CN104628805B - 一种两亲性脂核酸的制备方法 - Google Patents

一种两亲性脂核酸的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种制备两亲性脂核酸分子的制备方法，特别涉及一种制备3′-磷酸单脱氧核糖核酸两亲分子的制备方法。本发明以商业化的正构脂肪醇和脱氧核糖亚磷酰亚胺单体为原料，来制备3’端磷酸化的两亲性脂核酸，选择过氧化氢水溶液来代替碘来作为氧化剂，使用氨水来代替吡啶作为脱保护试剂。不仅简化了操作步骤，降低了有毒有害试剂的应用，还有效提高了产物收率。同时，通过对所得到的16种脂核酸进行了表界面性质测定，证实了它们的高表面活性。

Description

一种两亲性脂核酸的制备方法
技术领域
本发明涉及一种制备两亲性脂核酸分子的制备方法，具体地说，涉及一种制备3′-磷酸单脱氧核糖核酸两亲分子的制备方法。
背景技术
脂核酸是一类将亲水性核酸、核糖核酸或脱氧核糖核酸与疏水的官能团结合的复合生物两亲分子。由于脂核酸中的碱基之间可以形成氢键，因此脂核酸在溶液中的组装行为十分独特，被认为是构建新材料的重要组成部分。在众多类型的脂核酸中，3′或5′-磷酸核苷型两亲分子在基因转染和药物缓释等领域被广泛应用。但是如何高效大量制备该类分子一直是一个难题。现有的制备方法主要是酶催化和亚磷酰亚胺缩合。酶催化是以烷基磷脂酰胆碱和脱氧核糖核酸为原料，如B.Debora等人1997年在美国物理化学杂质以及G.Zandomeneghi等人2001年在瑞士化学学报上公开的磷脂酶D的催化下通过酯交换反应得到目标产物。受限于原料和酶的价格，以及较低的反应浓度，该方法难以实现较大量脂核酸的制备。后来，N.Campins等人2007年在DNA固相合成的基础上发展出了亚磷酰亚胺缩合方法来制备脂核酸，该方法较酶链接法有了较大的进步，可以较大量生产脂核酸。但是该方法需要使用碘以及吡啶类化学试剂，污染较大，而且原料利用率相对较低。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的不足，本发明提供一种两亲性脂核酸的制备方法，避免有毒试剂的使用，减少废弃物产生的排放，如使用过氧化氢来替代碘作为氧化剂，不仅仅避免了有毒试剂的使用，还极大简化了后处理；同时以氨水替代吡啶，在极大提高了产率的同时降低了成本，并减少了对环境的污染。
本发明的技术方案是：
一种两亲性脂核酸分子的制备方法，以正构脂肪醇与亚磷酰亚胺作为起始原料，以无水四氢呋喃为溶剂，在5-巯乙基四唑的催化下，得到亚磷酸酯，用过氧化氢作为氧化剂，将亚磷酸酯中的三价磷氧化为磷酸三酯中的五价磷；使用三氯乙酸的二氯甲烷溶液将核糖环上5′位羟基的4,4-二甲氧基三苯基甲基保护基团切除，并使用氨水来将磷酸三酯中的氰乙基脱除，得到两亲性脂核酸分子。
优选的，所述的正构脂肪醇采用含有偶数碳原子10至16个的疏水单元和3′-磷酸核苷酸的亲水单元的正构脂肪醇；
合成路线如下：
其中，a为5-巯乙基四唑、正构脂肪醇和四氢呋喃；b为30％过氧化氢水溶液；c为10％三氯乙酸二氯甲烷溶液；d为18％氨水，55℃；A为腺嘌呤，G为鸟嘌呤，C为胞核嘧啶和T为胸腺嘧啶。
制备方法具体步骤如下：
步骤1：10mmol正构脂肪醇，10mmol亚磷酰亚胺，20mmol5-巯乙基四唑溶于100mL无水四氢呋喃中，氮气保护下于25℃搅拌16hr；
步骤2：将5mL30％过氧化氢水溶液通过滴液漏斗以2mL/min的速率滴加至上述溶液中，25℃搅拌2hr；
步骤3：将氧化后的溶液加入无水硫酸钠干燥，上清液旋蒸除去有机溶剂。残余的油状物溶于150mL二氯甲烷中。
步骤4：将20mL10％的三氯乙酸二氯甲烷溶液加入上述溶液中，25℃搅拌1hr。向其中滴加饱和碳酸氢钠溶液，至无气泡产生，分出有机相，以无水硫酸钠干燥；
步骤5：滤除无水硫酸钠，旋蒸除去有机溶剂，油状产物置于密封管中，加入15mL18％氨水，55℃搅拌6hr。冷至室温后，滤出晶体，以2mL无水乙醇重结晶即可得到目标脂核酸。
本发明的有益效果是：
脂核酸是一类具有良好生物相容性的生物基两亲分子，在药物控释和基因转染中有着独特的地位。现阶段制备两亲脂核酸分子的方法无法实现大规模制备或者无法有效降低大规模制备的成本，高昂的成本限制了脂核酸的大规模合成和应用。本发明以商业化的正构脂肪醇和脱氧核糖亚磷酰亚胺单体为原料，来制备3’端磷酸化的两亲性脂核酸，选择过氧化氢水溶液来代替碘来作为氧化剂，使用氨水来代替吡啶作为脱保护试剂，本发明制备两亲性脂核酸分子的方法可以较低成本高效制备大量高纯度的脂核酸，并且无需使用多种高污染试剂，在降低成本的同时减轻了对环境的污染。所得到的脂核酸量可以达到百克级别，纯度大于99％，通过对所得到的16种脂核酸进行了表界面性质测定，证实了它们的高表面活性。
附图说明
附图1为25℃下0.2MNa-PO4缓冲溶液中脂核酸的表面张力数据；
其中，n＝10,■；n＝12,○；n＝14,▲；n＝16,◇
a)腺嘌呤型脂核酸；b)鸟嘌呤型脂核酸；c)胞嘧啶型脂核酸；d)胸腺嘧啶型脂核酸；
附图2为化合物3的核磁图谱；
附图3为化合物3的质谱图谱；
附图4为化合物7的核磁图谱；
附图5为化合物7的质谱图谱；
附图6为化合物11的核磁图谱；
附图7为化合物11的质谱图谱；
附图8为化合物15的核磁图谱；
附图9为化合物15的质谱图谱。
具体实施方式
合成路线如下：
本发明的具体实施方式如下：
一、两亲性脂核酸分子的制备方法，具体步骤如下：
步骤a：10mmol正构脂肪醇，10mmol亚磷酰亚胺，20mmol5-巯乙基四唑溶于100mL无水四氢呋喃中，氮气保护下于25℃搅拌16hr；
步骤b：将5mL30％过氧化氢水溶液通过滴液漏斗以2mL/min的速率滴加至上述溶液中，25℃搅拌2hr；
步骤c：将氧化后的溶液加入无水硫酸钠干燥，上清液旋蒸除去有机溶剂。残余的油状物溶于150mL二氯甲烷中。将20mL10％的三氯乙酸二氯甲烷溶液加入上述溶液中，25℃搅拌1hr。向其中滴加饱和碳酸氢钠溶液，至无气泡产生，分出有机相，以无水硫酸钠干燥；
步骤d：滤除无水硫酸钠，旋蒸除去有机溶剂，油状产物置于密封管中，加入15mL18％氨水，55℃搅拌6hr。冷至室温后，滤出晶体，以2mL无水乙醇重结晶即可得到目标脂核酸。收率在74-88％之间，形状为白色或浅黄色结晶。
为了进一步证明本发明制备方法制备的两亲性脂核酸分子的结构、纯度及活性，我们通过核磁共振氢谱和电喷雾解离质谱对制备得到的脂核酸进行了结构和纯度的表征，并系统研究了本发明制备的脂核酸的表界面活性。
采用核磁型号为BrukerAMX400Spectrometer(400MHz)，质谱型号为Agilent6510Q-TOF。
化合物核磁以及质谱数据分析：
化合物1
白色结晶，收率77％.1HNMR(MeOD,400MHz):δ＝8.36,8.20(d,ArH,2H),6.45-6.47(t,1-H,1H),5.36(m,4-H,1H),3.91-3.92(m,3-H,1H),3.85-3.87(m,CH2O,2H),3.59(m,5-H,2H),2.90(m,2-H,2H),1.67(m,CH2,20H),0.91(t,CH3,3H).ESIMScalcdforC20H37N6O6P,488.53；found470.20(M-NH4 +).
化合物2
白色结晶，收率74％.1HNMR(MeOD,400MHz):δ＝8.36,8.20(d,ArH,2H),6.45-6.47(t,1-H,1H),5.36(m,4-H,1H),3.91-3.92(m,3-H,1H),3.85-3.87(m,CH2O,2H),2.89-2.93(m,5-H,2H),2.06(m,2-H,2H),1.65-1.67(m,CH2,20H),0.91-0.92(t,CH3,3H).ESIMScalcdforC22H41N6O6P,516.28；found498.24(M-NH4 +).
化合物3(如图2和3所示)
浅黄色结晶，收率79％.1HNMR(MeOD,400MHz):δ＝8.38,8.21(d,ArH,2H),6.46-6.48(t,1-H,1H),5.01(m,4-H,1H),4.34(m,3-H,1H),3.87(m,CH2O,2H),2.90(m,5-H,2H),2.64-2.68(m,2-H,2H),1.65-1.67(m,CH2,24H),0.89-0.93(t,CH3,3H).ESIMScalcdforC24H45N6O6P,544.31；found526.27(M-NH4 +).
化合物4
白色结晶，收率82％..1HNMR(MeOD,400MHz):δ＝8.37-8.39,8.21(d,J＝8Hz,ArH,2H),6.46-6.49(t,1-H,1H),5.01-5.02(m,4-H,1H),4.34(m,3-H,1H),3.91-3.93,3.85-3.87(m,CH2O,4H),2.90-2.92(m,5-H,2H),2.69(m,2-H,2H),1.65-1.68(m,CH2,28H),0.90-0.93(t,CH3,3H).ESIMScalcdforC26H49N6O6P,572.35；found554.31(M-NH4 +).
化合物5
白色结晶，收率75％.1HNMR(MeOD,400MHz):δ＝7.97(d,ArH,1H),6.27-6.31(t,1-H,1H),5.01(m,4-H,1H),4.24-4.25(m,3-H,1H),3.89-3.91(m,CH2O,2H),3.84-3.85(m,5-H,2H),2.81,2.61-2.63(m,2-H,2H),1.64-1.66(m,CH2,16H),0.90(t,CH3,3H).ESIMScalcdforC20H37N6O7P,504.25；found486.21(M-NH4 +).
化合物6
浅黄色结晶，收率74％.1HNMR(MeOD,400MHz):δ＝7.98(d,ArH,1H),6.29(t,1-H,1H),4.89(m,4-H,1H),4.24-4.25(m,3-H,1H),3.90-3.91(m,CH2O,2H),3.85(m,5-H,2H),2.80-2.82(m,2-H,2H),1.64-1.66(m,CH2,20H),0.91(t,CH3,3H).ESIMScalcdforC22H41N6O7P,532.28；found514.24(M-NH4 +).
化合物7(如图4和5所示)
浅黄色结晶，收率75％.1HNMR(MeOD,400MHz):δ＝7.97(d,ArH,1H),6.27-6.31(t,1-H,1H),4.89(m,4-H,1H),4.24-4.25(m,3-H,1H),3.90-3.91(m,CH2O,2H),3.82-3.85(m,5-H,2H),2.80-2.82(m,2-H,2H),1.66(m,CH2,16H),0.90-0.91(t,CH3,3H).ESIMScalcdforC24H45N6O7P,560.31；found542.27(M-NH4 +).
化合物8
白色结晶，收率81％.1HNMR(MeOD,400MHz):δ＝7.97(d,ArH,1H),6.29(t,1-H,1H),5.00-5.02(m,4-H,1H),4.24-4.25(m,3-H,1H),3.89-3.91(m,CH2O,2H),3.85(m,5-H,2H),2.80-2.82,2.61-2.62(m,2-H,2H),1.64-1.66(m,CH2,28H),0.92-0.93(t,CH3,3H).ESIMScalcdforC26H49N6O7P,588.34；found570.30(M-NH4 +).
化合物9
白色结晶，收率86％.1HNMR(MeOD,400MHz):δ＝8.21-8.23(d,J＝8Hz,ArH,1H),6.28(d,ArH,1H),5.98-6.00(t,1-H,1H),4.89(m,4-H,1H),4.11-4.13(m,3-H,1H),3.88-3.89(m,CH2O,2H),3.83(m,5-H,2H),2.57-2.59(m,2-H,2H),1.26(m,CH2,16H),0.91(t,CH3,3H).ESIMScalcdforC19H37N4O7P,464.24；found446.20(M-NH4 +).
化合物10
白色结晶，收率87％.1HNMR(MeOD,400MHz):δ＝8.19-8.20(d,J＝4Hz,ArH,1H),6.29(d,ArH,1H),5.96-5.98(t,1-H,1H),4.89(m,4-H,1H),4.18-4.19(m,3-H,1H),3.90-3.91(m,CH2O+5-H,4H),2.57-2.59,2.23(m,2-H,2H),1.63-1.65(m,CH2,20H),0.90-0.93(t,CH3,3H).ESIMScalcdforC21H41N4O7P,492.27；found474.23(M-NH4 +).
化合物11(如图6和图7所示)
白色结晶，收率82％.1HNMR(MeOD,400MHz):δ＝8.22-8.24(d,J＝8Hz,ArH,1H),6.28(d,ArH,1H),5.99-6.01(t,1-H,1H),4.80(m,4-H,1H),4.19-4.20(m,3-H,1H),3.88-3.89(m,CH2O,2H),3.82-3.83(m,5-H,2H),2.28-2.29(m,2-H,2H),1.65(m,CH2,16H),0.90-0.94(t,CH3,3H).ESIMScalcdforC23H45N4O7P,520.30；found502.26(M-NH4 +).
化合物12
白色结晶，收率81％.1HNMR(MeOD,400MHz):δ＝8.20-8.22(d,J＝8Hz,ArH,1H),6.28(d,ArH,1H),5.98-6.00(t,1-H,1H),4.89(m,4-H,1H),4.19-4.20(m,3-H,1H),3.88-3.89(m,CH2O,2H),3.83(m,5-H,2H),2.28-2.29(m,2-H,2H),1.63-1.65(m,CH2,16H),0.92(t,CH3,3H).ESIMScalcdforC25H49N4O7P,548.33；found530.29(M-NH4 +).
化合物13
白色结晶，收率87％.1HNMR(MeOD,400MHz):δ＝7.88(d,ArH,1H),6.31-6.34(t,1-H,1H),4.15-4.16(m,4-H,1H),3.26(m,3-H,1H),3.82-3.83(m,CH2O+5-H,4H),2.47-2.48(m,2-H,2H),1.65(m,CH2,16H),0.91(t,CH3,3H).ESIMScalcdforC20H38N3O8P,479.24；found461.19(M-NH4 +).
化合物14
白色结晶，收率84％.1HNMR(MeOD,400MHz):δ＝7.88(d,ArH,1H),6.30-6.34(t,1-H,1H),4.16(m,4-H,1H),3.33(m,3-H,1H),3.88-3.90(m,CH2O,4H),3.82-3.83(m,5-H,4H),2.47-2.48(m,2-H,2H),1.30-1.33(m,CH2,20H),0.92(t,CH3,3H).ESIMScalcdforC22H42N3O8P,507.27；found489.22(M-NH4 +).
化合物15(如图8和图9所示)
白色结晶，收率80％.1HNMR(MeOD,400MHz):δ＝7.88(d,ArH,1H),6.31-6.34(t,1-H,1H),4.15-4.16(m,4-H,1H),3.33(m,3-H,1H),3.88-3.89(m,CH2O,4H),3.82-3.83(m,5-H,4H),2.47-2.48(m,2-H,2H),1.63-1.65(m,CH2,24H),0.92(t,CH3,3H).ESIMScalcdforC24H46N3O8P,535.30；found517.25(M-NH4 +).
化合物16
白色结晶，收率82％.1HNMR(MeOD,400MHz):δ＝7.88(d,ArH,1H),6.31-6.34(t,1-H,1H),4.15-4.16(m,4-H,1H),3.32-3.34(m,3-H,1H),3.88-3.89(m,CH2O,4H),3.82-3.83(m,5-H,4H),2.47-2.48(m,2-H,2H),1.63-1.65(m,CH2,28H),0.92(t,CH3,3H).ESIMScalcdforC26H50N3O8P,563.30；found545.28(M-NH4 +).
二、脂核酸表界面性质测定
将脂核酸溶于0.2mMNa-PO4(pH8.0)缓冲溶液中，配制得10mM溶液。并以此为母液稀释得8mM,5mM,2mM,1mM,0.8mM,0.5mM,0.2mM,0.1mM,0.08mM,0.05mM,0.02mM,0.01mM,0.008mM,0.005mM,0.002mM和0.001mM的浓度，上述溶液均取8mL于50mL洁净烧杯中，封口膜密封后置于暗处静置12h后测定表面张力。
表面张力仪选择KrussKT10型，选择铂片法测定。每次测定样品前，均以超纯水冲洗铂片至无残留，再以酒精灯将铂片烧红，待铂片冷至室温后对溶液表面张力进行测定。所有测量实验均于25℃恒温水浴槽测定，每个溶液样品测量重复三次，取平均值。
表1.脂核酸的表界面常数
表1中罗列了含有不同类型头基和不同长度烷基链的16种脂核酸在磷酸盐缓冲溶液中的表界面性质。从中我们可以看到所有脂核酸均表现出了良好的表面活性。在含有同样头基的脂核酸中，长烷基链的脂核酸表现出了更低的临界胶束浓度和更高的降低溶液表面张力的能力。而在含有同等长度烷基链的脂核酸中，含有嘌呤类碱基头基(dA和dG)的脂核酸比含有嘧啶类碱基头基(dC和dT)表现出更高的界面性能。
图1为含有不同类型碱基和不同长度脂肪链的脂核酸在pH8.0的磷酸盐缓冲溶液中的表面张力测定曲线，为25℃下0.2MNa-PO4缓冲溶液中脂核酸的表面张力数据(n＝10,■；n＝12,○；n＝14,▲；n＝16,◇)，纵坐标为不同浓度脂核酸溶液的表面张力，横坐标为脂核酸浓度的对数值。从图中我们可以看出所有脂核酸的表面张力随浓度改变的趋势和传统的阴离子型表面活性剂相似，含有相同碱基的脂核酸的临界胶束浓度随烷基链的增长而降低，与之对应的是表面活性的增强。图1中的曲线平滑，证明脂核酸样品的纯度较高。
本实施例仅为进一步说明本发明，并非对发明做出的任何限制，凡在本发明实质上内容做出的简单修改和改进均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种两亲性脂核酸分子的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
步骤1：10mmol正构脂肪醇，10mmol亚磷酰亚胺，20mmol5-巯乙基四唑溶于100mL无水四氢呋喃中，氮气保护下于25℃搅拌16hr；
步骤2：将5mL30％过氧化氢水溶液以2mL/min的速率滴加至上述溶液中，25℃搅拌2hr；
步骤3：将氧化后的溶液加入无水硫酸钠干燥，上清液旋蒸除去有机溶剂，残余的油状物溶于150mL二氯甲烷中；
步骤4：将20mL10％的三氯乙酸二氯甲烷溶液加入上述溶液中，25℃搅拌1hr，向其中滴加饱和碳酸氢钠溶液，至无气泡产生，分出有机相，以无水硫酸钠干燥；
步骤5：滤除无水硫酸钠，旋蒸除去有机溶剂，油状产物置于密封管中，加入15mL18％氨水，55℃搅拌6hr；冷至室温后，滤出晶体，以2mL无水乙醇重结晶即可得到目标脂核酸。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN101709073A (zh) * 2009-12-01 2010-05-19 北京大学 核苷酸磷脂分子及脂质体及其制备方法和应用
CN103232510A (zh) * 2012-11-23 2013-08-07 北京大学 5’-氨基-2’,5’-双脱氧核苷酸磷脂分子及其制备方法和应用

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