem acoplados durante o tempo necessário para realizar um método de imagiologia ou para M ter um efeito terapêutico. Por essa razão, o acoplamento preferencial da invenção é uma ligação iônica ou covalente. 0 agente radioterapêutico ou de imagiologia pode ser acoplado diretamente ao peptídeo em uma de suas extremidades terminais (terminação N ou terminação C), ou em uma cadeia lateral de um dos aminoácidos constitutivos da sequência. 0 agente radioterapêutico ou de imagiologia também pode ser acoplado indiretamente por meio de um ligante ou espaçador, em uma das extremidades terminais dos peptídeos, ou em uma cadeia lateral de um dos aminoácidos constitutivos da sequência. Em uma modalidade particular, M é ligado ao peptídeo pelo aprisionamento usando, por exemplo, um agente quelante.

[0070] Nesse sentido, em uma modalidade preferencial, o composto conjugado compreende um quelador C que tem capacidade para formar um quelato com M. Tais conjugados têm uma estrutura M-C-P. Vários queladores podem ser usados. De preferência, C é selecionado a partir de NODAGA (ácido 1,4,7triazaciclononano-l-ácido glutárico-4,7-diacético), DOTA (ácido tetra-azaciclododecano-1,4,7,1O-tetra-acético), NOTA (ácido 1,4,7-triazaciclononano-triacético), DOTA-GA (ácido 2,2',2-(10-(2,6-dioxotetra-hidro-2H-piran-3-il)-1,4,7,10tetra-azaciclododecano-1,4,7-tri-il)triacético), e

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 35/116

22/73 derivados funcionais dos mesmos. NODAGA e NOTA são preferenciais para imagiologia, enquanto DOTA é preferencial para radioterapia.

[0071] 0 termo derivados funcionais significa qualquer composto derivado dos queladores mencionados acima por substituição de um ou mais dos grupos funcionais do mesmo (isto é, grupos envolvidos na função quelante) por um outro grupo funcional sem prejudicar a dita função quelante e/ou pela adição e/ou deleção de grupos não envolvidos na função quelante sem prejudicar a dita função quelante.

[0072] 0 quelador C pode ser ligado diretamente ao peptídeo P (ou a T), ou através de um espaçador S, típica e covalentemente acoplado a P e C (ou a T e C) . Nesse sentido, em uma modalidade particular, os conjugados compreendem a estrutura M-C-P em que M, C e P são como definido acima e em que C é ligado diretamente ao peptídeo P. Em uma outra modalidade particular, os conjugados compreendem a estrutura M-C-S-P, em que M, C, S, e P são como definido acima. Em uma modalidade particular adicional, os conjugados compreendem a estrutura M-C-P-T ou P-T-C-M ou M-C-S-P-T ou P-T-S-C-M, em que M, C, S, P e T são como definido acima. Em uma modalidade adicional, P e T são acoplados através do grupo de espaçador az.

[0073] S pode ser selecionado a partir de agentes bifuncionais ou multifuncionais de alquila, arila, PEG ou natureza peptídica, e que tem em suas extremidades, grupos funcionais, como aminas, ésteres, aldeídos, ácidos de alquila ou arila, anidrido, grupos sulfidrila ou carboxila, grupos derivados de cloreto ou brometo de cianogênio, carbonildi-imidazol, succinimida ésteres, haletos

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 36/116

23/73 sulfônicos, maleimidas, azida, isotiocianato, alcinos. Em uma modalidade particular, S compreende um ou vários PEG, de preferência, com uma beta-alanina em uma extremidade da mesma. Por exemplo, S é um oligômero de doze PEG com uma beta-Alanina em uma extremidade da cadeia. Em uma outra modalidade, S compreende vários resíduos Gly, como G3 ou G4S. Em outras modalidades particulares, S compreende sequências de peptídeos negativamente carregadas hidrofílicas que abrangem aminoácidos de configuração D ou L, como várias unidades repetitivas His-Glu (2 ou 3 unidades) ou sequências neutras hidrofílicas que abrangem aminoácidos de configuração D ou L, como Gly-Gly-Gly-Arg-Asp-Asn. Em uma outra modalidade, grupos metabolizáveis estáveis em plasma, mas especificamente clivados nos rins por hidrolase na membrana de borda em escova tubular proximal podem ser usados para reduzir a retenção nos rins. Por exemplo, uma ligação glicil-lisina pode ser usada. S pode, então, ser qualquer modificador farmacocinético.

[0074] Em uma modalidade particular, a invenção se refere a compostos conjugados da fórmula (III):

M-C-S-P (III), em que

M representa um radionuclídeo farmaceuticamente aceitável,

C representa um quelador que forma um quelato com M,

S representa um espaçador, e

[0075] Em uma modalidade particular, a invenção se refere

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 37/116

24/73 a compostos conjugados como definido acima que compreendem adicionalmente um segundo grupo de alvejamento T.

[0076] Os compostos conjugados preferenciais da invenção são compostos da fórmula (III) em que

M representa um radionuclideo farmaceuticamente aceitável,

C é selecionado a partir de NODAGA, DOTA, NOTA e DOTAGA,

S representa um espaçador que compreende um agente bifuncional, PEG ou um peptideo, ou S é ausente, e

P representa um peptideo ou pseudopeptideo que tem no máximo 30 resíduos de aminoácido e tem capacidade para ligar o Receptor de Lipoproteína de Baixa Densidade (LDLR).

[0077] Nos compostos mais preferenciais da invenção, C é NODAGA ou DOTA e P compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 1-9.

[0078] Os exemplos específicos de compostos conjugados da invenção incluem:

⁶⁸Ga-NODAGA-SEQ ID NO: 1, ⁶⁸Ga-NOTA-SEQ ID NO: 1, ⁶⁸Ga-DOTA-SEQ ID NO: 1, ⁶⁸Ga-DOTA-GA-SEQ ID NO: 1, ¹⁸F-NODAGA-SEQ ID NO: 1, ¹⁸F-NOTA-SEQ ID NO: 1, ¹⁸F-DOTA-SEQ ID NO: 1, ¹⁸F-DOTA-GA-SEQ ID NO: 1, ⁹⁰Y-NODAGA-SEQ ID NO: 1, ⁹⁰Y-NOTA-SEQ ID NO: 1, ⁹⁰Y-DOTA-SEQ ID NO: 1, ⁹⁰Y-DOTA-GA-SEQ ID NO: 1,

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 38/116

25/73 min-NODAGA-SEQ ID NO: 1, min-NOTA-SEQ ID NO: 1, min-DOTA-SEQ ID NO: 1, min-DOTA-GA-SEQ ID NO: 1, ¹⁷⁷Lu-NODAGA-SEQ ID NO: 1, ¹⁷⁷Lu-NOTA-SEQ ID NO: 1, ¹⁷⁷Lu-DOTA-SEQ ID NO: 1, ¹⁷⁷Lu-DOTA-GA-SEQ ID NO: 1, ⁶⁸Ga-NODAGA-SEQ ID NO: 2, ⁶⁸Ga-NOTA-SEQ ID NO: 2, ⁶⁸Ga-DOTA-SEQ ID NO: 2, ⁶⁸Ga-DOTA-GA-SEQ ID NO: 2, ¹⁸F-NODAGA-SEQ ID NO: 2, ¹⁸F-NOTA-SEQ ID NO: 2, ¹⁸F-DOTA-SEQ ID NO: 2, ¹⁸F-DOTA-GA-SEQ ID NO: 2, ⁹⁰Y-NODAGA-SEQ ID NO: 2, ⁹⁰Y-NOTA-SEQ ID NO: 2, ⁹⁰Y-DOTA-SEQ ID NO: 2, ⁹⁰Y-DOTA-GA-SEQ ID NO: 2, min-NODAGA-SEQ ID NO: 2, min-NOTA-SEQ ID NO: 2, min-DOTA-SEQ ID NO: 2, min-DOTA-GA-SEQ ID NO: 2, ¹⁷⁷Lu-NODAGA-SEQ ID NO: 2, ¹⁷⁷Lu-NOTA-SEQ ID NO: 2, ¹⁷⁷Lu-DOTA-SEQ ID NO: 2, ¹⁷⁷Lu-DOTA-GA-SEQ ID NO: 2, ⁶⁸Ga-NODAGA-SEQ ID NO: 3, ⁶⁸Ga-NOTA-SEQ ID NO: 3,

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 39/116

26/73 ⁶⁸Ga-DOTA-SEQ ID NO: 3, ⁶⁸Ga-DOTA-GA-SEQ ID NO: 3, ¹⁸F-NODAGA-SEQ ID NO: 3, ¹⁸F-NOTA-SEQ ID NO: 3, ¹⁸F-DOTA-SEQ ID NO: 3, ¹⁸F-DOTA-GA-SEQ ID NO: 3, ⁹⁰Y-NODAGA-SEQ ID NO: 3, ⁹⁰Y-NOTA-SEQ ID NO: 3, ⁹⁰Y-DOTA-SEQ ID NO: 3, ⁹⁰Y-DOTA-GA-SEQ ID NO: 3, min-NODAGA-SEQ ID NO: 3, min-NOTA-SEQ ID NO: 3, min-DOTA-SEQ ID NO: 3, min-DOTA-GA-SEQ ID NO: 3, ¹⁷⁷Lu-NODAGA-SEQ ID NO: 3, ¹⁷⁷Lu-NOTA-SEQ ID NO: 3, ¹⁷⁷Lu-DOTA-SEQ ID NO: 3, ¹⁷⁷Lu-DOTA-GA-SEQ ID NO: 3, ⁶⁸Ga-NODAGA-SEQ ID NO: 4, ⁶⁸Ga-NOTA-SEQ ID NO: 4, ⁶⁸Ga-DOTA-SEQ ID NO: 4, ⁶⁸Ga-DOTA-GA-SEQ ID NO: 4, ¹⁸F-NODAGA-SEQ ID NO: 4, ¹⁸F-NOTA-SEQ ID NO: 4, ¹⁸F-DOTA-SEQ ID NO: 4, ¹⁸F-DOTA-GA-SEQ ID NO: 4, ⁹⁰Y-NODAGA-SEQ ID NO: 4, ⁹⁰Y-NOTA-SEQ ID NO: 4, ⁹⁰Y-DOTA-SEQ ID NO: 4, ⁹⁰Y-DOTA-GA-SEQ ID NO: 4,

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 40/116

27/73 min-NODAGA-SEQ ID NO: 4, min-NOTA-SEQ ID NO: 4, min-DOTA-SEQ ID NO: 4, min-DOTA-GA-SEQ ID NO: 4, ¹⁷⁷Lu-NODAGA-SEQ ID NO: 4, ¹⁷⁷Lu-NOTA-SEQ ID NO: 4, ¹⁷⁷Lu-DOTA-SEQ ID NO: 4, ¹⁷⁷Lu-DOTA-GA-SEQ ID NO: 4, ⁶⁸Ga-NODAGA-SEQ ID NO: 5, ⁶⁸Ga-NOTA-SEQ ID NO: 5, ⁶⁸Ga-DOTA-SEQ ID NO: 5, ⁶⁸Ga-DOTA-GA-SEQ ID NO: 5, ¹⁸F-NODAGA-SEQ ID NO: 5, ¹⁸F-NOTA-SEQ ID NO: 5, ¹⁸F-DOTA-SEQ ID NO: 5, ¹⁸F-DOTA-GA-SEQ ID NO: 5, ⁹⁰Y-NODAGA-SEQ ID NO: 5, ⁹⁰Y-NOTA-SEQ ID NO: 5, ⁹⁰Y-DOTA-SEQ ID NO: 5, ⁹⁰Y-DOTA-GA-SEQ ID NO: 5, min-NODAGA-SEQ ID NO: 5, min-NOTA-SEQ ID NO: 5, min-DOTA-SEQ ID NO: 5, min-DOTA-GA-SEQ ID NO: 5, ¹⁷⁷Lu-NODAGA-SEQ ID NO: 5, ¹⁷⁷Lu-NOTA-SEQ ID NO: 5, ¹⁷⁷Lu-DOTA-SEQ ID NO: 5, ¹⁷⁷Lu-DOTA-GA-SEQ ID NO: 5, ⁶⁸Ga-NODAGA-SEQ ID NO: 6, ⁶⁸Ga-NOTA-SEQ ID NO: 6,

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 41/116

28/73 ⁶⁸Ga-DOTA-SEQ ID NO: 6, ⁶⁸Ga-DOTA-GA-SEQ ID NO: 6, ¹⁸F-NODAGA-SEQ ID NO: 6, ¹⁸F-NOTA-SEQ ID NO: 6, ¹⁸F-DOTA-SEQ ID NO: 6, ¹⁸F-DOTA-GA-SEQ ID NO: 6, ⁹⁰Y-NODAGA-SEQ ID NO: 6, ⁹⁰Y-NOTA-SEQ ID NO: 6, ⁹⁰Y-DOTA-SEQ ID NO: 6, ⁹⁰Y-DOTA-GA-SEQ ID NO: 6, min-NODAGA-SEQ ID NO: 6, min-NOTA-SEQ ID NO: 6, min-DOTA-SEQ ID NO: 6, min-DOTA-GA-SEQ ID NO: 6, ¹⁷⁷Lu-NODAGA-SEQ ID NO: 6, ¹⁷⁷Lu-NOTA-SEQ ID NO: 6, ¹⁷⁷Lu-DOTA-SEQ ID NO: 6, ¹⁷⁷Lu-DOTA-GA-SEQ ID NO: 6 ⁶⁸Ga-NODAGA-S-SEQ ID NO: 1, ⁶⁸Ga-NOTA-S-SEQ ID NO: 1, ⁶⁸Ga-DOTA-S-SEQ ID NO: 1, ⁶⁸Ga-DOTA-GA-S-SEQ ID NO: 1, ¹⁸F-NODAGA-S-SEQ ID NO: 1, ¹⁸F-NOTA-S-SEQ ID NO: 1, ¹⁸F-DOTA-S-SEQ ID NO: 1, ¹⁸F-DOTA-GA-S-SEQ ID NO: 1, ⁹⁰Y-NODAGA-S-SEQ ID NO: 1, ⁹⁰Y-NOTA-S-SEQ ID NO: 1, ⁹⁰Y-DOTA-S-SEQ ID NO: 1,

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 42/116

29/73 ⁹⁰Y-DOTA-GA-S-SEQ ID NO: 1, min-NODAGA-S-SEQ ID NO: 1, min-NOTA-S-SEQ ID NO: 1, min-DOTA-S-SEQ ID NO: 1, min-DOTA-GA-S-SEQ ID NO: 1 ¹⁷⁷Lu-NODAGA-S-SEQ ID NO: 1, ¹⁷⁷Lu-NOTA-S-SEQ ID NO: 1, ¹⁷⁷Lu-DOTA-S-SEQ ID NO: 1, ¹⁷⁷Lu-DOTA-GA-S-SEQ ID NO: 1 ⁶⁸Ga-NODAGA-S-SEQ ID NO: 2, ⁶⁸Ga-NOTA-S-SEQ ID NO: 2, ⁶⁸Ga-DOTA-S-SEQ ID NO: 2, ⁶⁸Ga-DOTA-GA-S-SEQ ID NO: 2, ¹⁸F-NODAGA-S-SEQ ID NO: 2, ¹⁸F-NOTA-S-SEQ ID NO: 2, ¹⁸F-DOTA-S-SEQ ID NO: 2, ¹⁸F-DOTA-GA-S-SEQ ID NO: 2, ⁹⁰Y-NODAGA-S-SEQ ID NO: 2, ⁹⁰Y-NOTA-S-SEQ ID NO: 2, ⁹⁰Y-DOTA-S-SEQ ID NO: 2, ⁹⁰Y-DOTA-GA-S-SEQ ID NO: 2, min-NODAGA-S-SEQ ID NO: 2, min-NOTA-S-SEQ ID NO: 2, min-DOTA-S-SEQ ID NO: 2, min-DOTA-GA-S-SEQ ID NO: 2 ¹⁷⁷Lu-NODAGA-S-SEQ ID NO: 2, ¹⁷⁷Lu-NOTA-S-SEQ ID NO: 2, ¹⁷⁷Lu-DOTA-S-SEQ ID NO: 2, ¹⁷⁷Lu-DOTA-GA-S-SEQ ID NO: 2 ⁶⁸Ga-NODAGA-S-SEQ ID NO: 3,

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 43/116

30/73 ⁶⁸Ga-NOTA-S-SEQ ID NO: 3, ⁶⁸Ga-DOTA-S-SEQ ID NO: 3, ⁶⁸Ga-DOTA-GA-S-SEQ ID NO: 3, ¹⁸F-NODAGA-S-SEQ ID NO: 3, ¹⁸F-NOTA-S-SEQ ID NO: 3, ¹⁸F-DOTA-S-SEQ ID NO: 3, ¹⁸F-DOTA-GA-S-SEQ ID NO: 3, ⁹⁰Y-NODAGA-S-SEQ ID NO: 3, ⁹⁰Y-NOTA-S-SEQ ID NO: 3, ⁹⁰Y-DOTA-S-SEQ ID NO: 3, ⁹⁰Y-DOTA-GA-S-SEQ ID NO: 3, min-NODAGA-S-SEQ ID NO: 3, min-NOTA-S-SEQ ID NO: 3, min-DOTA-S-SEQ ID NO: 3, min-DOTA-GA-S-SEQ ID NO: 3 ¹⁷⁷Lu-NODAGA-S-SEQ ID NO: 3, ¹⁷⁷Lu-NOTA-S-SEQ ID NO: 3, ¹⁷⁷Lu-DOTA-S-SEQ ID NO: 3, ¹⁷⁷Lu-DOTA-GA-S-SEQ ID NO: 3 ⁶⁸Ga-NODAGA-S-SEQ ID NO: 4, ⁶⁸Ga-NOTA-S-SEQ ID NO: 4, ⁶⁸Ga-DOTA-S-SEQ ID NO: 4, ⁶⁸Ga-DOTA-GA-S-SEQ ID NO: 4, ¹⁸F-NODAGA-S-SEQ ID NO: 4, ¹⁸F-NOTA-S-SEQ ID NO: 4, ¹⁸F-DOTA-S-SEQ ID NO: 4, ¹⁸F-DOTA-GA-S-SEQ ID NO: 4, ⁹⁰Y-NODAGA-S-SEQ ID NO: 4, ⁹⁰Y-NOTA-S-SEQ ID NO: 4, ⁹⁰Y-DOTA-S-SEQ ID NO: 4,

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 44/116

31/73 ⁹⁰Y-DOTA-GA-S-SEQ ID NO: 4, min-NODAGA-S-SEQ ID NO: 4, min-NOTA-S-SEQ ID NO: 4, min-DOTA-S-SEQ ID NO: 4, min-DOTA-GA-S-SEQ ID NO: 4 ¹⁷⁷Lu-NODAGA-S-SEQ ID NO: 4, ¹⁷⁷Lu-NOTA-S-SEQ ID NO: 4, ¹⁷⁷Lu-DOTA-S-SEQ ID NO: 4, ¹⁷⁷Lu-DOTA-GA-S-SEQ ID NO: 4 ⁶⁸Ga-NODAGA-S-SEQ ID NO: 5, ⁶⁸Ga-NOTA-S-SEQ ID NO: 5, ⁶⁸Ga-DOTA-S-SEQ ID NO: 5, ⁶⁸Ga-DOTA-GA-S-SEQ ID NO: 5, ¹⁸F-NODAGA-S-SEQ ID NO: 5, ¹⁸F-NOTA-S-SEQ ID NO: 5, ¹⁸F-DOTA-S-SEQ ID NO: 5, ¹⁸F-DOTA-GA-S-SEQ ID NO: 5, ⁹⁰Y-NODAGA-S-SEQ ID NO: 5, ⁹⁰Y-NOTA-S-SEQ ID NO: 5, ⁹⁰Y-DOTA-S-SEQ ID NO: 5, ⁹⁰Y-DOTA-GA-S-SEQ ID NO: 5, min-NODAGA-S-SEQ ID NO: 5, min-NOTA-S-SEQ ID NO: 5, min-DOTA-S-SEQ ID NO: 5, min-DOTA-GA-S-SEQ ID NO: 5 ¹⁷⁷Lu-NODAGA-S-SEQ ID NO: 5, ¹⁷⁷Lu-NOTA-S-SEQ ID NO: 5, ¹⁷⁷Lu-DOTA-S-SEQ ID NO: 5, ¹⁷⁷Lu-DOTA-GA-S-SEQ ID NO: 5 ⁶⁸Ga-NODAGA-S-SEQ ID NO: 6,

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 45/116

32/73 ⁶⁸Ga-NOTA-S-SEQ ID NO: 6, ⁶⁸Ga-DOTA-S-SEQ ID NO: 6, ⁶⁸Ga-DOTA-GA-S-SEQ ID NO: 6, ¹⁸F-NODAGA-S-SEQ ID NO: 6, ¹⁸F-NOTA-S-SEQ ID NO: 6, ¹⁸F-DOTA-S-SEQ ID NO: 6, ¹⁸F-DOTA-GA-S-SEQ ID NO: 6, ⁹⁰Y-NODAGA-S-SEQ ID NO: 6, ⁹⁰Y-NOTA-S-SEQ ID NO: 6, ⁹⁰Y-DOTA-S-SEQ ID NO: 6, ⁹⁰Y-DOTA-GA-S-SEQ ID NO: 6, min-NODAGA-S-SEQ ID NO: 6, min-NOTA-S-SEQ ID NO: 6, min-DOTA-S-SEQ ID NO: 6, min-DOTA-GA-S-SEQ ID NO: 6, ¹⁷⁷Lu-NODAGA-S-SEQ ID NO: 6, ¹⁷⁷Lu-NOTA-S-SEQ ID NO: 6, ¹⁷⁷Lu-DOTA-S-SEQ ID NO: 6, ¹⁷⁷Lu-DOTA-GA-S-SEQ ID NO: 6 em que S é um espaçador como definido acima.

[0079] Em uma modalidade particular, os compostos conjugados da invenção podem estar na forma multimérica, isto é, podem compreender várias cópias de um grupo P ou M ou de ambos. Mais especificamente, os compostos conjugados podem compreender uma estrutura M-P-Xi-Pj-Mk em que M e P são como definido acima, X é um agente de reticulação, i é um número inteiro selecionado a partir de 0 ou 1, j é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2, 3, 4 ou 5, e k é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2, 3, 4 ou 5. Em tais estruturas multiméricas, quando i = 0, j e

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 46/116

33/73 k também são tipicamente iguais a 0. Além disso, k pode ser igual a ou abaixo de j . Além disso, em tais estruturas multiméricas, M pode ser ligado a P como definido acima (isto é, diretamente ou usando um quelador e/ou um espaçador).

[0080] Os exemplos particulares de tais compostos multiméricos têm uma estrutura M-P-X-Pj-Mk em que M e P são como definido acima, X é um agente de reticulação, j é 1 e k é 0.

[0081] 0 agente de reticulação X pode ser qualquer grupo de reticulação química compatível para uso na área farmacêutica ou veterinária. 0 grupo é, de preferência, desprovido de atividade biológica e toxicidade. 0 tamanho do agente de reticulação pode ser ajustado pela pessoa versada. Os exemplos preferenciais dos grupos X são plataformas de polilisina ou poliglutâmicas (blocos lineares, ciclizados ou ramificados) ou compostos orgânicos multifuncionais, como PEG(3)-Pentrimer-G 1-(NH2+4xN3)*4HC1 com uma função amino e quatro funções azida. Em uma modalidade particular, o agente de reticulação contém pelo menos dois grupos reativos funcionais, de preferência, pelo menos três, que permitem o acoplamento de pelo menos 2 peptídeos. Os exemplos de grupos reativos funcionais incluem, por exemplo, aminas, ácidos, tióis, azidas, alcinos, carbonilas ou hidrazinas. Os peptídeos podem ser acoplados a X diretamente, por uma ligação covalente com um grupo reativo funcional do agente ou através de um espaçador, que pode ser composto, por exemplo, de uma glicina ou uma série de glicina, uma molécula PEG ou um ácido amino-hexanoico.

[0082] Um exemplos específico de tal composto multimérico da invenção é composto de VHd como representado na Figura

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 47/116

34/73 :

D0TA-PEG2-E(PEG2-SEQ ID NO :1)-PEG2-E(PEG2-SEQ ID NO :1)NH2 .

[0083] A invenção também se refere a qualquer um dos compostos conjugados acima desprovidos de um grupo marcador M. Tais compostos são intermediários na preparação dos compostos conjugados identificados finais. De fato, como mostrado nos exemplos, os conjugados são, em primeiro lugar, preparados e a identificação é realizada de modo subsequente, tipicamente antes da administração. Então, a invenção também se refere a qualquer conjugado como definido acima que é desprovido de Μ. A invenção particularmente se refere a compostos de estrutura C-(S-)nP em que C, S, Pen são definidos e acoplados como definido acima, bem como variantes dos mesmos que compreendem um grupo T e/ou multimeros dos mesmos, como adicionalmente definido acima.

[0084] A invenção também se refere a uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um composto conjugado como definido acima. A composição pode compreender um ou mais diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. [0085] A invenção também se refere a uma composição de diagnóstico caracterizada pelo fato de que compreende um agente de imagiologia médica ou de diagnóstico composto de um composto de conjugado como definido acima.

Uso para imagiologia/diagnóstico [0086] Os conjugados da invenção podem ser usados para identificar, detectar ou diagnosticar cânceres que expressam LDLR in vivo, em qualquer mamífero, particularmente em indivíduos humanos.

[0087] Nesse sentido, em uma modalidade particular, M é

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 48/116

35/73 um radionuclídeo ou corante fluorescente adaptado para uso em conjunto de imagens, e ao método de identificação e/ou detecção compreende:

a) administrar o composto conjugado a um indivíduo,

b) realizar um método de imagiologia, e

c) analisar o sinal obtido na etapa b), em que a presença de um sinal é indicativa da presença de células cancerosas e/ou do estágio de evolução de um câncer no dito indivíduo.

[0088] 0 conjugado pode ser administrado de acordo com várias vias. De preferência, o conjugado é injetado por injeção sistêmica, parenteral ou local. Em particular, a injeção pode ser intravenosa, subcutânea, intramuscular, intra-arterial ou intratumoral. Em uma modalidade particular, o composto conjugado da invenção é injetado por via intravenosa. Tal modo de administração permite a difusão apropriada do composto no organismo e permite alcançar o tecido de interesse. Em uma outra modalidade, a administração é por injeção intratumoral. Tal modo é adequado quando a presença de um tumor é conhecida ou altamente suspeita, e o método é realizado para o estadiamento do tumor, avaliar sua progressão ou a eficácia de um tratamento, por exemplo.

[0089]	A quantidade	de composto administrado	pode	ser
aj ustada	pela pessoa	versada dependendo do propósito	do
método	(imagiologia,	detecção, monitoramento)	e	do
indivíduo	•
[0090]	Os compostos	da invenção podem ser usados	em vários

métodos de imagiologia conhecidos per se na técnica, como, sem limitação, cintilografia, tomografia por emissão de positrons (PET), tomografia computadorizada-tomografia por

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 49/116

36/73 emissão de positrons (PET-CT) ou tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT). Um método preferencial é PET.

[0091] Dependendo do método, o sinal obtido pode ser um valor de marcador quantitativo, uma imagem, uma curva de distribuição, um número de eventos de aniquilação de positron, etc. Na etapa c) , tal sinal é analisado para determinar a presença, estágio ou progressão de um câncer no indivíduo. 0 termo analisar se refere a qualquer método que permite determinar se um sinal corresponde a um sinal normal ou não. As análises não podem ser apenas visuais, mas também envolvem análises quantitativas. As análises podem incluir etapas de comparar o valor de um sinal obtido pelo conjunto de imagens com o valor do sinal de um tecido saudável conhecido do mesmo indivíduo ou de um outro indivíduo. 0 valor do sinal também pode ser comparado a um valor de referência.

[0092] Um valor obtido na etapa b) mais importante que um valor de referência ou um controle de um tecido saudável é indicativo da presença de células cancerosas. 0 estágio de evolução de um câncer pode ser avaliado comparando-se em um mesmo indivíduo um sinal obtido após duas sessões de imagiologia diferentes espaçadas no tempo.

[0093] Os compostos conjugados da invenção são particularmente adaptados para identificação e/ou detecção de células cancerosas que superexpressam LDLR. Nesse sentido, o termo células que superexpressam LDLR se refere a células que expressam pelo menos 10 % mais de LDLR em relação a um nível padrão de expressão. Tipicamente, 1000 a 3000 LDLR estão presentes na superfície de células normais.

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 50/116

37/73

As células que superexpressam LDLR são células que expressam pelo menos 20 % mais de LDLR, mais particularmente, pelo menos 50 %, 75 %, 100 % ou 150 % mais de LDLR.

[0094] Os exemplos específicos de cânceres que superexpressam LDLR que podem ser detectados usando o presente método incluem câncer pancreático, câncer adrenal, glioblastoma, câncer de próstata, câncer de cólon, câncer de fígado, câncer do pâncreas, câncer dos ovários, câncer de pulmão ou câncer de estômago.

Radioterapia [0095] Em um aspecto adicional, a invenção também se refere ao uso dos compostos conjugados da invenção para tratar câncer por radioterapia.

[0096] Os termos tratamento, que trata, tratar e outras expressões similares se referem à obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico, por exemplo, inibição de crescimento de células cancerosas ou ao aprimoramento de óbito de células cancerosas.

[0097] Nesse sentido, o método de tratamento compreende administrar a um indivíduo com necessidade do mesmo um composto conjugado como definido acima.

[0098] De preferência, o composto conjugado compreende um radionuclídeo adequado para radioterapia, como radionuclídeos emissores de beta ou radionuclídeos emissores de gama de alta energia, de preferência, com uma meia-vida longa (por exemplo, entre 1 a 75 dias) . Os radionuclídeos preferenciais para uso em radioterapia são selecionados a partir de 90Y, lllln, 1311 e 177Lu. Em uma modalidade preferencial, 90Y, 177Lu ou lllln são usados.

[0099] 0 conjugado pode ser administrado de acordo com

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 51/116

38/73 várias vias. De preferência, o conjugado é injetado por injeção sistêmica, parenteral ou local. Em particular, a injeção pode ser intravenosa, subcutânea, intramuscular, intra-arterial ou intratumoral. Em uma modalidade particular, o composto conjugado da invenção é injetado por via intravenosa. Tal modo de administração permite a difusão apropriada do composto no organismo e permite alcançar o tecido de interesse. Em uma outra modalidade, a administração é por injeção intratumoral.

[0100] 0 composto deve ser administrado em uma quantidade suficiente para irradiar o tumor. Tal quantidade pode ser ajustada pelo indivíduo versado.

[0101] 0 tratamento pode ser usado em separado ou em combinação com (por exemplo, em alternância ou conjunto com) outras terapias de câncer, como quimioterapia, por exemplo. [0102] 0 método pode ser usado para tratar qualquer câncer que superexpressa LDLR, como câncer pancreático, câncer adrenal, glioblastoma, câncer de próstata, câncer de cólon, câncer de fígado, câncer do pâncreas, câncer dos ovários, câncer de pulmão ou câncer de estômago. 0 mesmo pode ser usado em qualquer estágio de desenvolvimento do câncer, em qualquer indivíduo mamífero, particularmente indivíduos humanos. Tipicamente, vários regimes de tratamento sequencial são realizados. Para uso em terapia, os compostos conjugados da invenção podem estar na forma de quaisquer sais farmaceuticamente aceitáveis. A expressão sais farmaceuticamente aceitáveis se refere a, por exemplo, e de uma maneira não restritiva, base farmaceuticamente aceitável ou sais de adição de ácido, hidratos, ésteres, solvatos, precursores, metabólitos ou estereoisômeros. A expressão

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 52/116

39/73 sais farmaceuticamente aceitáveis se refere a sais não tóxicos, que podem ser geralmente preparados pela reação de uma base livre com um ácidos orgânico ou inorgânico adequado. Esses sais preservam a eficácia biológica e as propriedades de bases livres. Os exemplos representativos de tais sais incluem sais insolúveis em água e solúveis em água, como acetatos, N-metilglucamina amônio, amsonatos (4,4diaminostilbeno-2,2’-dissulfonatos), benzenossulfonatos, benzonatos, bicarbonatos, bissulfatos, bitartratos, boratos, bromidratos, brometos, buriratos, camsilatos, carbonates, hidrocloratos, cloretos, citratos, clavulanatos, dicloridratos, difosfatos, edetatos, edetatos de cálcio, edisilatos, estolates, esilatos, fumarates, gluceptates, gluconates, glutamates, glicolilarsanilatos, hexafluorofosfatos, hexilresorcinatos, hidrabaminas, hidroxinaftoatos, iodidas, isotionatos, lactates, lactobionatos, laurates, malates, maleates, mandelates, mesilates, metilbrometos, metilnitratos, metilsulfatos, mucatos, napsilatos, nitrates, 3-hidroxi-2-naftoatos, oleates, oxalates, palmitates, pamoates (1,1-metileno-bis2-hidroxi-3-naftoatos ou emboatos), pantotenatos, fosfates, picrates, poligalacturonatos, propionates, ptoluenossulfonatos, salicilatos, estearatos, subacetatos, succinates, sulfates, sulfossalicilatos, suramatos, tannates, tartrates, teoclatos, tosilatos, trietiodidas, trifluoroacetatos e valerianates.

[0103] Além disso, os compostos conjugados podem ser formulados com qualquer excipiente, carreador ou diluente farmacêutico adequado. Nesse sentido, a invenção também se refere a composições que compreendem um composto como

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 53/116

40/73 definido acima e um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. O carreador farmaceuticamente aceitável pode ser selecionado a partir dos carreadores classicamente usados de acordo com cada modo de administração. De acordo com o modo de administração previsto, os compostos podem estar na forma sólida, semissólida ou liquida. Para composições sólidas, como comprimidos, pílulas, pós ou grânulos que são livres ou estão incluídos em cápsulas de gelatina, a substância ativa pode ser combinada com: a) diluentes, por exemplo, lactose, dextrose, sacarose, manitol, sorbitol, celulose e/ou glicina; b) lubrificantes, por exemplo, silica, talco, ácido estérico, seu sal de magnésio ou cálcio e/ou polietileno glicol; c) ligantes, por exemplo, silicato de magnésio e alumínio, pasta de amido, gelatina, tragacanto, metilcelulose, carboximetil celulose sódica e/ou polivinilpirrolidona; d) desintegrantes, por exemplo, amido, ágar, ácido algínico ou seu sal de sódio ou misturas efervescentes; e/ou d) absorventes, corantes, agentes saborizantes e adoçantes. Os excipientes podem ser, por exemplo, manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, talco, celulose, glicose, sacarose, carbonato de magnésio e análogos de qualidade farmacêutica. Para composições semissólidas, como supositórios, o excipiente pode, por exemplo, ser uma emulsão ou suspensão oleosa ou à base de polialquileno glicol, como polipropileno glicol. Composições líquidas, em particular injetáveis ou aquelas incluídas em uma cápsula mole, podem ser preparadas, por exemplo, por dissolução, dispersão, etc., da substância ativa em um solvente farmaceuticamente puro como, por

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 54/116

41/73 exemplo, água, solução salina fisiológica, dextrose aquosa, glicerol, etanol, óleo e análogos dos mesmos.

[0104] As composições ou os conjugados da invenção podem ser administrados por qualquer via adequada e, de uma maneira não restritiva, por via parenteral, como, por exemplo, na forma de preparações que podem ser injetadas por via intravenosa, infusão, via subcutânea ou via intramuscular; por via oral (ou per os), como, por exemplo, na forma de comprimidos, cápsulas de gelatina, pós, péletes, suspensões ou soluções orais revestidas ou não revestidas (uma tal forma para administração oral pode ser com liberação imediata ou com liberação atrasada ou estendida); por via retal, como, por exemplo, na forma de supositórios; por via tópica, em particular por via transdérmica, como, por exemplo, na forma de emplastros, pomadas ou géis; por via intranasal, como, por exemplo, na forma de aerossol e aspersão; por via perlingual; ou por via intraocular.

[0105] A invenção também se refere a um método para prepara ou fabricar um composto de conjugado como definido acima, que compreende acoplar um marcador M a um peptídeo P, de preferência, usando um agente quelante C.

[0106] A invenção também se refere a um método para fabricar uma composição farmacêutica, que compreende fornecer um composto de conjugado como definido acima e formular o dito composto com um excipiente ou diluente adequado.

[0107] Outros aspectos e vantagens da presente invenção se tornarão evidentes mediante a consideração dos exemplos abaixo, que são apenas ilustrativos em natureza e que não limitam o escopo do presente pedido.

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 55/116

42/73

EXEMPLOS

Exemplo 1: Expressão de Receptor de LDL (LDLR) em tecidos de camundongo e tecidos humanos.

[0108] A f im de avaliar a expressão de LDLR de membrana em linhagens celulares humanas e de camundongo de interesse, o Kit de Extração de Proteoma Subcelular ProteoExtract (Calbiochem, La Jolla, CA, EUA) foi usado para preparar extratos de membrana de linhagens celulares cancerosas humanas e de camundongo.

[0109] Os extratos de membrana foram quantificados usando o Ensaio de Proteína DC da BioRad (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) seguindo as instruções do fabricante. Em primeiro lugar, 10 pg ou 20 pg de proteínas celulares membranares foram separados por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) em 4-12 % de géis de poliacrilamida e transferidos em membranas de nitrocelulose (Amersham Bio sciences). As membranas foram sondadas com um anticorpo anti-LDLR de cabra (R&D Systems, (1/500)), seguido por um anticorpo secundário anti-cabra peroxidase de asno conjugado (Jackson Immunoresearch). Por fim, as proteínas foram detectadas usando quimioluminescência.

[0110] Como mostrado na Figura 1 A, a expressão de LDLR é melhorada em adrenal (NCI-H295R), glioblastoma (U87MG), câncer de mama (MDA-MB-231) e em células cancerosas humanas de próstata (PC3). CH095 (células de Ovário de Hamster Chinês Manipuladas que expressam estavelmente hLDLR fusionado a GFP (hLDLR-GFP) são usadas como um controle positivo. Em células cancerosas pancreáticas humanas (Capan, BxPC3 e Panei), o nível de LDLR é variável. Em outros tipos celulares, como Hela (Câncer de Cérvice) ou células cancerosas de mama MCF7,

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 56/116

43/73 os níveis de expressão de LDLR são muito baixos, quase indetectáveis. A expressão de LDLR é melhorada em uma linhagem celular pancreática de camundongo PK4A (derivada de um camundongo que desenvolve tumores espontâneos no pâncreas) em comparação ao tecido pancreático normal.

Exemplo 2: Síntese de conjugados de alvejamento de LDLR fluorescentes: conjugado A, conjugado B, conjugado C e conjugado D.

[0111] Nos exemplos a seguir, a produção e os usos de conjugados A, B, C, e D são revelados. 0 conjugados A, B, C e D contêm, respectivamente, peptídeos A (SEQ ID NO: 1), B (SEQ ID NO: 13), C (SEQ ID NO: 6), e D (SEQ ID NO: 14), como mostrado abaixo.

Composto	Composição
Conjugado A	Fc-peptídeo A-A680
Conjugado B	Fc-peptídeo B-A680
Conjugado C	Fc-peptídeo C-A680
Conjugado D	Fc-peptídeo D-A680

Produção de proteína de fusão de conjugado C e conjugado D [0112] Os peptídeos C e D foram clonados em fusão com o fragmento Fc de uma IgGl.

[0113] A f im de produzir o fragmento Fc fusionado ao peptídeo C ou D, um construto de plasmídeo foi gerado com base no plasmídeo pINFUSE h!gGl-Fc2 (InvivoGen) que foi usado como modelo. Megainiciadores chamados de iniciador C ou iniciador D foram sintetizados por PCR usando os oligonucleotídeos:

- Iniciador direto:

CTTGGCATTATGCACCTCCA (SEQ ID NO: 10)

- Iniciador inverso que contém a sequência que codifica o

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 57/116

44/73 peptideo C:

CTGGCCAGCTAGCACTCAGCAACCGCGAAGACGAGGCATACAAGCACCTTTACCCGGAG

ACAGGGAG (SEQ ID NO: 11).

- Iniciador inverso que contém a sequência que codifica o peptideo D:

CTGGCCAGCTAGCACTCGCAGGGTCTGCCCAGCATTCTGCAAGCACCTTTAC

CCGGAGACAGGGAG (SEQ ID NO: 12).

[0114] 0 produto da reação de PCR foi purificado, digerido com Dpnl (enzima que digere o DNA metilado parental) e usado como um megainiciador em uma segunda reação de PCR realizada com o plasmídeo pINFUSE h!gGl-Fc2 usado como matriz usando o Kit de Mutagênese de Sítio Dirigido de QuickChange II (Agilent). Após a transformação de bactéria competente, colônias isoladas foram obtidas, DNA de plasmídeo foi preparado e o construto de cDNA foi sequenciado em ambas as fitas para verificação. Os vetores chamados de pConjugado-C e pConjugado-D permitem a expressão do fragmento Fc fusionado na terminação C com peptídeos C e D após a transfecção de células de mamífero. 0 sistema de expressão Expi293 (Thermo Fischer) foi usado para a expressão transiente de conjugados C e D de proteína de fusão em sobrenadantes de cultura. Após 72 horas de transfecção, sobrenadantes foram recuperados e purificados usando o kit PROSEP A de proteína A de anticorpo de Montage (Millipore) de acordo com as recomendações do fabricante .

Síntese de proteína de Conjugado A e Conjugado B:

[0115] Conjugação de peptídeos A e B para o fragmento Fc de IgGl humana (Merck Millipore) foi realizada usando o sulfo-SMCC de espaçador heterobifuncional (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EUA) de um modo em duas etapas.

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 58/116

45/73

Em primeiro lugar, permitiu-se que o fragmento Fc reagisse com sulfo-SMCC para obter uma proteína reativa contra frações de tiol; em uma segunda etapa, peptídeos A ou B funcionalizados em tiol foram conjugados para a proteína FcSMCC ligada à lisina.

Síntese de peptídeos funcionalizados em tiol [0116] As sequências de aminoácidos de peptídeo A e peptídeo B são respectivamente cMThzRLRGPen (SEQ ID NO: 1) e cRPLGRMC (SEQ ID NO: 13) em que Thz se refere a tiazolidina e Pen a penicilamina.

[0117] Os aminoácidos Ν-α-Fmoc-protegidos foram escolhidos com proteções de cadeia lateral ortogonal padrão: Fmoc-Cys(Trt)-OH (na configuração D ou L) , Fmoc-Pen(Trt)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Thz-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Leu-OH e Fmoc-Gly-OH. Os mesmos foram todos adquiridos junto a Iris Biotech, bem como Piperidina, Ácido trifluoroacético (TEA), Di-isopropiletilamina (DIEA), Etaneditiol (EDT), Tri-isopropilsilano (TIS), Hexafluorofosfato de benzotriazol-l-iloxitripirrolidinofosfônio (PyBop), Hexafluorofosfato de 1[bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3 -triazolo[4,5β]piridínio-3-óxido (HATU) e Cloridrato de 2-tritiltio-letilamina (Trt-cisteamina).

[0118] Dimetilformamida (DMF), anidrido propiônico, AcOH, K3[Fe(CN)6], carbonato de amônio e diclorometano (DCM) foram adquiridos junto a Sigma-Aldrich.

[0119] Tanto Pr-peptídeo A-G-CH2-CH2-SH quanto Prpeptídeo B-G-CH2-CH2-SH foram sintetizados por método de síntese de peptídeo de fase sólida (SPPS) usando uma estratégia Fmoc/tBu e uma Resina Fmoc-Gly-Wang (100-200

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 59/116

46/73 mesh, 1 % de DVB, carregamento de 0,7 mmol/g) adquirido junto a Iris Biotech. Tal resina permite a síntese de peptídeos completamente desprotegida em suas cadeias laterais e tem um ácido carboxílico livre em suas terminações C. Um resíduo Gly foi inserido na posição C-ter para permitir a funcionalização enquanto evita a racemização.

[0120] A síntese de peptídeo foi realizada em sintetizador de micro-onda da Liberty™ (CEM) para sequências cMThzRLRGPen e cRPLGRMC.

[0121] Para síntese automatizada, os aminoácidos foram acoplados através de ativação de micro-onda da função de ácido do aminoácido n+1 usando aa/DIEA/HATU: 4/4/8 (em relação à resina) em uma síntese de escala de 0,25 mmol. 0 tempo de acoplamento foi ajustado para 10 min. Os acoplamentos duplos foram necessários para aminoácidos introduzidos após resíduos de Tiazolidina ou Prolina. A desproteção do grupo Fmoc de um novo aminoácido então acoplado foi executada usando 20 % de piperidina em DMF. O último aminoácido acoplado durante o alongamento de peptídeo foi desprotegido e N-propionilado usando anidrido propriônico (2*5min Pr2O/DCM: 1/1).

[0122] Os peptídeos ligados à resina foram, então, clivados usando uma solução compreendida de TFA/TIS/H2O/EDT: 94/2/2/2 por pelo menos 2 horas à temperatura ambiente (TA). Um mínimo de 15 ml de solução de divagem foi usado por grama de resina. Os peptídeos brutos foram, então, precipitados usando éter gelado, centrifugados a 3000 rpm por 8 min e liofilizados em H2O/0,l % de TEA. Os sólidos brancos foram obtidos e presos na etapa de ciclização sem qualquer purificação adicional.

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 60/116

47/73 [0123] As pontes dissulfeto foram obtidas por ciclização intramolecular de duas funções tiol de dois Cys ou Pen adequadamente obtidos, na configuração L ou D. PrcMThzRLRGPen-G-OH e Pr-cRPLGRMC-G-OH bruto foram dissolvidos em AcOH 0,5 % para obter uma concentração final de 0,5 mg/ml. O carbonato de amônio (2 N) foi adicionado às soluções de peptídeo para alcançar um pH básico aproximado de 8-9. IG[Fe(CN)6] (0,01 N) foi, então, adicionado às misturas de reação até que uma cor amarelo persistente e brilhante fosse observada. O monitoramento das reações foi realizado por RPHPLC analítica. Usualmente, as reações foram quantitativas em menos que 30 min. As misturas de reação foram filtradas em uma membrana de 0,45 pm e purificadas por RP-HPLC preparativa. As frações com purezas acima de 95 % foram coletadas e liofilizadas para gerar pós brancos puros (pureza final > 95 %) . A homogeneidade e identidade dos peptídeos sintéticos puros foram avaliadas por RP-HPLC analítica. Os peptídeos foram satisfatoriamente verificados para identidade por espectrometria de massa de ESI em LCQ Fleet (ThermoFisher) usado em modo positivo.

[0124] A funcionalização de tiol de Pr-peptídeo B-G-OH e Pr-peptídeo A-G-OH foi realizada em suas terminações C usando cisteamina através de: i) ativação do primeiro resíduo Gly com PyBop/DIEA em DMF e reação com cloridrato de 2-tritiltio1-etilamina (Trt-cisteamina) e ii) remoção de proteções de cisteamina tritil em condições ácidas (DCM/TIS/TFA: 3/1/1). Conjugação química de Pr-peptídeo A-G-CH2-CH2-SH e Prpeptídeo B-G-CH2-CH2-SH para o fragmento Fc [0125] Em uma primeira etapa, peptídeos A e B foram funcionalizados com um espaçador sulfo-SMCC: Foi permitido

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 61/116

48/73 que o peptídeo A-SMCC e o peptídeo B-SMCC reagissem com as aminas primárias de um fragmento Fc humano (AG 714-Millipore) usando um excesso molar de 25 peptídeos por Fc. A reação incubada à temperatura ambiente (TA) por 1 hora em tampão de PBS. Para remover os peptídeos em excesso, a mistura foi, então, purificada em Colunas de Dessalinização de Dextrano de Pierce™ (Pierce). As concentrações de conjugado de Fcpeptídeo A e Fc-peptídeo B foram determinadas usando um ensaio ELISA anti-Fc.

Síntese química de conjugados A, B, C e D [0126] Para conjugar Alexa680™ de fluoróforo (A680 excitação: 679 nm; emissão:702 nm) para Fc-peptídeo A, Fcpeptídeo B, Fc-peptídeo C e Fc-peptídeo D, o Kit de Etiquetagem de Anticorpo Rápido de SAIVI™ (S30045ThermoFicher) foi usado. Esse kit é projetado para identificar os anticorpos com um grau ideal de identificação (DOE, razão entre corante e proteína) para aplicações de imagiologia ín vivo (DOE, de cerca de 2) . DOE de cada conjugado (consulte a tabela I) podem ser determinadas por espectroscopia de absorção fazendo uso da lei de FambertBeer: Absorbância (A) = coeficiente de extinção (ε) χ concentração molar χ comprimento da trajetória (d) . O espectro UV-VIS da solução de conjugado é medido. Determinação da absorbância (Amax) na máxima de absorção (Àabs) do corante e da absorbância (A280) em 280 nm (máxima de absorção de proteínas) gera acesso à concentração de corante ligado gerado por c(corante) = Amax / emax χ d, em que emax é o coeficiente de extinção do corante na máxima de absorção e para a concentração de proteína da mesma maneira a partir de sua absorbância em 280 nm: c(proteína) = Aprot

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 62/116

49/73 / eprotx d, em que eprot é o coeficiente de extinção da proteína em 280 nm. DOF é, então, calculado da seguinte forma: DOF = [Amax / smax] / [Aprot / eprot].

Nome de conjugado	DOL
Conjugado A	1,3
Conjugado B	1,5
Conjugado C	1,3
Conjugado D	1, 8

Tabela I: DOL de conjugados

As concentrações de conjugados A, B, C e D foram determinadas usando um ensaio ELISA anti-Fc.

Exemplo 3: Determinação de Ressonância de Plasma de

Superfície	(SPR) de afinidade de Conjugado A, B, C e D (K_D)
para LDLR.	Propriedades de ligação/endocitose de conjugados
para h/m	LDLR estavelmente expressado por células CHO e

linhagens celulares cancerosas.

Afinidade (Kp) de conjugados para LDLR [0127] LDLR humano recombinante (His-etiquetado) foi adquirido junto a

Biological (Beijing, China). A interação de conjugados com LDLR foi testada a 25 °C usando um Biacore T200 (GE

Healthcare) e 50 mM de HEPES-NaOH pH

7,4, 150 mM de NaCl,

0,005 % de Tween-20, 50 μΜ de EDTA como tampão em execução.

hLDLR foi imobilizado em um chip de sensor de densidade

NiHC (Xantec, Dusseldorf, Alemanha) em uma de 35-60 fmol/mm². A ligação de conjugados a células de fluxo revestidas com LDLR foi corrigida para ligação não específica para células de fluxo não revestidas. O método cinético de ciclo único foi usado para medir a afinidade de ligantes com LDLR. Os ligantes foram diluídos

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 63/116

50/73 em tampão em execução e injetados sequencialmente 2 minutos a 30 μΐ/min usando concentrações crescentes. As injeções de execução virgens de tampão em execução foram realizadas nas mesmas condições antes da injeção de ligante. Os sensorgramas de subtração dupla foram globalmente ajustados com o modelo de ligação de Langmuir de 1:1 de Avaliação de Biacore T200 versão 2.0. Kd_s são resumidos na seguinte tabela II:

Nome de conj ugado/ID	kon (M ⁷s ⁷)	kof f (s ⁷)	K_D (pM)
Conjugado A	1,20E+06	1,38E-04	115
Conjugado B	Sem ligação
Conjugado C	2,89E+05	2,44E-04	835
Conjugado D	Sem ligação

Tabela 11: Afinidade de conjugados A, B, C e D para

LDLR humano.

Ligação/endocitose de conjugados fluorescentes por células que expressam LDLR [0128] Para avaliar a capacidade de os conjugados com afinidade para h/mlDLR-GFP (conjugados A e C) e conjugados de controle (conjugados B e D) serem endocitados pelo LDLR, experimentos imunocitoquímicos que envolvem a incubação de todos os conjugados em células vivas de hLDLR-GFP foram realizados durante 1 hora a 37 °C seguido de análise de microscopia confocal.

[0129] Nesses experimentos, em relação à Figura 2, o sinal de LDLR-GFP é visualizado na coluna 2, o sinal de conjugado é diretamente visualizado na coluna 4 usando a fluorescência A680 ou na coluna 3 usando um anticorpo secundário conjugado anti-hFc-A594. Os núcleos celulares foram manchados de azul com Hoechst e seu sinal pode ser visualizado na coluna 1. A

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 64/116

51/73 coidentificação de LDLR-GFP e conjugados pode ser visualizada como um sinal destacado na coluna 5 na imagem de mesclagem. Os resultados obtidos indicam que os conjugados A e 0 se ligam a e são endocitados por células CHO-hLDLR-GFP enquanto os conjugados de controle B ou D não são.

Exemplo 4: Quantificação de ELISA da distribuição de conjugados de alvejamento de LDLR injetados i.v em camundongos com câncer ou não exposto a câncer.

[0130] As células PK4A de adenocarcinoma pancreático de camundongo foram obtidas a partir de S. Vasseur (Inserm U1068, Cellular Stress) e anteriormente descrito (Guillaumond F et al. 2013 Proc Natl Acad Sei USA 110(10):3919-3924). As células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 pg/ml), soro fetal bovino (10 % de Gold Serum, InVitrogen) e incubadas a 37 °C em uma atmosfera que contém 5 % de CO2. As células foram usadas para indução de tumor. Os xenoenxertos de tumor PK4A foram induzidos em Hsd de 4 semanas de idade: Camundongo macho sem pelo atimico-sem pelo Foxnlnu obtido a partir de Envigo (Harlan, Indianapolis, IN, EUA) por injeção subeutânea entre os ombros de 1* 10⁶células suspensas em 150 μΐ de meio completo. O tamanho de tumor foi visualmente avaliado em dias alternados e os animais foram usados para experimentos de imagiologia ín vivo. Uma vez que o volume de tumor subeutâneo PK4A alcançou aproximadamente 700-1500 mm³ de tamanho (10 a 14 dias pósimplantação), os camundongos com tumor foram injetados na veia da cauda com 5 nmols de conjugados. Após 2 horas para os conjugados A e B, e 4 horas para os conjugados C e D,

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 65/116

52/73 sangue total foi coletado em tubos heparinizados (Sigma Aldrich) e o plasma foi isolado após 15 min de centrifugação a 5000 g. Os camundongos foram, então, perfundidos com PBS IX em uma taxa de 2 ml/min por 10 min. Os órgãos foram extraídos, pesados e homogenizados em PBS/0,1 % de Triton (Sigma Aldrich) em PBS que contém um coquetel de inibidor de protease (Sigma Aldrich). Os homogenates de órgão foram congelados a -80 °C por 12 horas antes da sonicação 3 χ 10 sea clarificação dos lisatos de tecido foi realizada por centrifugação por 15 min a 20000 g. As concentrações de Fc nos sobrenadantes isolados foram medidas com uma ELISA antiFc. Os resultados na Figura 3 mostram um acúmulo de 40 vezes de conjugado A e acúmulo de 30 vezes de conjugado C em tumor pancreático vs pâncreas. O acúmulo no rim é mostrado como controle.

Exemplo 5: Biodistribuição de conjugado C e seu conjugado D de contraparte controlada em pâncreas saudável e tumor pancreático.

[0131] Os camundongos com tumor foram injetados por via intravenosa com 5 nmol de conjugado C, juntamente com conjugado D como um controle (n = 5). A imagiologia de corpo total por fluorescência foi monitorada a 15 min, 30 min, 60 min e 120 min após a injeção IV. O pâncreas, fígado e tecidos de tumor foram coletados no final do experimento (4 h após injeção de IV das moléculas), e fluorescência ex-vivo foi medida. A Figura 4 mostra que o conjugado C se acumula significativamente no tumor pancreático, em comparação ao conjugado controlado D. Além disso, esse acúmulo foi específico para o tumor pancreático visto que nenhum acúmulo foi observado no tecido pancreático saudável.

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 66/116

53/73

Exemplo 6: Síntese de NODAGA-SEQ IP NO: 1-NH₂, DOTA-SEQ IP NO: I-NH2, NODAGA-βΑ1Η-ΡΕΰ12-SEQ IP NO: 1-NH₂, ΡΟΤΑ-βΑΙπPEG12-SEQ ID NO: I-NH2 e seu respectivo controle escalável NODAGA-βΑ13-ΡΕ012-SEQ IP NO: 13 -NH₂ e DOTA^Ala-PEG12-SEQ ID NO: I4-NH2.

[0132] Nos exemplos a seguir, ⁶⁸Ga-CH44 é usado como uma abreviatura para ⁶⁸Ga-NODAGA-pAla-PEG12-SEQ ID NO: I-NH2, ⁶⁸Ga-FG77 0 é usado como uma abreviatura para ⁶⁸Ga-DOTA-pAlaPEG12-SEQ ID NO: I-NH2, ⁶⁸Ga-CH40 é usado como uma abreviatura para ⁶⁸Ga-NODAGA-pAla-PEG12-SEQ ID NO: 13-NH2, e ⁶⁸Ga-FG7 69 é usado como uma abreviatura para ⁶⁸Ga-DOTA-pAlaPEG12-SEQ ID NO: 13-NH2.

Abreviatura	Composto
⁶⁸Ga-CH44	⁶⁸Ga-NODAGA-3Ala-PEG12-SEQ ID NO: 1-NH₂
⁶⁸Ga-CH40	⁶⁸Ga-NODAGA-3Ala-PEG12-SEQ ID NO: 13- nh₂
⁶⁸Ga-FG770	⁶⁸Ga-DOTA-pAla-PEG12-SEQ ID NO: 1-NH₂
⁸Ga-FG769	⁶⁸Ga-DOTA-3Ala-PEG12-SEQ ID NO: 13-NH₂

[0133] Dois tipos de grades quelantes foram conjugados para vetores de peptídeo de alvejamento de LDLR:

- NODAGA (ácido 1,4,7-triazaciclononana-l-ácido glutárico4,7-diacético) permite a síntese de conjugados radioidentifiçados para imagiologia;

DOTA (ácido tetra-azaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético) foi introduzido para a preparação de conjugados radioidentifiçados com um potencial para radioterapia.

[0134] A NOTA macrocíclica (ácido 1,4,7triazaciclononano-1,4,7-triacético) e NODAGA são os ligantes mais favoráveis para a quelação de ⁶⁸Gálio que é um radiotraçador comumente usado. Dentre esses ligantes, NODAGA foi escolhido como a grade quelante a que contém uma fração

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 67/116

54/73 de acoplamento adicional em comparação a NOTA. Isso garante que todos os ácidos carboxilicos sejam disponíveis para saturar a coordenação de hexadentato.

[0135] Para radioterapia, lllíndio, 177Lu ou 90Ítrio são clinicamente usados. Tais radiometais se ajustam bem em queladores macrocíclicos de DOTA com os quais formam complexos termodinâmica e cineticamente estáveis. De fato, DOTA fornece oito átomos de doador e o tamanho de cavidade apropriado para formar complexos mais estáveis com esses radionuclídeos.

[0136] Tanto os derivados de NODAGA quanto de DOTA foram preparados para desenvolver agentes de imagiologia e a radioterapia mediada por receptor tem capacidade para alvejar preferencialmente cânceres que expressam LDLR.

[0137] Diferentes construtos foram projetados e preparados para avaliar a posição e a distância do quelador macrocíclico conjugado para os vetores de peptídeo: o agente quelante foi conjugado para a terminação C, a terminação N ou para a cadeia lateral de amino de uma lisina adicionalmente introduzida na sequência de vetor de peptídeo. Todos os derivados sempre se ligam ao receptoralvo de LDL como avaliado por análise de SPR em LDLR purificado. Foi, então, escolhido o construto que porta o agente quelante na terminação N visto que essa via de síntese é mais fácil de configurar.

[0138] A Figura 5 representa o esquema de reação para a síntese de conjugados de grade-ligante-peptídeo-NH2. No presente esquema, o exemplo da síntese de NODAGA-pAla-PEG12SEQ ID NO: 1-NH2 é mostrado.

[0139] Os reagentes e condições da reação de síntese são

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 68/116

55/73 da seguinte forma com referência à Figura 5:

- etapa A: AA (4 equivalentes (eq) ) , HATU (4 eq) , DIEA (8 eq), DMF, ativação de micro-onda;

- etapa b: Fmoc-PEG12-OH (1,5 eq), DIG (4 eq), HOBt (2 eq) , DMF, Temperatura Ambiente (TA), 24h;

- etapa c: Fmoc-(β)Ala-OH (3 eq), COMU (3 eq), DIEA (8 eq), DMF, TA, 3h;

etapa d: DMF/piperidina (20 %) 15 min, TFA/TIS/H2O/EDT (94/2/2/2), TA, 2 h;

- etapa e: AcOH (0,5 %), (NH₄)₂CO₃, K₃Fe (CN) ₆, pH= 7-8, [peptideo]=1 mg/ml;

- etapa f: NODAGA-NHS (2 eq), DIEA (10 eq), DMF, TA, 30 min. [0140] Métodos analíticos e de purificação:

Monitoramento de pureza e progresso de reação foram executados em um sistema Thermo Fisher UltiMate® 3000 equipado com um C18 KinetexTM (5 pm, 150 mm x 4,6 mm) . A detecção foi feita em 214 nm. O sistema de eluição foi composto de H2O/0,l % de TEA (solução A) e MeCN/0,1 % de TEA (solução B) . A taxa de fluxo foi 2 ml/min com um gradiente de 0-100 % de solução B em 4 min.

- Os produtos brutos foram purificados por RP-HPLC em um sistema Thermo Fisher UltiMate® 3000 equipado com um C18 LunaTM (5 pm, 100 mm x 21,2 mm) . A detecção foi feita em 214 nm. O sistema de eluição foi composto de H2O/0,l % de TEA (solução A) e MeCN/0,1 % de TEA (solução B). A taxa de fluxo foi 20 mF/min.

Síntese de H-SEQ ID NO: 1-NH2, H~3Ala-PEG12-SEQ ID NO: 1-NH2 e H-3Ala-PEG12-SEQ ID NO: 13-NH2:

[0141] Os aminoácidos Ν-α-Fmoc-protegidos foram escolhidos com proteções de cadeia lateral ortogonal padrão:

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 69/116

56/73

Fmoc-Cys(Trt)-OH (em configuração D ou L) , Fmoc-Pen(Trt)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Thz-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-pALa-OH e Fmoc-Gly-OH. Os mesmos foram todos adquiridos junto a Iris Biotech, bem como Piperidina, Ácido trifluoroacético (TFA), Di-isopropiletilamina (DIEA), Etaneditiol (EDT), Tri-isopropilsilano (TIS), hexafluorofosfato de l-ciano-2-etoxi-2-oxoetilidenaminooxi) dimetilamino-morfolino-carbénio (COMU),

Hexafluorofosfato de l-[bis(dimetilamino)metileno]-lH1,2,3-triazol[4,5-β]piridínio-3-óxido (HATU), N,N'-Diisopropilcarbodi-imida (DIC) e 1-Hidroxibenzotriazol.

[0142] Dimetilformamida (DMF) e Diclorometano (DOM) foram adquiridos junto a Sigma-Aldrich.

[0143] Ácido Fmoc-2l-amino-4,7,10,13, 16, 19hexaoxaenoicosanoico (Fmoc-PEG12-OH) foi adquirido junto a PolyPeptide Laboratories.

[0144] Conjugados H-SEQ ID NO: 1-NH2, H-pAla-PEG12-SEQ ID NO: 1-NH2 e H-pAla-PEG12-SEQ ID NO: 13-NH2 foram sintetizados por método de síntese de peptídeo de fase sólida (SPPS) usando uma estratégia de Fmoc/tBu e uma Resina Amida FmocRink (100-200 mesh, 1 % de DVB, carregamento 0,7 mmol/g) adquiridos junto a Iris Biotech. Tal resine permite a síntese de peptídeos completamente desprotegidos em suas cadeias laterais e que têm uma amida de terminal 0.

[0145] A síntese de peptídeo foi realizada em um sintetizador de micro-onda de Liberty™ (CEM) para sequências cMThzRLRGPen (SEQ ID NO: 1) e cRPLGRMC (SEQ ID NO: 13) enquanto os ligantes Fmoc-pAla-OH e Fmoc-PEG12-OH foram acoplados manualmente, quando considerados.

[0146] Para síntese automatizada, os aminoácidos foram

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 70/116

57/73 acoplados através de ativação de micro-onda da função de ácido do aminoácido n+1 usando aa/DIEA/HATU: 4/4/8 (em relação à resina) em uma síntese de escala de 0,25 mmol. O tempo de acoplamento foi ajustado para 10 min. Os acoplamentos duplos foram necessários para aminoácidos introduzidos após resíduos de Tiazolidina ou Prolina. A desproteção do grupo Fmoc de um novo aminoácido então acoplado foi executada usando 20 % de piperidina em DMF. O último aminoácido acoplado durante o alongamento de peptídeo foi desprotegido para permitir o acoplamento adicional na terminação N. Para as sequências com um ligante introduzido entre a grade e o vetor de peptídeo, Fmoc-PEG12-OH foi, então, introduzido manualmente usando aa/DIC/HOBt: 1,5/4/2 (em relação à resine) . A reação foi realizada durante a noite à temperatura ambiente. Um teste de TNBS permitiu monitorar a eficiência de acoplamento. Após a desproteção de Fmoc com uma solução de Piperidina/DMF (20 %, 3*5min), Fmoc-pALa-OH foi, por fim, conjugado para a terminação N livre usando aa/DIEA/COMU: 3/8/3 por 3 h à temperatura ambiente. Um teste de TNBS permitiu monitorar a eficiência de acoplamento e Fmoc foi removido com uma solução de piperidina de 20 % em DMF (3*5min).

[0147] Os peptídeos ligados à resina foram clivados usando uma solução compreendida de TFA/TIS/H2O/EDT: 94/2/2/2 por pelo menos 2 horas à temperatura ambiente (TA) . Um mínimo de 15 ml de solução de divagem foi usado por grama de resina. Os peptídeos brutos foram, então, precipitados usando éter gelado, centrifugados a 3000 rpm por 8 min e liofilizados em H2O/0,l % de TEA. Os sólidos brancos foram obtidos e presos na próxima etapa sem qualquer purificação

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 71/116

58/73 adicional.

Ciclização de conjugados H-SEQ IP NO: 1-NH₂, H-pAla-PEG12SEQ IP NO: 1-NH₂ e H-pAla-PEG12-SEQ IP NO: 13-NH₂:

[0148] As pontes dissulfeto foram obtidas por ciclização intramolecular de duas funções tiol de dois Cys ou Pen adequadamente protegidos, em configuração L ou D. AcOH, K3[Fe(CN)6] e carbonato de amônio foram adquiridos junto a Sigma-Aldrich. H bruto-SEQ ID NO: 1-NH₂, H-3Ala-PEG12-SEQ ID NO: 1-NH₂ e H-pAla-PEG12-SEQ ID NO: 13-NH₂ conjugados foram dissolvidos em AcOH 0,5 % para obter uma concentração final de 0,5 mg/ml. O carbonato de amônio (2 N) foi adicionado às soluções de peptídeo para alcançar um pH básico aproximado de 8-9. K3[Fe(CN)6] (0,01N) foi, então, adicionado às misturas de reação até que uma cor amarelo persistente e brilhante fosse observada. O monitoramento das reações foi realizado por RP-HPLC analítica. Usualmente, as reações foram quantitativas em menos que 30 min. As misturas de reação foram filtradas em uma membrana de 0,45 pm e purificadas por RP-HPLC preparativa. As frações com purezas acima de 95 % foram coletadas e liofilizadas para gerar pós brancos puros (pureza final > 95 %) . A homogeneidade e identidade dos peptídeos sintéticos puros foram avaliadas por RP-HPLC analítica. Os peptídeos foram satisfatoriamente verificados para identidade por espectrometria de massa de ESI em LCQ Fleet (ThermoFisher) usado em modo positivo.

Conjugação de NODAGA e DOTA para H-SEQ IP NO: 1-NH₂, H-pAlaPEG12-SEQ ID NO: 1-NH2 e H-pAla-PEG12-SEQ ID NO: 13-NH2:

[0149] Os queladores foram conjugados para os peptídeos usando os ésteres ativados de NODAGA mono-Nhidroxissuccinimida (NODAGA-NHS) e DOTA mono-N

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 72/116

59/73 hidroxissuccinimida (DOTA-NHS).

[0150] NODAGA-NHS e DOTA-NHS foram obtidos a partir de Chematech (Dijon, França).

[0151] A uma solução de peptídeo em DMF (1,2 mM) foi adicionado o agente quelante (4 eq) e DIEA (10 eq). Permitiuse que a mistura de reação fosse agitada à temperatura ambiente. 0 monitoramento da reação por RP-HPLC analítica avaliou que a reação foi quantitativa. As misturas de reação foram filtradas em uma membrana de 0,45 pm e purificadas por RP-HPLC preparativa. As frações com purezas acima de 95 % foram coletadas e liofilizadas para gerar pós brancos puros (pureza final > 95 %) . A homogeneidade e identidade dos peptídeos sintéticos puros foram avaliadas por RP-HPLC analítica. Os peptídeos foram satisfatoriamente verificados para identidade por espectrometria de massa de ESI em LCQ Fleet (ThermoFisher) usado em modo positivo.

Exemplo 7: Determinação de Ressonância de Plasma de Superfície (SPR) de afinidade de MG04/VH-DQ35, CH44, FG770, CH40 e FG769 (K_D) para LDLR.

Afinidade (Kp) de conjugados para FDLR [0152] LDLR humano recombinante (His-etiquetado) foi adquirido junto a Sino Biological (Beijing, China). A interação de conjugados com LDLR foi testada a 25 °C usando um Biacore T200 (GE Healthcare) e 50 mM de HEPES-NaOH pH 7,4, 150 mM de NaCl, 0,005 % de Tween-20, 50 μΜ de EDTA como tampão em execução. hLDLR foi imobilizado em um chip de sensor de NiHC (Xantec, Dusseldorf, Alemanha) em uma densidade de 35-60 fmol/mm². A ligação de conjugados a células de fluxo revestidas com LDLR foi corrigida para ligação não específica para células de fluxo não revestidas.

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 73/116

60/73

O método cinético de ciclo único foi usado para medir a afinidade de ligantes com LDLR. Os ligantes foram diluídos em tampão em execução e injetados sequencialmente 2 minutos a 30 μΐ/min usando concentrações crescentes. As injeções de execução virgens de tampão em execução foram realizadas nas mesmas condições antes da injeção de ligante. Os sensorgramas de subtração dupla foram globalmente ajustados com o modelo de ligação de Langmuir de 1:1 de Avaliação de Biacore T200 versão 2.0. Kd_s são resumidos na seguinte tabela II:

Nome de conjugado/ID	kon (M¹V¹)	kof f (s ⁷)	K_D (M)
CH44	2,84E+06	6,73E-02	23,7
CH4 0	Sem	Ligação
FG7 7 0	3,72E+05	4,01E-02	108
FG769	Sem	Ligação
MG04 ou VH-DO35	3,72E+06	5,59E-02	16,6

Tabela 11: Afinidade para LDLR de conjugados CH40, FG769, CH44, FG770 e MG04.

Exemplo 8: Imagiologia de PET de ⁶⁸Ga-CH44 e sua contraparte controlada ⁶⁸Ga-CH40 em um modelo de camundongo subcutâneo de tumor de glândula adrenal.

[0153] 0 objetivo nesse exemplo consistiu no uso de Varredura de PET para avaliar a biodistribuição de um conjugado gue alveja o LDLR (⁶⁸Ga-CH44) e sua contraparte controlada (⁶⁸Ga-CH40) seguindo a administração intravenosa para camundongos implantados com câncer adrenal (modelo de xenoenxerto). ¹⁸F-FDG foi usado como controle.

Materiais

Radioidentificação [0154] CH44 e CH40 foram radioidentifiçados usando cloreto de 68Ga. O gálio foi obtido na forma 68Ga3+ usando um gerador 68Ge/68Ga baseado em TiO2 comercial (Obninsk).

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 74/116

61/73

Uma reação de radioidentificação foi conduzida pela reação de 20 pg de NODAGA-CH44 e 40 pg NODAGA-CH40 com 74-148 MBq (2-4 mCi) de 68Ga em 200 pl de tampão de acetato de amônio (4 M, pH 6) a 25 °C por 15 minutos.

[0155] A atividade específica obtida para ^{* 68}Ga-CH44 e ⁶⁸GaCH40 foi 12,5 Bq/mmol e 5,5 Bq/mmol respectivamente.

Implantação de tumor [0156] Estudos em animais foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo comitê de ética Aix-Marseille (Comitê 14) . Camundongos macho sem pelo BAFB/c de quatro semanas de idade foram obtidos a partir de Charles River Inc. Os camundongos foram implantados por via subcutânea nos flancos superiores com células NCI-H295R (7><10⁶) em 150 pF de meio completo que contém 50 % de Matrigel (Coming) . Os camundongos foram usados para experimentos de imagiologia quando os tumores alcançaram um volume compreendido entre 700-1500 mm³.

Projeto experimental, dose e via de administração [0157] Os animais receberam a substância de teste por bolo único intravenoso na dose de 10± 4 MBq de 68Ga-CH44 ou 68GaCH4 0 .

[0158] Seis camundongos foram implantados com células de câncer adrenal de NCI-H295R. No dia 14 seguindo a implantação, os animais foram administrados por via intravenosa no intervalo de 24 horas com ¹⁸F-FDG, ⁶⁸Ga-CH44 e ⁶⁸Ga-CH40, respectivamente. No dia 32 pós-implantação, os animais foram administrados por via intravenosa com ⁶⁸Ga-CH44 seguido de 24 horas mais tarde com ⁶⁸Ga-CH40. Seguindo cada administração, a biodistribuição no xenoenxerto de câncer adrenal e em outros tecidos foi avaliada usando imagiologia

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 75/116

62/73 de PET.

Varredura de PET [0159] Grupos (n=5-7) de camundongos sem pelo foram administrados i.v. com 10 ± 4 MBq de ⁶⁸Ga-CH44 e varreduras de PET/CT foram adquiridas em 1 h pós-injeção (p.i.). Estudos de PET e PET/CT foram realizados em uma varredura de modelo de roedor de microPET/microCT (nanoPET/CT®, Mediso). Anestesia foi induzida com 5 % de isoflurano e mantida em 1,5 %. Para aprimorar a qualidade de imagem, 20 milhões de eventos de coincidência per camundongo foram adquiridos para cada varredura de emissão de PET estática (janela de energia, 400-600 keV; tempo: 20 minutos para um FOV). Para modalidade dupla PET/CT, imagens de CT (35 kVp, tempo de exposição de 350 ns e aproximação média) foram obtidas e o registro anatômico, bem como atenuação de correção, foi aplicado nas varreduras de PET correspondentes. Seis horas após a primeira injeção, o mesmo grupo de camundongos sem pelo foi administrado com 10±4 MBq de ⁶⁸Ga-CH40 e varreduras de PET/CT foram adquiridas em 1 hora pós-injeção (p.i.), essa série de aquisição constituiu seu grupo de controle.

Resultados

Imagiologia de PET [0160] A aquisição de imagem foi realizada no dia 14 para todos os três compostos e nos dias 32 para ⁶⁸Ga-CH44 , ⁶⁸GaCH40. No dia 14, as figurações de imagiologia de animais injetados com ¹⁸F-FDG mostraram nenhum acúmulo significativo no sítio de tumor (Figura 6A).

[0161] Ao contrário, nos dias 14 (Figuras 6 B e C) e 32 (Figuras 7A e B), as figurações de imagiologia mostraram na maioria dos animais um acúmulo significativo de ⁶⁸Ga-CH44 em

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 76/116

63/73 comparação a ⁶⁸Ga-CH40.

Conclusão [0162] Os experimentos mostraram na maioria dos animais uma imagiologia clara e seletiva e identificação de câncer adrenal com ⁶⁸Ga-CH44 no dia 14 e 32.

Exemplo 9: Imagiologia de PET de ⁶⁸Ga-FG770 e sua contraparte controlada ⁶⁸Ga-FG769 em um modelo de camundongo subcutâneo de tumor de glândula adrenal.

[0163] 0 objetivo nesse exemplo consistiu no uso de Varredura de PET para avaliar a biodistribuição de um conjugado que alveja o LDLR (⁶⁸Ga-FG770) e sua contraparte controlada (⁶⁸Ga-FG769) seguindo a administração intravenosa para camundongos implantados com câncer adrenal (modelo de xenoenxerto). A grade usada nesse Estudo foi DOTA em vez de NODAGA.

Materiais

Radioidentificação [0164] FG770 e FG769 foram radioidentifiçados usando cloreto de ⁶⁸Ga. 0 gálio foi obtido na forma ⁶⁸Ga³⁺ usando um gerador ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga baseado em T1O2 comercial (Obninsk) . Uma reação de radioidentificação foi conduzida pela reação de 20 pg de DOTA-FG770 e 20 pg DOTA-FG769 com 74-148 MBq (2-4 mCi) de ⁶⁸Ga em 100 pl de tampão de acetato de amônio (2 M, pH 4,5) a 95 °C por 15 minutos.

[0165] As atividades especificas obtidas para ⁶⁸Ga-FG770 e ⁶⁸Ga-FG769 foi 6,45 Bq/mmol e 6,16 Bq/mmol respectivamente. Implantação de tumor [0166] Estudos em animais foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo comitê de ética Aix-Marseille (Comitê 14) . Camundongos macho sem pelo BALB/c de quatro

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 77/116

64/73 semanas de idade foram obtidos a partir de Charles River Inc. Os camundongos foram implantados por via subcutânea nos flancos superiores com células NCI-H295R (7><10⁶) em 150 μΕ de meio completo que contém 50 % de Matrigel (Coming) . Os camundongos foram usados para experimentos de imagiologia quando os tumores alcançaram um volume compreendido entre 700-1500 mm³.

Projeto experimental, dose e via de administração [0167] Os animais receberam a substância de teste por bolo único intravenoso na dose de 10± 4 MBq de 68Ga-FG770 ou 68GaFG769.

[0168] Seis camundongos foram implantados com células de câncer adrenal de NCI-H295R. No dia 37 seguindo a implantação, os animais foram administrados por via intravenosa no intervalo de 24 horas com ⁶⁸Ga-FG770 and ⁶⁸GaFG769, respectivamente. Seguindo a administração, a biodistribuição no xenoenxerto de câncer adrenal e em outros tecidos foi avaliada usando imagiologia de PET.

Varredura de PET [0169] Os grupos (n =3) de camundongos sem pelo foram administrados por via intravenosa com 10± 4 MBq de ⁶⁸Ga-FG770 e varreduras de PET/CT foram adquiridas em 1 h pós-injeção (p.i.). Estudos de PET e PET/CT foram realizados em uma varredura de modelo de roedor de microPET/microCT (nanoPET/CT®, Mediso) . Anestesia foi induzida com 5 % de isoflurano e mantida em 1,5 %. Para aprimorar a qualidade de imagem, 20 milhões de eventos de coincidência per camundongo foram adquiridos para cada varredura de emissão de PET estática (janela de energia, 400-600 keV; tempo: 20 minutos para um FOV) . Para modalidade dupla PET/CT, imagens de CT

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 78/116

65/73 (35 kVp, tempo de exposição de 350 ns e aproximação média) foram obtidas e o registro anatômico, bem como atenuação de correção, foi aplicado nas varreduras de PET correspondentes.

[0170] 24 horas após a primeira injeção, o mesmo grupo de camundongos sem pelo foi administrado por via intravenosa com 10±4 MBq de ⁶⁸Ga-FG769 e varreduras de PET/CT foram adquiridas em 1 h e 4 h pós-injeção (p.i.), análise de Região quantitativa de interesse (ROI) das imagens de PET foi realizada na atenuação e decaiu as imagens de PET corrigidas usando Interviewfusion

Resultados

Imagiologia de PET [0171] A aquisição de imagem foi realizada no dia 37 tanto para o composto ⁶⁸Ga-FG770 quanto para o composto ⁶⁸Ga-FG769. As figurações de imagiologia mostraram na maioria dos animais um acúmulo significativo de ⁶⁸Ga-FG77 0 em comparação a ⁶⁸GaFG769 (Figuras 8A e 8B, respectivamente).

Conclusão [0172] Os experimentos mostraram na maioria dos animais uma imagiologia clara e seletiva e identificação de câncer adrenal com ⁶⁸Ga-FG770 no dia 37.

Exemplo 10: Imagiologia de PET de ⁶⁸Ga-CH44 e sua contraparte controlada ⁶⁸Ga-CH40 em um modelo de camundongo subcutâneo de câncer pancreático.

[0173] 0 objetivo nesse exemplo consistiu no uso de Varredura de PET para avaliar a biodistribuição de um conjugado gue alveja o LDLR (⁶⁸Ga-CH44) e sua contraparte controlada (⁶⁸Ga-CH40) seguindo a administração intravenosa para camundongos implantados com câncer pancreático (modelo

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 79/116

66/73 de xenoenxerto). ¹⁸F-FDG foi usado como controle.

Materiais

Radioidentificação [0174] CH44 e CH40 foram radioidentifiçados usando cloreto de 68Ga. 0 gálio foi obtido na forma 68Ga3+ usando um gerador 68Ge/68Ga baseado em Ti02 comercial (Obninsk). Uma reação de radioidentificação foi conduzida pela reação de 20 pg de CH44 e 40 pg CH40 com 74-148 MBq (2-4 mCi) de 68Ga em 200 pl de tampão de acetato de amônio (4 M, pH 6) a 25 °C por 15 minutos.

[0175] A atividade especifica obtida para ⁶⁸Ga-CH44 e ⁶⁸GaCH40 foi 12,5 Bq/mmol e 5,5 Bq/mmol respectivamente.

Implantação de tumor [0176] Estudos em animais foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo comitê de ética Aix-Marseille (Comitê 14) . Camundongos macho sem pelo BALB/c de quatro semanas de idade foram obtidos a partir de Charles River Inc. Os camundongos foram implantados por via subcutânea entre os ombros com células Pk4a (IxlO⁶) em 150 pl de meio completo. Os camundongos foram usados para experimentos de imagiologia quando os tumores alcançaram um volume compreendido entre 700-1500 mm³.

Projeto experimental, dose e via de administração [0177] Os animais receberam a substância de teste por bolo único intravenoso na dose de 10± 4 MBq de 68Ga-CH44 e 68GaCH4 0 .

[0178] Os camundongos (n = 5 a 6) foram implantados com células de câncer pancreático Pk4a. No dia 4 seguindo a implantação, os animais foram administrados por via intravenosa no intervalo de 24 horas com 18F-FDG, 68Ga-CH44

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 80/116

67/73 e 68Ga-CH40, respectivamente. No dia 12 pós-implantação, os animais foram administrados por via intravenosa com 68GaCH44 seguido de 24 horas mais tarde com 68Ga-CH40.

[0179] Seguindo cada administração, a biodistribuição no xenoenxerto de câncer pancreático e em outros tecidos foi avaliada usando imagiologia de PET.

Varredura de PET [0180] Grupos (n = 5 a 7) de camundongos sem pelo foram administrados i.v. 10± 4 MBq de ⁶⁸Ga-CH44 e varreduras de PET/CT foram adquiridas em 1 hora pós-injeção (p.i.). Estudos de PET e PET/CT foram realizados em uma varredura de modelo de roedor de microPET/microCT (nanoPET/CT®, Mediso). Anestesia foi induzida com 5 % de isoflurano e mantida em 1,5 %. Para aprimorar a qualidade de imagem, 20 milhões de eventos de coincidência per camundongo foram adquiridos para cada varredura de emissão de PET estática (janela de energia, 400-600 keV; tempo: 20 minutos para um FOV). Para modalidade dupla PET/CT, imagens de CT (35 kVp, tempo de exposição de 350 ns e aproximação média) foram obtidas e o registro anatômico, bem como atenuação de correção, foi aplicado nas varreduras de PET correspondentes. Seis horas após a primeira injeção, o mesmo grupo de camundongos sem pelo foi administrado com 10±4 MBq de ⁶⁸Ga-CH40 e varreduras de PET/CT foram adquiridas em 1 hora pós-injeção (p.i.), essa série de aquisição constituiu o grupo de controle.

Resultados

Imagiologia de PET [0181] Aquisição de imagem foi realizada no dia 4 para ¹⁸F-FDG, ⁶⁸Ga-CH44 e ⁶⁸Ga-CH40 e dia 12 para ⁶⁸Ga-CH44 e ⁶⁸GaCH40. Não há acúmulo significativo dos vários compostos no

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 81/116

68/73 dia 4 devido ao tamanho pequeno do tumor (Figuras 9A a 9C, respectivamente) . No entanto, as figurações de imagiologia mostraram na maioria dos animais um acúmulo significativo de ⁶⁸Ga-CH44 em comparação de ⁶⁸Ga-CH40 nos dias 12 (Figuras 10A a 10B, respectivamente).

Conclusão [0182] Os experimentos mostraram uma imagiologia clara e seletiva e identificação de câncer pancreático com ⁶⁸Ga-CH44 no dia 12 .

Exemplo 11: Imagiologia de PET de ⁶⁸Ga-CH44 e sua contraparte controlada ⁶⁸Ga-CH40 em um modelo de camundongo ortotópico de glioblastoma.

[0183] 0 objetivo nesse exemplo consistiu em avaliar usando a Varredura de PET a biodistribuição de um conjugado que alveja LDLR (⁶⁸Ga-CH44) e sua contraparte controlada (⁶⁸Ga-CH40) seguindo a administração intravenosa a camundongos implantados com glioblastoma (modelo de xenoenxerto). Uma comparação também foi executada no dia 21 contra ⁶⁸Ga-RGD, um marcador especifico de integrina usado em várias investigações clinicas para glioblastoma.

Materiais

Radioidentificação [0184] CH44 e CH40 foram radioidentifiçados usando cloreto de 68Ga. 0 gálio foi obtido na forma 68Ga3+ usando um gerador 68Ge/68Ga baseado em Ti02 comercial (Obninsk). Uma reação de radioidentificação foi conduzida pela reação de 20 pg de CH44 e 40 pg CH40 com 74-148 MBq (2-4 mCi) de 68Ga em 200 pl de tampão de acetato de amônio (4 M, pH 6) a 25 °C por 15 minutos.

[0185] A atividade especifica obtida para ⁶⁸Ga-CH44 e ⁶⁸Ga

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 82/116

69/73

CH40 foi 12,5 Bq/mmol e 5 Bq/mmol respectivamente. A atividade específica para ⁶⁸Ga-RGD foi 7,35 Bq/mmol.

Implantação de tumor [0186] Estudos em animais foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo comitê de ética Aix-Marseille (Comitê 14) . Camundongos macho sem pelo BALB/c de seis semanas de idade foram obtidos a partir de Charles River Inc. Os camundongos foram implantados no corpo estriado cerebral (1 mm anterior, 2 mm lateral para o bregma e 3 mm de profundidade) com células U87MG (5><10⁵) em 5 μΐ de PBS. Os camundongos foram usados para experimentos de imagiologia em J14 e J21 pós-injeção, com um volume esperado de 9 e 53 mm³ respectivamente.

Projeto experimental, dose e via de administração [0187] Os animais receberam a substância de teste por bolo único intravenoso na dose de 8± 4 MBq de 68Ga-CH44 e 68GaCH4 0 .

[0188] Os camundongos (n = 6) foram implantados com células de glioblastoma U87MG. No dia 14 seguindo a implantação, os animais foram administrados por via intravenosa no intervalo de 24 horas com ⁶⁸Ga-CH44 e ⁶⁸GaCH40, respectivamente. No dia 21 pós-implantação, os animais foram administrados por via intravenosa no intervalo de 24 horas e 72 horas com ¹⁶⁸Ga-CH44 , ⁶⁸Ga-CH40 e ⁶⁸Ga-RGD, respectivamente. Seguindo cada administração, a biodistribuição no câncer de glioblastoma e outros tecidos foi avaliada usando imagiologia de PET.

Varredura de PET [0189] Os camundongos (n = 6) de camundongos sem pelo foram administrados i.v. 8± 4 MBq de ⁶⁸Ga-CH44 e varreduras

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 83/116

70/73 de PET/CT foram adquiridas em 1 hora pós-injeção (p.i.). Estudos de PET e PET/CT foram realizados em uma varredura de modelo de roedor de microPET/microCT (nanoPET/CT®, Mediso). Anestesia foi induzida com 5 % de isoflurano e mantida em 1,5 %. Para aprimorar a qualidade de imagem, 20 milhões de eventos de coincidência per camundongo foram adquiridos para cada varredura de emissão de PET estática (janela de energia, 400-600 keV; tempo: 20 minutos para um FOV). Para modalidade dupla PET/CT, imagens de CT (35 kVp, tempo de exposição de 350 ns e aproximação média) foram obtidas e o registro anatômico, bem como atenuação de correção, foi aplicado nas varreduras de PET correspondentes. Seis horas após a primeira injeção, o mesmo grupo de camundongos sem pelo foi administrado com 8±4 MBq de ^{* * 68}Ga-CH40 e varreduras de PET/CT foram adquiridas em 1 hora pós-injeção (p.i.), essa série de aquisição constituiu seu grupo de controle.

Resultados

Imagiologia de PET [0190] A aquisição de imagem foi realizada no dia 14 para ⁶⁸Ga-CH44 e ⁶⁸Ga-CH40 e dias 21 para ⁶⁸Ga-CH44 , ⁶⁸Ga-CH40 e ⁶⁸Ga-RGD. As figurações de imagiologia mostraram para 4 de 6 camundongos um sinal de ⁶⁸Ga-CH44 no dia 14, e nenhum sinal significativo para ⁶⁸Ga-CH40 no dia 16 (Figuras 11A e 11B, respectivamente). No dia 21, todos os 6 camundongos mostraram um alto sinal de ⁶⁸Ga-CH44, significativamente mais forte que o sinal fraco de ⁶⁸Ga-CH40 ou ⁶⁸Ga-RGD (Figuras 11C, 11D, 11E, respectivamente). Uma análise da razão tumor/contra foi executada a fim de quantificar o sinal de imagiologia. A quantificação indica que ⁶⁸Ga-CH44 se acumula mais significativamente que ⁶⁸Ga-CH40 ou ⁶⁸Ga-RGD (cerca de 4

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 84/116

71/73 vezes) (Figura 12) .

Conclusão [0191] Os experimentos mostraram uma imagiologia clara e seletiva e identificação de câncer de glioblastoma com ⁶⁸GaCH44 no dia 21.

Exemplo 12: Imagiologia de PET de ⁶⁸Ga-CH44 e ⁶⁸Ga-MG04 em um modelo de camundongo subcutâneo de câncer adrenal.

[0192] 0 objetivo nesse exemplo consistiu em avaliar e comparar usando Varredura de PET a biodistribuição de dois conjugados que alvejam LDLR, um com uma grade de NODAGA (⁶⁸Ga-CH44) e um com uma grade de DOTA e sem um espaçador (S) (⁶⁸Ga-MG04), seguindo a administração intravenosa para camundongos implantados com modelo subcutâneo de câncer adrenal (modelo de xenoenxerto).

Materiais

Radioidentificação [0193] CH44 e MG04 foram radioidentifiçados usando cloreto de ⁶⁸Ga. 0 gálio foi obtido na forma ⁶⁸Ga³⁺ usando um gerador ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga baseado em T1O2 comercial (Obninsk) . Uma reação de radioidentificação foi conduzida pela reação de 20 pg de CH44 com ⁶⁸Ga em 200 μΐ de tampão de acetato de amônio (4 M, pH 6) a 25 °C por 15 minutos. Uma reação de radioidentificação foi conduzida pela reação de 20 pg de MG04 com ⁶⁸Ga em 200 pl de tampão de acetato de amônio (pH 4) a 100 °C por 10 minutos.

[0194] A atividade especifica obtida para ⁶⁸Ga-CH44 e ⁶⁸GaMG04 foram 331,3110,5 MBq/g e 449,71148,1 MBq/g respectivamente. O desempenho de complexação foi 91116,9 % para ⁶⁸Ga-MG04 e 9711,4 % para ⁶⁸Ga-CH44.

Implantação de tumor

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 85/116

72/73 [0195] Estudos em animais foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pela Universidade de ClermontAuvergne. Camundongos macho sem pelo BALB/c de quatro semanas de idade foram obtidos a partir de Charles River Inc. Os camundongos foram implantados por via subcutânea no fundo do pescoço com células NCI-H295R (7*10⁶) em 150 μΐ de meio completo que contém 50 % de Matrigel (Coming). Os camundongos foram usados para experimentos de imagiologia quando os tumores alcançaram um volume compreendido entre 200-400 mm³. Projeto experimental, dose e via de administração [0196] Os animais receberam a substância de teste por bolo único intravenoso em dose de 21,6±3,6MBq de ⁶⁸Ga-CH44 ou ⁶⁸GaMG04 em um volume de 150,8±40,3 μΐ.

[0197] Seis camundongos foram implantados com células de câncer adrenal de NCI-H295R. No dia 48 seguindo a implantação, os animais foram administrados por via intravenosa no intervalo de 48 horas com ⁶⁸Ga-CH44 e ⁶⁸GaMG04, respectivamente. Seguindo cada administração, a biodistribuição no xenoenxerto de câncer adrenal e em outros tecidos foi avaliada usando imagiologia de PET.

Varredura de PET [0198] Grupos (n=2) de camundongos sem pelo foram administrados i.v. com 21,6 ± 3,6 MBq de ⁶⁸Ga-CH44 e varreduras de PET/CT foram adquiridas em 1 h pós-injeção (p.i.). Estudos de PET e CT foram realizados em um modelo de roedor microPET (explore Vista, GE Healthcare) e em um modelo de roedor microCT (explore CT120, GE Healthcare) . Anestesia foi induzida com 5 % de isoflurano e mantida em 1,5 %. Para aprimorar a qualidade de imagem, 20 milhões de eventos de coincidência per camundongo foram adquiridos para cada

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 86/116

73/73 varredura de emissão de PET estática (janela de energia, 250-700 keV; tempo: 5 minutos para um FOV). Para modalidade dupla PET/CT, imagens de CT (70 kVp, tempo de exposição de 32 ns e aproximação média) foram obtidas e o registro anatômico, bem como atenuação de correção, foi aplicado nas varreduras de PET correspondentes. Quarenta e oito horas após a injeção de ^{* 68}Ga-CH44, o mesmo grupo de camundongos sem pelo foi administrado com 21,6±3,6 MBq de ⁶⁸Ga-MG04 e varreduras de PET/CT foram adquiridas em 1 hora pós-injeção (p.i.), essa série de aquisição constituiu o segundo grupo.

Resultados

Imagiologia de PET [0199] A aquisição de imagem foi realizada no dia 48 para ⁶⁸Ga-CH44. 48 horas mais tarde, a aquisição de imagem foi realizada para ⁶⁸Ga-MG04. Nos dias 48 (Figuras 13A) e 50 (Figuras 13B) , as figurações de imagiologia mostraram um acúmulo significativo de ⁶⁸Ga-CH44 e ⁶⁸Ga-MG04 (seta amarela=tumor, seta azul=rim) . Ademais, a absorção tumoral para ⁶⁸Ga-MG04 é 73 % mais alta em comparação a ⁶⁸Ga-CH44. São mostradas imagens com o mesmo limite (SUVmin=0; SUVmax=l). SUV (Valor de Absorção Padronizado):

Atividade de ROI Média (MBq/g)

Dose injetada (MBq)/peso corporal em gramas

Em que, MBq = Mega Becquerel e g = grama.

Conclusão [0200] Os experimentos mostraram uma identificação e imagiologia clara e seletiva de câncer adrenal com as duas moléculas, ⁶⁸Ga-MG04 e ⁶⁸Ga-CH44, com uma vantagem na absorção tumoral para ⁶⁸Ga-MG04 (73 %) .

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composto conjugado da fórmula:

M-C-P, caracterizado pelo fato de que

M representa um marcador farmaceuticamente aceitável,

C representa um quelador que forma um quelato com M, e

P representa um peptídeo ou pseudopeptídeo que tem no máximo 30 resíduos de aminoácido e tem capacidade para ligar o Receptor de Lipoproteína de Baixa Densidade (LDLR), para uso em um método de identificação e/ou detecção de células cancerosas em um indivíduo pela administração do composto conjugado ao indivíduo e análise da presença e/ou da quantidade de marcador.

2 . Composto conj ugado para uso , de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito composto é um multímero que compreende vários monômeros da fórmula (D . 3 . Composto conj ugado para uso , de acordo com a

reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que P compreende a sequência de aminoácidos (II):

Al-Met-A2-Arg-Leu-Arg-A3-A4 (II) , em que Al e A4 representam independentemente uma cisteína ou um análogo ou isóstero da mesma, A2 representa uma prolina ou um análogo ou isóstero da mesma, e A3 representa uma glicina ou um análogo ou isóstero da mesma.

4. Composto conjugado para uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que Al e A4 representam independentemente uma cisteína (Cys) ou um análogo da mesma selecionado a partir de (D)-cys,

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 88/116
2/6 penicilamina (Pen) e (D)-penicilamina ((D)-Pen); e/ou em que A2 representa uma prolina (Pro) ou um análogo da mesma selecionado a partir de ácido pipecólico (Pip) e ácido tiazolidina-4-carboxílico (Thz); e/ou em que A3 representa Gly ou sarcosina (Sar).

5. Composto conjugado para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que P compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9.

6. Composto conjugado para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que M representa um radionuclideo ou um marcador fluorescente.

7. Composto conjugado para uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que M é ¹⁸F ou ⁶⁸Ga.

8. Composto conjugado para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o M é ligado a P por uma ligação covalente ou iônica, direta ou indiretamente.

9. Composto conjugado para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o quelador C é selecionado a partir de NODAGA, DOTA, DOTA-GA, NOTA e derivados funcionais dos mesmos.

10. Composto conjugado para uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o quelador C é ligado a P através de um espaçador S.

11. Composto conjugado para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o composto compreende adicionalmente um segundo grupo

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 89/116
3/6 de alvejamento T que se liga a uma molécula distinta do LDLR.

12. Composto conjugado para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que M representa um radionuclideo e em que o método compreende as seguintes etapas:

a) administrar o composto conjugado a um indivíduo,

b) realizar um método de conjunto de imagens,

c) analisar o sinal obtido na etapa b), em que a presença de um sinal é indicativa da presença de células cancerosas e/ou do estágio de evolução de um câncer no dito indivíduo.

13. Composto conjugado para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por identificar e/ou detectar as células cancerosas que superexpressam o LDLR.

14. Composto conjugado para uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado a partir de um câncer pancreático, um câncer adrenal ou um glioblastoma.

15. Composto conjugado da fórmula (III) :

M-C-S-P (III), caracterizado pelo fato de que

M representa um radionuclideo farmaceuticamente aceitável,

C representa um quelador que forma um quelato com M,

S representa um espaçador, e

P representa um peptídeo ou pseudopeptídeo que tem no máximo 30 resíduos de aminoácido e tem capacidade para ligar o Receptor de Lipoproteína de Baixa Densidade (LDLR).

16. Composto conjugado da fórmula:

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 90/116
4/6

M-C-P caracterizado pelo fato de que

M representa um radionuclideo farmaceuticamente aceitável,

C representa um quelador que forma um quelato com M, e

P representa um peptídeo ou pseudopeptídeo que tem no máximo 30 resíduos de aminoácido e tem capacidade para ligar o Receptor de Lipoproteína de Baixa Densidade (LDLR).

17. Composto conjugado, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que o composto compreende adicionalmente um segundo grupo de alvejamento T que se liga a uma molécula distinta do LDLR.

18. Composto conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de que o dito composto é um multímero que compreende várias cópias de um grupo P ou M ou de ambos.

19. Composto conjugado, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o dito composto é um multímero que compreende vários monômeros da fórmula (III) .

20. Composto conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 19, caracterizado pelo fato de que P compreende a sequência de aminoácidos (II):

Al-Met-A2-Arg-Leu-Arg-A3-A4 (II), em que Al e A4 representam independentemente uma cisteína (Cys) ou um análogo da mesma selecionado a partir de (D)-cys, penicilamina (Pen) e (D)-penicilamina ((D)-Pen); e/ou em que A2 representa uma prolina (Pro) ou um análogo da mesma selecionado a partir de ácido pipecólico (Pip) e ácido tiazolidina-4-carboxílico (Thz); e/ou em que A3 representa Gly ou sarcosina (Sar), de preferência, P compreende uma

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 91/116
5/6 sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9.

21. Composto conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 20, caracterizado pelo fato de que M é um marcador ou um agente de radioterapia, de preferência, selecionado a partir de ¹⁸F, ⁶⁸Ga, ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu e ¹¹⁷Ιη.

22. Composto conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 21, caracterizado pelo fato de que C é selecionado a partir de NODAGA, DOTA, NOTA, DOTA-GA e derivados funcionais dos mesmos.

23. Composto conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, caracterizado por ser:

⁶⁸Ga-NODAGA-SEQ ID NO: 1, ou ⁶⁸Ga-DOTA-SEQ ID NO: 1, ou ¹⁷⁷Lu-DOTA-SEQ ID NO: 1, ou ⁶⁸Ga-NODAGA-S-SEQ ID NO: 1, ou ⁶⁸Ga-DOTA-S-SEQ ID NO: 1, ou ¹⁷⁷Lu-DOTA-S-SEQ ID NO: 1, em que S é um espaçador.

24. Composto conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 23, caracterizado por ser para uso em um método de imagiologia, identificação, detecção, diagnóstico ou radioterapia de câncer.

25. Composição caracterizada por compreender um composto conjugado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 20, e um diluente ou excipiente adequado.

26. Composto conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 23, caracterizado por ser desprovido de M.

27. Composto VHd caracterizado por ser como a Figura 14

Petição 870190072535, de 29/07/2019, pág. 92/116
6/6 representada .

28. Composto VHd, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por compreender adicionalmente um radionuclideo.