WO2006077857A1 - 粒子を脂質膜で被覆する方法 - Google Patents

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WO2006077857A1
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ribosome
membrane
suv
positively
lipid
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PCT/JP2006/300603
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Kentaro Kogure
Arisa Minoura
Hideyoshi Harashima
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National University Corporation Hokkaido University
Shionogi & Co., Ltd
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
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    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a method of coating particles with a lipid membrane.
  • a simple hydration method of a lipid membrane As a method for preparing a ribosome, for example, a simple hydration method of a lipid membrane is known.
  • the simple hydration method of a lipid membrane multilamellar ribosomes encapsulating the target substance can be prepared by hydrating the lipid membrane in the presence of the target substance such as a gene (Non-patent Document 1). ).
  • the target substance such as a gene
  • Non-Patent Literature l Kogure et al., Rjournal of Controlled Release], 2004, 98 ⁇ , 317-323
  • the lipid membranes are heterogeneously layered, so it was difficult to control the number of lipid membranes contained in the multilamellar ribosome.
  • the lipid membrane can be in layers as in the formation. It was only overlapped, and it was difficult to form a space between the lipid membranes.
  • the present invention provides a method capable of coating particles to be coated with two lipid membranes having a space between them, and two particles of particles to be coated by the method.
  • An object is to provide a ribosome obtained by coating with a membrane.
  • a first method of the present invention is a method of coating positively charged particles with two lipid membranes, wherein a plurality of negatively charged SUV ribosomes are contacted with the positively charged particles, Forming a negatively chargeable complex including a chargeable particle and the negatively chargeable SUV ribosome electrostatically bonded to the positively charged particle, and treating the negatively chargeable complex with a cation. To do.
  • positively chargeable particles can be coated with two lipid membranes having a space formed therebetween.
  • two lipid membranes that coat the positively charged particles (the first lipid membrane formed outside the positively charged particles)
  • a second lipid membrane formed outside the first lipid membrane) a space is formed, and a desired substance can be held in this space.
  • the positively charged particles are preferably aggregates of a target substance.
  • an aggregate of the target substance is enclosed, and a bilayer ribosome in which a space is formed between the two lipid membranes covering the aggregate of the target substance can be produced.
  • the positively chargeable particle is preferably a positively chargeable n-sheet ribosome (n is an integer of 1 or more).
  • n is an integer of 1 or more.
  • the positively charged particles have a zeta potential of 20 30 mV
  • the negatively charged SUV ribosome has a zeta potential of 20 30 mV.
  • a negatively chargeable complex including positively chargeable particles and a plurality of negatively chargeable SUV ribosomes electrostatically bound to the positively chargeable particles can be efficiently formed.
  • the positively chargeable particles preferably have a particle size of 50 nm or more. In this case, a negatively chargeable complex including positively chargeable particles and a plurality of negatively chargeable SUV ribosomes electrostatically bound to the positively chargeable particles can be efficiently formed.
  • a second method of the present invention is a method of coating negatively charged particles with two lipid membranes, wherein a plurality of positively charged SUV-type ribosomes are contacted with the negatively charged particles, and the negatively charged particles are contacted with the negatively charged particles.
  • negatively chargeable particles can be coated with two lipid membranes with a space formed therebetween.
  • the ribosome obtained by coating the negatively charged particles by the second method of the present invention between the two lipid membranes covering the negatively charged particles (the first lipid formed outside the negatively charged particles) A space is formed in the membrane and the second lipid membrane formed outside the first lipid membrane, and a desired substance can be held in this space.
  • the negatively chargeable particles are preferably aggregates of a target substance.
  • an aggregate of the target substance is enclosed, and a bilayer ribosome in which a space is formed between the two lipid membranes covering the aggregate of the target substance can be produced.
  • the negatively chargeable particles are preferably negatively chargeable n-sheet ribosomes (n is an integer of 1 or more).
  • n is an integer of 1 or more.
  • the negatively charged particles have a zeta potential of ⁇ 20 to ⁇ 30 mV, and the positively charged SUV ribosome has a zeta potential of 20 to 30 mV.
  • a positively chargeable complex including negatively chargeable particles and a plurality of positively chargeable SUV ribosomes electrostatically bound to the negatively chargeable particles can be efficiently formed.
  • the negatively chargeable particles preferably have a particle size of 50 nm or more. In this case, a positively chargeable complex including negatively chargeable particles and a plurality of positively chargeable SUV ribosomes electrostatically bound to the negatively chargeable particles can be efficiently formed.
  • particles to be coated can be coated with two lipid membranes having a space formed therebetween. Therefore, if aggregates of the target substance are used as the particles to be coated, the aggregates of the target substance are enclosed, and a space is formed between the two lipid membranes covering the aggregate of the target substance.
  • Two-membrane ribosomes can be produced, and if n-membrane ribosomes (n is an integer of 1 or more) are used as particles to be coated, the two lipid membranes that coat the n-membrane ribosomes It is possible to produce (n + 2) membrane ribosomes with a space between them. In the ribosome obtained by coating positively charged particles or negatively charged particles by the method of the present invention, a space is formed between the two lipid membranes covering the positively charged particles or the negatively charged particles. This space can hold a desired material.
  • FIG. 1 (a) is a diagram showing the results of measuring the DNA content of each fraction by DNA agarose gel electrophoresis, and (b) is the rhodamine content and NBD content of each fraction measured by fluorescence intensity. It is a figure which shows a result.
  • FIG. 2 shows the results of measuring the DNA content of each fraction by DNA agarose gel electrophoresis, (b) shows the results of measuring the rhodamine content and NBD content of each fraction by fluorescence intensity.
  • FIG. 3 is a diagram showing the expression activity of a luciferase gene introduced into cells by various multiple ribosomes.
  • a plurality of negatively chargeable SUV-type liposomes are brought into contact with positively charged particles, and the negatively charged particles are electrostatically bound to the positively charged particles and the positively charged particles.
  • Electrification s A negatively charged complex containing uv-type ribosome is formed.
  • a plurality of positively chargeable SUV-type liposomes are brought into contact with negatively chargeable particles, and positively chargeable S electrostatically bound to the negatively chargeable particles and the negatively chargeable particles.
  • a positively charged complex including UV-type ribosome is formed.
  • the zeta potential of the positively chargeable particles is not particularly limited as long as it is positive, but is usually 10 to 60 mV, preferably 20 to 50 mV, and more preferably 20 to 30 mV.
  • Negative chargeability The zeta potential of the particles is not particularly limited as long as it is negative, but is usually ⁇ 10 to ⁇ 60 mV, preferably 120 to 150,000 mV, more preferably 120 to 1-30 mV.
  • the zeta potential measurement conditions are not particularly limited, but the temperature conditions are usually 25 ° C.
  • the particle size of the positively charged particles and the negatively charged particles is not particularly limited, but the lower limit of the particle size is preferably 50 nm, more preferably 70 nm, and the upper limit of the particle size. Is preferably 500 nm, more preferably 200 nm.
  • the particle size of the positively charged particles is within the above range, when the negatively charged SUV ribosome electrostatically bound to the positively charged particles is treated with a cation, the positively charged particles are separated by two lipid membranes. It can coat efficiently.
  • the particle size of the negatively charged particles is in the above range, two negatively charged particles are separated when the positively charged SUV ribosome electrostatically bound to the negatively charged particles is treated with an anion. It can be efficiently coated with a fat film.
  • the positively chargeable particle may contain a neutral substance and / or an anionic substance in addition to the cationic substance as long as it is positively charged as a whole.
  • the negatively chargeable particles may contain a neutral substance and / or a cationic substance in addition to the anionic substance as long as it is negatively charged as a whole.
  • an aggregate of a target substance for example, a substance to be delivered into a cell or nucleus
  • a target substance for example, a substance to be delivered into a cell or nucleus
  • the bilayer ribosome in which the target substance is encapsulated by coating the positively or negatively charged particles with two lipid films can be produced.
  • the aggregate of the target substance may be composed solely of the target substance, or may contain a substance other than the target substance (for example, a carrier that holds the target substance).
  • the target substance and the anionic substance are electrostatically
  • the target substance agglomerates can be prepared by conjugating them into a complex.
  • an aggregate of the target substance can be prepared by electrostatically combining the target substance and a cationic substance to form a complex.
  • the target substance and the cationic substance are combined in an appropriate manner (for example, physical adsorption, hydrophobic bond, chemical bond, etc.) to form a complex.
  • an aggregate of the target substance can be prepared.
  • an aggregate of the target substance that is positively or negatively charged as a whole can be prepared by adjusting the mixing ratio of the target substance and the cationic substance or the anionic substance.
  • the target substance is not particularly limited, and examples thereof include nucleic acids, peptides, proteins, drugs, sugars, and complexes thereof.
  • the “nucleic acid” includes analogs or derivatives thereof (for example, peptide nucleic acid (PNA), phosphorothioate DNA, etc.) in addition to DNA or RNA.
  • the nucleic acid may be either single-stranded or double-stranded, and may be linear or circular, or may be misaligned.
  • a nucleic acid aggregate can be prepared by electrostatically binding the nucleic acid and the cationic substance to form a complex.
  • an aggregate of nucleic acids that are positively or negatively charged as a whole can be prepared.
  • the cationic substance used in preparing the aggregate of the target substance is not particularly limited as long as it is a substance having a cationic group in the molecule.
  • the cationic substance include cationic lipids (for example, Lipofectamine (manufactured by Invitrogen)); macromolecules having a cationic group; polylysine, polyarginine, a basic amino acid such as a copolymer of lysine and arginine alone Polymers or copolymers or derivatives thereof (eg stearyl derivatives); polycationic polymers such as polyethyleneimine, poly (arylamine), poly (diallyldimethylammonium chloride), darcosamine; use protamine sulfate, etc.
  • the power to do is S.
  • the number of cationic groups possessed by the cationic substance is not particularly limited, but is preferably 2 or more.
  • the cationic group is not particularly limited as long as it can be positively charged.
  • the anionic substance used in preparing the aggregate of the target substance is not particularly limited as long as it is a substance having an anionic group in the molecule.
  • the anionic substance include an anionic lipid; a polymer having an anionic group; a homopolymer or a copolymer of an acidic amino acid such as polyaspartic acid or a derivative thereof; xanthan gum, a powerful carboxyoxibule polymer, Polyanionic polymers such as carboxymethylcellulose polystyrene sulfonate, polysaccharide, and carrageenan can be used.
  • the number of anionic groups contained in the anionic substance is not particularly limited, but is preferably 2 or more.
  • the anionic group is not particularly limited as long as it can be negatively charged.
  • a functional group having a terminal carboxyleno group for example, a succinic acid residue, a malonic acid residue, etc.
  • a phosphoric acid group for example, a sulfuric acid group, etc.
  • n-sheet liposomes for example, positively or negatively charged n-sheet liposomes (n is an integer of 1 or more) can be used.
  • n-membrane ribosomes are used as positively or negatively charged particles, (n + 2) membrane ribosomes are prepared by coating positively or negatively charged particles with two lipid membranes. be able to.
  • a positively charged or negatively charged n-membrane ribosome may or may not be encapsulated with a target substance (for example, a substance to be delivered into cells or nuclei).
  • the ribosome may contain a neutral substance and / or an anionic substance in addition to the cationic substance as long as it is positively charged as a whole.
  • the negatively charged n-membrane ribosome may contain a neutral substance and / or a cationic substance in addition to the anionic substance as long as it is negatively charged as a whole.
  • n-membrane ribosome can be obtained by using a known method such as a hydration method, an ultrasonic treatment method, an ethanol injection method, an ether injection method, a reverse phase evaporation method, a surfactant method, or a freezing and thawing method. It is possible to produce S.
  • n-sheet membrane ribosomes can be prepared by coating positively or negatively charged particles with two lipid membranes using the method of the present invention.
  • the positively or negatively charged n-sheet membrane ribosome can be produced.
  • negatively charged n-sheet ribosome or neutral n-sheet By modifying the surface of the membrane ribosome with a cationic substance, a positively charged n -membrane liposome can be produced.
  • the surface of the positively charged n-membrane ribosome or neutral n-membrane ribosome is made an anionic substance.
  • the negatively charged n-membrane ribosome can be prepared by modifying with.
  • the n-membrane ribosome can be prepared, for example, by the hydration method as follows.
  • a lipid membrane is obtained by dissolving the components of the lipid membrane in an organic solvent and then evaporating and removing the organic solvent.
  • the organic solvent include hydrocarbons such as pentane, hexane, heptane and cyclohexane; halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform; aromatic carbonization such as benzene and toluene.
  • the lipid membrane can then be hydrated and converted to multilamellar ribosomes by stirring or sonication. Conversion from a multilamellar ribosome to a single membrane ribosome or from a single membrane ribosome to a multilamellar ribosome can be performed according to a known method. By passing the n-membrane ribosome through a filter having a predetermined pore size, it is possible to obtain an n-membrane ribosome having a certain particle size distribution.
  • the target substance When the target substance is water-soluble, by adding the target substance or its aggregate to an aqueous solvent used for hydrating the lipid membrane in the production of n-membrane ribosome, The target substance can be enclosed in the aqueous phase.
  • the target substance or its aggregate is added to the organic solvent used in the production of the n-membrane ribosome, thereby encapsulating the target substance in the lipid membrane of the ribosome.
  • a cationic substance having a hydrophobic group is added.
  • a hydrophobic group is inserted into the lipid membrane so that the cationic substance is exposed to the lipid membrane force, and the cationic substance can be introduced onto the surface of the negatively charged n-membrane ribosome or neutral n-membrane ribosome.
  • the surface of positively charged n-membrane ribosome or neutral n-membrane ribosome is modified with an anionic substance.
  • an anionic substance having a hydrophobic group is added to the external liquid of positively charged n-membrane ribosome or neutral n-membrane ribosome.
  • a hydrophobic group is inserted into the lipid membrane so that the anionic substance is exposed to the lipid membrane force.
  • An anionic substance can be introduced on the surface of positively charged n-membrane ribosome or neutral n-membrane ribosome.
  • the hydrophobic group is not particularly limited as long as it can be inserted into the lipid membrane.
  • the hydrophobic group include saturated or unsaturated fatty acid groups such as stearyl groups, sterol residues such as cholesterol residues, phospholipid residues, glycolipid residues, and long-chain aliphatic alcohol residues (for example, Phosphatidylethanolamine residue, etc.), polyoxypropylene alkyl group, glycerin fatty acid ester residue, etc., among which a fatty acid group having 10 to 20 carbon atoms (eg, palmitoyl group, oleyl group). , Stearyl group, arachidoyl group, etc.) are preferred.
  • the lipid membrane component in the n-membrane ribosome is not particularly limited as long as it does not inhibit the formation of the lipid bilayer.
  • lipid membrane components include lipids, membrane stabilizers, antioxidants, Examples include charged substances and membrane proteins.
  • lipid membrane constituents in positively charged n-membrane ribosomes are adjusted so that the n-membrane liposomes are positively charged as a whole, and lipids in negatively-charged n-membrane ribosomes
  • the type and content of membrane constituents are adjusted so that the n-membrane ribosome is negatively charged as a whole.
  • lipid membrane constituents that impart a positive charge include cationic lipids and cationic membrane stabilizers.
  • lipid membrane constituents that impart a negative charge include anionic lipids and anions. A functional membrane stabilizer and the like.
  • the type and content of the lipid membrane components in the n-membrane ribosome are the same as those of the n-membrane liposome. It is adjusted in consideration of the electric charge of the whole substance enclosed inside.
  • SUV small unilamellar vesicle type ribosomes have a particle size (diameter) of lOOnm or less
  • the particle size (diameter) of the SUV-type ribosome is not particularly limited as long as it is not more than lOOnm, but is usually 30 to: 100 nm, preferably 30 to 70 nm, and more preferably 30 to 50 nm.
  • Multilamellar ribosomes MUV
  • single membrane ribosomes other than SUV eg LUV (large unila mellar vesicle), GUV (giant unilamellar vesicle, etc.
  • SlOOnm generally lipid membranes with a particle size of lOOnm or larger are considered as flat membranes
  • SUV-type ribosomes have a particle diameter of less than lOOnm, so that aggregation of ribosomes with large membrane curvature and surface energy tends to occur.
  • the SUV-type ribosome can be produced, for example, by the ultrasonic method as follows.
  • a lipid membrane is obtained by dissolving the components of the lipid membrane in an organic solvent and then evaporating and removing the organic solvent.
  • the organic solvent include hydrocarbons such as pentane, hexane, heptane, and cyclohexane; halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, and aromatic hydrocarbons such as benzene and toluene. And the like; lower alcohols such as methanol and ethanol; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; ketones such as acetone and the like.
  • the lipid membrane can be hydrated, and multilamellar ribosomes can be produced by stirring or ultrasonic treatment using an ultrasonic bath.
  • the resulting multilamellar ribosome can be further sonicated with a probe-type ultrasonic device to prepare SUV-type ribosomes, which are small single-membrane ribosomes.
  • the lipid membrane components in the SUV-type ribosome are not particularly limited as long as they do not inhibit the formation of the lipid bilayer.
  • Examples of lipid membrane components include lipids, membrane stabilizers, antioxidants, Examples include charged substances and membrane proteins.
  • lipid membrane constituents in positively charged SUV-type ribosomes are adjusted so that the SUV-type ribosomes are positively charged as a whole, and the types of lipid membrane constituents in negatively charged SUV-type ribosomes and The content is adjusted so that the SUV-type ribosome is negatively charged as a whole.
  • lipid membrane constituents that impart a positive charge include cationic lipids, cationic membrane stabilizers, and the like, and lipids that impart a negative charge.
  • the membrane component include an anionic lipid and an anionic membrane stabilizer.
  • Positively charged SUV-type ribosomes as long as they are positively charged as a whole, in addition to lipid membrane constituents that impart a positive charge, lipid membrane constituents that impart a negative charge and / or neutral lipid membrane constituents
  • Negatively chargeable SUV ribosomes that may contain components, as long as they are negatively charged as a whole, in addition to lipid membrane components that impart a negative charge, lipid membrane components that impart a positive charge and / or Alternatively, a neutral lipid membrane component may be included.
  • the amount of the cationic lipid is usually 5 to 30% (molar ratio) of the total amount of the lipid. It is preferably 10 to 20% (molar ratio), more preferably 10 to 15% (molar ratio).
  • the amount of the anionic lipid is usually 5-30% (molar ratio) of the total amount of the lipid, preferably 10 to 20% (molar ratio), more preferably 10 to 15% (molar ratio).
  • the zeta potential of the positively charged SUV type ribosome is not particularly limited as long as it is positive, but it is usually 10 60 mV, preferably 20 50 mV, more preferably 20 30 mV, and the negatively charged SUV type ribosome.
  • the zeta potential is not particularly limited as long as it is negative, but it is usually 1 10 60 mV, preferably 1 20 50 mV, more preferably 1 20 30 mV.
  • the measurement conditions for the zeta potential are not particularly limited, but the temperature condition is usually 25 ° C.
  • the lipid is an essential component of the lipid membrane, and its blending amount is usually 30 to 100% (molar ratio) of the total blending amount of the lipid membrane constituents, preferably 50 to : 100% (molar ratio), more preferably 70 to 100% (molar ratio).
  • Examples of lipids include phospholipids, glycolipids, sterols, saturated or unsaturated fatty acids, and the like.
  • Examples of the phospholipid include phosphatidinorecholine (for example, dioleoyl phosphatidylcholine, dilauroyl phosphatidylcholine, dimyristoyl phosphatidylcholine, dipalmitoyl phosphatidylcholine, distearoyl phosphatidylcholine, etc.), phosphatidylglycerol (for example, dioleoylphosphatidyl).
  • Glycerol Dilauroyl phosphatidyl glycerol, dimyristoyl phosphatidyl glycerol, dipalmitoyl phosphatidyl glycerol, distearoyl phosphatidyl glycerol, etc.
  • phosphatidyl ethanolamine eg dioleoyl phosphatidyl ethanolamine, dilauroyl phosphatidyl ethanolamine, dimyristoyl phosphatidyl
  • phosphatidylserine phosphatidylinositol, phosphatidic acid, cardiolipin, sphingomyelin, egg yolk lecithin, soybean lecithin, hydrogenated products thereof, etc.
  • glycolipids include glyceglycoglycolipids (for example, sulfoxyribosyl glyceride, diglycosyl diglyceride, digalatatosyl diglyceride, galatatosinoresyl glyceride, glycosyl diglyceride), and sphingoglycolipids (for example, galactosyl celeb oral side, ratato Silcelebu mouthside, Gandarioside) and the like.
  • glyceglycoglycolipids for example, sulfoxyribosyl glyceride, diglycosyl diglyceride, digalatatosyl diglyceride, galatatosinoresyl glyceride, glycosyl diglyceride
  • sphingoglycolipids for example, galactosyl celeb oral side, ratato Silcelebu mouthside, Gandarioside
  • sterols examples include animal-derived sterols (eg, cholesterol, cholesterol succinic acid, lanosterol, dihydrolanostero monole, desmosterol, dihydrocholesterol), plant-derived sterols (phytosterol) (eg, stigmasterol). , Sitosterol, campesterol, brassicasterol), sterols derived from microorganisms (for example, timosterol, ergosterol) and the like.
  • the saturated or unsaturated fatty acid include saturated or unsaturated fatty acids having 12 to 20 carbon atoms such as palmitic acid, oleic acid, stearic acid, arachidonic acid, and myristic acid.
  • Lipids are classified into neutral lipids, cationic lipids and anionic lipids.
  • neutral lipids include diacylphosphatidylcholine, diacylphosphatidylethanolamine, cholesterol, ceramide, sphingomyelin, and cephalin.
  • cationic lipids include DODAC (dioctadecyldimethylamumum chloride), DOTMA (N- (2,3-dioleyloxy) propyl-N, N, N-trimethylammomum), DDAB (didodecylammonium), and the like.
  • the membrane stabilizer is an optional component added to physically or chemically stabilize the lipid membrane or to regulate the fluidity of the lipid membrane.
  • the amount is usually 10 to 50% (molar ratio), preferably 20 to 50% (molar ratio), more preferably 30 to 50% (molar ratio) of the total amount of lipid membrane constituents.
  • Examples of the membrane stabilizer include sterol, glycerin or fatty acid esters thereof.
  • Specific examples of the sterol are the same as those described above, and examples of the glycerin fatty acid ester include triolein and trioctanoin.
  • the antioxidant is an optional component added to prevent the oxidation of the lipid membrane, and its blending amount is usually the total blending amount of the lipid membrane constituent components. 5-30% (molar ratio), preferably 10-30% (molar ratio), more preferably 20-30% (molar ratio).
  • antioxidants examples include tocopherol, propyl gallate, ascorbyl palmitate, butylated hydroxytoluene and the like.
  • the charged substance is an optional component added to impart a positive charge or negative charge to the lipid membrane, and the blending amount thereof is the lipid membrane composition. It is usually 5 to 30% (molar ratio), preferably 10 to 20% (molar ratio), and more preferably 10 to 15% (molar ratio) of the total amount of the components.
  • Examples of the charged substance imparting a positive charge include saturated or unsaturated aliphatic amines such as stearylamine and oleylamine; saturated or unsaturated cationic synthetic lipids such as dioleoyltrimethylammonium propane and the like.
  • Examples of the charged substance that imparts a negative charge include dicetyl phosphate, cholesterol succinic acid, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, and phosphatidic acid.
  • the membrane protein is an optional component added to maintain the structure of the lipid membrane or to add functionality to the lipid membrane in the n-sheet membrane ribosome or SUV-type ribosome,
  • the blending amount is usually 0.1 2% (molar ratio), preferably 0.5 2% (molar ratio), more preferably 12% (molar ratio) of the total blending amount of the lipid membrane components.
  • membrane proteins include membrane surface proteins and integral membrane proteins.
  • the conditions for contacting the positively or negatively charged particles with the negatively or positively charged SUV-type ribosome are not particularly limited, but the temperature is usually 10 to 40 ° C, preferably 20 ° C. 30 ° C, pH is usually 6.5 to 8.0, preferably 7.0 to 7.5, and time is usually:! To 20 minutes, preferably 5 to 10 minutes.
  • the solvent used for the contact is not particularly limited, and for example, HEPES buffer, physiological saline, sucrose solution, etc. can be used.
  • the amount of negatively charged or positively charged SUV-type ribosomes dispersed in a solvent is usually an excessive amount with respect to positively charged or negatively charged particles, for example, for inclusion of positively charged or negatively charged particles.
  • the theoretically minimum required negative charge or positive charge SUV type liposome amount is 24 times the amount.
  • a negatively charged SUV ribosome When a negatively charged SUV ribosome is brought into contact with a positively charged particle, the positively charged particle and the negatively charged SUV ribosome are bound via an electrostatic interaction, and the surface of the positively charged particle is Are covered by multiple negatively charged SUV-type ribosomes. As a result, a negatively charged complex including positively charged particles and a plurality of negatively charged SUV ribosomes electrostatically bound to the positively charged particles is formed. At this time, a negatively chargeable complex having a zeta potential of 20 50 mV is preferably formed, and a negatively chargeable complex having a zeta electron of ⁇ 20 to 30 mV is more preferably formed.
  • the negatively charged SUV-type ribosome electrostatically bound to the positively charged particles can be efficiently treated with cations.
  • the zeta potential of the negatively chargeable complex can be adjusted by adjusting the zeta potential, particle size, etc. of the positively charged particles and the negatively chargeable SUV ribosome.
  • a positively charged SUV-type ribosome When a positively charged SUV-type ribosome is brought into contact with a negatively charged particle, the negatively charged particle and the positively charged SUV-type ribosome are bound via an electrostatic interaction, and the surface of the negatively charged particle is Are covered by multiple positively charged SUV-type ribosomes. As a result, a positively charged complex including negatively charged particles and a plurality of positively charged SUV ribosomes electrostatically bound to the negatively charged particles is formed. At this time, a positively chargeable complex having a zeta potential of 20 50 mV It is more preferable that a positively chargeable complex having a zeta electron of 20 to 30 mV is formed.
  • the positively charged SU V ribosome electrostatically bound to the negatively charged particles can be efficiently treated with an anion.
  • the zeta potential of the positively chargeable complex can be adjusted by adjusting the zeta potential, particle size, etc. of the negatively charged particles and the positively charged SUV ribosome.
  • the formed negatively chargeable complex is then treated with a cation.
  • the formed positively chargeable composite is then treated with an anion.
  • the cation is not particularly limited, and examples thereof include monovalent cations such as H + ; divalent cations such as Ca 2+ and Mg 2+ ; trivalent cations such as Al 3 + and the like.
  • the quality ones causing H + for example, hydrochloric acid, can be used an acid such as acetic, is a substance causing Ca 2+, for example, can be used Shioi ⁇ calcium or the like, Mg 2+
  • magnesium chloride or the like can be used as a substance that generates Al 3 +
  • aluminum chloride or the like can be used as a substance that generates Al 3+ , for example.
  • Anions are not particularly limited, for example, OH-, SO 2_ , PO 3_ , dissociation type
  • Examples include short chain fatty acids.
  • H_ for example, sodium hydroxide can be used, and as a substance that generates SO 2 , for example, sodium sulfate or the like
  • sodium phosphate As a substance that can be used and generates PO 3_ , for example, sodium phosphate is used.
  • Examples of substances that produce dissociated short-chain fatty acids include force prillic acid (CH (CH
  • the conditions for treating the negatively chargeable complex with a cation are not particularly limited, but the temperature is usually 10 to 40 ° C, preferably 20 to 30 ° C, and the pH is usually 6.5. ⁇ 8.0, preferably 7.0 to 7.5, and the time is usually 1 to 20 minutes, preferably 5 to 10 minutes.
  • the solvent used in the catalysis treatment is not particularly limited as long as it is an aqueous solution.
  • a HEPES buffer or the like can be used.
  • the amount of the cation added to the solvent can be appropriately adjusted according to the properties of the catalyst and the like, but is usually 50 times the amount of lipid (cation mole / lipid mole) or more.
  • the conditions for treating the positively chargeable composite with an anion are not particularly limited, but the temperature is usually 10 to 40 ° C, preferably 20 to 30 ° C, and the pH is usually 6.5. ⁇ 8.0, preferably 7.0 to 7.5, and the time is usually 1 to 20 minutes, preferably 5 to 10 minutes.
  • the solvent used in the anion treatment is not particularly limited as long as it is an aqueous solution. For example, a HEPES buffer or the like can be used.
  • the amount of anion added to the solvent can be appropriately adjusted according to the properties of the anion, but is usually 50 times the amount of lipid (anion mole / lipid mole) or more.
  • the aggregate of the target substance When the aggregate of the target substance is used as positively or negatively charged particles, the aggregate of the target substance is enclosed, and a space is formed between the two lipid membranes covering the aggregate of the target substance.
  • n-membrane ribosome n is an integer of 1 or more
  • 2 (N + 2) membrane ribosomes with spaces formed between the lipid membranes are produced.
  • Ribosomes obtained by coating positively charged particles with two lipid membranes using the first method of the present invention are usually negatively charged. However, depending on the magnitude of the zeta potential of the negatively chargeable composite, the type of cation, etc., it may be positively charged.
  • the ribosome obtained by coating negatively charged particles with two lipid membranes using the second method of the present invention is usually positively charged. However, depending on the magnitude of the zeta potential of the positively chargeable composite, the type of anion, etc., it may be negatively charged.
  • the obtained positively charged ribosome is obtained.
  • the surface of the obtained negatively charged ribosomes or neutral ribosomes is modified with a cationic substance to prepare positively charged ribosomes. It is possible to use ribosomes as positively charged particles in the first method of the present invention.
  • multilamellar ribosomes can be produced while controlling the number of lipid membranes.
  • a negatively charged ribosome is obtained by coating positively or negatively charged particles with two lipid membranes using the first or second method of the present invention, the obtained negatively charged ribosome is obtained. Can be used as the negatively charged particles in the second method of the present invention.
  • positively charged ribosomes or neutral ribosomes are obtained, the surface of positively charged ribosomes or neutral liposomes is modified with an anionic substance to prepare negatively charged ribosomes. It can be used as negatively charged particles in the second method of the invention.
  • two new lipid membranes can be formed outside the two already formed lipid membranes, Multilamellar ribosomes can be produced while controlling the number of lipid membranes.
  • two new lipid membranes are formed outside the two already formed lipid membranes, they are formed between the two lipid membranes already formed and the two lipid membranes. The preserved space is kept as it is.
  • the target substance is preferably encapsulated in the ribosome obtained by coating positively or negatively charged particles with two lipid membranes by the first or second method of the present invention.
  • the target substance is a substance to be delivered into the cell or nucleus (for example, a nucleic acid, peptide, protein, drug, sugar, complex thereof, etc.)
  • the ribosome encapsulating the target substance is replaced with the target substance. It can be used as a vector for intracellular or nuclear delivery.
  • the ribosome in which the target substance is encapsulated can be obtained by using aggregates of the target substance as positively or negatively charged particles, and in the n-sheet membrane in which the target substance is encapsulated as positively or negatively charged particles. It can be obtained by using ribosomes. Also positively charged or negatively charged It can be obtained by holding the target substance between two newly formed lipid membranes on the outside of the particles (for example, by holding a liquid containing the target substance).
  • the biological species from which the cell to which the target substance is delivered is derived is not particularly limited, and may be any animal, plant, microorganism, etc., but is preferably a mammal that is preferably an animal. It is even better to be there. Examples of mammals include humans, monkeys, mice, hidges, sheep, horses, pigs, rabbits, dogs, cats, rats, mice, guinea pigs and the like.
  • the type of cell to which the target substance is delivered is not particularly limited, and examples thereof include somatic cells, germ cells, stem cells, or cultured cells thereof.
  • the ribosome encapsulating the target substance can be used, for example, in the state of a dispersion.
  • a dispersion solvent for example, a buffer solution such as a physiological saline, a phosphate buffer, a quench buffer, and an acetic acid buffer can be used.
  • additives such as sugars, polyvalent alcohol, water-soluble polymers, nonionic surfactants, antioxidants, pH regulators, hydration accelerators may be added to the dispersion. ⁇ .
  • the ribosome encapsulating the target substance can be used both in vivo and in vitro.
  • examples of the route of administration include parenteral administration such as intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, and nasal administration.
  • the dosage and the number of administrations are the types of the target substance enclosed in the liposome. It can be appropriately adjusted according to the amount and the like.
  • DNA and poly-L-lysine were each dissolved in 5 mM HEPES buffer (pH 7.4).
  • plasmid DNA a plasmid DNA having a total length of about 7 kbp containing a CMV promoter and a luciferase gene linked downstream thereof
  • DNA DNA
  • poly-L-lysine solution 0.1 mgZmL
  • the particle size of the DNA / poly-L-lysine complex thus prepared was about 70-100 nm and the zeta potential was about 30-40 mV.
  • the hydrodynamic diameter is measured by the quasi-elastic light scattering method, and the zeta potential is electrophoretic.
  • the analysis was performed with a light scattering spectrophotometer (ELS-8000) (the same applies hereinafter).
  • Fluorescent labeling of SUV-type ribosomes can be achieved by incorporating rhodamine (red) or NBD (4-nitrobenzo-2-oxa-l, 3-diazole) labeled dioleoylphosphatidylethanolamine (blue). went. At this time, rhodamine as an aqueous phase marker was dissolved in a solvent that hydrates the lipid membrane (10 mM), and NBD-labeled lipid as a lipid marker was dissolved in a clotted form solution (0.1 to the total lipid). Mol%).
  • SUV-type ribosome 500 ⁇ L was added to DNA / poly L-lysine complex-containing solution 250 ⁇ L, and both were brought into contact with each other. As a result, a complex containing a DNA / poly-L-lysine complex and a plurality of SUV-type ribosomes electrostatically bound to the DNA / poly-L-lysine complex is formed.
  • the particle size of this complex was about 500-3000 nm and the zeta potential was about ⁇ 3 OmV.
  • the contact was performed at room temperature (about 25 ° C) for 5 minutes.
  • the H + treated suspension was layered on a discontinuous sucrose density gradient (0, 30, 60%) and ultracentrifuged at 20 ° C, 1 60, OOOg for 2 hours. It was. LmL fractions were collected from the top and measured for fluorescence intensity. Among the fractions collected by discontinuous sucrose density gradient ultracentrifugation, the fraction with a high DNA content was designated as a ribosome-containing fraction.
  • the ribosome-containing fraction is sucrose 30-60. It was possible to recover from the boundary of / o.
  • the DNAZ poly-L-lysine complex was covered with a lipid membrane, and the ribosome encapsulating the DNA / poly-L-lysine complex (hereinafter referred to as “first ribosome”) was prepared.
  • first ribosome the ribosome encapsulating the DNA / poly-L-lysine complex
  • SUV-type ribosomes that were fluorescently labeled with NBD-labeled lipid (blue) were used.
  • octarginine 5 mol 0 % of total lipids was added to the surface of the first ribosome. /.) was introduced (hereinafter referred to as “second ribosome”).
  • the zeta potential of the first liposome was negative (approximately 30 mM), but the zeta potential of the second ribosome obtained by introducing octaarginine onto the surface of the first ribosome was positive (approximately 30 to 50mV).
  • an SUV-type liposome (particle size: about 50 to 100 nm, zeta potential: about 30 mV, lipid concentration: 0.5 mM, addition amount: 1.5 mL) was added and both were brought into contact.
  • a complex including the second ribosome and a plurality of SUV-type ribosomes electrostatically bound to the second ribosome is considered to be formed.
  • SUV-type ribosomes in which the inner aqueous phase was fluorescently labeled with rhodamine were used.
  • the particle size of the formed composite was about 340 to 1500 nm, and the zeta potential was about ⁇ 30 mV.
  • the fraction with high DNA content (fraction 11) was used as the ribosome-containing fraction.
  • the ribosome-containing fraction is sucrose 5-30. It was possible to recover from the boundary of / o.
  • the inner aqueous phase containing rhodamine is Ribosome lipid membrane and the lipid membrane formed outside of the second ribosome, and then fluorescence energy transfer should be observed between NBD and rhodamine. is there.
  • the lipid membrane of the second ribosome and the lipid membrane of the SUV ribosome are fused by membrane fusion between SUV ribosomes electrostatically bound to the second ribosome.
  • the inner aqueous phase containing rhodamine is considered to be retained inside the second ribosome, so that there is a fluorescence energy transfer between the NBD and rhodamine. Should be observed.
  • the DNAZ poly-L-lysine complex When the DNAZ poly-L-lysine complex is coated with a lipid membrane and the ribosome encapsulating the DNA / poly-L-lysine complex (the first ribosome) is prepared, the inner aqueous phase is formed with rhodamine as the SUV-type ribosome.
  • NBD as a SUV-type ribosome when using a fluorescently-labeled product and forming a complex containing a second ribosome and multiple SUV-type ribosomes electrostatically bound to the second ribosome
  • a fluorescently labeled lipid was used.
  • the suspension after H + treatment was layered on a discontinuous sucrose density gradient (0, 5, 30%), and ultracentrifugation was performed for 2 hours at 20 ° C, 160, OOOg. Fractions were collected from the top in 1 mL portions. The DNA content of each fraction was measured by DNA agarose gel electrophoresis (see Fig. 2 (a)), and the fluorescence intensity of rhodamine and NBD was measured to calculate the rhodamine content and NBD content (see Fig. 2 (b)). ).
  • a DNA / poly-L-lysine complex was formed according to Example 1 (1).
  • an SUV ribosome having a lipid membrane composed of egg yolk phosphatidylcholine / cholesterol succinic acid (9: 2 (molar ratio)) (hereinafter referred to as “first SUV ribosome”).
  • An SUV-type ribosome (hereinafter referred to as “second SUV-type liposome”) having a lipid membrane composed of dioleoylphosphatidylethanolamine / cholesterol succinic acid (9: 2 (molar ratio)) was prepared.
  • the first SUV-type ribosome was used to coat the DNA / poly-1L-lysine complex with a lipid membrane to prepare ribosome A (double membrane).
  • the DNAZ poly-L-lysine complex was coated with a lipid membrane using the second SUV-type liposome to prepare ribosome B (double membrane).
  • ribosome A (4 membranes) was prepared by coating ribosome A with a lipid membrane using the second SUV-type ribosome.
  • liposome B was coated with a lipid membrane to prepare ribosome D (four-layer membrane).
  • the amount of protein in the cell lysate was measured using a BCA protein quantification kit (PIERCE, Rockford (IL)). The results are shown in Fig. 3. As shown in Fig. 3, it was shown that the function of the ribosome (gene transfer ability) was changed by changing the composition and number of lipid membranes constituting the ribosome.

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Abstract

　被覆対象である粒子を、その間に空間が形成された２枚の脂質膜で被覆することができる方法を提供することを目的とし、この目的を達成するために、正帯電性粒子を２枚の脂質膜で被覆する方法であって、前記正帯電性粒子に複数の負帯電性ＳＵＶ型リポソームを接触させ、前記正帯電性粒子と前記正帯電性粒子に静電的に結合した前記負帯電性ＳＵＶ型リポソームとを含む負帯電性複合体を形成させ、前記負帯電性複合体をカチオンで処理する。

Description

明 細 書
粒子を脂質膜で被覆する方法
技術分野
[0001] 本発明は、粒子を脂質膜で被覆する方法に関する。
背景技術
[0002] 近年、薬物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖等を標的部位に確実に送達するため のベクターの開発が盛んに行われている。例えば、遺伝子治療においては、 目的の 遺伝子を標的細胞へ導入するためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス、 アデノ関連ウィルス等のウィルスベクターが開発されている。し力 ながら、ウィルス ベクターは、大量生産の困難性、抗原性、毒性等の問題があるため、このような問題 点が少ないリボソームベクターが注目を集めている。リボソームベクターは、その表面 に抗体、タンパク質、糖鎖等の機能性分子を導入することにより、標的部位に対する 指向性を向上させることができるという利点も有している。
[0003] リボソームの調製方法としては、例えば、脂質膜の単純水和法が知られている。脂 質膜の単純水和法によれば、遺伝子等の目的物質の存在下、脂質膜を水和させる ことにより目的物質が封入された多重膜リボソームを調製することができる（非特許文 献 1)。こうして調製された多重膜リボソームに対して脂質膜の単純水和法を再度適 用することにより、多重膜リボソームの外側にさらに新たな脂質膜を重層することがで きる。このように脂質膜の単純水和法を繰り返し行うことにより、多重膜リボソームに含 まれる脂質膜の数を増加させることができる。
非特許文献 l : Kogure等， rjournal of Controlled Release] , 2004年， 98卷， 317-323 頁
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] しかしながら、脂質膜の単純水和法等の従来の方法では、脂質膜が不均一に重層 されるため、多重膜リボソームに含まれる脂質膜の数を制御することは困難であった 。また、脂質膜の単純水和法等の従来の方法では、脂質膜が地層のように何層にも 重ねられるだけであり、脂質膜の間に空間を形成させることは困難であった。
[0005] そこで、本発明は、被覆対象である粒子を、その間に空間が形成された 2枚の脂質 膜で被覆することができる方法、及び該方法によって被覆対象である粒子を 2枚の脂 質膜で被覆して得られるリボソームを提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明の第 1の方法は、正帯電性粒子を 2枚の脂質膜で被覆する方法であって、 前記正帯電性粒子に複数の負帯電性 SUV型リボソームを接触させ、前記正帯電性 粒子と前記正帯電性粒子に静電的に結合した前記負帯電性 SUV型リボソームとを 含む負帯電性複合体を形成させ、前記負帯電性複合体をカチオンで処理することを 特徴とする。
[0007] 本発明の第 1の方法によれば、正帯電性粒子を、その間に空間が形成された 2枚 の脂質膜で被覆することができる。正帯電性粒子を本発明の第 1の方法により被覆し て得られるリボソームにおいて、正帯電性粒子を被覆する 2枚の脂質膜 (正帯電性粒 子の外側に形成された第 1の脂質膜及び第 1の脂質膜の外側に形成された第 2の脂 質膜)の間には空間が形成されており、この空間には所望の物質を保持させることが できる。
[0008] 本発明の第 1の方法において、前記正帯電性粒子が目的物質の凝集体であること が好ましい。この場合、 目的物質の凝集体が封入されており、 目的物質の凝集体を 被覆する 2枚の脂質膜の間に空間が形成された 2枚膜リボソームを作製することがで きる。
[0009] 本発明の第 1の方法において、前記正帯電性粒子が正帯電性 n枚膜リボソーム (n は 1以上の整数である。）であることが好ましい。この場合、正帯電性 n枚膜リボソーム を被覆する 2枚の脂質膜の間に空間が形成された (n + 2)枚膜リボソームを作製する こと力 Sできる。
[0010] 本発明の第 1の方法において、前記正帯電性粒子のゼータ電位が 20 30mVで あり、前記負帯電性 SUV型リボソームのゼータ電位が 20 30mVであることが 好ましい。この場合、正帯電性粒子と該正帯電性粒子に静電的に結合した複数の負 帯電性 SUV型リボソームとを含む負帯電性複合体を効率よく形成させることができる [0011] 本発明の第 1の方法において、前記正帯電性粒子の粒径が 50nm以上であること が好ましい。この場合、正帯電性粒子と該正帯電性粒子に静電的に結合した複数の 負帯電性 SUV型リボソームとを含む負帯電性複合体を効率よく形成させることがで きる。
[0012] 本発明の第 2の方法は、負帯電性粒子を 2枚の脂質膜で被覆する方法であって、 前記負帯電性粒子に複数の正帯電性 SUV型リボソームを接触させ、前記負帯電性 粒子と前記負帯電性粒子に静電的に結合した前記正帯電性 SUV型リボソームとを 含む正帯電性複合体を形成させ、前記正帯電性複合体をァニオンで処理することを 特徴とする。
[0013] 本発明の第 2の方法によれば、負帯電性粒子を、その間に空間が形成された 2枚 の脂質膜で被覆することができる。負帯電性粒子を本発明の第 2の方法により被覆し て得られるリボソームにおいて、負帯電性粒子を被覆する 2枚の脂質膜の間 (負帯電 性粒子の外側に形成された第 1の脂質膜及び第 1の脂質膜の外側に形成された第 2 の脂質膜）には空間が形成されており、この空間には所望の物質を保持させることが できる。
[0014] 本発明の第 2の方法において、前記負帯電性粒子が目的物質の凝集体であること が好ましい。この場合、 目的物質の凝集体が封入されており、 目的物質の凝集体を 被覆する 2枚の脂質膜の間に空間が形成された 2枚膜リボソームを作製することがで きる。
[0015] 本発明の第 2の方法において、前記負帯電性粒子が負帯電性 n枚膜リボソーム (n は 1以上の整数である。）であることが好ましい。この場合、負帯電性 n枚膜リボソーム を被覆する 2枚の脂質膜の間に空間が形成された (n + 2)枚膜リボソームを作製する こと力 Sできる。
[0016] 本発明の第 2の方法において、前記負帯電性粒子のゼータ電位が— 20〜― 30m Vであり、前記正帯電性 SUV型リボソームのゼータ電位が 20〜30mVであることが 好ましい。この場合、負帯電性粒子と該負帯電性粒子に静電的に結合した複数の正 帯電性 SUV型リボソームとを含む正帯電性複合体を効率よく形成させることができる [0017] 本発明の第 2の方法において、前記負帯電性粒子の粒径が 50nm以上であること が好ましい。この場合、負帯電性粒子と該負帯電性粒子に静電的に結合した複数の 正帯電性 SUV型リボソームとを含む正帯電性複合体を効率よく形成させることがで きる。
発明の効果
[0018] 本発明の方法によれば、被覆対象である粒子を、その間に空間が形成された 2枚 の脂質膜で被覆することができる。したがって、被覆対象である粒子として目的物質 の凝集体を使用すれば、 目的物質の凝集体が封入されており、 目的物質の凝集体 を被覆する 2枚の脂質膜の間に空間が形成された 2枚膜リボソームを作製することが でき、被覆対象である粒子として n枚膜リボソーム (nは 1以上の整数である。）を使用 すれば、 n枚膜リボソームを被覆する 2枚の脂質膜の間に空間が形成された (n + 2) 枚膜リボソームを作製することができる。正帯電性粒子又は負帯電性粒子を本発明 の方法により被覆して得られるリボソームにおいて、正帯電性粒子又は負帯電性粒 子を被覆する 2枚の脂質膜の間には空間が形成されており、この空間には所望の物 質を保持させることができる。
図面の簡単な説明
[0019] [図 1] (a)は各フラクションの DNA含量を DNAァガロースゲル電気泳動によって測定 した結果を示す図であり、 (b)は各フラクションのローダミン含量及び NBD含量を蛍 光強度によって測定した結果を示す図である。
[図 2] (a)は各フラクションの DNA含量を DNAァガロースゲル電気泳動によって測定 した結果を示す図であり、 (b)は各フラクションのローダミン含量及び NBD含量を蛍 光強度によって測定した結果を示す図である。
[図 3]各種多重リボソームによって細胞内に導入されたルシフェラーゼ遺伝子の発現 活性を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0020] 本発明の第 1の方法においては、まず、正帯電性粒子に複数の負帯電性 SUV型リ ポソームを接触させ、正帯電性粒子と正帯電性粒子に静電的に結合した負帯電性 s uv型リボソームとを含む負帯電性複合体を形成させる。
本発明の第 2の方法においては、まず、負帯電性粒子に複数の正帯電性 SUV型リ ポソームを接触させ、負帯電性粒子と負帯電性粒子に静電的に結合した正帯電性 S UV型リボソームとを含む正帯電性複合体を形成させる。
[0021] 正帯電性粒子のゼータ電位は正である限り特に限定されるものではないが、通常 1 0〜60mV、好ましくは 20〜50mV、さらに好ましくは 20〜30mVである。負帯電性 粒子のゼータ電位は負である限り特に限定されるものではなレ、が、通常— 10〜― 60 mV、好ましくは一20〜一 50mV、さらに好ましくは一20〜一 30mVである。ゼータ 電位の測定条件は特に限定されるものはないが、温度条件は通常 25°Cである。
[0022] 正帯電性粒子及び負帯電性粒子の粒径は特に限定されるものではなレ、が、粒径 の下限値は、好ましくは 50nm、さらに好ましくは 70nmであり、粒径の上限値は、好 ましくは 500nm、さらに好ましくは 200nmである。正帯電性粒子の粒径が上記範囲 にあると、正帯電性粒子に静電的に結合した負帯電性 SUV型リボソームをカチオン で処理したときに、正帯電性粒子を 2枚の脂質膜で効率よく被覆することができる。ま た、負帯電性粒子の粒径が上記範囲にあると、負帯電性粒子に静電的に結合した 正帯電性 SUV型リボソームをァニオンで処理したときに、負帯電性粒子を 2枚の脂 質膜で効率よく被覆することができる。
[0023] 正帯電性粒子は、全体として正に帯電する限り、カチオン性物質に加え、中性物質 及び/又はァニオン性物質を含んでいてもよい。負帯電性粒子は、全体として負に 帯電する限り、ァニオン性物質に加え、中性物質及び/又はカチオン性物質を含ん でいてもよい。
[0024] 正帯電性又は負帯電性粒子としては、例えば、 目的物質 (例えば細胞内又は核内 に送達すべき物質)の凝集体を使用することができる。正帯電性又は負帯電性粒子 として目的物質の凝集体を使用する場合、正帯電性又は負帯電性粒子を 2枚の脂 質膜で被覆することにより、 目的物質が封入された 2枚膜リボソームを作製することが できる。 目的物質の凝集体は、 目的物質のみ力 構成されていてもよいし、 目的物質 以外の物質 (例えば、 目的物質を保持する担体）を含んでいてもよい。
[0025] 目的物質が正に帯電している場合、例えば、 目的物質とァニオン性物質とを静電 的に結合させて複合体化することにより、 目的物質の凝集体を調製することができる 。 目的物質が負に帯電している場合、例えば、 目的物質とカチオン性物質とを静電 的に結合させて複合体化することにより、 目的物質の凝集体を調製することができる 。 目的物質が負及び正のいずれにも帯電していない場合、 目的物質とカチオン性物 質とを適当な様式 (例えば、物理的吸着、疎水結合、化学結合等）で結合させて複合 体化することにより、 目的物質の凝集体を調製することができる。複合体化の際、 目 的物質とカチオン性物質又はァニオン性物質との混合比率を調整することにより、全 体として正又は負に帯電する目的物質の凝集体を調製することができる。
[0026] 目的物質は特に限定されるものではなぐ例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、薬 物、糖、これらの複合体等が挙げられる。なお、「核酸」には、 DNA又は RNAに加え 、これらの類似体又は誘導体 (例えば、ペプチド核酸（PNA)、ホスホロチォエート D NA等）が含まれる。また、核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよいし、線 状又は環状のレ、ずれであってもよレ、。
[0027] 目的物質が核酸である場合、核酸とカチオン性物質と静電的に結合させて複合体 化することにより、核酸の凝集体を調製することができる。複合体化の際、核酸とカチ オン性物質との混合比率を調整することにより、全体として正又は負に帯電する核酸 の凝集体を調製することができる。
[0028] 目的物質の凝集体を調製する際に使用するカチオン性物質は、分子中にカチオン 性基を有する物質である限り特に限定されるものではなレ、。カチオン性物質としては 、例えば、カチオン性脂質（例えば、 Lipofectamine (Invitrogen社製））；カチオン性基 を有する高分子；ポリリジン、ポリアルギニン、リジンとアルギニンの共重合体等の塩 基性アミノ酸の単独重合体若しくは共重合体又はこれらの誘導体 (例えばステアリル 化誘導体）；ポリエチレンィミン、ポリ（ァリルァミン）、ポリ（ジァリルジメチルアンモニゥ ムクロライド）、ダルコサミン等のポリカチオン性ポリマー；硫酸プロタミン等を使用する こと力 Sできる。カチオン性物質が有するカチオン性基の数は特に限定されるものでは ないが、好ましくは 2個以上である。カチオン性基は正に荷電し得る限り特に限定さ れるものではなぐ例えば、アミノ基;メチノレアミノ基、ェチルァミノ基等のモノアルキル アミノ基；ジメチルァミノ基、ジェチルァミノ基等のジアルキルアミノ基；ィミノ基；グァニ ジノ基等が挙げられる。
[0029] 目的物質の凝集体を調製する際に使用するァニオン性物質は、分子中にァニオン 性基を有する物質である限り特に限定されるものではなレ、。ァニオン性物質としては 、例えば、ァニオン性脂質；ァニオン性基を有する高分子；ポリアスパラギン酸等の酸 性アミノ酸の単独重合体若しくは共重合体又はこれらの誘導体；キサンタンガム、力 ノレボキシビュルポリマー、カルボキシメチルセルロースポリスチレンスルホン酸塩、ポ リサッカライド、カラギーナン等のポリア二オン性ポリマー等を使用することができる。 ァニオン性物質が有するァニオン性基の数は特に限定されるものではなレ、が、好ま しくは 2個以上である。ァニオン性基は負に荷電し得る限り特に限定されるものでは なぐ例えば、末端カルボキシノレ基を有する官能基 (例えば、コハク酸残基、マロン酸 残基等）、リン酸基、硫酸基等が挙げられる。
[0030] 正帯電性又は負帯電性粒子としては、例えば、正帯電性又は負帯電性 n枚膜リポ ソーム (nは 1以上の整数である。）を使用することができる。正帯電性又は負帯電性 粒子として n枚膜リボソームを使用する場合、正帯電性又は負帯電性粒子を 2枚の脂 質膜で被覆することにより、（n + 2)枚膜リボソームを作製することができる。正帯電性 又は負帯電性 n枚膜リボソームの内部には目的物質 (例えば細胞内又は核内に送達 すべき物質）が封入されていてもよいし、封入されていなくてもよい。正帯電性 n枚膜 リボソームは、全体として正に帯電する限り、カチオン性物質に加え、中性物質及び /又はァニオン性物質を含んでいてもよい。負帯電性 n枚膜リボソームは、全体とし て負に帯電する限り、ァニオン性物質に加え、中性物質及び/又はカチオン性物質 を含んでいてもよい。
[0031] n枚膜リボソームは、例えば、水和法、超音波処理法、エタノール注入法、エーテル 注入法、逆相蒸発法、界面活性剤法、凍結'融解法等の公知の方法を用いて作製 すること力 Sできる。また、 n枚膜リボソームは、本発明の方法を使用して正帯電性又は 負帯電性粒子を 2枚の脂質膜で被覆することにより作製することができる。
[0032] n枚膜リボソームを構成する物質 (例えば、脂質膜構成成分、リボソーム内部に封入 される物質等）の種類及び含有量を調節することにより、正帯電性又は負帯電性 n枚 膜リボソームを作製することができる。また、負帯電性 n枚膜リボソーム又は中性 n枚 膜リボソームの表面をカチオン性物質で修飾することにより、正帯電性 n枚膜リポソ一 ムを作製することができ、正帯電性 n枚膜リボソーム又は中性 n枚膜リボソームの表面 をァニオン性物質で修飾することにより、負帯電性 n枚膜リボソームを作製することが できる。
[0033] n枚膜リボソームは、例えば、水和法により次のように作製することができる。脂質膜 の構成成分を有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を蒸発除去することにより脂質膜を 得る。この際、有機溶剤としては、例えば、ペンタン、へキサン、ヘプタン、シクロへキ サン等の炭化水素類;塩化メチレン、クロ口ホルム等のハロゲン化炭化水素類；ベン ゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類;メタノール、エタノール等の低級アルコール 類；酢酸メチル、酢酸ェチル等のエステル類；アセトン等のケトン類等が挙げられ、こ れらを単独で又は 2種以上を組み合わせて使用することができる。次いで、脂質膜を 水和させ、攪拌又は超音波処理することにより、多重膜リボソームに転換することがで きる。多重膜リボソームから 1枚膜リボソームへの転換又は 1枚膜リボソームから多重 膜リボソームへの転換は公知の方法に従って行うことができる。 n枚膜リボソームを所 定のポアサイズのフィルターで通過させることにより、一定の粒度分布を持った n枚膜 リボソームを得ること力 Sできる。
[0034] 目的物質が水溶性である場合、 n枚膜リボソームの製造にあたり脂質膜を水和する 際に使用される水性溶媒に目的物質又はその凝集体を添加することにより、リポソ一 ム内部の水相に目的物質を封入することができる。また、 目的物質が脂溶性である場 合には、 n枚膜リボソームの製造にあたり使用される有機溶剤に目的物質又はその 凝集体を添加することにより、リボソームの脂質膜に目的物質を封入することができる
[0035] 負帯電性 n枚膜リボソーム又は中性 n枚膜リボソームの表面をカチオン性物質で修 飾する場合、例えば、負帯電性 n枚膜リボソーム又は中性 n枚膜リボソームの外液に 、疎水性基を有するカチオン性物質を添加する。これにより、カチオン性物質が脂質 膜力 露出するように疎水性基が脂質膜に挿入され、負帯電性 n枚膜リボソーム又は 中性 n枚膜リボソームの表面にカチオン性物質を導入することができる。
[0036] 正帯電性 n枚膜リボソーム又は中性 n枚膜リボソームの表面をァニオン性物質で修 飾する場合、例えば、正帯電性 n枚膜リボソーム又は中性 n枚膜リボソームの外液に 、疎水性基を有するァニオン性物質を添加する。これにより、ァニオン性物質が脂質 膜力 露出するように疎水性基が脂質膜に挿入され。正帯電性 n枚膜リボソーム又は 中性 n枚膜リボソームの表面にァニオン性物質を導入することができる。
[0037] 疎水性基は、脂質膜に挿入され得る限り特に限定されるものでない。疎水性基とし ては、例えば、ステアリル基等の飽和又は不飽和の脂肪酸基、コレステロール残基等 のステロール残基、リン脂質残基、糖脂質残基、長鎖脂肪族アルコール残基 (例えば 、フォスファチジルエタノールァミン残基等）、ポリオキシプロピレンアルキル基、グリセ リン脂肪酸エステル残基等が挙げられるが、これらのうち特に炭素数 10〜20の脂肪 酸基 (例えば、パルミトイル基、ォレイル基、ステアリル基、ァラキドイル基等）が好まし レ、。
[0038] n枚膜リボソームにおける脂質膜構成成分は、脂質二重層の形成を阻害しない限り 特に限定されるものではなぐ脂質膜構成成分としては、例えば、脂質、膜安定化剤 、抗酸化剤、荷電物質、膜タンパク質等が挙げられる。
[0039] 正帯電性 n枚膜リボソームにおける脂質膜構成成分の種類及び含有量は、 n枚膜リ ポソームが全体として正に帯電するように調節され、負帯電性 n枚膜リボソームにお ける脂質膜構成成分の種類及び含有量は、 n枚膜リボソームが全体として負に帯電 するように調節される。正の電荷を付与する脂質膜構成成分としては、例えば、カチ オン性脂質、カチオン性膜安定化剤等が挙げられ、負の電荷を付与する脂質膜構 成成分としては、ァニオン性脂質、ァニオン性膜安定化剤等が挙げられる。なお、 n 枚膜リボソームの内部に所定の物質 (例えば目的物質の凝集体）が封入されている 場合、 n枚膜リボソームにおける脂質膜構成成分の種類及び含有量は、 n枚膜リポソ ームの内部に封入されてレ、る物質全体の電荷を考慮して調節される。
[0040] SUV (small unilamellar vesicle)型リボソームは、粒径（直径）が lOOnm以下である
1枚膜リボソームである。 SUV型リボソームの粒径（直径）は lOOnm以下である限り 特に限定されるものではなレ、が、通常 30〜： 100nm、好ましくは 30〜70nm、さらに 好ましくは 30〜50nmである。
[0041] 多重膜リボソーム（MLV)、 SUV以外の 1枚膜リボソーム（例えば LUV (large unila mellar vesicle)、 GUV (giant unilamellar vesicle)等) ίま、粒子径カ SlOOnm以上であ るため（一般的に lOOnm以上の粒子径を有する脂質膜は平面膜として考えられる） 、膜の曲率及び表面エネルギーが小さぐリボソーム同士の凝集が生じ難レ、。これに 対して、 SUV型リボソームは、粒子径が lOOnm未満であるため、膜の曲率及び表面 エネルギーが大きぐリボソーム同士の凝集が生じ易い。したがって、正帯電性粒子 に静電的に結合した負帯電性 SUV型リボソームをカチオンで処理すると、効率よく 負帯電性 SUV型リボソーム同士を膜融合させることができる。また、負帯電性粒子に 静電的に結合した正帯電性 SUV型リボソームをァニオンで処理すると、効率よく正 帯電性 SUV型リボソーム同士を膜融合させることができる。
[0042] SUV型リボソームは、例えば、超音波法により次のようにして作製することができる 。脂質膜の構成成分を有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を蒸発除去することにより 脂質膜を得る。この際、有機溶剤としては、例えば、ペンタン、へキサン、ヘプタン、シ クロへキサン等の炭化水素類;塩化メチレン、クロ口ホルム等のハロゲン化炭化水素 類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類;メタノール、エタノール等の低級アル コール類；酢酸メチル、酢酸ェチル等のエステル類；アセトン等のケトン類等が挙げら れ、これらを単独で又は 2種以上を組み合わせて使用することができる。次いで、脂 質膜を水和させ、攪拌又は超音波槽を用いた超音波処理により多重膜リボソームを 作製することができる。得られた多重膜リボソームを、さらにプローブ型超音波装置に よって超音波処理することにより、小さい 1枚膜リボソームである SUV型リボソームを 調製すること力 Sできる。
[0043] SUV型リボソームにおける脂質膜構成成分は、脂質二重層の形成を阻害しない限 り特に限定されるものではなぐ脂質膜構成成分としては、例えば、脂質、膜安定化 剤、抗酸化剤、荷電物質、膜タンパク質等が挙げられる。
[0044] 正帯電性 SUV型リボソームにおける脂質膜構成成分の種類及び含有量は、 SUV 型リボソームが全体として正に帯電するように調節され、負帯電性 SUV型リボソーム における脂質膜構成成分の種類及び含有量は、 SUV型リボソームが全体として負 に帯電するように調節される。正の電荷を付与する脂質膜構成成分としては、例えば 、カチオン性脂質、カチオン性膜安定化剤等が挙げられ、負の電荷を付与する脂質 膜構成成分としては、ァニオン性脂質、ァニオン性膜安定化剤等が挙げられる。正 帯電性 SUV型リボソームは、全体として正に帯電する限り、正の電荷を付与する脂 質膜構成成分に加え、負の電荷を付与する脂質膜構成成分及び/又は中性の脂 質膜構成成分を含んでいてもよぐ負帯電性 SUV型リボソームは、全体として負に帯 電する限り、負の電荷を付与する脂質膜構成成分に加え、正の電荷を付与する脂質 膜構成成分及び/又は中性の脂質膜構成成分を含んでいてもよい。
[0045] 正帯電性 SUV型リボソームが正の電荷を付与する脂質膜構成成分としてカチオン 性脂質を含む場合、カチオン性脂質の配合量は脂質の総配合量の通常 5〜30% ( モル比）、好ましくは 10〜20% (モル比）、さらに好ましくは 10〜： 15% (モル比）であ る。
負帯電性 SUV型リボソームが負の電荷を付与する脂質膜構成成分としてァニオン 性脂質を含む場合、ァニオン性脂質の配合量は脂質の総配合量の通常 5〜30% ( モル比）、好ましくは 10〜20% (モル比）、さらに好ましくは 10〜： 15% (モル比）であ る。
[0046] 正帯電性 SUV型リボソームのゼータ電位は正である限り特に限定されるものでは ないが、通常 10 60mV、好ましくは 20 50mV、さらに好ましくは 20 30mVであ り、負帯電性 SUV型リボソームのゼータ電位は負である限り特に限定されるものでは ないが、通常一 10 60mV、好ましくは一 20 50mV、さらに好ましくは一 20 30mVである。ゼータ電位の測定条件は特に限定されるものはないが、温度条 件は通常 25°Cである。
[0047] n枚膜リボソーム又は SUV型リボソームにおいて、脂質は脂質膜の必須成分であり 、その配合量は脂質膜構成成分の総配合量の通常 30〜100% (モル比）、好ましく は 50〜： 100% (モル比）、さらに好ましくは 70〜100% (モル比）である。
[0048] 脂質としては、例えば、リン脂質、糖脂質、ステロール、飽和又は不飽和の脂肪酸 等が挙げられる。リン脂質としては、例えば、ホスファチジノレコリン (例えば、ジォレオ ィルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチ ジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン 等）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジォレオイルホスファチジルグリセロール、 ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、 ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジグリセロール 等）、ホスファチジルエタノールァミン（例えば、ジォレオイルホスファチジルエタノー ノレアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールァミン、ジミリストイルホスファチジルェ タノールァミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン、ジステアロイルホスフ ァチジエタノールァミン等）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホス ファチジン酸、カルジォリピン、スフインゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、これ らの水素添加物等が挙げられる。糖脂質としては、例えば、グリセ口糖脂質 (例えば、 スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラタトシルジグリセリド、ガ ラタトシノレジグリセリド、グリコシルジグリセリド）、スフインゴ糖脂質 (例えば、ガラクトシ ルセレブ口シド、ラタトシルセレブ口シド、ガンダリオシド）等が挙げられる。ステロール としては、例えば、動物由来のステロール（例えば、コレステロール、コレステロールコ ハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロ一ノレ、デスモステロール、ジヒドロコレステロ ール）、植物由来のステロール（フィトステロール）（例えば、スチグマステロール、シト ステロール、カンペステロール、ブラシカステロール）、微生物由来のステロール（例 えば、チモステロール、エルゴステロール）等が挙げられる。飽和又は不飽和の脂肪 酸としては、例えば、パルミチン酸、ォレイン酸、ステアリン酸、ァラキドン酸、ミリスチ ン酸等の炭素数 12〜20の飽和又は不飽和の脂肪酸が挙げられる。
脂質は、中性脂質、カチオン性脂質及びァニオン性脂質に分類され、中性脂質と しては、例えば、ジァシルホスファチジルコリン、ジァシルホスファチジルエタノールァ ミン、コレステロール、セラミド、スフインゴミエリン、セフアリン、セレブロシド等が挙げら れ、カチオン性脂質としては、例えば、例えば、 DODAC (dioctadecyldimethylammo mum chloride)、 DOTMA (N- (2,3-dioleyloxy) propyl-N,N,N-trimethylammomum)、 DDAB (didodecylammonium bromide)、 DOTAP ( 1 ,2-dioleoyloxy-3-trimethylammo nio propane)、 DC— Choi (3 β— N- (N'，N，，-dimethy卜 aminoethane)— carbamol choles terol)、 DMRIE (l,2-dimyristoyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium)、 D OSPA (2,3-dioleyloxy-N-[2 (sperminecarboxamido) ethyl]— N,N_dimethy卜 1— propan aminum trifluoroacetate)等が挙げられ、ァニオン性脂質としては、例えば、カルジォ リピン、ジァシルホスファチジルセリン、ジァシルホスファチジン酸、 N—スクシニルホ スファチジルエタノールァミン（N—スクシニル PE)、ホスファチジン酸、ホスファチジ ノレイノシトーノレ、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエチレングリコール、コレ ステロールコハク酸等が挙げられる。
[0050] n枚膜リボソーム又は SUV型リボソームにおいて、膜安定化剤は、脂質膜を物理的 又は化学的に安定させたり、脂質膜の流動性を調節したりするために添加する任意 の成分であり、その配合量は脂質膜構成成分の総配合量の通常 10〜50% (モル比 )、好ましくは 20〜50% (モル比）、さらに好ましくは 30〜50% (モル比）である。
[0051] 膜安定化剤としては、例えば、ステロール、グリセリン又はその脂肪酸エステル等が 挙げられる。ステロールとしては、上記と同様の具体例が挙げられ、グリセリンの脂肪 酸エステルとしては、例えば、トリオレイン、トリオクタノイン等が挙げられる。
[0052] n枚膜リボソーム又は SUV型リボソームにおいて、抗酸化剤は、脂質膜の酸化を防 止するために添加する任意の成分であり、その配合量は脂質膜構成成分の総配合 量の通常 5〜30% (モル比）、好ましくは 10〜30% (モル比）、さらに好ましくは 20〜 30% (モル比）である。
[0053] 抗酸化剤としては、例えば、トコフエロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸ァスコ ルビル、ブチル化ヒドロキシトルエン等が挙げられる。
[0054] n枚膜リボソーム又は SUV型リボソームにおレ、て、荷電物質は、脂質膜に正荷電又 は負荷電を付与するために添加する任意の成分であり、その配合量は脂質膜構成 成分の総配合量の通常 5〜30% (モル比）、好ましくは 10〜20% (モル比）、さらに 好ましくは 10〜： 15% (モル比）である。
[0055] 正荷電を付与する荷電物質としては、例えば、ステアリルァミン、ォレイルァミン等の 飽和又は不飽和脂肪族ァミン；ジォレオイルトリメチルアンモニゥムプロパン等の飽和 又は不飽和カチオン性合成脂質等が挙げられ、負電荷を付与する荷電物質としては 、例えば、ジセチルホスフェート、コレステロールコハク酸、ホスファチジルセリン、ホス ファチジルイノシトール、ホスファチジン酸等が挙げられる。
[0056] n枚膜リボソーム又は SUV型リボソームにおレ、て、膜タンパク質は、脂質膜の構造 を維持したり、脂質膜に機能性を付与したりするために添加する任意の成分であり、 その配合量は脂質膜構成成分の総配合量の通常 0. 1 2% (モル比）、好ましくは 0 . 5 2% (モル比）、さらに好ましくは 1 2% (モル比）である。
[0057] 膜タンパク質としては、例えば、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質等が挙げ られる。
[0058] 正帯電性又は負帯電性粒子にそれぞれ負帯電性又は正帯電性 SUV型リボソーム を接触させる条件は特に限定されるものではないが、温度は通常 10 40°C、好まし くは 20 30°Cであり、 pHは通常 6. 5 8. 0、好ましくは 7. 0〜7. 5であり、時間は 通常:!〜 20分間、好ましくは 5〜： 10分間である。接触させる際に用いる溶媒は特に 限定されるものではなレ、が、例えば、 HEPES緩衝液、生理食塩水、ショ糖溶液等を用 レ、ることができる。溶媒中に分散させる負帯電性又は正帯電性 SUV型リボソームの 量は、通常、正帯電性又は負帯電性粒子に対して過剰量であり、例えば、正帯電性 又は負帯電性粒子の封入に理論上最低限必要な負帯電性又は正帯電性 SUV型リ ポソーム量の 2 4倍量である。
[0059] 正帯電性粒子に負帯電性 SUV型リボソームを接触させると、正帯電性粒子と負帯 電性 SUV型リボソームとは静電的相互作用を介して結合し、正帯電性粒子の表面 は複数の負帯電性 SUV型リボソームによって覆われる。これにより、正帯電性粒子と 正帯電性粒子に静電的に結合した複数の負帯電性 SUV型リボソームとを含む負帯 電性複合体が形成される。この際、ゼータ電位が 20 50mVの負帯電性複合 体が形成されることが好ましく、ゼータ電子が― 20 ― 30mVの負帯電性複合体が 形成されることがさらに好ましい。これにより、正帯電性粒子に静電的に結合した負 帯電性 SUV型リボソームを効率よくカチオンで処理することができる。負帯電性複合 体のゼータ電位は、正帯電性粒子及び負帯電性 SUV型リボソームのゼータ電位、 粒径等を調節することにより調節することができる。
[0060] 負帯電性粒子に正帯電性 SUV型リボソームを接触させると、負帯電性粒子と正帯 電性 SUV型リボソームとは静電的相互作用を介して結合し、負帯電性粒子の表面 は複数の正帯電性 SUV型リボソームによって覆われる。これにより、負帯電性粒子と 負帯電性粒子に静電的に結合した複数の正帯電性 SUV型リボソームとを含む正帯 電性複合体が形成される。この際、ゼータ電位が 20 50mVの正帯電性複合体が 形成されることが好ましぐゼータ電子が 20〜30mVの正帯電性複合体が形成され ることがさらに好ましい。これにより、負帯電性粒子に静電的に結合した正帯電性 SU V型リボソームを効率よくァニオンで処理することができる。正帯電性複合体のゼータ 電位は、負帯電性粒子及び正帯電性 SUV型リボソームのゼータ電位、粒径等を調 節することにより調節すること力 Sできる。
[0061] 本発明の第 1の方法においては、次いで、形成された負帯電性複合体をカチオン で処理する。
本発明の第 2の方法においては、次いで、形成された正帯電性複合体をァニオン で処理する。
[0062] カチオンは特に限定されるものではなぐ例えば、 H+等の 1価のカチオン； Ca2+、 Mg2+等の 2価のカチオン； Al3+等の 3価のカチオン等が挙げられる。 H+を生じる物 質としては、例えば、塩酸、酢酸等の酸を使用することができ、 Ca2+を生じる物質とし ては、例えば、塩ィ匕カルシウム等を使用することができ、 Mg2+を生じる物質としては、 例えば、塩化マグネシウム等を使用することができ、 Al3+を生じる物質としては、例え ば、塩化アルミニウム等を使用することができる。
[0063] ァニオンは特に限定されるものではなぐ例えば、 OH―、 SO 2_、 PO 3_、解離型
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短鎖脂肪酸等が挙げられる。〇H_を生じる物質としては、例えば、水酸化ナトリウム 等を使用することができ、 SO 2一を生じる物質としては、例えば、硫酸ナトリウム等を
4
使用することができ、 PO 3_を生じる物質としては、例えば、リン酸ナトリウム等を使用
4
することができ、解離型短鎖脂肪酸を生じる物質としては、例えば、力プリル酸 (CH (
3
CH ) COOH)等を使用することができる。
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[0064] 負帯電性複合体をカチオンで処理する条件は特に限定されるものではないが、温 度は通常 10〜40°C、好ましくは 20〜30°Cであり、 pHは通常 6. 5〜8. 0、好ましく は 7. 0〜7. 5であり、時間は通常 1〜20分間、好ましくは 5〜： 10分間である。カチォ ン処理の際に用いる溶媒は水溶液である限り特に限定されるものではなぐ例えば、 HEPES緩衝液等を用いることができる。溶媒中に添加するカチオンの量は、カチォ ンの性質等に応じて適宜調節することができるが、通常、脂質量の 50倍量 (カチオン モル/脂質モル)以上である。 [0065] 正帯電性複合体をァニオンで処理する条件は特に限定されるものではないが、温 度は通常 10〜40°C、好ましくは 20〜30°Cであり、 pHは通常 6. 5〜8. 0、好ましく は 7. 0〜7. 5であり、時間は通常 1〜20分間、好ましくは 5〜： 10分間である。ァニォ ン処理の際に用いる溶媒は水溶液である限り特に限定されるものではなぐ例えば、 HEPES緩衝液等を用いることができる。溶媒中に添加するァニオンの量は、ァニォ ンの性質等に応じて適宜調節することができるが、通常、脂質量の 50倍量 (ァニオン モル/脂質モル)以上である。
[0066] 負帯電性複合体をカチオンで処理すると、正帯電性粒子に静電的に結合した負帯 電性 SUV型リボソームの表面の負電荷が消失し、負帯電性 SUV型リボソームの表 面の疎水性が増加し、隣接する負帯電性 SUV型リボソーム同士の膜融合が誘起さ れ、正帯電性粒子が 2枚の脂質膜で被覆される。また、正帯電性複合体をァニオン で処理すると、負帯電性粒子に静電的に結合した正帯電性 SUV型リボソームの表 面の正電荷が消失し、正帯電性 SUV型リボソームの表面の疎水性が増加し、隣接 する正帯電性 SUV型リボソーム同士の膜融合が誘起され、負帯電性粒子が 2枚の 脂質膜で被覆される。こうして正帯電性又は負帯電性粒子の外側には、正帯電性又 は負帯電性粒子を被覆する 2枚の脂質膜が新たに形成されるが、このとき、 2枚の脂 質膜はその間に空間が形成されるように形成される。
[0067] 正帯電性又は負帯電性粒子として目的物質の凝集体を使用した場合、 目的物質 の凝集体が封入されており、 目的物質の凝集体を被覆する 2枚の脂質膜の間に空間 が形成された 2枚膜リボソームが作製され、正帯電性又は負帯電性粒子として n枚膜 リボソーム (nは 1以上の整数である。）を使用した場合、 n枚膜リボソームを被覆する 2 枚の脂質膜の間に空間が形成された (n+ 2)枚膜リボソームが作製される。
[0068] 本発明の第 1の方法を用いて正帯電性粒子を 2枚の脂質膜で被覆することにより得 られるリボソームは、通常、負帯電性である。但し、負帯電性複合体のゼータ電位の 大きさ、カチオンの種類等によっては、正帯電性である場合もあると考えられる。本発 明の第 2の方法を用いて負帯電性粒子を 2枚の脂質膜で被覆することにより得られる リボソームは、通常、正帯電性である。但し、正帯電性複合体のゼータ電位の大きさ 、ァニオンの種類等によっては、負帯電性である場合もあると考えられる。 [0069] 本発明の第 1又は第 2の方法を用いて正帯電性又は負帯電性粒子を 2枚の脂質膜 で被覆することにより正帯電性リボソームが得られた場合、得られた正帯電性リポソ一 ムを本発明の第 1の方法における正帯電性粒子として使用することができる。負帯電 性リボソーム又は中性リボソームが得られた場合、得られた負帯電性リボソーム又は 中性リボソームの表面をカチオン性物質で修飾して正帯電性リボソームを調製し、調 製された正帯電性リボソームを本発明の第 1の方法における正帯電性粒子として使 用すること力 Sできる。このように、本発明の第 1及び Z又は第 2の方法を繰り返し行うこ とにより、脂質膜の数を制御しながら多重膜リボソームを作製することができる。
[0070] 本発明の第 1又は第 2の方法を用いて正帯電性又は負帯電性粒子を 2枚の脂質膜 で被覆することにより負帯電性リボソームが得られた場合、得られた負帯電性リポソ一 ムを本発明の第 2の方法における負帯電性粒子として使用することができる。正帯電 性リボソーム又は中性リボソームが得られる場合、正帯電性リボソーム又は中性リポソ ームの表面をァニオン性物質で修飾して負帯電性リボソームを調製し、調製された 負帯電性リボソームを本発明の第 2の方法における負帯電性粒子として使用すること ができる。このように、本発明の第 1及び/又は第 2の方法を繰り返し行うことにより、 既に形成されている 2枚の脂質膜の外側に新たな 2枚の脂質膜を形成させることがで き、脂質膜の数を制御しながら多重膜リボソームを作製することができる。なお、既に 形成されている 2枚の脂質膜の外側に新たな 2枚の脂質膜が形成される際、既に形 成されている 2枚の脂質膜及び当該 2枚の脂質膜の間に形成されている空間はその まま保持される。
[0071] 本発明の第 1又は第 2の方法によって正帯電性又は負帯電性粒子を 2枚の脂質膜 で被覆することにより得られるリボソームには、 目的物質が封入されていることが好ま しい。 目的物質が細胞内又は核内に送達すべき物質 (例えば、核酸、ペプチド、タン パク質、薬物、糖、これらの複合体等）である場合、 目的物質が封入されたリボソーム を、 目的物質の細胞内又は核内送達用ベクターとして使用することができる。 目的物 質が封入されたリボソームは、正帯電性又は負帯電性粒子として目的物質の凝集体 を使用することにより、また、正帯電性又は負帯電性粒子として目的物質が封入され た n枚膜リボソームを使用することにより得ることができる。また、正帯電性又は負帯電 性粒子の外側に新たに形成される 2枚の脂質膜の間に目的物質を保持させることに より（例えば、 目的物質を含有する液体を保持させることにより）得ることができる。
[0072] 目的物質を送達すべき細胞が由来する生物種は特に限定されるものではなぐ動 物、植物、微生物等のいずれであってもよいが、動物であることが好ましぐ哺乳動物 であることがさらに好ましレ、。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ゥシ、ヒッジ、ャ ギ、ゥマ、ブタ、ゥサギ、ィヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。また、 目的物質を送達すべき細胞の種類は特に限定されるものではなぐ例えば、体細胞 、生殖細胞、幹細胞又はこれらの培養細胞等が挙げられる。
[0073] 目的物質が封入されたリボソームは、例えば、分散液の状態で使用することができ る。分散溶媒としては、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液，クェン緩衝液，酢酸緩 衝液等の緩衝液を使用することができる。分散液には、例えば、糖類、多価アルコー ノレ、水溶性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、 pH調節剤、水和促進剤等の 添加剤を添加して使用してもよレヽ。
[0074] 目的物質が封入されたリボソームは、 in vivo及び in vitroのいずれにおいても使用 することもできる。 in vivoにおいて使用する場合、投与経路としては、例えば、静脈、 腹腔内、皮下、経鼻等の非経口投与が挙げられ、投与量及び投与回数は、リポソ一 ムに封入された目的物質の種類や量等に応じて適宜調節することができる。
実施例
[0075] 〔実施例 1〕
( 1 ) DNAZポリ _ L—リシン複合体の形成
DNA及びポリ一L—リシンをそれぞれ 5mM HEPESバッファー（pH7. 4)に溶解 した。なお、 DNAとしては、プラスミド DNA(CMVプロモータ及びその下流に連結さ れたルシフェラーゼ遺伝子を含有する全長約 7kbpのプラスミド DNA)を用いた。次 いで、 DNA溶液（0. lmgZmL)及びポリ— L—リシン溶液（0. lmgZmL)を混合 し、室温下、ボルテックスを用いて攪拌し、 DNA/ポリ— L—リシン複合体含有液（D NA濃度 0· 05mg/mL)を調製した。こうして調製された DNA/ポリ一 L—リシン複 合体の粒径は約 70〜100nmであり、ゼータ電位は約 30〜40mVであった。なお、 流体力学的直径は準弾性光散乱方法によって測定し、ゼータ電位は、電気泳動的 光散乱分光測光器 (ELS-8000)によって分析した (以下同様)。
[0076] (2) SUV型リボソームの調製
卵黄ホスファチジルコリン/コレステロールコハク酸（9： 2 (モル比） )をクロ口ホルム 0 . 5mLに溶解し、溶解液をガラス試験管に収容した。窒素ガスの吹き付けにより溶媒 を除去した後、デシケーター内に 1時間収納して乾燥させた。得られた脂質膜 (0. 5 5 μモノレ）を、予め 25°Cまで温めておいた HEPES緩衝液 lmLを用いて水和させ、 超音波槽で超音波処理することにより脂質膜を剥離した。さらにプローブ型超音波装 置により 10分間超音波処理を行うことによって、 SUV型リボソームを調製した。こうし て調製された SUV型リボソームの粒径は約 50〜： !OOnmであり、ゼータ電位は約— 30mVであった。
[0077] SUV型リボソームの蛍光標識は、ローダミン（赤）又は NBD (4-nitrobenzo-2-oxa- l，3-diazole)標識化ジォレオイルホスファチジルエタノールァミン（青）を取り込ませる ことにより行った。この際、水相マーカーとしてのローダミンは脂質膜を水和する溶媒 中に溶かし（10mM)、脂質マーカーとしての NBD標識化脂質はクロ口ホルム溶液に 溶力した（総脂質に対して 0. 1モル％)。
[0078] (3) DNA/ポリ L リシン複合体の脂質膜による被覆
DNA/ポリ L—リシン複合体含有液 250 μ Lに SUV型リボソーム 500 μ Lを添 加して、両者を接触させた。これにより、 DNA/ポリ—L—リシン複合体と、 DNA/ ポリ L リシン複合体に静電的に結合した複数の SUV型リボソームとを含む複合 体が形成されると考えられる。この複合体の粒径は約 500〜3000nmであり、ゼータ 電位は約— 3 OmVであった。なお、接触は室温 (約 25°C)で 5分間行った。
[0079] 接触後、 0. 1N塩酸 55 μ Lを添カ卩し、上記複合体を Η+で処理した。これにより、 D ΝΑ /ポリ— L—リシン複合体に静電的に結合した SUV型リボソームの表面の負電 荷が消失し、 SUV型リボソームの表面の疎水性が増加し、隣接する SUV型リポソ一 ム同士の膜融合が誘起されると考えられる。 Η+処理後の粒径は約 85〜： 130nmであ り、ゼータ電位は約—20〜― 40mVであった。 H+処理によって粒径が小さくなつて レ、ることから、 DNA/ポリ一L—リシン複合体に静電的に結合した SUV型リボソーム 同士の膜融合が誘起され、 DNAZポリ— L—リシン複合体が脂質膜で被覆され、 D NA/ポリ L リシン複合体が封入されたリボソームが形成されたことが示された。
[0080] H+処理後の懸濁液を不連続ショ糖密度勾配（0, 30, 60%)上に重層し、 20°C、 1 60, OOOgの条件で 2時間、超遠心分離を行った。上部から lmLずつ画分を回収し、 蛍光強度を測定した。不連続ショ糖密度勾配超遠心分離によって回収された画分の うち、 DNA含量の高い画分をリボソーム含有画分とした。リボソーム含有画分は、ショ 糖 30〜60。/oの境界から回収することができた。
[0081] 〔実施例 2〕
実施例 1と同様にして、 DNAZポリ—L—リシン複合体を脂質膜で被覆し、 DNA /ポリ— L—リシン複合体が封入されたリボソーム（以下「第 1のリボソーム」とレ、う）を 調製した。なお、この際、 SUV型リボソームとして NBD標識化脂質 (青)で蛍光標識 したものを使用した。
[0082] 第 1のリボソームの外液に lmgZmLステアリル化ォクタアルギニン溶液 12 μ Lを 添加し、室温で 30分間放置することにより、第 1のリボソームの表面にォクタアルギニ ン（総脂質の 5モル0/。）を導入した（以下「第 2のリボソーム」という）。なお、第 1のリポ ソームのゼータ電位は負（約 30mM)であったが、第 1のリボソームの表面にォクタ アルギニンを導入して得られた第 2のリボソームのゼータ電位は正（約 30〜50mV) であった。
[0083] 実施例 1と同様にして、第 2のリボソーム含有液（0· 37mM, 750 /i L)に SUV型リ ポソーム（粒径：約 50〜100nm,ゼータ電位：約 30mV,脂質濃度： 0. 55mM, 添加量： 1. 5mL)を添加し、両者を接触させた。これにより、第 2のリボソームと、第 2 のリボソームに静電的に結合した複数の SUV型リボソームとを含む複合体が形成さ れると考えられる。なお、この際、 SUV型リボソームとしてローダミンで内水相を蛍光 標識したものを使用した。形成された複合体の粒径は約 340〜： 1500nmであり、ゼ ータ電位は約― 30mVであった。
[0084] 接触後、 0. 1N塩酸 165 μ Lを添加し、上記複合体を Η+で処理した。これにより、 第 2のリボソームに静電的に結合した SUV型リボソームの表面の負電荷が消失し、 S UV型リボソームの表面の疎水性が増加し、 Ρ 接する SUV型リボソーム同士の膜融 合が誘起されると考えられる。 Η+処理後の粒径は約 170〜240nmであり、ゼータ電 位は約一 60mVであった。 H+処理によって粒径が小さくなつていることから、第 2のリ ポソームに静電的に結合した SUV型リボソーム同士の膜融合が誘起され、第 2のリ ポソームが脂質膜で被覆されたことが示された。
[0085] H+処理後の懸濁液を不連続ショ糖密度勾配（0， 5, 30%)上に重層し、 20°C、 16 0, 000gの条件で 2時間、超遠心分離を行った。上部力、ら lmLずつ画分を回収した 。各フラクションの DNA含量を DNAァガロースゲル電気泳動によって測定するととも に（図 1 (a)参照）、ローダミン及び NBDの蛍光強度を測定してローダミン含量及び N BD含量を算出した（図 1 (b)参照）。
[0086] 不連続ショ糖密度勾配超遠心分離によって回収された画分のうち、 DNA含量の高 い画分（フラクション 11)をリボソーム含有画分とした。リボソーム含有画分は、ショ糖 5 〜30。/oの境界から回収することができた。
[0087] また、リボソーム含有画分において、 NBD、ローダミン及び DNAが共存していたこ と力 、 SUV型リボソームは、ローダミンを含有する内水相を保持したまま融合し、融 合後のリボソームにおいて、ローダミンを含有する内水相が保持された空間が形成さ れていることが示された。
[0088] さらに、リボソーム含有画分において、 NBDとローダミンとの間に蛍光エネルギー 移動は観察されな力 た。第 2のリボソームの脂質膜には NBD標識化脂質 (青)が含 有されているので、第 2のリボソームの脂質膜と、ローダミンを含有する内水相とは接 触していないことが示された。すなわち、第 2のリボソームに静電的に結合した SUV 型リボソーム同士の膜融合により、第 2のリボソームは 2枚の脂質膜で被覆され、ロー ダミンを含有する内水相は、第 2のリボソームの外側に新たに形成された 2枚の脂質 膜の間の空間に保持されていることが示された。仮に、第 2のリボソームに静電的に 結合した SUV型リボソーム同士の膜融合により、第 2のリボソーム力^枚の脂質膜で 被覆されたとすれば、ローダミンを含有する内水相は、第 2のリボソームの脂質膜と、 第 2のリボソームの外側に形成された脂質膜との間に保持されていると考えられるが 、そうすると、 NBDとローダミンとの間に蛍光エネルギー移動が観察されるはずであ る。また、仮に、第 2のリボソームに静電的に結合した SUV型リボソーム同士の膜融 合により、第 2のリボソームの脂質膜と SUV型リボソームの脂質膜とが融合したとすれ ば (脂質膜の数に変化なし）、ローダミンを含有する内水相は、第 2のリボソームの内 部に保持されていると考えられる力 そうすると、 NBDとローダミンとの間に蛍光エネ ルギー移動が観察されるはずである。
[0089] 〔実施例 3〕
DNAZポリ—L—リシン複合体を脂質膜で被覆し、 DNA/ポリ—L—リシン複合 体が封入されたリボソーム（第 1のリボソーム）を調製する際、 SUV型リボソームとして ローダミンで内水相を蛍光標識したものを使用した点、及び、第 2のリボソームと、第 2 のリボソームに静電的に結合した複数の SUV型リボソームとを含む複合体を形成す る際に、 SUV型リボソームとして NBD標識化脂質で蛍光標識したものを使用した点 を除き、実施例 2と同様の試験を行った。
[0090] なお、実施例 2の結果から、第 1のリボソーム及び第 2のリボソームにおいては、 DN A/ポリ _L_リシン複合体が 2枚の脂質膜で被覆されており、この 2枚の脂質膜の 間にローダミンを含有する内水相が保持されていると考えられる。
H+処理後の懸濁液を不連続ショ糖密度勾配（0, 5, 30%)上に重層し、 20°C、 16 0, OOOgの条件で 2時間、超遠心分離を行った。上部から lmLずつ画分を回収した 。各フラクションの DNA含量を DNAァガロースゲル電気泳動によって測定するととも に（図 2 (a)参照）、ローダミン及び NBDの蛍光強度を測定してローダミン含量及び N BD含量を算出した（図 2 (b)参照）。
[0091] 不連続ショ糖密度勾配超遠心分離によって回収された画分のうち、 DNA含量の高 い画分 (フラクション 11)をリボソーム含有画分とした。リボソーム含有画分は、ショ糖 5 〜30%の境界から回収することができた。
[0092] また、リボソーム含有画分において、 NBD、ローダミン及び DNAが共存していたこ と、及び NBDとローダミンとの間に蛍光エネルギー移動は観察されな力 たことから 、第 2のリボソームに静電的に結合した SUV型リボソームが膜融合する際、第 2のリポ ソームにおいて 2枚の脂質膜の間に形成された空間（ローダミンを含有する内水相が 保持された空間）が保持されることが示された。
[0093] 〔実施例 4〕
実施例 1 (1)に従って、 DNA /ポリ— L—リシン複合体を形成した。なお、 DNAと しては、実施例（1)と同様に、プラスミド DNA (CMVプロモータ及びその下流に連結 されたルシフェラーゼ遺伝子を含有する全長 7037bpのプラスミド DNA (CMVプロ モーターを有する pcDNA3. 1プラスミドにルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだもの） )を用いた。
[0094] 実施例 1 (2)に従って、卵黄ホスファチジルコリン/コレステロールコハク酸（9 : 2 ( モル比） )からなる脂質膜を有する SUV型リボソーム（以下「第 1の SUV型リボソーム」 とレヽう。）、ジォレオイルホスファチジルエタノールァミン/コレステロールコハク酸（9 : 2 (モル比））からなる脂質膜を有する SUV型リボソーム（以下「第 2の SUV型リポソ一 ム」という。）を調製した。
[0095] 実施例 1 (3)に従って、第 1の SUV型リボソームを用いて DNA/ポリ一L—リシン 複合体を脂質膜で被覆し、リボソーム A (2枚膜)を調製した。また、第 2の SUV型リポ ソームを用いて DNAZポリ—L—リシン複合体を脂質膜で被覆し、リボソーム B (2枚 膜)を調製した。また、第 2の SUV型リボソームを用いてリボソーム Aを脂質膜で被覆 し、リボソーム C (4枚膜)を調製した。また、第 1の SUV型リボソームを用いてリポソ一 ム Bを脂質膜で被覆し、リボソーム D (4枚膜)を調製した。
[0096] リボソーム A〜Dの外液に lmg/mLステアリル化ォクタアルギニン溶液 12 μ Lを 添加し、室温で 30分間放置することにより、各リボソームの表面にォクタアルギニン（ 総脂質の 5モル0 /0)を導入した。なお、各リボソームの表面にォクタアルギニンを導入 することにより、全てのリボソームの細胞内移行経路は統一される（マクロピノサイト一 シス）。
[0097] 各リボソーム（DNA 0. 4 μ §相当）を懸濁した 0· 25mLの血清不含 DMEM培地 を、 24ゥヱルプレートで培養した NIH3T3細胞（4 X 104細胞 Zゥエル）に添加し、 37 °Cで 3時間インキュベートした。 3時間後、 10%ゥシ胎児血清を含む培地 lmLを添カロ し、さらに 45時間インキュベートした。その後、細胞を溶解し、細胞溶解液にルシフヱ ラーゼ活性測定試薬 (luciferase assay system, Promega社製)を加え、ルシフェラーゼ 活性をルミノメーター（LuminescencerPSN、 ATTO)を用いて測定した。細胞溶解液中 のタンパク質量は BCAタンパク質定量キット（PIERCE、ロックフォード (IL))を使用して 測定した。 その結果を図 3に示す。図 3に示すように、リボソームを構成する脂質膜の組成、数 等を変化させることにより、リボソームの機能 (遺伝子導入能力）が変化することが示さ れた。

Claims

請求の範囲
[1] 正帯電性粒子を 2枚の脂質膜で被覆する方法であって、
前記正帯電性粒子に複数の負帯電性 SUV型リボソームを接触させ、前記正帯電 性粒子と前記正帯電性粒子に静電的に結合した前記負帯電性 SUV型リボソームと を含む負帯電性複合体を形成させ、前記負帯電性複合体をカチオンで処理すること を特徴とする前記方法。
[2] 前記正帯電性粒子が目的物質の凝集体であることを特徴とする請求項 1記載の方 法。
[3] 前記正帯電性粒子が正帯電性 n枚膜リボソーム (nは 1以上の整数である。 )である ことを特徴とする請求項 1記載の方法。
[4] 前記正帯電性粒子のゼータ電位が 20 30mVであり、前記負帯電性 SUV型リポ ソームのゼータ電位が 20 30mVであることを特徴とする請求項 1記載の方法
[5] 前記正帯電性粒子の粒径が 50nm以上であることを特徴とする請求項 1記載の方 法。
[6] 負帯電性粒子を 2枚の脂質膜で被覆する方法であって、
前記負帯電性粒子に複数の正帯電性 SUV型リボソームを接触させ、前記負帯電 性粒子と前記負帯電性粒子に静電的に結合した前記正帯電性 SUV型リボソームと を含む正帯電性複合体を形成させ、前記正帯電性複合体をァニオンで処理すること を特徴とする前記方法。
[7] 前記負帯電性粒子が目的物質の凝集体であることを特徴とする請求項 6記載の方 法。
[8] 前記負帯電性粒子が負帯電性 n枚膜リボソーム (nは 1以上の整数である。）である ことを特徴とする請求項 6記載の方法。
[9] 前記負帯電性粒子のゼータ電位が— 20 ― 30mVであり、前記正帯電性 SUV型 リボソームのゼータ電位が 20 30mVであることを特徴とする請求項 6記載の方法。
[10] 前記負帯電性粒子の粒径が 50nm以上であることを特徴とする請求項 6記載の方 法。 正帯電性粒子を請求項 1〜5のいずれかに記載の方法により 2枚の脂質膜で被覆 して得られるリボソーム。
負帯電性粒子を請求項 6〜： 10のいずれかに記載の方法により 2枚の脂質膜で被
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