CN105175442A - 一种用于转染试剂的阳离子脂质体及其制备和应用 - Google Patents

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刘建强
叶世辉
赵京文
房婕
段勇
曹晓莉
李锦�
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Abstract

本发明涉及一种用于转染试剂的阳离子脂质体的制备和应用。所述阳离子脂质体可将生物大分子及其他化合物提呈至细胞，其可单独使用，也可与其他化合物联合使用。本发明脂质体的阳离子头部有更加敏感、易于断裂的二硫键；疏水区采用了不对称的双链结构，使其有更高的转染效率及更低的细胞毒性。

Description

一种用于转染试剂的阳离子脂质体及其制备和应用
技术领域
本发明涉及一种可用于转染试剂的阳离子脂质体及其制备和应用。
背景技术
阳离子脂质体通常包括：阳离子头部，疏水锚定区以及两者间的链接部分。带正电荷的头部对于与核酸的磷酸骨架的结合是至关重要的。疏水锚定区参与形成支架，以帮助完成内吞作用或与细胞膜融合。
新合成的脂质体都有新的分子结构，有更高的转染效率及更低的毒性。进一步了解转染的机制，可以帮助我们更好的理解结构与活性的关系。阳离子脂质体通过静电作用与核酸结合后，通过疏水作用，使核酸压缩为聚合物。细胞内吞后，这种聚合物可保护核酸免受核酸酶的降解。当其进入细胞核后，通过生理的刺激，例如酶的活化，pH值的变化等等，而使脂质体极性头部的二硫键断裂，释放DNA，完成转染。由于不同类型的细胞有不同的膜成分，所以不同类型的细胞需要使用不同的脂质体进行转染。尽管在阳离子脂质体研发领域取得长足进展，但仍需要对其进行不断改善。
目前市场上常见的转染试剂的转染效率较低，尤其对于悬浮细胞，其转染效率更低，同时价格昂贵。因此，市场上急需一种转染效率更高且价格便宜，适合于国内大多数实验室使用转染试剂。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的阳离子脂质体化合物，适用于大多数常用细胞的转染，与目前主流的转染试剂相比，其转染效率更高、同时其价格更便宜，适合于国内大多数实验室使用。
本发明的技术方案是：
一种用于转染试剂的阳离子脂质体，其特征在于：所述阳离子脂质体的分子通式为：
其中，R1及R2是8～40个碳原子的直链、支链或环烷基或烯基；R3是H或氨基醇。
进一步地，所述R3的氨基醇，其结构为：
所述R3的氨基醇为氨基乙醇、氨基丙醇、氨基丁醇中的一种。
进一步地，所述R1及R2是8～24碳原子的直链烷基。
本发明的阳离子脂质体，可单独或与其他化合物联合使用，形成阳离子聚合物，与阴离子高分子结合，如核酸。将核酸转入细胞内。
本发明的阳离子脂质体，可以由所述的阳离子脂质体，添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成转染试剂盒。
所述辅助性成分包括DOPE、DOPC或胆固醇。
本发明可用于体外和体内转染，尤其是转染真核细胞或组织。
进一步地，本发明可用于转染细胞或组织，以表达外源基因；也可以用于转基因动物的生产；还可用于基因治疗，可将外源核酸转入细胞或组织。特别是，本发明在癌症治疗方面有特殊的效果。
本发明脂质体的阳离子头部有更加敏感、易于断裂的二硫键；疏水区采用了不对称的双链结构。这些结构特点使其有更高的转染效率。
本发明与目前主流的转染试剂相比，其转染效率更高，同时其价格更便宜，适合于国内大多数实验室使用。
附图说明
图1阳离子转染试剂转染HEK-293细胞
图2阳离子转染试剂转染COS-7细胞
图3阳离子转染试剂转染HeLa细胞
具体实施方式
以下参照附图，以具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
根据本发明制备的转染试剂，其分子式为(A)：
合成路线为：
1)化合物I的合成
在锥形瓶中，将40mL冰乙酸加入至苯并三唑(3.8g；31.8mmol)中。将50mL漂白剂缓慢加入溶液中。混合物在室温下搅拌2h。将得到的白色固定过滤，用水洗涤直至滤液的pH＝7。在真空下干燥，得到白色固体1-氯代苯并三唑，其产率为90％(4.38g)。在氮气保护下，将苯并三唑(2.4g；20mmol)与1-氯代苯并三唑(3.07g；20mmol)溶于100mL二氯甲烷中。将混合物降温至-80℃，将15mL含有正十二硫醇(5.06g；25mmol)的二氯甲烷缓慢滴加入溶液中。在-80℃下搅拌1h，将含有10mL硫脲(1.53g；20mmol)的四氢呋喃悬液加入溶液中。将混合物升温至-30℃，搅拌1h。将溶液再冷却至-80℃，将10mL含有巯基乙醇(1.4mL；20mmol)的二氯甲烷溶液滴加入溶液中。搅拌过夜后，缓慢升温至室温。在真空下去除溶剂。用硅胶层析柱进行纯化，得到白色固体的化合物I。
2)化合物II的合成
将化合物I(1.66g；6mmol)及亚磷酸二苯酯(1.3g；6mmol)，在120°C减压下搅拌，蒸馏。1h后，得到白色固体的化合物II。
3)化合物III的合成
在氮气保护下，将化合物II(2.50g；3mmol)加入预冷(0℃)的含有二异丙基乙胺(700μL；4mmol)及N,N-二甲丙基-1,3-二胺(0.4g；4mmol)的25mL二氯甲烷中。再加入溴三氯甲烷(400μL；4mmol)，搅拌过夜，将温度缓慢升高至室温。去除二氯甲烷，用己烷(150mL)溶解残留物。过滤去除不溶解颗粒，用浓盐水(3×150mL)洗涤。用硫酸镁干燥有机相，过滤，浓缩，用含有硅胶的层析柱纯化，得到化合物III。
4)化合物IV的合成
将二异丙基乙胺(12.2mL，70mmol)加入至100ml含有化合物III(2.96g；5mmol)，N-(2,3-环氧丙酯)-苯邻二甲酰亚胺(14.2g；70mmol)的无水的N,N-二甲基甲酰胺中。在氮气保护下，将反应混合物密封于圆底烧瓶中，110℃下加热12h。去除N,N-二甲基甲酰胺，二异丙基乙胺，得到黄色油状物。用乙醇对粗提物质进行再结晶。得到白色固体，即得到化合物IV。
4)化合物V的合成
在室温下，将肼(5.8mL；150mmol)加入至250ml含有化合物IV(9.9g；10mmol)的无水乙醇中。将溶液置于90℃的水浴中，溶液中出现白色的固体沉淀。反应混合物搅拌至回流3h，冷却至-20℃。白色固体沉淀于瓶底。将上部清澈的乙醇溶液倒出。将残余物用冷乙醇洗涤2次。将混合的乙醇溶液进行浓缩，真空下干燥过夜。得到油性的终产物化合物V。
实施例2
使用商业获得的阳离子脂质转染试剂LipofectAMINEPLUS，FuGENETM-6与本发明的化合物进行比较。HEK-293(人胚肾衍生细胞)、COS-7(SV40病毒基因转化的非洲绿猴肾成纤维细胞)和HeLa(人宫颈癌衍生细胞)与β半乳糖苷酶报告质粒DNApCMV·SPORT-β-gal(生命技术有限公司)进行反应。
1)转染前一天，将细胞接种于含有0.4ml培养基的24孔组织培养板中。培养基为含有1％非必需氨基酸、10％胎牛血清的DMEM培养基。对于HEK-293及COS-7细胞系，接种前，用Poly-L-Lysine包板，增加细胞的粘附。
2)第二天，DNA转染试剂的制备如下：
用含1％NEAA的无血清的DMEM，将阳离子脂质试剂和DNA分别稀释至25ul。对于LipofectAMINEPLUS，将7～14ulPLUS试剂加入DNA，混合后，室温下孵育15min。稀释的DNA与稀释的脂质体混合后，室温下至少孵育15min，允许DNA和脂质体形成复合物。随后，将孵育的复合体，逐滴加入培养基中，反复摇动培养板，使其混合。在37℃下，细胞孵育24h，允许报告质粒pCMV·SPORT-β-gal，编码的lacZ转基因表达。转染24h后，将生长培养基及转染复合体从培养孔中移出，每孔中的细胞用1mlD-PBS漂洗。在每个孔中，加入1ml含有0.1MTritonX-100的0.1％Tris(pH8.0)，进行细胞裂解。将培养板在-80℃至少保存2h，然后在室温下或37℃下融化。离心后，融化的细胞裂解液清澈，取上清液，使用酶底物ONPG对β-gal活性进行分析。用Bradford测定裂解液中的总蛋白浓度。转染细胞抽提物的β-gal活性，可通过标准曲线进行计算。
0.4ugpCMV·SPORT-β-galDNA及转染试剂转染HEK-293(FIG.1)、COS-7(FIG.2)、HeLa(FIG.3)细胞。检测转染试剂，终产品：胆固醇的比例为1:15(M/M)；终产品：DOPE的比例为1:1(M/M)。同时使用LipofectAMINEPLUS(LifeTechnologies)；FuGENETM-6(BoehringerMannheim)作为对照。终产品的范围为0.2～4ul；LipofectAMINEPLUS及FuGENE-6的范围为0.2～4ul。根据使用说明书使用FuGENE-6，LipofectAMINEPLUS。
实验结果如表1～3所示。
表1：阳离子转染试剂转染HEK-293细胞
终产品：胆固醇 终产品：DOPE LipofectAMINE PLUS FuGENETM-6
0.2μL 2850* 4500* 200* 60*
0.6μL 4850* 7900* 800* 200*
1.2μL 6500* 8300* 2000* 2800*
1.8μL 7900* 7600* 2100* 2600*
2μL 8000* 7400* 2500* 2000*
4μL 5900* 4300* 2300* 1500*
*单位为：ngbeta-gal/cm2
表2：阳离子转染试剂转染COS-7细胞
终产品：胆固醇 终产品：DOPE LipofectAMINE PLUS FuGENETM-6
0.2μL 700* 1700* 600* 60*
0.6μL 1800* 3000* 900* 80*
1.2μL 2500* 3100* 1800* 90*
1.8μL 2700* 2800* 2000* 120*
2μL 2200* 2000* 1600* 70*
4μL 900* 1400* 2100* 30*
*单位为：ngbeta-gal/cm2
表3：阳离子转染试剂转染HeLa细胞
终产品：胆固醇 终产品：DOPE LipofectAMINE PLUS FuGENETM-6
0.2μL 10* 20* 10* 20*
0.6μL 100* 160* 20* 60*
1.2μL 290* 350* 30* 210*
1.8μL 310* 300* 50* 120*
2μL 160* 100* 60* 60*
4μL 100* 50* 30* 40*
*单位为：ngbeta-gal/cm2
实验结果表明：本发明所合成的转染试剂的转染效率优于LipofectAMINEPLUS(LifeTechnologies)；FuGENETM-6(BoehringerMannheim)。
以上所述仅对本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡是在本发明的权利要求限定范围内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种用于转染试剂的阳离子脂质体，其特征在于：所述阳离子脂质体的分子通式为：
其中，R1及R2是8～40个碳原子的直链、支链或环烷基或烯基；R3是H或氨基醇。
2.根据权利要求1所述的用于转染试剂的阳离子脂质体，其特征在于：所述R3的氨基醇，其结构为：
3.根据权利要求2所述的用于转染试剂的阳离子脂质体，其特征在于：所述R3的氨基醇为氨基乙醇、氨基丙醇、氨基丁醇中的一种。
4.根据权利要求1所述的用于转染试剂的阳离子脂质体，其特征在于：所述R1及R2是8～24碳原子的直链烷基。
5.一种转染试剂盒，是由权利要求1～4中任一项所述的阳离子脂质体添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成。
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