CN112816573A - 一种同时检测藻油中磷脂、糖脂及甘油酯的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种同时检测藻油中磷脂、糖脂及甘油酯的方法，所述方法包括采用高效液相色谱与质谱联用技术对样品溶液进行分析，高效液相色谱系统中，流动相A为水、甲醇和甲酸铵的混合溶液，其中水:甲醇体积比＝(0.9‑1.1):(1.9‑2.1)，甲酸铵浓度为3‑8mM；流动相B为异丙醇、乙腈和甲酸铵的混合溶液，其中异丙醇:乙腈体积比＝(4.8‑5.2):1，甲酸铵浓度为3‑8mM。本发明提供的检测方法可同时检测出藻油中磷脂、糖脂及甘油酯三类物质的构成及含量，结果准确度高，且操作便捷，为藻油的后期纯化工艺提供技术支持。

Description

一种同时检测藻油中磷脂、糖脂及甘油酯的方法
技术领域
本发明涉及药品保健品领域，尤其涉及一种同时检测藻油中磷脂、糖脂及甘油酯的方法。
背景技术
甘油酯根据分子所用脂肪酸分子的数目可分为甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯。
磷脂包括甘油磷脂(glycerophospholipid)和鞘磷脂(sphingomyelin，SM)。鞘磷脂主要存在于哺乳动物细胞中，在脑和神经细胞膜中特别丰富，亦称神经醇磷脂，故植物中的磷脂一般即为甘油磷脂。甘油磷脂分子由1个磷酸、1个甘油骨架、1个亲水头部R和1个疏水尾部等4部分组成。亲水头部R是磷脂分子的极性端，可以是胆碱、乙醇胺、肌醇、丝氨酸、甘油，构成不同种类的甘油磷脂化合物：磷脂酸(Phosphoric acid，PA)、磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine，PC)、磷脂酰乙醇胺(Lysophosphatidylethanolamine，PE)、磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol，P I)、磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)、磷脂酰甘油(Phosphatidylglycerol，PG)等。此外，当磷脂分子失去一条疏水尾之后，即成为溶血性磷脂(Lysophospholipid)。
与磷脂相似，糖脂也可分为两类：甘油糖脂(glyceroglycolipid)和鞘糖脂(Glycosphingolipid)。鞘糖脂主要存在于哺乳动物细胞中，而植物中的糖脂则以甘油糖脂为主，其包括硫代异鼠李糖单酰基甘油(SQMG)，硫代异鼠李糖甘油二酯(SQDG)，单半乳糖二酰基甘油(MGDG，Monogalaetosyldiacylglycerol)，双半乳糖二酰基甘油(DGDG，Digalactosyldiacylglycerol)等。
藻类直接提取的藻油是由包括甘油酯、糖脂和磷脂构成的混合物，在后续纯化处理或副产物的提取中会面临较多挑战，研究藻油中的磷脂、糖脂及甘油酯对藻油后期的工艺纯化有很大帮助。然而，目前的检测方法要么主要是针对脂肪酸组成进行检测，甲酯化后无法得到准确结构；要么至多只能同时检测以上三类物质中的两类，不能同时检测这三类物质。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种同时检测藻油中磷脂、糖脂及甘油酯的方法，为藻油的后期纯化工艺提供技术支持。
本发明提供一种同时检测藻油中磷脂、糖脂及甘油酯的方法，包括采用高效液相色谱与质谱联用技术对样品溶液进行分析；
高效液相色谱系统中，流动相A为水、甲醇和甲酸铵的混合溶液，其中水:甲醇体积比＝(0.9-1.1):(1.9-2.1)，甲酸铵浓度为3-8mM；流动相B为异丙醇、乙腈和甲酸铵的混合溶液，其中异丙醇:乙腈体积比＝(4.8-5.2):1，甲酸铵浓度为3-8mM。
优选地，高效液相色谱系统中，流动相A为水、甲醇和甲酸铵的混合溶液，其中水:甲醇体积比＝1:2，甲酸铵浓度为5mM；流动相B为异丙醇、乙腈和甲酸铵的混合溶液，其中异丙醇:乙腈体积比＝5:1，甲酸铵浓度为5mM。
进一步地，所述高效液相色谱系统中，梯度洗脱条件为：0.5min，20-30％B相；1.5min 40-50％B相；3min 60-70％B相；13min 98％B相；13.1min 20-30％B相；17min 20-30％B相。进一步优选为：0.5min，20％B相；1.5min 40％B相；3min 60％B相；13min 98％B相；13.1min20％B相；17min 20％B相。
这些条件主要是根据柱子的特性、待测物的溶解度、极性与流动相的极性匹配度经过大量实验摸索出来的，当由于一些细微的差异使这些条件不匹配的时候会出现目标待测物未分开，峰型不清晰等现象，无法准确得到待测物的信息。
进一步地，所述高效液相色谱系统中，柱温为58-63℃，样品室温度为2-6℃，流动相速度为0.3-0.6mL/min。
进一步地，质谱系统中，ESI离子源，正负模式，质谱采集的质量数范围为m/z 100-1200，质谱条件如下：
正离子模式：Curtain Gas:35.000psi；Ion Source Gas1:50.000psi；Ion SourceGas2:50.00psi；IonSpray Voltage:5500.00V，DP:75V，CE:35V；Temperature:600℃；
负离子模式：Curtain Gas:35.000psi；Ion Source Gas1:50.000psi；Ion SourceGas2:50.00psi；DP:-75V，CE:-35V；IonSpray Voltage:-4500.00V；Temperature:600℃。
进一步地，所述样品溶液由藻油经异丙醇稀释所得，并加入内标物。
进一步地，所述样品溶液中，藻油浓度为0.01-0.1mg/ml。
本发明提供的检测方法可同时检测出藻油中磷脂、糖脂及甘油酯三类物质的构成及含量，结果准确度高，且操作便捷，为藻油的后期纯化工艺提供技术支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中藻油检测所得液质色谱图；
图2为本发明实施例1中糖脂DGDG正离子模式检测的质谱图；
图3为本发明实施例1中磷脂PC正离子模式检测的质谱图；
图4为本发明实施例1中溶血磷脂LPC正离子模式检测的质谱图；
图5为本发明实施例1中甘油酯正离子模式检测的质谱图；
图6为本发明对比例1中藻油检测所得液质色谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种同时检测藻油中磷脂、糖脂及甘油酯的方法，步骤如下：
前处理：称取藻油约10mg，用异丙醇稀释至0.05mg/ml，加入全脂内标50μL(10μg/mL)，过0.22μm有机滤膜，上机。
其中内标物为磷脂(包括PE、PS、PG、PI、PA、PC、LPC、LPE)、糖脂(SM、DG)、甘油三酯的氘标。
色谱系统：Agilent1290；色谱柱：Agilent C18column(100×2.1mm，2.6μm)；进样量：10μL；流速：0.4mL/min；柱温：60℃；样品室温度：4℃。A相：水:甲醇体积比＝1:2(含5mM甲酸铵)；B相：异丙醇：乙腈体积比＝5:1(含5mM甲酸铵)，梯度洗脱条件：0.5min，20％B相；1.5min 40％B相；3min 60％B相；13min 98％B相；13.1min 20％B相；17min 20％B相。
质谱系统：AB Sciex
Figure BDA0002866238280000052
6600，ESI离子源，正负模式，质谱采集的质量数范围为m/z 100-1200，质谱条件如下：
正离子模式：Curtain Gas:35.000psi；Ion Source Gas1:50.000psi；Ion SourceGas2:50.00psi；IonSpray Voltage:5500.00V，DP:75V，CE:35V；Temperature:600℃；
负离子模式：Curtain Gas:35.000psi；Ion Source Gas1:50.000psi；Ion SourceGas2:50.00psi；DP:-75V，CE:-35V；IonSpray Voltage:-4500.00V；Temperature:600℃
应用MSDIAL ver、PeakView和MultiQuant等软件完成脂质的定性和定量，糖脂、甘油酯和磷脂定量公式如下：
脂质含量＝(S1/S2)×C/M
S1-待测物峰面积；S2-内标峰面积；C-内标质量；M-样本质量。
藻油经检测分析共得到34种糖脂、26种磷脂和123种甘油酯，具体组成及含量见表1～3。图1为藻油检测所得液质色谱图，图2～5为几种常规的糖脂如DGDG(图2)和磷脂如PC(图3)、LPC(图4)以及甘油三酯(图5)的质谱图。
表1原油中的糖脂构成及含量
Figure BDA0002866238280000051
Figure BDA0002866238280000061
表2原油中的磷脂构成及含量
序号 化合物名称 原油中含量 序号 化合物名称 原油中含量
1 LPC 16:0 0.0709％ 14 PC 16:0-20:5 0.3055％
2 LPC 16:1 0.0728％ 15 PC 16:1-20:5 0.0204％
3 LPC 18:1 0.0528％ 16 PC 16:2-20:5 0.0879％
4 PC 16:0-16:1 0.7034％ 17 PC 18:1-20:4 0.1542％
5 PC 16:1-16:1 0.4286％ 18 PC 18:1-20:5 0.1848％
6 PC 16:0-18:1 0.5512％ 19 PC 20:5-20:5 0.0782％
7 PC 16:1-18:1 0.8996％ 20 PC 20:4-20:5 0.0341％
8 PC 16:1-18:2 0.4707％ 21 PE 16:1-16:1 0.0482％
9 PC 16:1-18:3 0.0744％ 22 PE 18:1-20:4 0.0460％
10 PC 14:0-20:5 0.0350％ 23 PG 16:0-16:0 0.2758％
11 PC 18:1-18:1 0.1225％ 24 PG 16:0-16:1 1.5040％
12 PC 18:1-18:2 0.1099％ 25 PG 16:0-20:5 0.9334％
13 PC 18:2-18:2 0.4743％ 26 PG 16:1-20:5 0.1153％
表3原油中的甘油酯构成及含量
Figure BDA0002866238280000062
Figure BDA0002866238280000071
Figure BDA0002866238280000081
验证：选择含量较高的C16:0进行验证，这三类物质中C16:0的总含量为17.33％(以甘油三酯计)，与气相色谱甲酯化检测脂肪酸方法所测得C16:0的含量17.87％(以甘油三酯计)接近，说明本方法所得到的结果是可靠的。
对比例1
本对比例提供一种检测藻油中脂质的方法，步骤如下：
前处理：称取藻油约10mg，用异丙醇稀释至0.05mg/ml，加入全脂内标(同实施例1)50μL(10μg/mL)，过0.22μm有机滤膜，上机。
色谱系统：Agilent1290；色谱柱：Agilent C18column(100×2.1mm，2.6μm)；进样量：10μL；流速：0.4mL/min；柱温：60℃；样品室温度：4℃。A相：水:甲醇体积比＝1:2(含5mM甲酸铵)；B相：异丙醇(含5mM甲酸铵)，梯度洗脱条件：0.5min，20％B相；1.5min40％B相；3min 60％B相；13min 98％B相；13.1min 20％B相；17min20％B相。
质谱系统：AB Sciex
Figure BDA0002866238280000091
6600，ESI离子源，正负模式，质谱采集的质量数范围为m/z 100-1200，质谱条件如下：
正离子模式：Curtain Gas:35.000psi；Ion Source Gas1:50.000psi；Ion SourceGas2:50.00psi；IonSpray Voltage:5500.00V，DP:75V，CE:35V；Temperature:600℃；
负离子模式：Curtain Gas:35.000psi；Ion Source Gas1:50.000psi；Ion SourceGas2:50.00psi；DP:-75V，CE:-35V；IonSpray Voltage:-4500.00V；Temperature:600℃
结果所得色谱图如图6所示，与图1相比，本对比例中三种物质并未完全出峰，无法达到本发明目的。
由以上结果可以看出，本发明提供的方法能够同时检测藻油中的磷脂、糖脂及甘油酯，为藻油的后期纯化工艺提供技术支持。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一种同时检测藻油中磷脂、糖脂及甘油酯的方法，其特征在于，包括采用高效液相色谱与质谱联用技术对样品溶液进行分析；
高效液相色谱系统中，流动相A为水、甲醇和甲酸铵的混合溶液，其中水:甲醇体积比＝(0.9-1.1):(1.9-2.1)，甲酸铵浓度为3-8mM；流动相B为异丙醇、乙腈和甲酸铵的混合溶液，其中异丙醇:乙腈体积比＝(4.8-5.2):1，甲酸铵浓度为3-8mM。
2.根据权利要求1所述的同时检测藻油中磷脂、糖脂及甘油酯的方法，其特征在于，所述高效液相色谱系统中，梯度洗脱条件为：0.5min，20-30％B相；1.5min 40-50％B相；3min60-70％B相；13min 98％B相；13.1min 20-30％B相；17min 20-30％B相。
3.根据权利要求2所述的同时检测藻油中磷脂、糖脂及甘油酯的方法，其特征在于，所述高效液相色谱系统中，柱温为58-63℃，样品室温度为2-6℃，流动相速度为0.3-0.6mL/min。
4.根据权利要求1所述的同时检测藻油中磷脂、糖脂及甘油酯的方法，其特征在于，质谱系统中，ESI离子源，正负模式，质谱采集的质量数范围为m/z 100-1200，质谱条件如下：
正离子模式：Curtain Gas:35.000psi；Ion Source Gas1:50.000psi；Ion SourceGas2:50.00psi；IonSpray Voltage:5500.00V，DP:75V，CE:35V；Temperature:600℃；
负离子模式：Curtain Gas:35.000psi；Ion Source Gas1:50.000psi；Ion SourceGas2:50.00psi；DP:-75V，CE:-35V；IonSpray Voltage:-4500.00V；Temperature:600℃。
5.根据权利要求1～4任一项所述的同时检测藻油中磷脂、糖脂及甘油酯的方法，其特征在于，所述样品溶液由藻油经异丙醇稀释所得，并加入内标物。
6.根据权利要求5所述的同时检测藻油中磷脂、糖脂及甘油酯的方法，其特征在于，所述样品溶液中，藻油浓度为0.01-0.1mg/ml。
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