CN104931618B - 复杂样品中6种磷脂的多重检测方法 - Google Patents
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Abstract
复杂样品中6种磷脂的多重检测方法，包括HPLC分析：正相硅胶色谱柱，100mm×4.6mm，柱温25℃；洗脱流速1.5mL/min，按体积比，梯度洗脱的流动相为：0.0min，A40％，B57％，C3％；8.0min，A40％，B50％，C10％；15.0min，A40％，B50％，C10％；15.1min，A40％，B57％，B3％；24.0min，A40％，B57％，C3％；其中，流动相A是含0.01～0.08％三乙胺的正己烷，流动相B是异丙醇，流动相C是10～20％的乙酸溶液。本发明的方法操作简单、快速准确、各组分分离良好、重复性高，易于检测实践中应用推广。
Description
技术领域
本发明属于生物分析领域，尤其是涉及复杂生物样品中多种磷脂组分的同时检测。
背景技术
动植物体内磷脂种类繁多，多以磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺为主。受限于生物样品中复杂组分的干扰，磷脂组分的检测，尤其是磷脂组分的多重检测方法亟待开发。
现有技术中，磷脂分析常用的方法有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、质谱(MS)和气质联用(C-MS)技术等。随着质谱技术的发展，更为强大的LC-MS方法也用于磷脂的定向定量分析中。检测实践中，高效液相色谱法(HPLC)仍然是目前磷脂分离和定性定量分析的最常用的方法。HPLC分析磷脂常用检测器为紫外检测器(UV)和蒸发光散射检测器(ELSD)。这两种检测器中，ELSD的响应信号独立于分子中的双键数目，也比UV检测器更为灵敏，并且ELSD在梯度洗脱程序中能提供稳定的基线，因此，ELSD越来越多地用于磷脂的高效液相色谱分析。
用于磷脂检测的色谱技术中，正相色谱主要基于头部基团极性大小分离不同种类的磷脂；反相色谱分离磷脂主要基于磷脂上脂肪酸酰基链的疏水性不同，但是相比而言，后者一般分离度较差，峰重合严重，因此应用较少。在生物样品等复杂样品的磷脂成分分析实践中，正相色谱应用较多，常用的流动相一般分为两类：氯仿-甲醇-水(氨水)体系和正己烷-异丙醇-水体系。前者在检测实践中有较好的应用，但是高效液相色谱仪中存在的聚合物材质的配件在氯仿中可能发生溶胀或收缩，影响机器的气密性和使用寿命。而后一体系多用于等度洗脱，但分离过程中往往存在分离时间长，峰形扩散严重，定量不稳定等问题，需要配合更加优化的技术方案来使用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种复杂样品中6种磷脂的多重检测方法，该方法基于HPLC技术，包括如下步骤：
(1)预制待测样品；
(2)取检测量的预制待测样品，溶解于氯仿溶液，氮气吹干后精确称取残余物质量，然后将残余物溶于正己烷和异丙醇按照体积比3:1的混合溶剂中，0.22μm孔径的有机相滤膜过滤除杂；
(3)HPLC分析：
正相硅胶色谱柱，100mm×4.6mm，柱温25℃；
洗脱流速1.5mL/min，按体积比，梯度洗脱的流动相为：
0.0min，A 40％，B 57％，C 3％；
8.0min，A 40％，B 50％，C 10％；
15.0min，A 40％，B 50％，C 10％；
15.1min，A 40％，B 57％，B 3％；
24.0min，A 40％，B 57％，C 3％；
其中，流动相A是含0.01～0.08％(体积百分含量)三乙胺的正己烷，流动相B是异丙醇，流动相C是10～20％的乙酸溶液(体积百分含量)；
(4)对比相同条件下PE、PI、PS、PC、SM和LPC混合标准品检测结果判定样品检测结果。
本发明针对检测实践需求，并针对生物样品等复杂样品的磷脂组成含量分析特点，提供了综合优化的基于整体硅胶柱的多重磷脂同时检测方案。本发明的方法操作简单、快速准确、各组分分离良好、重复性高，易于检测实践中应用推广。
附图说明
本发明附图5幅：
图1是磷脂标准曲线。
图2是六种磷脂混合标品的HPLC-ELSD多重检测图谱。
图3是仿刺参性腺磷脂的HPLC-ELSD多重检测图谱。
图4是鱼脑磷脂的HPLC-ELSD多重检测图谱。
图5是鸡脑磷脂多重检测的HPLC-ELSD图谱。
具体实施方式
本发明提供一种复杂样品中的磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酰肌醇(PI)，磷脂酰丝氨酸(PS)，磷脂酰胆碱(PC)，鞘磷脂(SM)和溶血磷脂酰胆碱(LPC)六种磷脂进行快速分离及多重检测方法。该方法基于高效液相色谱法(HPLC)，并针对检测目标样本特点综合优化。
所述多重检测方法的具体实施方式中，所述的步骤(3)中HPLC流动相中，流动相A是含0.04％三乙胺的正己烷，流动相B是异丙醇，流动相C是13％的乙酸溶液。
所另一具体实施方式中，所述的步骤(3)中HPLC分析配合蒸发光检测器(ELSD)进行检测，分流模式，以空气作为雾化气，雾化气流速1.0～2.0L/min；漂移管温度40～50℃。更优选发光检测器雾化气流速1.7L/min；漂移管温度45℃。
更为具体的实施方式中，本发明选用日立LaChrom Elite系列高效液相色谱仪，搭配Alltech2000蒸发光检测器；色谱柱则选用Performance-Si型正相硅胶色谱柱(100mm×4.6mm)。
本发明的上述检测方法应用于检测实践中，多用于针对动物组织等复杂生物样品的检测，具体实施方式中包括预制待测样品的步骤，一般包括提取样品总脂及去除其中的中性脂、糖脂和色素的步骤。本发明针对动物脑组织、性腺组织等待检样品，提供一种简单便捷，并且处理后样品与后续检测过程契合度高的样品预置方法，包括如下步骤：
a.取待测样品组织匀浆，按1g/1ml比例与氯仿-甲醇(2:1,v/v)溶剂混合，搅拌，静置十分钟后抽滤，收集滤液，脱水旋干得样品总脂；
b.样品总脂溶于少量氯仿进行硅胶柱层析，4～6倍柱体积的氯仿洗脱中性脂，2～4倍柱体积丙酮洗脱糖脂和色素，然后用甲醇洗脱；
c.甲醇洗脱组分溶于氯仿，-20℃冷冻保存，即得预制待测样品。
本领域技术人员容易理解，上述本发明的具体和/或优选的实施方式可以适当组合，以获得包含这些优选技术特征的方案，如本申请的优选实施方式之一，是复杂样品中6种磷脂的多重检测方法，包括如下步骤：
(1)预制待测样品：
a.取待测动物组织样品组织匀浆，按1g/1ml比例与氯仿-甲醇(2:1,v/v)溶剂混合，搅拌，静置十分钟后抽滤，收集滤液，脱水旋干得样品总脂；
b.样品总脂溶于少量氯仿进行硅胶柱层析，4～6倍柱体积的氯仿洗脱中性脂，2～4倍柱体积丙酮洗脱糖脂和色素，然后用甲醇洗脱；
c.甲醇洗脱组分溶于氯仿，-20℃冷冻保存，即得预制待测样品；
(2)取检测量的预制待测样品，溶解于氯仿溶液，氮气吹干后精确称取残余物质量，然后将残余物溶于正己烷和异丙醇按照体积比3:1的混合溶剂中，0.22μm孔径的有机相滤膜过滤除杂；
(3)HPLC分析：
日立LaChrom Elite系列高效液相色谱仪；
Alltech2000蒸发光检测器，分流模式，以空气作为雾化气，雾化气流速1.7L/min；漂移管温度45℃；
Performance-Si型正相硅胶色谱柱，100mm×4.6mm，柱温25℃；
洗脱流速1.5mL/min，按体积比，梯度洗脱的流动相为：
0.0min，A 40％，B 57％，C 3％；
8.0min，A 40％，B 50％，C 10％；
15.0min，A 40％，B 50％，C 10％；
15.1min，A 40％，B 57％，B 3％；
24.0min，A 40％，B 57％，C 3％；
其中，流动相A是含0.04％三乙胺的正己烷，流动相B是异丙醇，流动相C是13％的乙酸溶液；
(4)对比相同条件下PE、PI、PS、PC、SM和LPC标准品检测结果判定样品检测结果，标准品浓度0.6-1.0mg/mL。
以下为本发明的具体实施例，这些实施例仅为进一步说明本发明，不应当理解为对本发明任何形式的限制。
实施例1.标准样品检测及标准曲线制备
(1)标准样品：PE(P7943)、PI(P2517)、PS(P7769)、PC(P3556)、SM(S0756)和LPC(L0906)标准品购自Sigma-Aldrich。
(2)HPLC-ELSD分析方法：
日立LaChrom Elite系列高效液相色谱仪；
Alltech2000蒸发光检测器，分流模式，以空气作为雾化气，雾化气流速1.7L/min；漂移管温度45℃；
Performance-Si型正相硅胶色谱柱，100mm×4.6mm，柱温25℃；
洗脱流速1.5mL/min，按体积比，梯度洗脱的流动相为：
0.0min，A 40％，B 57％，C 3％；
8.0min，A 40％，B 50％，C 10％；
15.0min，A 40％，B 50％，C 10％；
15.1min，A 40％，B 57％，B 3％；
24.0min，A 40％，B 57％，C 3％；
其中，流动相A是含0.04％三乙胺的正己烷，流动相B是异丙醇，流动相C是13％的乙酸溶液；
本实施例在以下标准品浓度范围内梯度稀释进样：PE(0.25μg～20μg)，PI(0.13μg～10μg)，PS(0.5μg～16μg)，PC(0.44μg～35μg)，SM(0.06μg～6μg)，LPC(0.5μg～20μg)。标准品的量为横坐标，峰面积为纵坐标，以Y＝aXb的指数函数模型和线形关系模型分别进行拟合，结果如表1所示。两种模型的R2均大于0.99。
表1.磷脂标准曲线方程及R2值
由表1可知，Y＝a+bX的线形关系模型较Y＝aXb的指数形式模型更好。即在实施例选择的浓度范围内，ELSD检测器的输出信号与进样量之间的关系是符合线形的，故选择Y＝a+bX的线形关系模型作为磷脂定量的标准曲线对仿刺参性腺中各类磷脂进行定量。得6种磷脂检测标准曲线如图1。
按照上述(2)的HPLC-ELSD分析方法检测6种标准品的混合样品，得HPLC-ELSD图谱如附图2。可见，11min以内完成出峰，各组分分离良好。
实施例2.HPLC-ELSD的分析方法评价
按照实施例1的检测方法，以磷脂标准品重复三次进样的峰面积的均值、RSD及C.V.值。结果见表2。可见，所有磷脂标样的峰面积重现性很好，C.V.(变异系数)值均小于3.5％。
表2.磷脂标准品峰面积的重现性
| 磷脂标准品 | 峰面积(×106) | 变异系数 |
| PE | 2.052±0.042 | 2.06 |
| PI | 1.436±0.037 | 2.62 |
| PS | 1.443±0.034 | 2.32 |
| PC | 0.766±0.023 | 2.95 |
| SM | 2.798±0.097 | 3.48 |
| LPC | 2.110±0.072 | 3.41 |
实施例3.基于HPLC-ELSD多重检测仿刺参性腺磷脂组成及含量
(1)预制待测样品：
取待测的海参性腺样品组织流水解冻，使用高速组织匀浆机进行匀浆。1:10(g/ml)的比例与氯仿-甲醇(2:1,v/v)溶液混合，搅拌，静置十分钟后抽滤，收集滤液，脱水旋干得海参性腺总脂。称取海参性腺总脂约600mg用少量氯仿溶解后上样，硅胶柱层析。分别依次用5倍柱体积的氯仿洗脱中性脂，三倍柱体积丙酮洗脱糖脂和色素，再用甲醇将磷脂洗脱下来。将磷脂溶于氯仿中，-20℃冷冻保存。
(2)HPLC-ELSD多重检测：吸取适量预制样品溶于氯仿溶液，氮气吹干后精确称取残余物重量，溶解于HPLC级正己烷-异丙醇(3:1，v/v)混合液中。使用前0.22μm孔径的有机相滤膜过滤除杂待检。
按照实施例1(2)的方法进行检测，并使用外标法测定样品中各种磷脂含量，结果如图3及表3所示：
表3.仿刺参性腺磷脂的定量分析结果
| 磷脂种类 | 含量(g/100g) |
| PE | 18.84 |
| PI | 2.74 |
| PS | 8.47 |
| PC | 46.37 |
| SM | 0.23 |
| LPC | 未检出 |
仿刺参性腺中PE、PI、PS、PC、SM、LPC六类磷脂的含量检测结果显示：磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸这三类磷脂含量较高，三种磷脂的含量达到73.68g/100g磷脂样品，其中磷脂酰胆碱含量最高，为46.37g/100g磷脂样品，占总脂的22.86％，性腺干重的3.73％。溶血磷脂胆碱未检出。
本实验结果中(如图3)，除去已知的六种磷脂，仿刺参性腺磷脂中还存在其它两类磷脂组分X1、X2，初步分析这两种磷脂分别是磷脂酸(PA)和磷脂酰甘油(PG)。
实施例4.基于HPLC-ELSD多重检测鱼脑磷脂组成及含量
将鱼脑流水解冻,使用高速组织匀浆机进行匀浆。1:10(g/ml)的比例与氯仿-甲醇(2:1,v/v)溶液混合，搅拌，静置十分钟后抽滤，收集滤液，脱水旋干得鱼脑总脂。称取鱼脑总脂约600mg用少量氯仿溶解后上样，硅胶柱层析，分别依次用5倍柱体积的氯仿洗脱中性脂，三倍柱体积丙酮洗脱糖脂和色素，再用甲醇将磷脂洗脱下来。将磷脂溶于氯仿中，-20℃冷冻保存。吸取适量样品溶于氯仿溶液，氮气吹干后精确称取残余物重量，按照一定浓度溶解于HPLC级正己烷-异丙醇(3:1，v/v)混合液中。使用前0.22μm孔径的有机相滤膜过滤除杂。
按照实施例1(2)的方法进行检测，并使用外标法测定样品中各种磷脂含量，结果如图4及表4所示：
表4.鱼脑磷脂的定量分析结果
| 磷脂种类 | 含量(g/100g) |
| PE | 17.39 |
| PI | 1.20 |
| PS | 5.01 |
| PC | 45.73 |
| SM | 未检出 |
| LPC | 未检出 |
实施例5.基于HPLC-ELSD多重检测鸡脑磷脂组成及含量
将鸡脑流水解冻,使用高速组织匀浆机进行匀浆。1:10(g/ml)的比例与氯仿-甲醇(2:1,v/v)溶液混合，搅拌，静置十分钟后抽滤，收集滤液，脱水旋干得鱼脑总脂。称取鱼脑总脂约600mg用少量氯仿溶解后上样，硅胶柱层析，分别依次用5倍柱体积的氯仿洗脱中性脂，三倍柱体积丙酮洗脱糖脂和色素，再用甲醇将磷脂洗脱下来。将磷脂溶于氯仿中，-20℃冷冻保存。吸取适量样品溶于氯仿溶液，氮气吹干后精确称取残余物重量，按照一定浓度溶解于HPLC级正己烷-异丙醇(3:1，v/v)混合液中。使用前0.22μm孔径的有机相滤膜过滤除杂。
按照实施例1(2)的方法进行检测，并使用外标法测定样品中各种磷脂含量，结果如图5及表5所示：
表5.鸡脑磷脂的定量分析结果
| 磷脂种类 | 含量(g/100g) |
| PE | 2.82 |
| PI | 7.50 |
| PS | 5.29 |
| PC | 12.24 |
| SM | 3.56 |
| LPC | LPC |
Claims (6)
1.复杂样品中6种磷脂的多重检测方法，包括如下步骤：
(1)预制待测样品；
(2)取检测量的预制待测样品，溶解于氯仿溶液，氮气吹干后精确称取残余物质量，然后将残余物溶于正己烷和异丙醇按照体积比3:1的混合溶剂中，0.22μm孔径的有机相滤膜过滤除杂；
(3)HPLC分析：
正相硅胶色谱柱，100mm×4.6mm，柱温25℃；
洗脱流速1.5mL/min，按体积比，梯度洗脱的流动相为：
0.0min，A 40％，B 57％，C 3％；
8.0min，A 40％，B 50％，C 10％；
15.0min，A 40％，B 50％，C 10％；
15.1min，A 40％，B 57％，C 3％；
24.0min，A 40％，B 57％，C 3％；
其中，流动相A是含0.01～0.08％三乙胺的正己烷，流动相B是异丙醇，流动相C是10～20％的乙酸溶液；
(4)对比相同条件下磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰胆碱，鞘磷脂和溶血磷脂酰胆碱混合标准品检测结果判定样品检测结果。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中HPLC分析配合蒸发光检测器进行检测，分流模式，以空气作为雾化气，雾化气流速1.0～2.0L/min；漂移管温度40～50℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中HPLC流动相中，流动相A是含0.04％三乙胺的正己烷，流动相B是异丙醇，流动相C是13％的乙酸溶液。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的发光检测器雾化气流速1.7L/min；漂移管温度45℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的预制待测样品是分离提取样品中的粗总磷脂，包括提取样品总脂及去除其中的中性脂、糖脂和色素的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的预制待测样品包括如下步骤：
a.取待测样品组织匀浆，按1g/1ml比例与氯仿-甲醇按照体积比2:1的混合溶剂混合，搅拌，静置十分钟后抽滤，收集滤液，脱水旋干得样品总脂；
b.样品总脂溶于少量氯仿进行硅胶柱层析，4～6倍柱体积的氯仿洗脱中性脂，2～4倍柱体积丙酮洗脱糖脂和色素，然后用甲醇洗脱；
c.甲醇洗脱组分溶于氯仿，-20℃冷冻保存，即得预制待测样品。
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