CN108181387A - 一种猪肺磷脂原料药中磷脂组分含量检测的新方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公布了一种猪肺磷脂原料药中磷脂组分含量检测的新方法。目的在于利用较简单的流动相提高了检测的分离度、结果的准确性、方法的重现性，减少了对色谱柱的损耗。开发出如下检测新方法：猪肺磷脂样品溶液经过正相硅胶色谱柱分离后，8种主要的磷脂组分得到基线分离，即使最难分离的磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺也得到了很好的分离度，方法重现性高，然后经蒸发光散射检测器检测，用对数外标曲线法准确定量各磷脂组分含量。本发明分离度好，准确度高，重现性好，操作简单。

Description

一种猪肺磷脂原料药中磷脂组分含量检测的新方法
一、技术领域：
本发明涉及一种猪肺磷脂原料药中磷脂组分含量检测的方法，属于医药分析技术领域。
二、背景技术：
猪肺磷脂是一种天然提取的肺表面活性物质，主要作用是降低肺泡气-液界面表面张力，保持肺泡稳定，防止肺不张。在伴有呼吸障碍的早产儿，猪肺磷脂有使肺泡扩张和稳定的作用，可改善肺的顺应性和气体交换，从而治疗新生儿呼吸窘迫症。猪肺磷脂中各磷脂占干重的90％以上，大部分为磷脂酰胆碱(PC)，具有表面活性的PC为二棕榈酸磷脂酰胆碱；其余的磷脂还包括磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PSE)、心磷酯(CAR)和鞘磷脂(SM)，起到辅助的治疗作用；溶血磷脂酰胆碱(LPC)是磷脂酰胆碱的降解产物，浓度过高会溶解红细胞膜，因此也要加以检控。因此测定猪肺磷脂中各磷脂组分的含量是非常有必要的。现有的磷脂含量的测定主要是磷含量法和硫氰亚铁铵比色法，前者测定磷含量，通过折算磷脂的平均分子量估算磷脂含量，后者通过紫外比色法测定，这两种方法准确度差，操作繁琐，易受干扰，而且只能得到磷脂总含量值。《中国药典》卵磷脂和大豆磷脂项下采用了高效液相色谱法，但是不能基线分离磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺，分离度只有0.8，而且两相流动相中均含有水，对正相色谱柱损耗很大。国外也有采用高效液相色谱法测定的案例，但采用三相流动相体系，复杂繁琐，重现性低。本方法采用高效液相色谱法，样品溶液通过正相硅胶柱分离，再采用蒸发光散射检测器进行检测，对数标准曲线法计算含量，有效地测定了各磷脂组分含量，本法可使磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺的分离度达到2.4，其他磷脂组分的分离度更好。
三、发明内容
本发明的目的在于提供一种检测限低，干扰小，操作简单，灵敏度好，准确度高，重现性好，特别是针对猪肺磷脂中磷脂组分含量的检测方法。可使最难分离的磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺的分离度达到2.4，有效保证了定量的准确性和重现性；采用两相流动相体系，操作简单，减小对色谱柱的损耗。
本发明的测定方法如下步骤所示：
(1)供试品溶液的制备
取磷脂原料药约20mg，精密称定，置50ml量瓶中，用三氯甲烷-甲醇(2∶1)溶解并稀释至刻度，摇匀，6000rpm离心5分钟，取上清液作为供试品溶液1(用于磷脂酰胆碱的检测)；另取本品约50mg，精密称定，置10ml量瓶中，用三氯甲烷-甲醇(2∶1)溶解并稀释至刻度，摇匀， 6000rpm离心5分钟，取上清液作为供试品溶液2。
(2)对照品溶液的制备
取磷脂酰胆碱(PC)对照品约60mg，精密称定，用三氯甲烷-甲醇(2∶1)溶解定容至10ml，摇匀，作为对照品母液1；取磷脂酰甘油(PG)对照品约10mg，精密称定，用三氯甲烷-甲醇(2∶1)溶解定容至10ml，摇匀，作为对照品母液2；取磷脂酰乙醇胺(PE)对照品约20mg，精密称定，用三氯甲烷-甲醇(2∶1)溶解定容至10ml，摇匀，作为对照品母液3；取磷脂酰肌醇(PI)对照品约20mg，精密称定，用三氯甲烷-甲醇(2∶1)溶解定容至10ml，摇匀，作为对照品母液4；取磷脂酰丝氨酸(PSE)对照品约20mg，精密称定，用三氯甲烷-甲醇(2∶1) 溶解定容至10ml，摇匀，作为对照品母液5；取心磷脂(CAR)对照品约10mg，精密称定，用三氯甲烷-甲醇(2∶1)溶解定容至10ml，摇匀，作为对照品母液6；取鞘磷脂(SM)对照品约 40mg，精密称定，用三氯甲烷-甲醇(2∶1)溶解定容至10ml，摇匀，作为对照品母液7；取溶血磷脂酰胆碱(LPC)对照品约10mg，精密称定，用三氯甲烷-甲醇(2∶1)溶解定容至10ml，摇匀，作为对照品母液8；分别取对照品母液1：0.3、0.4、0.5、0.6、0.7ml；对照品母液2： 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8ml；对照品母液3：0.1、0.2、0.4、0.6、1.0ml；对照品母液4： 0.1、0.25、0.4、0.5、0.6ml；对照品母液5：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml；对照品母液6： 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml；对照品母液7：0.25、0.4、0.5、0.6、0.75ml；对照品母液8： 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml五个浓度梯度于5个10ml容量瓶中，用三氯甲烷-甲醇(2∶1) 稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含PC：180μg、240μg、300μg、360μg、420μg；PG：10μg、 20μg、40μg、60μg、80μg；PE：20μg、40μg、80μg、120μg、200μg；PI：20μg、50μg、80μg、 100μg、120μg；SPE：20μg、40μg、60μg、80μg、100μg；CAR：10μg、20μg、30μg、40μg、50μg； SM：100μg、160μg、200μg、240μg、300μg；LPC：10μg、20μg、30μg、40μg、50μg五个浓度梯度的溶液，作为混合对照品溶液。
(3)色谱条件
仪器：高效液相色谱仪，检测器为蒸发光散射检测器(ELSD)；
色谱柱：硅胶色谱柱，
流动相：
流动相A 甲醇-水-冰醋酸-三乙胺，
流动相B 正己烷-异丙醇-冰醋酸-三乙胺；
梯度洗脱(postrun：30min)：
进样量：20μL；
流速：1.0mL/min；
柱温：40℃；
ELSD检测条件：温度70℃，氮气流速2.0L/min，撞击器关闭，增益1；
(4)样品检测
取混合对照品溶液各20μl按浓度由低至高注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以浓度的对数值为横坐标，峰面积的对数值为纵坐标计算回归方程。取供试品溶液1和供试品溶液2各20 μl注入液相色谱仪，分别记录样品各磷脂组分的峰面积。以供试品溶液1带入标准曲线计算 PC含量；以供试品溶液2带入标准曲线计算PG、PE、PI、PSE、CAR、SM、LPC含量。
四.附图说明
图1：中国药典方法分析磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇混合对照品色谱图
图2：本方法分析9种磷脂混合对照品色谱图。

Claims (1)

1.一种测定猪肺磷脂原料药中磷脂组分含量的检测方法，本发明的测定方法如下步骤所示：
(1)供试品溶液的制备
取磷脂原料药约20mg，精密称定，置50ml量瓶中，用三氯甲烷-甲醇(2∶1)溶解并稀释至刻度，摇匀，6000rpm离心5分钟，取上清液作为供试品溶液1(用于磷脂酰胆碱的检测)；另取本品约50mg，精密称定，置10ml量瓶中，用三氯甲烷-甲醇(2∶1)溶解并稀释至刻度，摇匀，6000rpm离心5分钟，取上清液作为供试品溶液2；
(2)对照品溶液的制备
取磷脂酰胆碱(PC)对照品约60mg，精密称定，用三氯甲烷-甲醇(2∶1)溶解定容至10ml，摇匀，作为对照品母液1；取磷脂酰甘油(PG)对照品约10mg，精密称定，用三氯甲烷-甲醇(2∶1)溶解定容至10ml，摇匀，作为对照品母液2；取磷脂酰乙醇胺(PE)对照品约20mg，精密称定，用三氯甲烷-甲醇(2∶1)溶解定容至10ml，摇匀，作为对照品母液3；取磷脂酰肌醇(PI)对照品约20mg，精密称定，用三氯甲烷-甲醇(2∶1)溶解定容至10ml，摇匀，作为对照品母液4；取磷脂酰丝氨酸(PSE)对照品约20mg，精密称定，用三氯甲烷-甲醇(2∶1)溶解定容至10ml，摇匀，作为对照品母液5；取心磷脂(CAR)对照品约10mg，精密称定，用三氯甲烷-甲醇(2∶1)溶解定容至10ml，摇匀，作为对照品母液6；取鞘磷脂(SM)对照品约40mg，精密称定，用三氯甲烷-甲醇(2∶1)溶解定容至10ml，摇匀，作为对照品母液7；取溶血磷脂酰胆碱(LPC)对照品约10mg，精密称定，用三氯甲烷-甲醇(2∶1)溶解定容至10ml，摇匀，作为对照品母液8；分别取对照品母液1：0.3、0.4、0.5、0.6、0.7ml；对照品母液2：0.1、0.2、0.4、0.6、0.8ml；对照品母液3：0.1、0.2、0.4、0.6、1.0ml；对照品母液4：0.1、0.25、0.4、0.5、0.6ml；对照品母液5：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml；对照品母液6：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml；对照品母液7：0.25、0.4、0.5、0.6、0.75ml；对照品母液8：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml五个浓度梯度于5个10ml容量瓶中，用三氯甲烷-甲醇(2∶1)稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含PC：180μg、240μg、300μg、360μg、420μg；PG：10μg、20μg、40μg、60μg、80μg；PE：20μg、40μg、80μg、120μg、200μg；PI：20μg、50μg、80μg、100μg、120μg；SPE：20μg、40μg、60μg、80μg、100μg；CAR：10μg、20μg、30μg、40μg、50μg；SM：100μg、160μg、200μg、240μg、300μg；LPC：10μg、20μg、30μg、40μg、50μg五个浓度梯度的溶液，作为混合对照品溶液；
(3)色谱条件
仪器：高效液相色谱仪，检测器为蒸发光散射检测器(ELSD)；
色谱柱：硅胶色谱柱，；
流动相：流动相A 甲醇-水-冰醋酸-三乙胺，
流动相B 正己烷-异丙醇-冰醋酸-三乙胺；
梯度洗脱(postrun：30min)：
进样量：20μL；
流速：1.0mL/min；
柱温：40℃；
ELSD检测条件：温度70℃，氮气流速2.0L/min，撞击器关闭，增益1；
(4)样品检测
取混合对照品溶液各20μl按浓度由低至高注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以浓度的对数值为横坐标，峰面积的对数值为纵坐标计算回归方程；取供试品溶液1和供试品溶液2各20μL注入液相色谱仪，分别记录样品各磷脂组分的峰面积；以供试品溶液1带入标准曲线计算PC含量；以供试品溶液2带入标准曲线计算PG、PE、PI、PSE、CAR、SM、LPC含量。
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