CN105327358B - 一种联合输送核酸与多肽的纳米制剂及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明针对生物大分子核酸与多肽药物在体内易降解和难以到达靶细胞的缺点，提供了一种联合输送核酸与多肽的纳米制剂及制备方法。所述纳米制剂采用对人体安全的多功能阳离子多肽和阳离子脂质体/核酸非病毒载体同时包裹多肽药物与核酸药物形成纳米颗粒，制备出可以利用多肽与核酸联合治疗疾病的生物大分子药物载体。将阳离子脂质体与多肽进行混合，然后通过静电作用与核酸药物组装成表面带正电的纳米颗粒，并进一步通过静电作用和氢键覆盖透明质酸进一步形成表面带负电荷的纳米靶向颗粒。其优势是同时装载多肽药物与核酸药物，通过多肽药物与聚精氨酸之间可降解的键的断裂来实现多肽药物的不断释放，通过载体的解组装实现核酸的有效释放。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种药物技术领域的药物输送方法，具体地，涉及一种联合输送核酸与多肽的纳米制剂及制备方法，特别是一种可用于两种或两种以上生物大分子药物的联合治疗疾病的生物药物制剂。
背景技术
癌症是人类面临的难以治愈的重大疾病之一，目前采用的化疗、放疗和外科手术的方法存在毒性大、缺乏靶向性、对正常组织与细胞伤害大，和以及切除不干净等弊端，并且开发新的小分子药物周期长花费大。而生物大分子药物(如多肽、核酸与蛋白质)具有特定的治疗靶点、毒性小。特别是核酸与多肽药物结构明确、制备时间短。但生物大分子药物大多在体内易被降解难以到达治疗位点，因此需要有合适的载体输送其到达特定的病变细胞内的治疗位点。近年来，随着生物大分子药物的治病机理的逐渐明确，核酸、多肽以及蛋白药物成为研究的新的亮点。目前，核酸药物的载体报道的非常多，如文献[Yin,H等人，用于基因治疗的非病毒载体，自然评论遗传学，2014,15,541-55]中的记载。但多肽药物的载体研究较少，事实上，多肽药物分子量较小，靶点明确，在阻断或调控病变基因方面发挥着重要的作用，参见文献[Ellerby,H.M等人，靶向促凋亡肽的抗肿瘤活性，自然医学，1999,5,1032-8]中的记载。
如果我们能够设计出同时有效输送多肽与核酸的载体，那将为生物大分子的输送治疗做出突破性工作。本发明利用对人体安全的生物医用材料，构建出同时输送核酸药物与多肽药物的生物响应性载体。
发明内容
本发明的目的在于克服现有多肽与核酸输送技术中的不足，提供一种联合输送核酸与多肽的纳米制剂及制备方法，所述纳米制剂可以同时靶向输送多肽药物与核酸药物。
本发明涉及用核酸、阳离子多肽(如表1)、阳离子脂质体组装的三元纳米颗粒，以及在此基础上包裹透明质酸的四元纳米颗粒。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供一种联合输送核酸与多肽的纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：
A、将多肽与阳离子脂质体混合；
B、将步骤A的混合液加入到核酸药物中孵育制备得到三元纳米颗粒；所述三元纳米颗粒为表面带正电荷的纳米颗粒；
C、向所述三元纳米颗粒中加入透明质酸钠水溶液，混合均匀，放置得四元纳米颗粒，即所述纳米制剂。所述四元纳米颗粒为表面带负电荷的可以靶向到肿瘤细胞的纳米颗粒。
优选地，步骤A中，所述阳离子脂质体通过以下步骤制得：将质量比为0.5～2:1的阳离子脂质与中性脂质的氯仿溶液，旋转蒸发掉溶剂，然后水合过夜，超声30-60分钟。
优选地，所述阳离子脂质为2,3-二油酰基-丙基-三甲胺、2,3-二油酰氧丙基-1-溴化三甲胺，或其它合成的两亲性阳离子脂质；所述中性脂质为二油酰磷脂酰乙醇胺或其它合成的两亲性具有融膜作用的中性脂质。
优选地，步骤A中，所述多肽包括通过步骤A1制备得到的其中一种或多种多肽和通过步骤A2制备得到的其中一种或多种多肽的混合物：
A1、将多肽药物与阳离子多肽通过可降解键连接起来获得；
A2、先将靶向多肽或肿瘤细胞穿透肽与阳离子多肽通过不同的间隔肽序列来制备多功能多肽。
优选地，所述多肽包括如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3中的一种或多种的组合，其氨基酸序列如表1所示。
表1
| 多肽名称 | 序列号 | 氨基酸序列 |
| P1 | SEQ ID No.1 | RRRRRRRRRRRRRRRRKRPTMRFRYTWNPMK |
| Pa | SEQ ID No.2 | GGWYRQVRRRRRRRRRRR |
| Pb | SEQ ID No.3 | VQRYWGGRRRRRRRRRRR |
所述Pa与Pb的制备为利用可降解的键将作为多肽药物的GGWYRQV序列与聚精氨酸(R11)通过不同的序列端连接起来即构建得到两个可以不断降解释放多肽药物GGWYRQV的多肽Pa与Pb。
优选地，所述多肽为P1与Pa或Pb按质量比为1:(0～4)的组合。
优选地，所述阳离子脂质体、多肽和核酸药物的质量比为(0.5～2):(2～7):1进行混合。
优选地，步骤A中，所述核酸药物是指DNA,siRNA,shRNA,以及microRNA。
优选地，步骤A中，所述孵育为常温下孵育25-35分钟。
第二方面，本发明还提供一种通过所述的制备方法制备得到的纳米制剂。
本发明可用于生物大分子核酸与多肽联合输送的纳米制剂是通过模块化组装而成，各组分之间没有通过化学共价键连接。模块化组装，是指各组分之间通过静电作用、疏水作用以及氢键等非共价键组装形成的纳米颗粒。
第三方面，本发明还提供一种联合输送核酸与多肽的纳米制剂在治疗疾病中的用途。
本发明针对生物大分子核酸与多肽药物在体内易降解和难以到达靶细胞的缺点，采用对人体安全的多功能阳离子多肽和阳离子脂质体/核酸非病毒载体同时包裹多肽药物与核酸药物形成纳米颗粒，制备出可以利用多肽与核酸联合治疗疾病的生物大分子药物载体。该载体的特点是利用模块组装的原理，将阳离子脂质、含有特定细胞靶向肽或细胞穿透肽的多功能阳离子多肽与多肽药物进行混合，然后通过静电作用与核酸药物组装成表面带正电的纳米颗粒，并进一步通过静电作用和氢键覆盖透明质酸进一步形成表面带负电荷的纳米靶向颗粒。其优势是同时装载多肽药物与核酸药物，通过多肽药物与聚精氨酸之间可降解的键的断裂来实现多肽药物的不断释放，通过载体的解组装实现核酸的有效释放。
本发明方法与现有的lipopolyplexes相比，不仅避免了聚阳离子的毒性(多肽是人体内源性分子)，而且有效突破了通过PEG化实现体内长效循环的弊端。兼顾到达靶细胞之前的稳定性和进入靶细胞之后的生物响应性。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明利用阳离子多肽与阳离子脂质体联合包裹核酸与多肽药物，然后在该纳米体系的外表面紧密包裹透明质酸，形成表面带负电荷的纳米颗粒，该纳米颗粒可以特定靶向肿瘤细胞，通过细胞穿透或者受体介导的方式进入内涵体，外面的透明质酸与多肽在内涵体内降解，暴露出的脂质通过融膜作用进入细胞质。然后解组装释放出核酸药物和多肽药物。由于多肽分布在整个纳米颗粒内部，所以在进入细胞后通过调节多肽药物与聚精氨酸的连接键的降解速度来控制多肽药物的释放位点。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为四元纳米颗粒的示意图；
图2为四元纳米颗粒的凝胶电泳图；
图3为四元纳米颗粒HLPD的Zeta电位图；
图4为四元纳米颗粒HLPD的粒径图；
图5为四元纳米颗粒HLPD被肝癌细胞HepG2内吞图；
图6为四元纳米颗粒HLPD的肝癌细胞HepG2细胞萤光素酶转染活性图；
图7为四元纳米颗粒HLPD的肝癌细胞HepG2细胞的毒性图；
其中，H代表透明质酸；L代表阳离子脂质体；D代表DNA。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明对包裹生物大分子核酸药物的四元纳米颗粒的物化性质表征方法包括：凝胶电泳、动态光散射和Zeta电位；初步的转染活性与毒性实验的DNA质粒是荧光素酶PGL3质粒；细胞是肝癌细胞HepG2。
本发明实施例涉及一种多肽与核酸共同输送的纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
a、通过薄膜分散法制备阳离子脂质体：本实验采用阳离子脂质(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)与中性脂质1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)的质量比为1：1的氯仿溶液旋转蒸发掉溶剂，然后水合过夜，超声30-60分钟。
b、利用可降解的键将作为多肽药物的GGWYRQV序列与聚精氨酸(R11)通过不同的序列端连接起来构建Pa与Pb两个可以不断降解释放多肽药物GGWYRQV的多肽。
c、纳米制剂的制备：利用上述制备好的脂质体稀释到一定浓度(0.04mg/mL)，与一定浓度的多肽(0.16mg/mL)按质量比为1:4进行混合，其中多肽组分为P1、Pa或Pb中的一种或多种的组合。再加入到核酸溶液中制备表面带正电荷的纳米颗粒，所述阳离子脂质体、多肽和核酸的质量比为1:4:1，在常温下孵育25-35分钟制备三元纳米颗粒。然后对应加入适量的透明质酸钠水溶液，并混合均匀，放置15分钟制备四元纳米颗粒。
实施例1四元纳米颗粒的制备方法
如图1所示，四元纳米颗粒的用于测物化性质的体系在水溶液中进行。将一定量的阳离子脂质体与多肽混合后加入到核酸水溶液中继续混合均匀。在室温下孵育30分钟制得三元纳米颗粒，然后将透明质酸加入该混合物中并充分混合均匀，静置15分钟制得四元纳米颗粒。用于细胞实验的载体体系用无血清培养基代替超纯水即可。
实施例2四元纳米颗粒的凝胶电泳
称取0.3g的琼脂糖粉末，倒入锥形瓶中，将30ml1×TAE缓冲液加入至锥形瓶中，在加热的条件下将其充分溶解，待温度降到65℃后，加入Gelred in warter 3μL，迅速倒入制胶槽中，插入样品梳，在室温下放置0.5-1h等待胶变为凝固态。接着将样品梳拔出，再将TAE缓冲液倒入样品槽中使其浸没凝胶。制备不同比例的四元纳米颗粒10μL，将6×上样缓冲液2μL与四元纳米颗粒混匀，上样10μL，同时上样10μL naked PGL3质粒作为对照。随后在110mV电压下电泳45min，关掉电泳，取出凝胶置于紫外凝胶成像系统观察并记录电泳图像。结果如图1，条带从左向右依次为：
Maker,Naked DNA,样品(1)-(10)；其中，四元纳米颗粒样品的质量比分别为H:L:P1:D＝15:1:4:1(1)、H:L:Pa:D＝15:1:4:1(2)、H:L:P1:Pa:D＝15:1:1:3:1(3)、H:L:P1:Pa:D＝15:1:2:2:1(4)、H:L:P1:Pa:D＝15:1:3:1:1(5)、H:L:P1:D＝15:1:4:1(6)、H:L:Pb:D＝15:1:4:1(7)、H:L:P1:Pb:D＝15:1:1:3:1(8)、H:L:P1:Pb:D＝15:1:2:2:1(9)、H:L:P1:Pb:D＝15:1:3:1:1(10)。从电泳图中我们可以观察到复合物的位置都停在起点，说明我们的载体完全包裹了DNA，从而有效保护DNA，避免DNA在细胞吞噬前被降解。
实施例3四元纳米颗粒的Zeta电位
四元纳米颗粒的粒径和电位使用粒度分析仪测定。采用zetasizer 2000测定四元纳米颗粒的表面电荷，样品测定时间设置为自动，每个样品测定3次，取平均值作图。四元纳米颗粒的ζ电位测定结果如图3所示。从图中可见这9个不同的四元纳米颗粒的ζ电位比较稳定:HPLD带负电荷，其电荷的绝对值大于30mV，说明它们形成的分散体系也相对稳定。
实施例4四元纳米颗粒的粒径
室温条件下，用Malvern Nano ZS激光粒度仪测定Q-complexes的水化半径，折射介质设置为水，折射率为1.33，粘度为0.8872cP，每个样品测定3次，取平均值作图。制备不同比例的四元纳米颗粒400μL。首先，在室温下预热粒度分析仪30min，在微量样品池中加入四元纳米颗粒溶液，用超纯水稀释至500μL，将微量样品池插入粒度分析仪的测试槽中，每个样品记录三次测试结果，观察并记录样品粒径的平均值，同时也要注意样品的分散性(PDI)。从图4中可见这几个不同的四元纳米颗粒的粒径都比较稳定，基本上在150～200nm左右，其大小有利于细胞内吞。
实施例5肝癌细胞HepG2内吞实验
在24孔板内种6×104个HepG2细胞，培养24小时后将四元纳米颗粒加入到细胞中(1μg DNA/孔)利用异硫氰酸荧光素(FITC)标记多肽药物。将24孔板转移至细胞培养箱中进行转染，转染时间为4h。待4h转染结束后，取出24孔板，进行流式细胞仪所需的细胞处理。采用BD FACSCalibur流式细胞仪进行检测。未加样品组(untreated组)的样品为基准调节流式分析的各项参数设置。因为本实验选用了异硫氰酸荧光素(FITC)共价连接多肽药物的方法来检测多肽药物是否能够进入细胞内。由图5可见，随着多肽药物的量的增加，相应地多肽药物被靶细胞内吞的数量在逐渐增加。
实施例6肝癌细胞HepG2的萤光素酶转染活性实验
将培养好的细胞接种于96孔板中，每孔细胞数为2×104个，将其置于细胞培养箱中培养24h。加入不同的四元纳米颗粒:每孔加入的DNA的质量是250ng，每孔加入200μL的四元纳米颗粒溶液，并平行3个复孔，稀释介质为10％胎牛血清的DMEM/f12培养基，并以商业化转染试剂Lipofectamine 2000与DNA的复合物作为对照组。孵育24h后，取出96孔板弃去培养液，每孔加入200μL的四元纳米颗粒溶液，置于细胞培养箱中培养24h。取出96孔板，吸去培养液，每孔加入200μL 1×PBS缓冲溶液冲洗一遍，吸去PBS，每孔加入30μL裂解液，于4℃冰箱放置30min，置于-80℃放置过夜。
检测瞬时发光强度：取出96孔板，从每个孔中吸出20μL裂解液至对应的流式管中，打开照度计，预热20min，测试时每个流式管中加入20μL荧光素酶底物，快速吹打均匀，检测其瞬时发光强度(RLU)。
检测蛋白总量：采用Micro BCA测定法来确定裂解液中的蛋白总量。通过样品的相对发光强度除以样品的总蛋白浓度后所得数(RLU/mg protein)来衡量细胞转染效率(即荧光素酶蛋白的表达量)，每个样品平行测3次，取平均值作图。
由图6可以看出，加入P1的四元纳米复合物与未加入P1的组相比可以明显提高细胞转染效率。
实施例7肝癌细胞HepG2的细胞毒性实验
采用CCK-8Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit考察包裹DNA的纳米颗粒复合物对滑膜细胞的毒性。毒性实验开始前，先将细胞接种到96孔中，每孔的细胞数为1×104个，接种24h后，取出96孔板弃去培养液，每孔给不同比例的200μL的复合物溶液，每个样品平行3个复孔，置于细胞培养箱中培养24h后，向96孔板每孔细胞中加入CCK-8试剂10μL，避光在细胞培养箱中培养2-4h，用多功能酶标仪测定样品在450nm处的吸光度OD值。细胞存活率(百分比)是以待测样品的吸光度相比正常细胞的吸光度值来表示。由图7可以看出，四元纳米颗粒的毒性大于不含透明质酸的三元纳米颗粒的毒性，由此分析，四元纳米颗粒中具有抑制肿瘤细胞生长的多肽药物起到了抑制肿瘤生长的作用。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (8)
1.一种联合输送核酸与多肽的纳米制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、将多肽与阳离子脂质体混合；
B、将步骤A的混合液加入到核酸药物中孵育制备得到三元纳米颗粒；
C、向所述三元纳米颗粒中加入透明质酸钠，混合得四元纳米颗粒，即所述纳米制剂；
步骤A中，所述多肽包括通过步骤A1制备得到的多肽和通过步骤A2制备得到的其中一种或两种多肽的混合物：
A1、将多肽药物与阳离子多肽通过可降解键连接起来获得序列为SEQ ID No.1的多肽；
A2、先将靶向多肽或肿瘤细胞穿透肽与阳离子多肽通过不同的间隔肽序列来制备多功能多肽；所示多功能多肽序列为SEQ ID No.2或SEQ ID No.3。
2.根据权利要求1所述的联合输送核酸与多肽的纳米制剂的制备方法，其特征在于，步骤A中，所述阳离子脂质体通过以下步骤制得：将质量比为0.5～2:1的阳离子脂质与中性脂质的氯仿溶液，旋转蒸发掉溶剂，然后水合过夜，超声30-60分钟。
3.根据权利要求2所述的联合输送核酸与多肽的纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述阳离子脂质为2,3-二油酰基-丙基-三甲胺、2,3-二油酰氧丙基-1-溴化三甲胺；所述中性脂质为二油酰磷脂酰乙醇胺。
4.根据权利要求1所述的联合输送核酸与多肽的纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述阳离子脂质体、多肽和核酸药物的质量比为(0.5～2):(2～7):1。
5.根据权利要求1所述的联合输送核酸与多肽的纳米制剂的制备方法，其特征在于，步骤B中，所述核酸药物是指DNA,siRNA,shRNA,以及microRNA。
6.根据权利要求1所述的联合输送核酸与多肽的纳米制剂的制备方法，其特征在于，步骤B中，所述孵育为常温下孵育25-35分钟。
7.一种根据权利要求1所述的制备方法制备得到的纳米制剂。
8.一种根据权利要求7所述的纳米制剂在制备治疗疾病的药物中的用途。
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