CN108896680B - 一种利用液质联用技术检测蛋白粉的磷脂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分析化学的技术领域，尤其涉及一种利用液质联用技术检测蛋白粉的磷脂的方法。本发明的方法包括：单独配制磷脂酰乙醇胺PE、磷脂酰丝氨酸PS和磷脂酰肌醇PI的梯度浓度的工作标准液，采用HPLC‑MS/MS联用技术检测，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线；其中，HPLC系统条件为：以C4色谱柱或其同等性能的色谱柱为固定相；取待测样品用溶剂超声波提取，离心、过滤获得供试品溶液，按照HPLC‑MS/MS联用技术检测，代入到标准工作曲线中获得待测样品中磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸或磷脂酰肌醇的浓度。本发明解决目前没有一种能在蛋白粉中定量检测PE、PS、PI的含量的技术缺陷。

Description

一种利用液质联用技术检测蛋白粉的磷脂的方法
技术领域
本发明属于分析化学的技术领域，尤其涉及一种利用液质联用技术检测蛋白粉的磷脂的方法。
背景技术
磷脂(Phospholipid)，也称磷脂类、磷脂质，是指含有磷酸的脂类，属于复合脂。磷脂是组成生物膜的主要成分，分为甘油磷脂与鞘磷脂两大类，分别由甘油和鞘氨醇构成。磷脂为两性分子，一端为亲水的含氮或磷的头，另一端为疏水(亲油)的长烃基链。由于此原因，磷脂分子亲水端相互靠近，疏水端相互靠近，常与蛋白质、糖脂、胆固醇等其它分子共同构成脂双分子层，即细胞膜的结构。其中，磷脂根据甘油骨架的不同可以分为磷酸甘油脂(glycerolphospholipid)和鞘磷脂(sphingolipid)。它们都是极性脂。极性脂由极性部分(叫做极性头)和非极性部分(叫做非极性尾)组成。其中，甘油磷脂又可以根据极性头部集团的不同区分为磷脂酰胆碱(Phosphatidyl cholines,PC)、磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamines,PE)、磷脂酰丝氨酸(Phosphatidyl serines,PS)、磷脂酰肌醇(Phosphatidyl inositols,PI)、磷脂酰甘油(PG)、甘油磷脂酸(phosphatidic acid,PA)等。
目前检测磷脂的方法较多，主要检测方法有色谱分析方法、质谱检测方法、化学法、酶法等方法。其中色谱和质谱检测方法最为准确，因为在蛋白粉基质成分复杂，使得现有技术难以分离并准确检测出蛋白粉的磷脂类物质。因此，目前，还没有一种能在蛋白粉中定量检测磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明公开了一种利用液质联用技术检测磷脂的方法，有效解决目前没有一种能在组合物中定量检测磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)的含量的技术缺陷。
本发明提供了一种利用液质联用技术检测磷脂的方法，包括：
步骤1、单独配制磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇的梯度浓度的工作标准液，采用HPLC-MS/MS联用技术检测，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线；
其中，HPLC系统条件为：
以C4色谱柱或其同等性能的色谱柱为固定相，以甲醇和乙腈为流动相A的有机相、以含乙酸铵的水溶液为流动相A的水相，以含乙酸铵的异丙醇为流动相B进行梯度洗脱；
步骤2、取待测样品用溶剂超声波提取，离心、过滤获得供试品溶液，按照步骤1中HPLC-MS/MS联用技术检测，得到的结果代入到所述标准工作曲线中获得待测样品中磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸或磷脂酰肌醇的浓度，其中，待测样品包括磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇。
作为优选，采用HPLC-MS/MS联用技术的ESI中性丢失模式分析。
作为优选，所述C4色谱柱或其同等性能的色谱柱的柱温为30-50℃。
作为优选，所述HPLC的流速为0.3-0.6mL/min。
作为优选，所述甲醇∶所述乙腈∶所述含乙酸铵的水溶液的体积比为1∶1∶3；其中所述含乙酸铵的水溶液的乙酸铵的浓度为5mmol/L。
作为优选，所述含乙酸铵的异丙醇的乙酸铵浓度为5mmol/L。
作为优选，所述溶剂包括三氯甲烷和甲醇；所述三氯甲烷∶所述甲醇的体积比为1∶1。
作为优选，当检测所述待测样品的磷脂酰乙醇胺时，ESI中性丢失模式的扫描范围为600-800。
作为优选，当检测所述待测样品的磷脂酰丝氨酸时，ESI中性丢失模式的扫描范围为600-950。
作为优选，当检测所述待测样品的磷脂酰肌醇时，ESI中性丢失模式的扫描范围为840-940。
本发明的目的针对现有技术中无法从磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)混合物定量检测不同磷脂的含量，因此，本发明公开一种利用液质联用技术检测磷脂的方法，该方法能经有机溶剂提取后，用HPLC-MS/MS联用技术检测分析，采用中性丢失扫描模式扫描，外标法定量，从蛋白粉中单独检测磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)或磷脂酰肌醇(PI)的含量，使用本申请的方法能有效避免蛋白粉中杂质对磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)或磷脂酰肌醇(PI)的检测影响，并达到了较高的精密度、线性关系、回收率等标准，大大节省检测的时间和成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示本发明实施例1提供的空白对照的质谱图，其中，横坐标为时间/min，纵坐标为离子响应强度/cps；
图2示发明实施例1提供的标准曲线图，其中，横坐标为浓度/μg/mL，纵坐标为离子响应强度/cps；
图3示本发明实施例2提供的空白对照的质谱图，其中，横坐标为时间/min，纵坐标为离子响应强度/cps；
图4示发明实施例2提供的标准曲线图，其中，横坐标为浓度/μg/mL，纵坐标为离子响应强度/cps；
图5示本发明实施例3提供的空白对照的质谱图，其中，横坐标为时间/min，纵坐标为离子响应强度/cps；
图6示发明实施例3提供的标准曲线图，其中，横坐标为浓度/μg/mL，纵坐标为离子响应强度/cps；
图7示本发明对比例1提供的质谱图，其中，横坐标为时间/min，纵坐标为离子响应强度/cps；
图8示本发明对比例2提供的质谱图，其中，横坐标为时间/min，纵坐标为离子响应强度/cps；
图9示本发明对比例3提供的质谱图，其中，横坐标为时间/min，纵坐标为离子响应强度/cps；
图10示本发明对比例4提供的质谱图，其中，横坐标为时间/min，纵坐标为离子响应强度/cps。
具体实施方式
本发明提供了一种利用液质联用技术检测磷脂的方法，用于解决目前没有一种能在组合物中定量检测磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)的含量的技术缺陷。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
其中，以下实施例所用原料均为市售或自制。以下样品为富含磷脂蛋白粉。
实施例1
本发明实施例提供了一种利用液质联用技术检测磷脂酰乙醇胺的具体方法，包括：
步骤1、精密称取磷脂酰乙醇胺的对照品11.05mg，置于10ml容量瓶中，加入三氯甲烷∶甲醇(体积比为1∶1)溶液溶解并定容至容量瓶刻度，摇匀，得到对照品储备液(1.083mg/ml)。对照品溶液放在-18℃的冰箱中避光储存备用。精密移取对照储备液1ml，用三氯甲烷∶甲醇(体积比为1∶1)溶液稀释并定容至25ml容量瓶中，得到对照中间液。精密移取对照中间液1ml，用三氯甲烷∶甲醇(体积比为1∶1)溶液稀释并定容至10ml容量瓶中，得到磷脂酰乙醇胺的对照供试液，磷脂酰乙醇胺的对照供试液分别进样2μl、4μl、8μl、15μl、20μl，在HPLC系统条件下，进行分析测定，绘制外标法标准工作曲线。
其中，HPLC系统条件为：
色谱柱：
Figure BDA0001737807910000042
HPLC COLUMN，WP300 C4(5um 4.6x150mm)；
柱温：40℃；
流速：0.4ml/min；
流动相-A相：甲醇∶乙腈∶含乙酸铵的水溶液的体积比为1∶1∶3；其中含乙酸铵的浓度为5mmol/L；
流动相-B相：异丙醇(含5mmol/L的乙酸铵)；
按以下梯度洗脱
Figure BDA0001737807910000041
Figure BDA0001737807910000051
质谱条件：
ESI+模式，Neutral loss 141分析，扫描范围为600-800
DP：91、CE：32、CAD：4、EP：10、CUR：20、IS：5500、TEM：500℃、GAS1：50、GAS2：50。
步骤2、精密称取样品(样品包括磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇)，置于10ml容量瓶中，加入适量水，室温超声(40KHz)，振荡均匀，取出用水定容至容量瓶刻度，摇匀。精密移取1ml试液至50ml容量瓶中，加入适量三氯甲烷∶甲醇(体积比为1∶1)溶液，室温超声(40KHz，10min)使样品溶解均匀后用三氯甲烷∶甲醇(体积比为1∶1)溶液定容至容量瓶刻度，摇匀，经有机滤膜过滤，即得供试品溶液。进样2μl，按照以上HPLC系统条件和质谱条件，进行，按照步骤1中HPLC-MS/MS联用技术检测，代入到标准工作曲线中获得待测样品中磷脂酰乙醇胺的浓度。
结果计算公式如下：
X＝V×C÷M×K
式中：X-试样中PE的含量，％；
C-试样溶液中PE的浓度，μg/ml；
M-试样的质量，mg；
V-试样稀释的体积，ml；
K-单位转换系数，K＝0.1。
步骤3、使用三氯甲烷∶甲醇(体积比为1∶1)溶液作为空白溶液不加样品，按以上供试品溶液的制备方法处理得到空白溶液，按照以上HPLC系统条件和质谱条件测定空白溶液，与磷脂酰乙醇胺的对照供试液的出峰时间对比。结果如图1所示，空白溶液在磷脂酰乙醇胺的出峰时间处均无吸收峰，表明空白溶液对测定结果无干扰。
外标法标准工作曲线的绘制方法如下：
1、对不同浓度的磷脂酰乙醇胺的对照供试液按照以上方法检测，结果如下表：
Figure BDA0001737807910000061
2、根据上表的数据，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线如图2所示，线性评价如下：相关系数为0.9984，因此用该方法测定磷脂酰乙醇胺在浓度为2.167μg/ml至21.67μg/ml之间呈现良好的线性，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T27404-2008要求相关系数≥0.99】。
3、检出限和定量限：分析方法的检出限DL和定量限QL由信噪比(S/N)计算。DL定义为S/N＝3时对应的待分析浓度，QL定义为S/N＝10时对应的待分析浓度。其中，检出限：当信噪比(S/N)为3时，PE检出限为0.23μg/ml；样品取样量55mg，稀释体积为500ml时，方法的PE检出限为2.1μg/mg；定量限：当信噪比(S/N)为10时，PE定量限为0.77μg/ml；样品取样量55mg，稀释体积为500ml时，方法的PE检出限为7.0μg/mg。
4、精密度试验：称取6份样品，按供试品溶液的制备方法处理样品，按照本发明实施例1的方法检测样品磷脂酰乙醇胺的含量，计算其RSD(％)，试验数据见下表。
Figure BDA0001737807910000062
Figure BDA0001737807910000071
上表的数据表明：6份样品PE含量的RSD为1.5％，表明本发明的方法有较好的精密度，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T27404-2008要求RSD(％)≤2.0％】。
5、耐用性试验(稳定性)：将步骤2的供试品溶液分别在室温下放置0h、1h、2h、4h、6h、8h后，按步骤1中HPLC-MS/MS联用技术测定PE峰面积，计算其RSD(％)。试验数据如下表：
Figure BDA0001737807910000072
试验结论：供试品溶液分别在室温下放置0h、1h、2h、4h、6h、8h后，PE峰面积响应RSD为1.2％，表明样品供试液在室温下8小时内的PE稳定性良好。
6、准确度试验(回收率)：精密称取约55mg样品9份(已知样品的PE含量：4.04％)，分成3组，每组3份，各置于10ml容量瓶中，加入适量水，室温超声(40KHz)，振荡均匀，取出用水定容至容量瓶刻度，摇匀。精密移取1ml试液至50ml容量瓶中，每组分别精密加入PE对照加标溶液(浓度：10.26mg/ml)0.03ml、0.055ml、0.08ml，然后加入适量三氯甲烷∶甲醇(体积比为1∶1)溶液，室温超声(40KHz,10min)使样品溶解均匀后用三氯甲烷∶甲醇(体积比为1∶1)溶液定容至容量瓶刻度，摇匀，经有机滤膜过滤，即得样品加标供试液。回收率试验结果如下表。
Figure BDA0001737807910000081
根据以下公式计算回收率：
测得加入量＝加标样品测得量—样品测得量；
回收率(％)＝测得加入量/理论加入量×100％；
试验结论：平均回收率为：100.4％，相对标准偏差(RSD)为2.5％，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T27404-2008要求回收率为95—105％】。
通过以上的检测试验，可知：通过对PE含量测定方法进行线性、精密度、耐用性试验(稳定性)、专属性试验(空白)、检出限、定量限、准确度(回收率)试验，均符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求，证明本发明的利用液质联用技术检测磷脂的方法是科学有效的，能对富含磷脂蛋白粉中的PE含量起到质量控制的目的。
实施例2
本发明实施例提供了一种利用液质联用技术检测磷脂酰肌醇的具体方法，包括：
步骤1、精密称取磷脂酰肌醇(PI)的对照品23.68mg，置于20ml容量瓶中，加入三氯甲烷∶甲醇(体积比为1∶1)溶液溶解并定容至容量瓶刻度，摇匀，得到对照品储备液(1.16mg/ml)。对照品溶液放在-18℃的冰箱中避光储存备用。精密移取对照储备液1ml，用三氯甲烷∶甲醇(体积比为1∶1)溶液稀释并定容至25ml容量瓶中，得到对照中间液。精密移取对照中间液1ml，用三氯甲烷∶甲醇(体积比为1∶1)溶液稀释并定容至10ml容量瓶中，得到磷脂酰肌醇(PI)的对照供试液，磷脂酰肌醇(PI)的对照供试液分别进样0.5μl、1μl、2μl、4μl、8μl，在HPLC-MS/MS联用技术下，进行分析测定，绘制外标法标准工作曲线。
其中，HPLC系统条件为：
色谱柱：
Figure BDA0001737807910000091
HPLC COLUMN，WP300C4(5um 4.6x150mm)；
柱温：40℃；
流速：0.4ml/min；
流动相-A相：甲醇∶乙腈∶含乙酸铵的水溶液的体积比为1∶1∶3；其中含乙酸铵的浓度为5mmol/L；
流动相-B相：异丙醇(含5mmol/L的乙酸铵)；
按以下梯度洗脱：
Time(min) B％
0.5 20
1.5 40
3.0 60
13.0 98
13.1 20
17.0 20
质谱条件：
ESI+模式，Neutral loss 277分析，扫描范围为840-940。
DP：7、CE：30、CAD：6、EP:10、CUR：20、IS：5500、TEM：500℃、GAS1：50、GAS2：50。
步骤2、精密称取样品(样品包括磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇)，置于10ml容量瓶中，加入适量水，室温超声(40KHz)，振荡均匀，取出用水定容至容量瓶刻度，摇匀。精密移取1ml试液至50ml容量瓶中，加入适量三氯甲烷∶甲醇(体积比为1∶1)溶液，室温超声(40KHz，10min)使样品溶解均匀后用三氯甲烷∶甲醇(体积比为1∶1)溶液定容至容量瓶刻度，摇匀，经有机滤膜过滤，即得供试品溶液。进样2μl，按照以上HPLC系统条件和质谱条件，进行，按照步骤1中HPLC-MS/MS联用技术检测，代入到标准工作曲线中获得待测样品中磷脂酰肌醇(PI)的浓度。
结果计算公式如下：
X＝V×C÷M×K
式中：X—试样中PI的含量，％；
C—试样溶液中PP的浓度，μg/ml；
M—试样的质量，mg；
V—试样稀释的体积，ml；
K—单位转换系数，K＝0.1。
步骤3、使用三氯甲烷∶甲醇(体积比为1∶1)溶液作为空白溶液不加样品，按以上供试品溶液的制备方法处理得到空白溶液，按照以上HPLC系统条件和质谱条件测定空白溶液，与磷脂酰肌醇的对照供试液的出峰时间对比。结果如图3所示，空白溶液在磷脂酰肌醇的出峰时间处均无吸收峰，表明空白溶液对测定结果无干扰。
外标法标准工作曲线的绘制方法如下：
1、对不同浓度的磷脂酰肌醇的对照供试液按照以上方法检测，结果如下表：
Figure BDA0001737807910000101
2、根据上表的数据，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线如图4所示，线性评价如下：相关系数为0.9921，因此用该方法测定磷脂酰肌醇在浓度为1.16μg/ml至13.90μg/ml之间呈现良好的线性，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T27404-2008要求相关系数≥0.99】。
3、检出限和定量限：分析方法的检出限DL和定量限QL由信噪比(S/N)计算。DL定义为S/N＝3时对应的待分析浓度，QL定义为S/N＝10时对应的待分析浓度。其中，检出限：当信噪比(S/N)为3时，磷脂酰肌醇(PI)检出限为0.17μg/ml；样品取样量55mg，稀释体积为500ml时，方法的PI检出限为1.6μg/mg；定量限：当信噪比(S/N)为10时，PI定量限为0.57μg/ml；样品取样量55mg，稀释体积为500ml时，方法的PI检出限为5.2μg/mg。
4、精密度试验：称取6份样品，按供试品溶液的制备方法处理样品，按照本发明实施例1的方法检测样品的PI含量，计算其RSD(％)，试验数据见下表。
Figure BDA0001737807910000111
上表的数据表明：6份样品PI含量的RSD为2.0％，表明本发明的方法有较好的精密度，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T27404-2008要求RSD(％)≤2.0％】。
5、耐用性试验(稳定性)：将步骤2的供试品溶液分别在室温下放置0h、1h、2h、4h、6h、8h后，按步骤1中HPLC-MS/MS联用技术测定PI峰面积，计算其RSD(％)。试验数据如下表：
Figure BDA0001737807910000112
试验结论：供试品溶液分别在室温下放置0h、1h、2h、4h、6h、8h后，PI峰面积响应RSD为1.5％，表明样品供试液在室温下8小时内的PI稳定性良好。
6、准确度试验(回收率)：精密称取约55mg样品9份(已知样品的PI含量：1.27％)，分成3组，每组3份，各置于10ml容量瓶中，加入适量水，室温超声(40KHz)，振荡均匀，取出用水定容至容量瓶刻度，摇匀。精密移取1ml试液至50ml容量瓶中，每组分别精密加入PI对照加标溶液(浓度：1.16mg/ml)0.7ml、1.1ml、2.0ml，然后加入适量三氯甲烷∶甲醇(体积比为1∶1)溶液，室温超声(40KHz,10min)使样品溶解均匀后用三氯甲烷∶甲醇(体积比为1∶1)溶液定容至容量瓶刻度，摇匀，经有机滤膜过滤，即得样品加标供试液。回收率试验结果如下表。
Figure BDA0001737807910000121
根据以下公式计算回收率：
测得加入量＝加标样品测得量—样品测得量；
回收率(％)＝测得加入量/理论加入量×100％；
试验结论：平均回收率为：100.8％，相对标准偏差(RSD)为3.3％，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T27404-2008要求回收率为95—105％】。
通过以上的检测试验，可知：通过对PI含量测定方法进行线性、精密度、耐用性试验(稳定性)、专属性试验(空白)、检出限、定量限、准确度(回收率)试验，均符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求，证明本发明的利用液质联用技术检测磷脂的方法是科学有效的，能对富含磷脂蛋白粉中的PI含量起到质量控制的目的。
实施例3
本发明实施例提供了一种利用液质联用技术检测磷脂酰丝氨酸(PS)的具体方法，包括：
步骤1、精密称取磷脂酰丝氨酸(PS)的对照品20.04mg，置于20ml容量瓶中，加入三氯甲烷∶甲醇(体积比为1∶1)溶液溶解并定容至容量瓶刻度，摇匀，得到对照品储备液(0.982mg/m1)。对照品溶液放在-18℃的冰箱中避光储存备用。精密移取对照储备液1ml，用三氯甲烷∶甲醇(体积比为1∶1)溶液稀释并定容至25ml容量瓶中，得到对照中间液。精密移取对照中间液1ml，用三氯甲烷∶甲醇(体积比为1∶1)溶液稀释并定容至10ml容量瓶中，得到磷脂酰丝氨酸(PS)的对照供试液，磷脂酰丝氨酸(PS)的对照供试液分别进样0.5μl、1μl、2μl、4μl、8μl，在HPLC-MS/MS联用技术条件下，进行分析测定，绘制外标法标准工作曲线。
其中，HPLC系统条件为：
色谱柱：
Figure BDA0001737807910000131
HPLC COLUMN，WP300C4(5um 4.6×150mm)；
柱温：40℃；
流速：0.4ml/min；
流动相-A相：甲醇∶乙腈∶含乙酸铵的水溶液的体积比为1∶1∶3；其中含乙酸铵的浓度为5mmol/L；
流动相-B相：异丙醇(含5mmol/L的乙酸铵)；
按以下梯度洗脱：
Figure BDA0001737807910000132
质谱条件：
ESI+模式，Neutral loss 185分析，扫描范围为600-950。
DP：120、CE：31、CAD：4、EP：10、CUR：20、IS：5500、TEM：500℃、GAS1：50、GAS2：50。
步骤2、精密称取样品(样品包括磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇)，置于10ml容量瓶中，加入适量水，室温超声(40KHz)，振荡均匀，取出用水定容至容量瓶刻度，摇匀。精密移取1ml试液至50ml容量瓶中，加入适量三氯甲烷∶甲醇(体积比为1∶1)溶液，室温超声(40KHz，10min)使样品溶解均匀后用三氯甲烷∶甲醇(体积比为1∶1)溶液定容至容量瓶刻度，摇匀，经有机滤膜过滤，即得供试品溶液。进样2μl，按照以上HPLC系统条件和质谱条件，进行，按照步骤1中HPLC-MS/MS联用技术检测，代入到标准工作曲线中获得待测样品中PS的浓度。
结果计算公式如下：
X＝V×C÷M×K
式中：X-试样中PS的含量，％；
C-试样溶液中PS的浓度，μg/ml；
M-试样的质量，mg；
V-试样稀释的体积，ml；
K-单位转换系数，K＝0.1。
步骤3、使用三氯甲烷∶甲醇(体积比为1∶1)溶液作为空白溶液不加样品，按以上供试品溶液的制备方法处理得到空白溶液，按照以上HPLC系统条件和质谱条件测定空白溶液，与PS的对照供试液的出峰时间对比。结果如图5所示，空白溶液在PS的出峰时间处均无吸收峰，表明空白溶液对测定结果无干扰。
外标法标准工作曲线的绘制方法如下：
1、对不同浓度的PS的对照供试液按照以上方法检测，结果如下表：
Figure BDA0001737807910000141
Figure BDA0001737807910000151
2、根据上表的数据，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线如图4所示，线性评价如下：相关系数为0.9946，因此用该方法测定PS在浓度为0.98μg/ml至15.72μg/ml之间呈现良好的线性，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T27404-2008要求相关系数≥0.99】。
3、检出限和定量限：分析方法的检出限DL和定量限QL由信噪比(S/N)计算。DL定义为S/N＝3时对应的待分析浓度，QL定义为S/N＝10时对应的待分析浓度。其中，检出限：当信噪比(S/N)为3时，PS检出限为0.12μg/ml；样品取样量55mg，稀释体积为500ml时，方法的PS检出限为1.1μg/mg；定量限：当信噪比(S/N)为10时，PS定量限为0.40μg/ml；样品取样量55mg，稀释体积为500ml时，方法的PS检出限为3.7μg/mg。
4、精密度试验：称取6份样品，按供试品溶液的制备方法处理样品，按照本发明实施例1的方法检测样品的PS含量，计算其RSD(％)，试验数据见下表。
Figure BDA0001737807910000152
上表的数据表明：6份样品PS含量的RSD为1.8％，表明本发明的方法有较好的精密度，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T27404-2008要求RSD(％)≤2.0％】。
5、耐用性试验(稳定性)：将步骤2的供试品溶液分别在室温下放置0h、1h、2h、4h、6h、8h后，按步骤1中HPLC-MS/MS联用技术测定PS峰面积，计算其RSD(％)。试验数据如下表：
Figure BDA0001737807910000161
试验结论：供试品溶液分别在室温下放置0h、1h、2h、4h、6h、8h后，PS峰面积响应RSD为2.0％，表明样品供试液在室温下8小时内的PS稳定性良好。
6、准确度试验(回收率)：精密称取约55mg样品9份(已知样品的PS含量：2.19％)，分成3组，每组3份，各置于10ml容量瓶中，加入适量水，室温超声(40KHz)，振荡均匀，取出用水定容至容量瓶刻度，摇匀。精密移取1ml试液至50ml容量瓶中，每组分别精密加入PS对照加标溶液(浓度：0.982mg/m1)1.1ml、2.2ml、2.7ml，然后加入适量三氯甲烷∶甲醇(体积比为1∶1)溶液，室温超声(40KHz，10min)使样品溶解均匀后用三氯甲烷∶甲醇(体积比为1∶1)溶液定容至容量瓶刻度，摇匀，经有机滤膜过滤，即得样品加标供试液。回收率试验结果如下表。
Figure BDA0001737807910000162
根据以下公式计算回收率：
测得加入量＝加标样品测得量-样品测得量；
回收率(％)＝测得加入量/理论加入量×100％；
试验结论：平均回收率为：100.7％，相对标准偏差(RSD)为3.4％，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T27404-2008要求回收率为95-105％】。
通过以上的检测试验，可知：通过对PS含量测定方法进行线性、精密度、耐用性试验(稳定性)、专属性试验(空白)、检出限、定量限、准确度(回收率)试验，均符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求，证明本发明的利用液质联用技术检测磷脂的方法是科学有效的，能对富含磷脂蛋白粉中的PS含量起到质量控制的目的。
对比例1
本发明实施例提供了一个对比例，具体步骤如下：
参照实施例2的利用液质联用技术检测磷脂酰肌醇的具体方法，其区别是对比例采用C8色谱柱检测磷脂酰肌醇(PI)的含量，其结果如图7，采用C8色谱柱检测会使得PI的谱图中会出现多个峰重合在一起的情况。
对比例2
本发明实施例提供了一个对比例，具体步骤如下：
参照实施例2的利用液质联用技术检测磷脂酰肌醇的具体方法，其区别是对比例采用C18色谱柱检测磷脂酰肌醇(PI)的含量，其结果如图8，采用C18色谱柱检测会使得PI的谱图中会出现多个峰交叉重合在一起的情况。
对比例3
本发明实施例提供了一个对比例，具体步骤如下：
参照实施例2的利用液质联用技术检测磷脂酰肌醇的具体方法，其区别是对比例采用氨基柱检测磷脂酰肌醇(PI)的含量，其结果如图9，采用氨基柱检测会使得PI的谱图无法出峰。
对比例4
本发明实施例提供了一个对比例，具体步骤如下：
参照实施例1的利用液质联用技术检测磷脂酰乙醇胺的具体方法，其区别是对比例采用硅胶柱检测磷脂酰乙醇胺(PE)的含量，其结果如图10，采用硅胶柱检测会使得PE的谱图的出峰不理想情况。
综上所述，本发明解决了现有技术中无法从含有磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)的蛋白粉中定量检测磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)含量的技术缺陷。本发明的目的在于利用了C4色谱柱的液质联用技术检测磷脂。采用中性丢失扫描模式扫描，外标法定量，从组合物中检测磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)或磷脂酰肌醇(PI)的含量，并达到了较高的精密度、线性关系、回收率等标准，大大节省检测的时间和成本。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种利用液质联用技术检测蛋白粉的磷脂的方法，其特征在于，包括：
步骤1、单独配制磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇的梯度浓度的工作标准液，采用HPLC-MS/MS联用技术检测，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线；
其中，HPLC系统条件为：
以C4色谱柱为固定相，以甲醇和乙腈为流动相A的有机相、以含乙酸铵的水溶液为流动相A的水相，以含乙酸铵的异丙醇为流动相B进行梯度洗脱；其中，所述流动相A相中，所述甲醇：所述乙腈：所述含乙酸铵的水溶液的体积比为1：1：3；其中含乙酸铵的浓度为5mmol/L；
所述流动相B相中，所述异丙醇中含5mmol/L的乙酸铵；所述梯度洗脱的程序为0.5 min20% B，1.5 min 40% B，3.0 min 60% B，13.0 min 98% B，13.1 min 20% B，17.0 min 20%B；
步骤2、取待测样品用溶剂超声波提取，离心，过滤获得供试品溶液，按照步骤1中HPLC-MS/MS联用技术检测，得到的检测结果代入到所述标准工作曲线中获得待测样品中磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸或磷脂酰肌醇的浓度，其中，待测样品包括磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇；采用HPLC-MS/MS联用技术检测采用ESI中性丢失模式分析；
当检测所述待测样品的磷脂酰乙醇胺时，ESI中性丢失模式的扫描范围为600-800；当检测所述待测样品的磷脂酰丝氨酸时，ESI中性丢失模式的扫描范围为600-950；当检测所述待测样品的磷脂酰肌醇时，ESI中性丢失模式的扫描范围为840-940。
2.根据权利要求1所述的利用液质联用技术检测蛋白粉的磷脂的方法，其特征在于，所述C4色谱柱的柱温为30-50℃。
3.根据权利要求1所述的利用液质联用技术检测蛋白粉的磷脂的方法，其特征在于，所述HPLC的流速为0.3-0.6mL/min。
4.根据权利要求1所述的利用液质联用技术检测蛋白粉的磷脂的方法，其特征在于，所述溶剂包括三氯甲烷和甲醇；所述三氯甲烷：所述甲醇的体积比为1:1。
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