RU2546530C1 - Способ количественного определения бенз(а)пирена в крови методом жидкостной хроматографии - Google Patents
Способ количественного определения бенз(а)пирена в крови методом жидкостной хроматографии Download PDFInfo
- Publication number
- RU2546530C1 RU2546530C1 RU2014102793/15A RU2014102793A RU2546530C1 RU 2546530 C1 RU2546530 C1 RU 2546530C1 RU 2014102793/15 A RU2014102793/15 A RU 2014102793/15A RU 2014102793 A RU2014102793 A RU 2014102793A RU 2546530 C1 RU2546530 C1 RU 2546530C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- acetonitrile
- plasma
- blood
- vol
- sorbent
- Prior art date
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицинским токсикологическим исследованиям, в частности к санитарной токсикологии, и может быть использовано для количественного определения бенз(а)пирена в крови, для оценки риска здоровью человека и разработки мероприятий по обеспечению химической безопасности. Способ осуществляется следующим образом. Каждую пробу крови анализируют дважды. Свежеотобранную пробу крови центрифугируют со скоростью 2000 об/мин в течение 5 мин. Разделяют на фракции плазмы и форменных элементов. Проводят твердофазную экстракцию плазмы путем последовательного пропускания под вакуумом через картридж с сорбентом Oasis HLB 3 сс 100%-ного ацетонитрила, дистиллированной воды, плазмы, дистиллированной воды, 50%-ного водного раствора ацетонитрила. Затем картридж с сорбентом высушивают под вакуумом и пропускают через сорбент 100%-ный метиленхлорид. Аликвотную часть полученного экстракта хроматографируют. Для получения экстракта форменных элементов проводят дисперсионную твердофазную экстракцию: добавляют к ним 100%-ный ацетонитрил, интенсивно встряхивают. Добавляют набор солей QuECHeRS для экстракции, встряхивают интенсивно, центрифугируют 10 минут со скоростью 2000 об/мин, при этом образуется 3 слоя, верхний слой переносят в другую пробирку, в которой содержится набор солей QuECHeRS для очистки, центрифугируют со скоростью 2000 об/мин, отбирают верхний слой. Экстракт плазмы и форменных элементов анализируют на жидкостном хроматографе Agilent серии 1200 с флуориметрическим детектором на колонке Zorbax длиной 50 мм и внутренним диаметром 4,6 мм с сорбентом Eclipse РАН Cпри температуре колонки 27°C, при использовании в качестве подвижной фазы с
Description
Изобретение относится к медицинским токсикологическим исследованиям, в частности к санитарной токсикологии, и может быть использовано для количественного определения бенз(а)пирена в крови, для оценки риска здоровью человека и разработки мероприятий по обеспечению химической безопасности.
Бенз(а)пирен является одним из наиболее сильных канцерогенов среди полиароматических углеводородов (далее ПАУ). Концентрация бенз(а)пирена в воздухе на уровне 3-6 нг/м3 при длительном воздействии может привести к увеличению частоты рака легкого у населения. Поэтому в России и многих других странах законодательно введены максимально допустимые пределы для бенз(а)пирена, что, в свою очередь, обусловливает необходимость разработки и применения соответствующих методов контроля.
Для определения бенз(а)пирена и других ПАУ в различных средах используют методы газовой и жидкостной хроматографии, масс-спектроскопии и т.д. Наиболее высокую достоверность идентификации и чувствительность имеют методы, основанные на использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой. Определение бенз(а)пирена в различных объектах окружающей среды сильно осложняется тем, что он присутствует обычно в очень малых концентрациях. При определении возможны потери вещества на различных этапах анализа, в частности в результате улетучивания его в процессе отгонки растворителей.
Анализ литературы показал, что известные химико-аналитические методы касаются в основном определения метаболитов бенз(а)пирена в биологических средах при его экспозиции различными путями. Это связано, вероятнее всего, с тем, что бенз(а)пирен является «латентным» химическим веществом. При попадании в организм он метаболизирует с образованием более токсичных соединений, которые вызывают канцерогенный и другие опасные для организма эффекты.
Известны различные способы определения бенз(а)пирена: в пищевых продуктах, в биологических объектах (жире, мышцах и тканях).
В соответствии с СанПиН 2.3.2.560-96 допустимый уровень содержания бенз(а)пирена в пищевых продуктах составляет 0,001 мг/кг. Загрязнение пищевых продуктов бенз(а)пиреном происходит из воздуха, воды и в результате переработки пищевых продуктов. Применение открытого огня или жаровен, для которых используют древесный уголь, могут вызывать загрязнения ПАУ не только воздуха, но и пищи, которая готовится таким способом.
Например, известен способ определения бенз(а)пирена в пищевых продуктах животного происхождения (копченых мясных и рыбных продуктах) [1]. Пробоподготовка включает следующие процедуры: гомогенизированную пробу экстрагируют хлористым метиленом, экстракт фильтруют через бумажный фильтр и слой безводного сульфата натрия. Фильтрат упаривают на роторном испарителе, перерастворяют в 100 см3 гексана, переносят в делительную воронку емкостью на 1000 см3 и двумя порциями по 50 см3 смеси диметилформамида и воды переэкстрагируют. Отделяют нижний слой, а из верхнего гексанового экстрагируют ПАУ повторно. Гексановый слой отбрасывают, а объединенный диметилформамидный экстракт разбавляют 100 см3 и экстрагируют ПАУ гексаном трижды по 40 см3. Гексановые экстракты объединяют и промывают водой двумя порциями по 50 см3. Фильтруют через бумажный фильтр и слой безводного сульфата натрия помещают в грушевидную колбу на 200 см3. Обезвоженный экстракт упаривают до объема 1-1,5 см3 а остаток растворителя удаляют током азота или воздуха. Высушенный экстракт растворяют в 200 мм3 ацетонитрила и анализируют методом тонкослойной хроматографии. Способ позволяет определить 0,5-1 мкг бенз(а)пирена в 1 кг массы биоматериала.
Также известен метод определения бенз(а)пирена в копченостях методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с флуориметрической и УФ-детекцией [2]. Навеску массой 5 г измельчают, перетирают с 0,2 г безводного сульфата натрия и помещают в коническую колбу. Туда же добавляют 50 мл изопропанола и проводят экстракцию в течение 15 минут. Экстракт фильтруют в круглодонную колбу, добавляют 6 мл воды и 0,2 г гидроксида калия. Проводят гидролиз экстракта в течение 30 минут в колбе с обратным холодильником. Гидролизат фильтруют в стакан, добавляют 60 мл воды и экстрагируют 3×10 мл хлороформа (нижний слой). Органические вытяжки объединяют, осушают над хлоридом кальция и упаривают на роторном испарителе до объема 3-5 мл. Упаренную вытяжку переносят на стеклянную колонку диаметром 1-2 см, заполненную на 5 см силикагелем с зернением 60-140 мкм, и элюируют полиароматические углеводороды 30 мл смеси «гексан-хлороформ» 80:20. Элюат упаривают на роторном испарителе до объема 3-5 мл, переносят в пробирку на 5 мл и отгоняют растворитель током воздуха. Сухой остаток перерастворяют в 500 мкл ацетонитрила (смеси «ацетонитрил-вода» 95:5) и анализируют на колонке с Диасорбом C16 с использованием УФ- и флуориметрической детекции.
Также известны: Способ определения ПАУ в биологических объектах [3] и Способ количественного определения углеводородов в биологических объектах [4]. Однако их недостатком является то, что определение производится только суммы ПАУ, без разделения на составляющие, что делает известные способы неселективными.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ определения бенз(а)пирена в биологическом объекте - мышечной ткани, методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектором [5]. Для определения бенз(а)пирена 3 г мускула гомогенизировали жидким азотом и извлекали из матрицы 50 см3 гексана при действии ультразвуком в течение 30 минут. Гомогенаты фильтровали через безводный сульфат натрия и концентрировали приблизительно до 1 см3 при 45°C в ротационном испарителе. Сконцентрированный раствор очищали, используя активизированный патрон Florisil. Бенз(а)пирен элюировали с патрона 18 см3 раствора гексана и дихлорметана в соотношении 3:1, элюат высушивали при 45°C, затем растворяли в 1 см3 ацетонитрила и обрабатывали ультразвуком. Затем 20 мм3 фильтрованного раствора анализировали, используя жидкостную хроматографию с детектором флюоресценции. Недостатком указанного известного способа является низкая чувствительность определения (нижний предел определения 1 мкг/кг), поэтому способ применяется в токсикологических исследованиях.
Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в обеспечении высокой чувствительности способа при одновременном обеспечении селективности и его доступности для серийных анализов.
Указанный технический результат достигается предлагаемым способом количественного определения бенз(а)пирена в крови методом жидкостной хроматографии, включающим отбор пробы крови, ее твердофазную экстракцию и исследование экстракта путем жидкостной хроматографии, при этом новым является то, что после отбора пробы крови проводят ее консервацию добавлением гепарина, подвергают пробу крови центрифугированию со скоростью 2000 об/мин в течение 5 мин с отделением при этом плазмы и форменных элементов, далее осуществляют раздельную пробоподготовку указанных плазмы и форменных элементов крови, при этом для пробоподготовки плазмы осуществляют твердофазную экстракцию плазмы на сорбенте Oasis HLB путем последовательного пропускания через указанный сорбент ацетонитрила, дистиллированной воды, плазмы, дистиллированной воды, 50%-ного водного раствора ацетонитрила, затем картридж с сорбентом высушивают под вакуумом и далее пропускают через него экстрагент - 100%-ный метиленхлорид, экстракт высушивают в потоке воздуха и сухой остаток перерастворяют в 100%-ном ацетонитриле, получая экстракт плазмы, а пробоподготовку форменных элементов пробы крови осуществляют дисперсионной твердофазной экстракцией путем добавления к ним 100%-ного ацетонитрила, перемешивания, добавления набора солей по методу QuECHeRS для экстракции, перемешивания, дальнейшего центрифугирования, отбора верхней фазы и добавления к ней набора солей по методу QuECHeRS для очистки, перемешивания, повторного центрифугирования этой очищенной верхней части и вновь отбора верхней фазы - экстракта форменных элементов пробы крови для анализа, затем полученные экстракты плазмы и форменных элементов пробы крови анализируют по отдельности методом жидкостной хроматографии, используя в качестве подвижной фазы смесь ацетонитрила и воды при их изменяющемся соотношении от 60:40 об.% до 90:10 об.% соответственно, а также 100%-ный ацетонитрил в градиентном режиме, который осуществляют при хроматографии путем подачи вначале в течение 1 мин подвижной фазы, состоящей из смеси ацетонитрила и воды в соотношении 60:40 об.%, затем путем увеличения в течение 3 мин в подвижной фазе ацетонитрила до 68 об.%, дальнейшего увеличения его концентрации в течение 1,5 мин до 70 об.%, затем увеличения концентрации ацетонитрила в течение 1,5 мин до 90 об.%, а также увеличения ацетонитрила до 100% в течение следующих 4,5 мин. и пропускания такой подвижной фазы в течение еще 1,5 мин с последующим резким снижением объемного количества ацетонитрила до 60 об.% и пропусканием такой подвижной фазы через колонку в течение 4 мин до уравновешивания колонки, а количество бенз(а)пирена в крови устанавливают по градуировочному графику, причем результаты анализов, полученные при хроматографировании экстрактов плазмы и форменных элементов, суммируют.
Скорость потока подвижной фазы составляет 1,5 мл/мин.
Жидкостную хроматографию проводят на жидкостном хроматографе «Agilent 1200» с флуориметрическим детектором при длине волны возбуждения 265 нм и длине волны эмиссии 412 нм при температуре колонки 27°C.
Указанный технический результат достигается за счет следующего.
Благодаря тому, что отобранную пробу крови подвергают консервации путем добавления гепарина, обеспечивается стабилизация цельной крови для дальнейшего разделения на плазму и форменные элементы.
Благодаря тому, что отобранную пробу крови подвергают центрифугированию со скоростью 2000 об/мин в течение 5 мин, происходит разделение пробы на фракции, что обеспечивает раздельный анализ плазмы и форменных элементов при определении бенз(а)пирена.
Экспериментальным путем было установлено, что высокая чувствительность и точность определения бенз(а)пирена в крови достигается лишь при строго определенной последовательности пробоподготовки плазмы и форменных элементов, полученных из пробы.
Пропускание через указанный сорбент Oasis HLB ацетонитрила и дистиллированной воды обеспечивает очистку сорбента от возможного присутствия посторонних примесей и увлажнение сорбента перед пропусканием плазмы (в целом - это подготовка сорбента к анализу). А промывка сорбента после пропускания плазмы дистиллированной водой и 50%-ным водным раствором ацетонитрила необходима для цели удаления с сорбента слабоудерживаемых компонентов биоматериала и повышения селективности извлечения. Использование водного раствора ацетонитрила именно такой концентрации обеспечивает хорошее удаление ненужных компонентов, и в то же время не производится экстракция целевого компонента.
Сушка картриджа с сорбентом под вакуумом необходима для удаления остатков воды, которые мешают дальнейшему проведению анализа (вода переходит в экстракт метиленхлорида, при выпаривании которого капля воды неизвестного объема не испаряется, а остается в пробирке, в которой перерастворяют высушенный экстракт. Таким образом остается неизвестным общий объем анализируемой жидкости, что влияет на точность расчета концентрации бенз(а)пирена в плазме крови.
Сушка экстракта после пропускания через сорбент экстрагента 100%-ного метиленхлорида необходима для перевода аналита в совместимый с подвижной фазой растворитель (ацетонитрил). А перерастворение сухого остатка в 100%-ном ацетонитриле обеспечивает полный переход аналита (бенз(а)пирена) в анализируемый раствор.
Предложенная последовательность пробоподготовки форменных элементов пробы крови также обусловлена указанным выше химизмом.
Проведение последующего анализа экстракта плазмы и форменных элементов методом жидкостной хроматографии с особыми режимами, а именно: используя в качестве подвижной фазы смесь ацетонитрила и воды при их изменяющемся соотношении от 60:40 об.% до 90:10 об.% соответственно, а также 100%-ный ацетонитрил в градиентном режиме, который осуществляют при хроматографии путем подачи вначале в течение 1 мин подвижной фазы, состоящей из смеси ацетонитрила и воды в соотношении 60:40 об.%, затем путем увеличения в течение 3 мин в подвижной фазе ацетонитрила до 68 об.%, дальнейшего увеличения его концентрации в течение 1,5 мин до 70 об.%, затем увеличения концентрации ацетонитрила в течение 1,5 мин до 90 об.%, а также увеличения ацетонитрила до 100% в течение следующих 4,5 мин и пропускания такой подвижной фазы в течение еще 1,5 мин с последующим резким снижением объемного количества ацетонитрила до 60 об.% и пропусканием такой подвижной фазы через колонку в течение 4 мин до уравновешивания колонки, соответствует оптимизации элюирования, а значит, обеспечивает высокую чувствительность предлагаемого способа. Следует пояснить, что изменение объемного соотношения ацетонитрила и воды в подвижной фазе осуществляется за счет работы градиентного насоса Agilent 1200, смешивающего от 2 до 4 компонентов подвижной фазы.
Исследование экстрактов на жидкостном хроматографе «Agilent 1200» с флуориметрическим детектором при длине волны возбуждения 265 нм и длине волны эмиссии 412 нм при температуре колонки 27°C обусловлено достижением максимального сигнала флуориметрического детектора, что влияет на чувствительность и точность определения.
Скорость потока подвижной фазы 1,5 мл/мин является оптимальной при проведении исследований.
Количество бенз(а)пирена в крови устанавливают по градуировочному графику, причем результаты анализов, полученные при хроматографировании экстрактов плазмы и форменных элементов, суммируют. Это позволяет повысить точность определения, т.к. пробоподготовку плазмы и форменных элементов следует производить по-разному.
Для осуществления предлагаемого способа проводят следующие операции в нижеуказанной последовательности:
- производят отбор пробы крови в количестве 2 см3;
- переносят указанную пробу в центрифужную пробирку и центрифугируют со скоростью 2000 об/мин в течение 5 мин;
- верхнюю часть - плазму, отделяют от нижней части - форменных элементов;
- проводят по отдельности их экстракцию.
Алгоритм экстракций
Твердофазную экстракцию плазмы проводят по следующей схеме: кондиционирование картриджа Oasis HLB 1 сс (30 мг) 1 см3 ацетонитрила, 1 см3 дистиллированной воды, далее загрузка 0,5 см3 плазмы на картридж Oasis HLB 1 сс (30 мг), промывка картриджа с нанесенной пробой 1 см3 дистиллированной воды, 0,2 см3 50%-ного водного раствора ацетонитрила, высушивание картриджа в токе воздуха посредством вакуумного насоса, элюирование 1 см3 100%-ным метиленхлоридом. Затем метиленхлорид высушивают в токе воздуха, сухой остаток перерастворяют в 0,5 см3 100%-ного ацетонитрила. Полученный экстракт плазмы в дальнейшем анализируют в количестве 20 мм3 на жидкостном хроматографе.
Дисперсионная твердофазная экстракция форменных элементов: к 0,5 см3 форменных элементов прибавляют 2 см3 100-%-ного ацетонитрила, интенсивно встряхивая 1 мин, при этом белки крови сворачиваются, добавляют 250 мг набора солей по методу QuECHeRS для экстракции (состав: магния сульфат, натрия хлорид, натрия цитрат, динатриевая соль лимонной кислоты), встряхивают интенсивно в течение 1 минуты, центрифугируют 10 минут со скоростью 2000 об/мин, при этом образуется 3 слоя, 1,5 см3 верхнего слоя переносят в другую пробирку, в которой содержится 120 мг набора солей по методу QuECHeRS для очистки (состав: магния сульфат, сорбент С18), встряхивают 1 мин, вновь центрифугируют 10 минут со скоростью 2000 об/мин, отбирают верхний слой экстракта форменных элементов и анализируют 20 мм3 на жидкостном хроматографе.
Условия проведения анализа жидкостной хроматографии для обоих экстрактов соответствуют следующим характеристикам:
| Колонка | Zorbax Eclipse РАН C18; 4,6×50 мм; размер частиц 3,5 микрон |
| Флуориметрический детектор: длина волны возбуждения длина волны эмиссии |
|
| 265 нм | |
| 412 нм | |
| Подвижная фаза | А: вода; В: ацетонитрил |
| Градиентное изменение состава подвижной фазы (в смеси с водой) | 0-1 мин - 60 об.% ацетонитрила |
| 1-4 мин - 68 об.% ацетонитрила | |
| 4-4,5 мин - 70 об.% ацетонитрила | |
| 4,5-6,0 мин - 90 об.% ацетонитрила | |
| 6-10,5 мин - 100% ацетонитрила | |
| 10,5-12 мин - 100% ацетонитрила | |
| в 12 мин - резкое снижение до 60 об.% ацетонитрила | |
| 12-16 мин - 60 об.% ацетонитрила | |
| Скорость протока | 1,5 мл/мин |
| Температура колонки | 27°C |
| Вводимый объем | 20 мкл |
Количество бенз(а)пирена в крови устанавливают по градуировочному графику, причем результаты анализов, полученные при хроматографировании экстрактов плазмы и форменных элементов, суммируют.
Для построения градуировочного графика в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 1 см3 стандартного образца (ГСО) бенз(а)пирена в ацетонитриле с концентрацией 100 мкг/см3, доводят содержимое колбы до метки ацетонитрилом и перешивают. Концентрация бенз(а)пирена в исходном растворе (раствор №1) составляет 1 мкг/см3. Затем 2,5 см3 раствора №1 вносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят ацетонитрилом до метки. Концентрация бенз(а)пирена в разбавленном растворе (раствор №2) составляет 25 нг/см3. Используют свежеприготовленный раствор.
Градуировочную характеристику устанавливают методом абсолютной градуировки. Она выражает зависимость площади пика на хроматограмме (мм2) от массовой концентрации бенз(а)пирена в крови (мг/дм3) и строится по 5 сериям рабочих стандартных растворов. Каждую серию, состоящую из 3 стандартных растворов, готовят в мерных пробирках вместимостью 5 см3. Для этого в каждую пробирку вносят растворы бенз(а)пирена для градуировки №1 и 2 в соответствии с таблицей 1, доводят содержимое пробирки до метки 5 см3 цельной кровью и перемешивают.
| Таблица 1 | |||||
| Градуировочные растворы для определения бенз(а)пирена в крови в диапазоне массовых концентраций 0,0001-3,002 мг/дм3 | |||||
| Номер раствора | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Объем раствора №1, мм3 | - | 2,5 | 5,0 | 7,5 | 10,0 |
| Объем раствора №2, мм3 | 20,0 | - | - | - | - |
| Количество бенз(а)пирена, в 5 см3 градуировочного раствора, нг | 0,5 | 2,5 | 5,0 | 7,5 | 10,0 |
| Массовая концентрация бенз(а)пирена в крови, мг/дм3 | 0,0001 | 0,0005 | 0,001 | 0,0015 | 0,002 |
| Таблица 2 | |||||
| Градуировочные растворы для определения бенз(а)пирена в крови в диапазоне массовых концентраций 0,00001-0,0001 мг/дм3 | |||||
| Номер раствора | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Объем раствора №2, мм3 | 2,0 | 4,0 | 10,0 | 16,0 | 20,0 |
| Количество бенз(а)пирена, в 5 см3 градуировочного раствора, нг | 0,05 | 0,1 | 0,25 | 0,4 | 0,5 |
| Массовая концентрация бенз(а)пирена в крови, мг/дм3 | 0,00001 | 0,00002 | 0,00005 | 0,00008 | 0,0001 |
Отработка оптимальных жидкостно-хроматографических параметров для определения бенз(а)пирена в крови предлагаемым способом осуществлялась с использованием жидкостного хроматографа «Agilent 1200», оснащенного термостатом колонок, градиентным насосом и флуориметрическим детектором.
Полнота разделения бенз(а)пирена в присутствии компонентов матрицы достигнута на колонке Zorbax длиной 50 мм и внутренним диаметром 4,6 мм с сорбентом Eclipse РАН (C18) зернением 3,5 мкм при температуре колонки 27°C, при использовании режимов указанного выше градиентного изменения состава подвижной фазы. Максимальный сигнал флуориметрического детектора получен при длине волны возбуждения 265 нм и длине волны эмиссии 412 нм. В случае, если не был применен градиентный режим элюирования чувствительность способа резко изменялась.
В процессе исследований по выбору оптимальных условий проведения твердофазной экстракции (ТФЭ) бенз(а)пирена из плазмы крови, включающей кондиционирование сорбента Oasis HLB растворителем - 100%-ным ацетонитрилом и дистиллированной водой, промывку картриджа от мешающих компонентов матрицы дистиллированной водой и 50%-ным водным раствором ацетонитрила после нанесения анализируемой пробы плазмы на указанный сорбент и последующую десорбцию бенз(а)пирена 100%-ным метиленхлоридом, были апробированы 2 варианта пробоподготовки: без предварительной деглюкуронизации и с деглюкуронизацией путем добавления в плазму раствора β-глюкуронидазы в ацетатном буфере (2500 ME), перемешивания и термостатирования на водяной бане при температуре 37°C в течение 1 часа. Данные, полученные в ходе испытаний, приведены в таблице 3.
| Таблица 3 | ||
| Эффективность извлечения бенз(а)пирена из плазмы крови методом твердофазной экстракции | ||
| № режима | Режимы пробоподготовки | Степень экстракции, % |
| 1 | Элюирование метиленхлоридом без деглюкуронизации | 38,7 |
| 2 | Предварительная деглюкуронизация и элюирование метиленхлоридом |
13,2 |
Данные, приведенные в таблице 3, показывают, что максимальная степень экстракции бенз(а)пирена из плазмы крови была достигнута при использовании режима №1, который применяли в дальнейших исследованиях.
Экспериментальным путем также были установлены, наряду с необходимостью применения в качестве экстрагента 100%-ного метиленхлорида, и другие характеристики и режимы предлагаемого способа, обеспечивающие эффективное и селективное извлечение бенз(а)пирена из пробы крови и повышение чувствительности и точности определения, а именно: центрифугирование пробы крови при 2000 об/мин, использование при твердофазной экстракции 1 см3 100%-ного ацетонитрила и 1 см3 дистиллированной воды для конденционирования сорбента, промывание картриджа 1 см3 дистиллированной воды и 0,2 см3 50%-ного водного раствора ацетонитрила после пропускания фракции плазмы крови перед экстракцией 1,0 см3 100%-ного метиленхлорида.
При изучении выбора оптимальных условий извлечения бенз(а)пирена из форменных элементов методом дисперсионной твердофазной экстракции, включающей добавление к клеткам крови 100%-ного ацетонитрила и набора солей по методу QuECHeRS «для экстракции», а также отделение и очистку экстракта набором солей по методу QuECHeRS «для очистки», было установлено, что степень экстракции составляет 64%.
Пример конкретного выполнения предлагаемого способа
Анализируют пробы крови (обследуемая группа населения). Каждую пробу крови анализируют дважды. Свежеотобранную пробу крови объемом 2 см3 центрифугируют со скоростью 2000 об/мин в течение 5 мин. Разделяют на фракции плазмы и форменных элементов. Отбирают 0,5 см3 плазмы и проводят твердофазную экстракцию, последовательно пропуская под вакуумом через картридж с сорбентом Oasis HLB 3 сс 1 см3 100%-ного ацетонитрила, 1 см3 дистиллированной воды, 0,5 см3 плазмы, 1 см3 дистиллированной воды, 0,2 см3 50%-ного водного раствора ацетонитрила. Затем картридж с сорбентом высушивают под вакуумом, переносят в накопительный сосуд (бюкс) и пропускают через сорбент 1,0 см3 100%-ного хлористого метилена. Скорость экстракции (скорость потока) не более см3/мин. Аликвотную часть полученного экстракта отбирают и хроматографируют на жидкостном хроматографе Agilent серии 1200 с флуориметрическим детектором на колонке Zorbax длиной 50 мм и внутренним диаметром 4,6 мм с сорбентом Eclipse РАН C18 при температуре колонки 27°C, при использовании в качестве подвижной фазы смеси ацетонитрила и воды со скоростью потока 1,5 см3/мин и оптимизации элюирования в градиентном режиме (1 мин подача подвижной фазы: смеси 60 об.% ацетонитрила и 40 об.% воды, увеличение ацетонитрила с 60 об.% до 68 об.% в течение 3 мин, увеличение ацетонитрила с 68 об.% до 70 об.% в течение 0,5 мин, увеличение ацетонитрила с 70 об.% до 90 об.% в течение 1,5 мин, увеличение ацетонитрила с 90 об.% до 100 об.% в течение 4,5 мин, подача 100%-ного ацетонитрила в течение 1,5 мин, затем резкое снижение ацетонитрила до 60 об.% и подача 60 об.% ацетонитрила в течение 4 мин до уравновешивания колонки). При этом длина волны возбуждения флуориметрического детектора составляла 265 нм и длина волны эмиссии - 412 нм.
По градуировочному графику определяют содержание бенз(а)пирена в плазме (пробы 1-5). Полученные результаты приведены в таблице 4.
Отбирают 0,5 см3 форменных элементов и проводят дисперсионную твердофазную экстракцию: к 0,5 см3 форменных элементов прибавляют 2 см3 100%-ного ацетонитрила, интенсивно встряхивают в течение 1 мин, добавляют 250 мг набора солей по методу QuECHeRS «для экстракции», встряхивают интенсивно в течение 1 минуты, центрифугируют 10 минут со скоростью 2000 об/мин, при этом образуется 3 слоя, 1,5 см3 верхнего слоя переносят в другую пробирку, в которой содержится 120 мг набор солей по методу QuECHeRS «для очистки», встряхивают 1 мин, вновь центрифугируют 10 минут со скоростью 2000 об/мин, отбирают верхний слой и анализируют 20 мм3 на жидкостном хроматографе Agilent серии 1200 аналогично плазме.
По градуировочному графику определяют содержание бенз(а)пирена в форменных элементах (пробы 1-5). Полученные результаты приведены в таблице 4.
| Таблица 4 | ||||||
| Результаты исследования образцов крови на содержание бенз(а)пирена в диапазоне массовых концентраций 0,00001-0,002 мг/дм3 | ||||||
| № образца |
Плазма крови | Форменные элементы крови | Цельная кровь | |||
| Результаты параллельных определений, мг/дм3 |
Результат измерения, мг/дм3 |
Результаты параллельных определений, мг/дм3 |
Результат измерения, мг/дм3 |
Результат измерения (суммированный), мг/дм3 |
Относительная погрешность, % |
|
| 1 | 0,000010 | 0,000011±0,0000026 | 0,000028 | 0,000031±0,0000074 | 0,000042±0,000005 | 20,7 |
| 0,000012 | 0,000034 | |||||
| 2 | 0 | 0 | 0,000017 | 0,000018±0,0000043 | 0,000018±0,0000021 | 17,6 |
| 0 | 0,000020 | |||||
| 3 | 0,000011 | 0,000012±0,0000029 | 0,000011 | 0,000010±0,0000024 | 0,000022±0,0000026 | 20,1 |
| 0,000013 | 0,000009 | |||||
| 4 | 0,000010 | 0,000010±0,0000024 | 0,000011 | 0,000010±0,0000024 | 0,000021±0,0000024 | 18,5 |
| 0,000010 | 0,000008 | |||||
| 5 | 0,000023 | 0,000021±0,000005 | 0,000024 | 0,000046±0,000011 | 0,000067±0,000008 | 15,0 |
| 0,000019 | 0,000022 | |||||
Чувствительность определения бенз(а)пирена в анализируемом объеме крови (10 мм3) составила 0,2 пг (или 0,00001 мг/дм3). Погрешность определения не превышает 23,6%.
Методика выполнения измерений обеспечивает получение результатов измерений с погрешностью, не превышающей значений, приведенных в таблицах 5 и 6.
| Таблица 5 | |||
| Значения показателей повторяемости, воспроизводимости, точности | |||
| Наименование определяемого компонента и диапазон измерений, мг/дм3 | Показатель повторяемости, σr, % | Показатель воспроизводимости, σR, % | Показатель точности, ±δ, % (Р=0,95) |
| Бенз(а)пирен от 0,00001 до 0,002 вкл. | 2,3 | 7,7 | 23,6 |
| Таблица 6 | ||
| Значения пределов повторяемости и воспроизводимости при доверительной вероятности р=0,95 | ||
| Наименование определяемого компонента и диапазон измерений, мкг/дм3 | Предел повторяемости, rn, % | Предел внутрилабораторной воспроизводимости, |
| Бенз(а)пирен от 0,00001 до 0,002 вкл. | 6,2 | 21,4 |
Применение предлагаемого способа позволяет повысить чувствительность определения бенз(а)пирена, как минимум, в 10 раз, например, по сравнению с прототипом.
Заявляемый способ прост и может быть рекомендован для серийных анализов.
Источники информации
1. Патент РФ №2153167.
2. Сычев С.Н. Методы совершенствования хроматографических систем и механизмы удерживания в ВЭЖХ. Орел, Орловский ГТУ, 2000 г., с.211.
3. Патент РФ №2187106.
4. Патент РФ №1337764.
5. Kang Н., Jeong S., Cho М., Cho J. Changes of biomarkers with oral exposure to benzo(a)pyrene, phenanthrene and pyrene in rats // J. Vet. Sci. 2007. - 8(4). - p.361-368.
Claims (3)
1. Способ количественного определения бенз(а)пирена в крови методом жидкостной хроматографии, включающий отбор пробы крови, ее твердофазную экстракцию и исследование экстракта путем жидкостной хроматографии, отличающийся тем, что после отбора пробы крови проводят ее консервацию добавлением гепарина, подвергают пробу крови центрифугированию со скоростью 2000 об/мин в течение 5 мин с отделением при этом плазмы и форменных элементов, далее осуществляют раздельную пробоподготовку указанных плазмы и форменных элементов крови, при этом для пробоподготовки плазмы осуществляют твердофазную экстракцию плазмы на сорбенте Oasis HLB путем последовательного пропускания через указанный сорбент ацетонитрила, дистиллированной воды, плазмы, дистиллированной воды, 50%-ного водного раствора ацетонитрила, затем картридж с сорбентом высушивают под вакуумом и далее пропускают через него экстрагент - 100%-ный метиленхлорид, экстракт высушивают в потоке воздуха и сухой остаток перерастворяют в 100%-ном ацетонитриле, получая экстракт плазмы, а пробоподготовку форменных элементов пробы крови осуществляют дисперсионной твердофазной экстракцией путем добавления к ним 100%-ного ацетонитрила, перемешивания, добавления набора солей по методу QuECHeRS для экстракции, перемешивания, дальнейшего центрифугирования, отбора верхней фазы и добавления к ней набора солей по методу QuECHeRS для очистки, перемешивания, повторного центрифугирования этой очищенной верхней части и вновь отбора верхней фазы - экстракта форменных элементов пробы крови для анализа, затем полученные экстракты плазмы и форменных элементов пробы крови анализируют по отдельности методом жидкостной хроматографии, используя в качестве подвижной фазы смесь ацетонитрила и воды при их изменяющемся соотношении от 60:40 об.% до 90:10 об.% соответственно, а также 100%-ный ацетонитрил в градиентном режиме, который осуществляют при хроматографии путем подачи вначале в течение 1 мин подвижной фазы, состоящей из смеси ацетонитрила и воды в соотношении 60:40 об.%, затем путем увеличения в течение 3 мин в подвижной фазе ацетонитрила до 68 об.%, дальнейшего увеличения его концентрации в течение 1,5 мин до 70 об.%, затем увеличения концентрации ацетонитрила в течение 1,5 мин до 90 об.%, а также увеличения ацетонитрила до 100% в течение следующих 4,5 мин и пропускания такой подвижной фазы в течение еще 1,5 мин с последующим резким снижением объемного количества ацетонитрила до 60 об.% и пропусканием такой подвижной фазы через колонку в течение 4 мин до уравновешивания колонки, а количество бенз(а)пирена в крови устанавливают по градуировочному графику, причем результаты анализов, полученные при хроматографировании экстрактов плазмы и форменных элементов, суммируют.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что скорость потока подвижной фазы составляет 1,5 мл/мин.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что жидкостную хроматографию проводят на жидкостном хроматографе «Agilent 1200» с флуориметрическим детектором при длине волны возбуждения 265 нм и длине волны эмиссии 412 нм при температуре колонки 27°C.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014102793/15A RU2546530C1 (ru) | 2014-01-28 | 2014-01-28 | Способ количественного определения бенз(а)пирена в крови методом жидкостной хроматографии |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014102793/15A RU2546530C1 (ru) | 2014-01-28 | 2014-01-28 | Способ количественного определения бенз(а)пирена в крови методом жидкостной хроматографии |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2546530C1 true RU2546530C1 (ru) | 2015-04-10 |
Family
ID=53295880
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014102793/15A RU2546530C1 (ru) | 2014-01-28 | 2014-01-28 | Способ количественного определения бенз(а)пирена в крови методом жидкостной хроматографии |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2546530C1 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2589897C1 (ru) * | 2015-04-23 | 2016-07-10 | Федеральное Государственное Автономное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Дальневосточный Федеральный Университет" (Двфу) | Способ определения общих и полициклических ароматических углеводородов в компонентах экосистемы |
| CN110743504A (zh) * | 2019-11-15 | 2020-02-04 | 山东农业大学 | 一种净化吸附材料及其在同时检测番茄中十种杀虫剂残留中的应用 |
| CN117169390A (zh) * | 2023-10-18 | 2023-12-05 | 宁波市疾病预防控制中心(宁波市健康教育与促进中心) | 一种测定血液中安妥的方法、试剂盒及应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1337764A1 (ru) * | 1984-08-06 | 1987-09-15 | Институт питания АМН СССР | Способ количественного определени углеводородов в биологических объектах |
| RU2466406C1 (ru) * | 2011-10-20 | 2012-11-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" (ФБУН "ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения") | Способ количественного определения бенз(а)пирена в моче методом жидкостной хроматографии |
-
2014
- 2014-01-28 RU RU2014102793/15A patent/RU2546530C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1337764A1 (ru) * | 1984-08-06 | 1987-09-15 | Институт питания АМН СССР | Способ количественного определени углеводородов в биологических объектах |
| RU2466406C1 (ru) * | 2011-10-20 | 2012-11-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" (ФБУН "ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения") | Способ количественного определения бенз(а)пирена в моче методом жидкостной хроматографии |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Kang Н., Jeong S., Cho М., Cho J. Changes of biomarkers with oral exposure to benzo(a)pyrene, phenanthrene and pyrene in rats // J. Vet. Sci. 2007. - 8(4). - p.361-368. * |
| ГОСТ Р 51310-99 Вода питьевая. Метод определения содержания бенз(а)пирена. М. - 1999. - 10 с. SU 1435991 A1, Куйбышевский авиационный институт им.акад. С.П.Королева * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2589897C1 (ru) * | 2015-04-23 | 2016-07-10 | Федеральное Государственное Автономное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Дальневосточный Федеральный Университет" (Двфу) | Способ определения общих и полициклических ароматических углеводородов в компонентах экосистемы |
| CN110743504A (zh) * | 2019-11-15 | 2020-02-04 | 山东农业大学 | 一种净化吸附材料及其在同时检测番茄中十种杀虫剂残留中的应用 |
| CN117169390A (zh) * | 2023-10-18 | 2023-12-05 | 宁波市疾病预防控制中心(宁波市健康教育与促进中心) | 一种测定血液中安妥的方法、试剂盒及应用 |
| CN117169390B (zh) * | 2023-10-18 | 2024-05-03 | 宁波市疾病预防控制中心(宁波市健康教育与促进中心) | 一种测定血液中安妥的方法、试剂盒及应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Shen et al. | Screening, determination and confirmation of chloramphenicol in seafood, meat and honey using ELISA, HPLC–UVD, GC–ECD, GC–MS–EI–SIM and GCMS–NCI–SIM methods | |
| Fux et al. | Development of an ultra-performance liquid chromatography–mass spectrometry method for the detection of lipophilic marine toxins | |
| Tan et al. | Method validation in the determination of aflatoxins in noodle samples using the QuEChERS method (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) and high performance liquid chromatography coupled to a fluorescence detector (HPLC–FLD) | |
| Qin et al. | Analysis of sulfonamides, tilmicosin and avermectins residues in typical animal matrices with multi-plug filtration cleanup by liquid chromatography–tandem mass spectrometry detection | |
| CN107607645B (zh) | 一种同时检测鱼肉中多种类兽药残留的方法 | |
| CN107037149B (zh) | 一种鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留量测定的方法 | |
| Herrero et al. | Feasibility of ultra-high performance liquid and gas chromatography coupled to mass spectrometry for accurate determination of primary and secondary phthalate metabolites in urine samples | |
| RU2431829C1 (ru) | Способ определения содержания левомицетина в пищевых продуктах и сорбент для его осуществления | |
| RU2546530C1 (ru) | Способ количественного определения бенз(а)пирена в крови методом жидкостной хроматографии | |
| CN105445390B (zh) | 乳制品中氯霉素类残留的检测方法 | |
| RU2425380C1 (ru) | Способ количественного определения диметилтерефталата в моче методом жидкостной хроматографии | |
| Guo et al. | Highly sensitive fluorescence methods for the determination of alfuzosin, doxazosin, terazosin and prazosin in pharmaceutical formulations, plasma and urine | |
| CN109828051B (zh) | 一种有毒化合物的检测方法 | |
| CN108680691B (zh) | 烟用香精香料中邻苯二甲酸酯的测定方法 | |
| CN106885853B (zh) | 快速测定食用油中阿维菌素类农药残留的前处理方法及定量分析方法 | |
| RU2466406C1 (ru) | Способ количественного определения бенз(а)пирена в моче методом жидкостной хроматографии | |
| Chang et al. | Simultaneous determination of eleven quinolones antibacterial residues in marine products and animal tissues by liquid chromatography with fluorescence detection | |
| CN116297920A (zh) | 一种食品中类胡萝卜素的快速检测方法 | |
| RU2633013C2 (ru) | Способ определения левомицетина в кормах животного происхождения с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии | |
| CN112083057B (zh) | 一种虾青素的检测方法 | |
| Zhu et al. | Simultaneous determination of abietic acid and dehydroabietic acid residues in duck meat by HPLC-PAD-FLD | |
| Guo et al. | Simultaneous detection method for mycotoxins and their metabolites in animal urine by using impurity adsorption purification followed by liquid chromatography-tandem mass detection | |
| Taghvaee et al. | The potential of low temperature extraction method for analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in refined olive and refined pomace olive oils by HPLC/FLD | |
| CN113267589A (zh) | 一种头发中16种合成大麻素类物质及其代谢物的分析方法 | |
| CN112285243A (zh) | 一种动物组织样品中药物残留检测的处理方法、确证检测方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160129 |