CN115089561A - 一种细胞膜包被的前药纳米粒、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细胞膜包被的前药纳米粒，包括：由脂质单分子层和装载于所述脂质单分子层中的SN38前药组成的SN38前药脂质纳米粒以及包裹在纳米粒外面的细胞膜；所述的脂质单分子层由卵磷脂、胆固醇和DDAB/DOTAP作为骨架，同时以DSPE‑PEG2k双亲性聚合物作为添加剂。本发明同时提供了一种上述细胞膜包被的前药纳米粒的制备方法及应用。本发明的这种仿生纳米载药平台表现出活性药物的酯酶响应性释放，显著延长了药物的体内循环时间，提高了药物的生物利用度，增强了药物的抗肿瘤生长的效果。本发明提供的仿生纳米载药平台为小分子化疗药物提供了广阔的临床转化前景，也为肿瘤治疗提供的新的选择方案。

Description

一种细胞膜包被的前药纳米粒、制备方法及应用
技术领域
本发明属于药物研发技术领域，具体是涉及一种细胞膜包被的前药纳米粒、制备方法及应用。
背景技术
最近，mRNA脂质纳米颗粒在开发创新的严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)疫苗方面取得了显著成效，这促使纳米技术的发展与进步，以满足各种医疗需求。同时，肿瘤纳米药物可通过血液循环靶向肿瘤，并减少正常器官的蓄积，具有很大的临床价值。与传统的化学治疗相比，纳米药物可显著延长疗程，提高生物利用度，增强疗效，并最大限度地减少全身副作用。然而，通过静脉注射的纳米药物可能会被宿主单核吞噬细胞系统(MPS)清除，影响其药代动力学，导致其瘤内药物蓄积不足。为了延长纳米药物的体内循环时间，已经开发了一些纳米药物“隐身”策略，如合成聚合物(聚乙二醇，聚-L-谷氨酸等)或两性离子聚合物。尽管这些材料相对惰性，但也有报道称聚乙二醇化的纳米药物可能会激活固有免疫，导致其从血液循环中清除，从而降低药效且不能减少药物的系统毒性。
为改善纳米药物的药代动力学，目前开发了仿生细胞膜包被的纳米载药平台以增强其在生物医学中的应用。这些仿生纳米平台由合成的纳米颗粒核心和包被在外面细胞膜构成。由于其外层保留了细胞膜的脂质和蛋白等成分，使其能够特异性中和某些致病分子、免疫逃逸、延长血液循环并促进病灶处的药物蓄积。目前，已有多种类型的细胞膜被用于仿生纳米药物递送平台的制备，包括红细胞、白细胞、血小板、肿瘤细胞和干细胞等。在这些细胞类型中，免疫细胞备受关注。巨噬细胞是骨髓来源的白细胞，可感知趋化信号，且具有高效的肿瘤靶向能力。除此之外，有报道称巨噬细胞还能传统化疗药物无法到达的肿瘤乏血管区域。因此，基于巨噬细胞膜的仿生纳米载药平台具有独特的优势和良好的应用前景。
通常，肿瘤治疗药物以非共价形式装载在细胞膜包被的纳米载体中。然而，物理包被的药物较易从递送平台上释放出来，增加药物的代谢速度，药代动力学特性差。此外，毒性化疗药物在血液循环中的迅速释放会导致较大的系统毒性。对母药进行化学键修饰形成前药，使其在体内需通过酶和/或化学反应断键裂解转化为活性母药才能发挥作用，从而显著改善其理化性质或体内性能。
发明内容
我们先前的研究表明，抗肿瘤药物7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)可通过酯键与聚己内酯(PCL)可逆性连接，得到前药分子PCLn-SN38。该前药易被组装在聚乙二醇-b-聚己内酯共聚物(如PEG10k-b-PCL10k)中，以形成可系统给药的纳米药物。前药包裹于载体后，可显著降低血液中游离药物浓度，且表现出活性SN38药物的酯酶响应性释放。因此，这种方法显著减小了药物毒性，使药物注射剂量有所提高。
本发明涉及将7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)与聚己内酯 (poly-ε-caprolactone，PCL)通过共价偶联形成的前药和卵磷脂，胆固醇， DSPE-PEG2k，DDAB/DOTAP等脂质非共价形成前药脂质纳米粒进行药物体内递送，并在比基础上包被细胞膜以实现仿生纳米递送，该仿生纳米载药系统不仅可以增强药物的肿瘤递送和抗肿瘤效果，降低药物的全身毒性，还能靶向肿瘤的转移灶，抑制肿瘤的转移。
本发明中，我们基于聚合物前药脂质纳米粒(SLP)，在其表面包被脂多糖(LPS)刺激后的M1型小鼠单核/巨噬细胞系细胞膜或其他种类细胞的细胞膜。此仿生纳米载药平台表现出更强的肿瘤细胞粘附和内吞作用，可提高药物的瘤内蓄积，增强药物的抗肿瘤效果，减少肿瘤的转移。
本发明将聚己内酯(PCL)与SN38共价偶联，生成SN38-聚合物偶联前药(SN38前药)，使其能够包被入脂质纳米粒中。SN38前药结构式如下式，其中，前药中聚己内酯的聚合度n的范围是7-35。作为优选，本发明中所用聚己内酯的聚合度n＝28。
Figure BDA0003698466220000031
一种细胞膜包被的前药纳米粒，包括：由脂质单分子层和装载于所述脂质单分子层中的SN38前药组成的SN38前药脂质纳米粒以及包裹在纳米粒外面的细胞膜；
所述的脂质单分子层由卵磷脂、胆固醇和DDAB/DOTAP作为骨架，同时以DSPE-PEG2k双亲性聚合物作为添加剂；
所述的SN38前药(PCL-SN38前药)的结构如下：
Figure BDA0003698466220000032
本发明利用卵磷脂和胆固醇作为单层脂质的骨架分子，添加带正电的脂质双十烷基二甲基溴化铵(DDAB)或溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)减小脂质纳米粒的负电荷绝对值，利于细胞内吞和细胞膜包被，同时添加DSPE-PEG2k双亲性聚合物提供PEG基团，从而构建前药脂质纳米粒(SLP)。
作为优选，所述细胞膜包被的前药脂质纳米粒为球形形貌，粒径为 50-800nm；所述SN38前药脂质纳米粒为球形形貌，粒径为50-600nm。
作为优选，以SN38计，载药量为2～15％。作为进一步优选，以SN38 计，载药量为5％。
作为优选，卵磷脂、胆固醇、DDAB/DOTAP和DSPE-PEG2k质量比为10～20:1.5～3.5:1:3～5。作为进一步优选，卵磷脂、胆固醇、DDAB/DOTAP 和DSPE-PEG2k质量比为35:5:2:8。
作为优选，本发明使用卵磷脂、胆固醇、DDAB和DSPE-PEG2k作为前药脂质纳米粒配方。
本发明提取小鼠红细胞的细胞膜，并将其包被在脂质纳米粒表面。
本发明提取小鼠骨髓来源树突状细胞系(DC2.4)的细胞膜，并将其包被在脂质纳米粒表面。
本发明提取小鼠肿瘤细胞的细胞膜，并将其包被在脂质纳米粒表面。
作为优选，所述细胞膜采用小鼠单核/巨噬细胞系。本发明提取小鼠单核/巨噬细胞系(RAW264.7)的细胞膜，并将其包被在脂质纳米粒表面。
作为优选，本发明利用LPS(脂多糖)刺激小鼠单核/巨噬细胞系 (RAW264.7)以获得M1型巨噬细胞膜，提取其细胞膜后将其包被在脂质纳米粒表面，从而构建细胞膜包被的脂质纳米粒(mSLP)。
本发明提供了SN38前药脂质纳米粒的制备方法，包括：
一种SN38前药脂质纳米粒的制备方法，包括：将卵磷脂、胆固醇、 DDAB或DOTAP和DSPE-PEG2k的脂质混合物溶于有机溶剂I中，再将溶于有机溶剂II的PCL-SN38前药与以上脂质混合物混合后，通过纳米沉淀法得到均匀分散的SN38前药脂质纳米粒。
作为优选，所述的有机溶剂I为乙醇；所述有机溶剂II为丙酮。
本发明制备SN38最终浓度为1mg/ml的前药脂质体，SN38载药量为 5％，将卵磷脂、胆固醇、DDAB或DOTAP和DSPE-PEG2k质量比为35:5:2:8 的脂质混合物溶于乙醇中，再将溶于丙酮的PCL-SN38前药与以上脂质混合物混合后边搅拌边缓慢滴入水中，搅拌10分钟后，用旋转蒸发仪除去剩余的丙酮，得到均匀分散的SN38前药脂质纳米粒(SLP)。
一种上述任一项所述技术方案所述的细胞膜包被的前药脂质纳米粒的制备方法，将分离提取的细胞膜与SN38前药脂质纳米粒充分混合，将混合物用挤出器通过聚碳酸酯薄膜挤压，制备细胞膜包被的SN38前药脂质纳米粒。
本发明提供了膜包被脂质纳米粒的制备方法，包括：
本发明分离细胞膜后，将1×105-1×1010个细胞分离得到的细胞膜与1 mL浓度为1mg/ml的SLP充分混合。将混合物用挤出器通过400nm的聚碳酸酯薄膜挤压，制备细胞膜包被的前药脂质纳米粒(mSLP)。
本发明提供了上述SN38前药脂质纳米粒(SLP)和M1型小鼠单核/ 巨噬细胞膜包被的前药脂质纳米粒(mSLP)的粒径分布图和扫描电镜图，其平均粒径均在50-800nm范围内，且细胞膜包被后的纳米粒粒径增大。
本发明提供了SLP和mSLP的体外稳定性分析，37℃下分别在磷酸缓冲液和10％的胎牛血清中测试稳定性1周，结果显示这两种纳米粒的稳定性良好，粒径变化小。
本发明提供了SLP在有无酯酶条件下，于37℃、含有0.4％吐温80 的磷酸缓冲液中的释放实验。实验结果表明，前药脂质纳米粒在无酯酶条件下释放缓慢，但在有酯酶条件下迅速释放，且释放出来的多为活性药物分子SN38，而非前药分子。
本项目提供了SN38前药脂质纳米粒和不同种类细胞膜包被的前药脂质纳米粒的细胞粘附实验，实验结果显示前药脂质纳米粒的肿瘤细胞粘附作用弱，且小鼠红细胞、小鼠骨髓来源树突状细胞系(DC2.4)、小鼠肿瘤细胞、小鼠单核/巨噬细胞系(RAW264.7)等细胞膜包被的前药脂质纳米粒对肿瘤细胞的粘附能力弱，仅经过LPS刺激后的M1型小鼠单核/巨噬细胞膜包被的前药脂质纳米粒表现出较强的肿瘤细胞粘附能力。
本项目提供了SLP和mSLP的细胞内吞实验，实验结果显示M1型小鼠单核/巨噬细胞膜包被的前药脂质纳米粒表现出更强的细胞内吞能力。
本项目提供了SLP和mSLP的体外细胞毒实验、凋亡实验和细胞周期实验，实验结果显示这两种脂质纳米粒均表现出较好的体外抗肿瘤效果，且与游离的活性SN38药物相当。
本项目提供了SN38前药脂质纳米粒和M1型小鼠单核/巨噬细胞膜包被的前药脂质纳米粒的体内药代动力学研究，结果表明静脉注射后的 SN38在脂质纳米粒中缓慢释放，其血液循环时间明显长于临床用药伊立替康(CPT-11)，且细胞膜包被后的脂质纳米粒表现出更好的药代动力学特性。
本项目提供了SLP和mSLP在小鼠肿瘤内的蓄积实验，实验结果显示，在小鼠给药后8h，24h和48h，mSLP在肿瘤内的药物浓度均显著高于 SLP，即mSLP具有更强的肿瘤蓄积能力。
本项目提供了SLP和mSLP在小鼠脏器转移灶的蓄积实验，实验结果显示，mSLP在发生转移的脏器内的蓄积更强，提示mSLP具有更强的肿瘤转移灶的靶向能力。
本项目提供了SN38前药脂质纳米粒和M1型小鼠单核/巨噬细胞膜包被的前药脂质纳米粒的体内抗肿瘤分析实验。结果显示这两种脂质纳米粒不仅对小鼠的体重无显著影响，还能显著提高SN38的药效，且细胞膜包被后的纳米粒表现出更好的抗肿瘤效果。
与现有技术相比，本发明的优势如下：
1)本发明用于构成单层脂质骨架的卵磷脂和胆固醇均为人体正常代谢所必需的化学成分，用于合成前药的聚己内酯也具有很好的生物相容性和生物降解性，符合大规模生产的要求，便于临床转化，具备良好的市场前景；
2)与临床所用的伊立替康极低的酶解转化速率相比，本发明构建的SN38前药脂质体明显提高了SN38的递送效率，且可在生理条件下有效减少水解导致的药物失活，减小系统毒性；
3)本发明使用的双亲性分子DSPE-PEG2k提供的PEG基团，可在一定程度上保护脂质纳米粒不被网状内皮系统中的巨噬细胞吞噬，其表面包被的M1型巨噬细胞的细胞膜可进一步增加纳米粒在血液循环中的稳定性，延长在药物在血液中的循环时间，提高药物利用率；
4)与其他几个细胞膜相比，本发明构建的M1型巨噬细胞膜包被的前药脂质纳米粒表现出更强的肿瘤细胞粘附能力及内吞能力，提示其具有更快更强的肿瘤杀伤能力。
5)本发明构建的前药脂质纳米粒能明显提高药物的血液循环时间，且M1型巨噬细胞膜包被可进一步改善其药代动力学特征，提高药物的生物利用度；
6)本发明构建的前药脂质纳米粒具有较好的抗肿瘤效果，且M1型巨噬细胞膜包被后的药效更佳。
总之，本发明公开了一种结合小分子化疗药物化学合成改造、脂质纳米粒载药和细胞膜表面修饰的仿生纳米药物递送平台。首先将化疗药物 SN38与聚己内酯通过酯键偶联形成SN38前药，将其装载至单层脂质纳米粒中，再在纳米粒表面包被细胞膜。这种仿生纳米载药平台表现出活性药物的酯酶响应性释放，显著延长了药物的体内循环时间，提高了药物的生物利用度，增强了药物的抗肿瘤生长的效果。本发明提供的仿生纳米载药平台为小分子化疗药物提供了广阔的临床转化前景，也为肿瘤治疗提供的新的选择方案。
附图说明
图1为实施例3中SN38前药脂质纳米粒(含DDAB配方)(SLP) 的粒径分布图；
图2为实施例3中SN38前药脂质纳米粒(含DDAB配方)(SLP) 的透射电镜图；
图3为实施例3中SN38前药脂质纳米粒(含DDAB配方)(SLP) 制备所得液体的照片；
图4为实施例3中M1型小鼠单核/巨噬细胞膜包被的SN38前药脂质纳米粒(mSLP)的粒径分布图；
图5为实施例3中M1型小鼠单核/巨噬细胞膜包被的SN38前药脂质纳米粒(mSLP)的透射电镜图；
图6为实施例3中M1型小鼠单核/巨噬细胞膜包被的SN38前药脂质纳米粒(mSLP)制备所得液体的照片；
图7为实施例3中SLP和mSLP的电位统计图；
图8为实施例3中SN38前药脂质纳米粒(含DOTAP配方)的粒径分布图；
图9为实施例3中SN38前药脂质纳米粒(含DOTAP配方)的透射电镜图；
图10为实施例4中SLP和mSLP在PBS中的体外稳定性分析；
图11为实施例4中SLP和mSLP在10％FBS中的体外稳定性分析；
图12为实施例5中SLP在有/无酯酶情况下的药物释放分析；
图13为实施例6中SLP和mSLP的体外细胞粘附作用分析，纵坐标是几种不同的染色，hoechst是细胞核，lectin是细胞膜，DiI是纳米粒， overlay是几个颜色通道的结合；
图14为实施例7中SLP和mSLP的体外细胞内吞作用分析；
图15为实施例8中SLP和mSLP的体外细胞毒性分析；
图16为实施例9中SLP和mSLP的诱导凋亡作用分析；
图17为实施例10中SLP和mSLP的诱导细胞周期阻滞作用分析；
图18为实施例11中SLP和mSLP的药代动力学分析；
图19为实施例12中SLP和mSLP的药物瘤内蓄积分析；
图20为实施例13中SLP和mSLP的脏器转移灶内药物蓄积分析；
图21为实施例14中SLP和mSLP的体内抗肿瘤效果实验。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式进一步详细说明本发明，但附图和下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。本领域的技术人员根据本发明的内容作出的一些非本质的调整和改进均属于本发明的保护范围。
实施例1 SN38前药脂质纳米粒(SLP)的制备
为了制备SN38载药量为5％，最终药物浓度为1mg/mL的SN38前药脂质纳米粒，首先将卵磷脂、胆固醇、DDAB/DOTAP和DSPE-PEG2k质量比为35:5:2:8的脂质混合物溶于60μL乙醇中，再将其与溶于1mL 丙酮中的PCL-SN38前药分子充分混合，将此混合物边搅拌边缓慢滴入水中，搅拌10分钟后，用旋转蒸发仪除去剩余的丙酮，得到均匀分散的脂质颗粒。根据高效液相色谱测得的药物浓度将脂质纳米粒定容到1mg/mL，分别得到含DDAB或DOTAP的SN38前药脂质纳米粒(SLP)。
实施例2细胞膜包被的SN38前药脂质纳米粒(mSLP)的制备
为了制备M1型巨噬细胞膜包被的SN38前药脂质纳米粒，首先用1 μg/mL的LPS刺激小鼠单核/巨噬细胞系(RAW264.7)细胞12小时，分离提取细胞膜，将1×105-1×1010个细胞分离得到的细胞膜与1mL浓度为1 mg/ml的SLP(采用的是含DDAB的SLP)充分混合。将混合物用挤出器通过400nm的聚碳酸酯薄膜挤压，制备得到M1型巨噬细胞膜包被的 SN38前药脂质纳米粒(mSLP)。
按照该方法，分别制备小鼠红细胞(RBC)，小鼠树突状细胞DC2.4，小鼠肿瘤细胞4T1，小鼠单核/巨噬细胞系RAW264.7，LPS刺激后的 RAW264.7的细胞膜包被的SN38前药脂质纳米粒。
实施例3纳米粒的粒径和电位
使用动态光散射仪分别测量SLP和mSLP的粒径分布和Zeta电位。激光以90°入射，入射波长为633nm。每个样品平行测量3次，平衡时间设定为2分钟，测量温度为25℃。每个测量样品的SN38当量浓度均为 0.1mg/mL。所得数据为纳米粒粒径和电位的平均值。使用透射电子显微镜(TEM)表征纳米粒的形貌。取0.5mg/mL SN38当量浓度的SLP或 mSLP液体点样于铜网上，使用2％醋酸铀进行负染，待样品在空气中自然干燥后用透射电子显微镜进行观察。以上脂质纳米粒的粒径、电位及透射电子显微镜观察结果如图1～9所示。图1～图3分别为含DDAB配方的 SN38前药脂质纳米粒(SLP)的粒径分布图、透射电镜图和制备所得液体的照片；图4～图6分别为含DDAB配方的M1型小鼠单核/巨噬细胞膜包被的SN38前药脂质纳米粒(mSLP)的粒径分布图、透射电镜图和制备所得液体的照片；图7为含DDAB配方的SLP和mSLP电位统计图；图8～9 为含DOTAP配方的SN38前药脂质纳米粒的粒径分布图、透射电镜图。
下面实施例中，SLP为含DDAB配方的SLP，所用前药聚合度n＝28。
实施例4 SLP和mSLP的体外稳定性测试
将1mg/mL SN38当量的SLP和mSLP稀释到PBS和10％的胎牛血清中，使最终SN38当量浓度为0.1mg/mL。将稀释的纳米粒在37℃环境中保存，每天用动态光散射仪测量粒径，每次测三个平行样，如图10和图 11所示。
实施例5 SN38前药脂质纳米粒的体外释放
将3mL SN38当量浓度为0.1mg/mL的前药脂质纳米粒液体(PBS或含30U/mL猪肝酯酶)分别装入截留分子量为7000kDa的透析袋中。然后将末端封闭的透析袋置于20mL释放介质中(pH为7.4，含0.4％吐温 80的磷酸缓冲液)，于37℃环境中在摇床上以100r/min的速度持续摇晃，分别在2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h和168 h收集含有药物的释放液，并加入等量的释放液，最后，用紫外可见分光光度计在378nm处进行定量，从而得到SN38前药脂质纳米粒在有无酯酶条件下的体外释放情况。如图12所示，SN38前药脂质纳米粒在有酯酶条件下释放显著加快，且从脂质纳米粒中释放出来的多为游离的活性 SN38分子，为药物在肿瘤部位的迅速释放并发挥作用提供了理论基础。
实施例6 SLP和mSLP的细胞粘附作用
为考察实施例1和实施例2中的SLP和mSLP体外对肿瘤细胞的靶向和粘附作用，我们将细胞膜红色荧光探针DiI包被入纳米粒，得到DiI标记的SLP和mSLP。将贴壁的小鼠三阴性乳腺癌细胞系4T1经胰酶消化离心后，用培养基将细胞充分吹打均匀后，进行细胞计数后接种于六孔板中，密度为2×105/孔，于37℃培养过夜。将DiI标记的SLP和mSLP(500 nmol/LDiI)加入细胞中，在4℃下孵育4h。用冷的PBS洗涤细胞3次，然后用凝集素(绿色荧光)进行细胞膜染色，在4℃下染色1h。用冷的 PBS洗涤3次，用Hoechst 33342在37℃下进行核染色30min。用荧光显微镜观察纳米颗粒的粘附情况。如图13所示，仅M1型巨噬细胞膜包被的纳米粒表现出较强的肿瘤细胞粘附能力(原图中红色显示区域)，由此可知M1型巨噬细胞膜包被的纳米粒对肿瘤细胞的靶向性更强，同时也为仿生纳米药物对肿瘤细胞的靶向提供了理论基础。
实施例7 SLP和mSLP的细胞内吞作用
为考察实施例1和实施例2中的SLP和mSLP的体外细胞内吞作用，我们使用实施例6中的DiI标记的SLP和mSLP。实施例6中的4T1细胞接种于六孔板中，密度为2×105/孔，于37℃培养过夜。将DiI标记的 SLP和mSLP(500nmol/L DiI)加入细胞中，于37℃孵育4h。以正常培养液孵育的细胞作为对照。消化收集细胞，用PBS洗涤三次后，用流式细胞仪分析细胞内吞情况。如图14所示，mSLP的体外细胞内吞作用显著高于SLP，提示其具有更快更强的细胞杀伤能力。
实施例8 SLP和mSLP的细胞毒性作用
为考察实施例1和实施例2中的SLP和mSLP对肿瘤细胞增殖的抑制作用，使用了细胞活力检测试剂盒(CCK-8)。将实施例6中的4T1经胰酶消化离心后，用培养基将细胞充分吹打均匀后，进行细胞计数后用培养基浆细胞悬液稀释至合适的细胞浓度。将细胞以每孔3000-5000个细胞 /100μL的密度接种到96孔板中，设置3个复孔。37℃培养24h后，加入100μL预先配置好的不同浓度的CPT-11、SN38、SLP和mSLP液体，对照组加等体积的正常培养基。细胞继续培养72h后，小心吸去孔内液体，按比例向每孔加入CCK-8溶液，孵育1-2h后，使用酶标仪在450nm处测定每孔的吸光度。计算细胞相对活性：cell viability＝(A sample/Acontrol) ×100％。其中A表示在450nm处的吸光度。细胞相对活性为实验组与对照组吸光度的比值，取每组三个复孔的平均值。如图15所示，SLP和mSLP 均表现出较强的细胞毒性，与游离的SN38药物相当。
实施例9 SLP和mSLP的促细胞凋亡效应
实施例6中的4T1细胞接种于六孔板中，密度为2×105/孔，于37℃培养过夜。分别加入浓度为3×IC50的游离SN38、SLP和mSLP，每组设置3个复孔。孵育48小时后，用不含EDTA的胰酶消化，离心收集细胞，用冷的PBS洗涤2次。去除上清后加入1×binding buffer小心吹打重悬，调整细胞密度为106个细胞/mL，加入5μL FITC Aimexin V和5μL PI。在避光处孵育20分钟后，加入400μL的1×binding buffer，轻轻混合。在1 小时内用流式细胞仪对细胞进行分析。其中，对照组为未经药物处理的细胞。如图16所示，与游离SN38相比，SLP和mSLP均表现出相当的诱导细胞凋亡的能力。
实施例10 SLP和mSLP的细胞周期阻滞作用
同实施例6在六孔板中接种4T1细胞，于37℃培养过夜。分别加入浓度为2×IC50的游离SN38、SLP和mSLP，每组设置3个复孔。孵育 24小时后，胰酶消化收集细胞，吸去上清，用75％的冰乙醇固定细胞，在-20℃固定过夜。次日，用冷的PBS洗涤细胞2次，用600μL PI溶液重悬。于避光处孵育30分钟后，用流式细胞仪分析细胞周期。其中，对照组为未经药物处理的细胞。如图17所示，发现SLP和mSLP均能显著增加G2/M期细胞的比例，降低G1期细胞的比例，从而将细胞周期阻滞在G2/M期。
实施例11药代动力学实验
SLP和mSLP的药代动力学研究在体重约为200g的SD大鼠中进行，每组5只。CPT-11、SLP和mSLP分别以10mg/kg的SN38当量浓度进行尾静脉单次注射给药。在给药后5min、30min、1h、2h、4h、7h、24h、 48h和72h分别采血约0.5mL。血液样品置于抗凝管中，以4500rpm在 4℃下离心10分钟，以获得血浆样品。血浆样品用0.5M氢氧化钠在37℃下水解2h，然后用0.5M盐酸中和。利用高效液相色谱对样品中游离的 SN38进行定量分析。如图18所示，相比临床用药伊立替康，前药脂质纳米粒具有更长的血液循环时间，且巨噬细胞膜包被使纳米药物具有更好的药代动力学特性，包括高稳定性和稳定的药物释放动力学。
实施例12 SLP和mSLP的瘤内蓄积实验
本发明使用了Balb/c小鼠的4T1原位乳腺癌模型对实施例1和实施例 2中的SLP和mSLP研究药物在肿瘤中的蓄积。当肿瘤体积达到约150mm3时，小鼠随机分为两组。分别单次尾静脉注射SLP和mSLP，给药浓度均为15mg/kg SN38当量浓度。分别于注射后8h，24h和48h切除肿瘤并称重。将肿瘤组织在液氮中快速冷冻，然后使用组织研磨仪进行研磨，离心得到组织提取液。所有样品用0.1mol/L氢氧化钠在37℃下处理2h，然后用0.1mol/L氯化氢中和。最后用乙腈提取游离SN38，用高效液相色谱法测定药物浓度。如图19所示，在三个时间点mSLP均具有更高的瘤内药物浓度，表现出更强的瘤内蓄积能力。
实施例13 SLP和mSLP的脏器转移灶蓄积实验
本发明使用了Balb/c小鼠的4T1原位乳腺癌自发转移模型对实施例1 和实施例2中的SLP和mSLP研究药物在脏器转移灶中的蓄积。我们将近红外花菁荧光染料DiR包被入纳米粒，得到DiR标记的SLP和mSLP。 4T1乳腺细胞原位接种小鼠后35天，小鼠发生肿瘤自发转移至肝、脾、肺。本实验还设置原位注射4T1细胞7天后建立的非转移肿瘤模型作为对照。将两种模型的小鼠随机分为两组，分别单次尾静脉注射SLP和mSLP，给药浓度均为15mg/kgSN38当量浓度。在给药后24h牺牲小鼠，并取下其肝、脾、肺和原位肿瘤等，使用动物活体成像仪进行成像，并统计各脏器的荧光强度。如图20所示，mSLP在发生肿瘤转移的脏器中蓄积更强，提示其具有转移肿瘤灶的靶向能力。
实施例14 SLP和mSLP的抗肿瘤药效实验
本发明使用了Balb/c小鼠的4T1原位乳腺癌模型对实施例1和实施例 2中的SLP和mSLP进行抗肿瘤药效评价。当肿瘤体积达到50-100mm3时，将小鼠随机分为4组。分别尾静脉注射生理盐水、伊立替康(CPT-11)、 SN38前药脂质纳米粒(SLP)和巨噬细胞膜包被的前药脂质纳米粒(mSLP)。给药浓度均为10mg/kg SN38当量浓度，体积均为200μL，每隔两天注射一次，总共注射三次。在治疗期间，持续监测肿瘤的长宽、小鼠的体重及生存情况，以评估药物的抗肿瘤效果。肿瘤体积的计算公式为：肿瘤体积＝(长×宽2)/2。药物的抗肿瘤效果如图21所示。由图可知，这两种纳米药物的应用均可显著抑制原发肿瘤的生长。且与SLP相比，mSLP表现出更强的抑制肿瘤生长的活性。同时，mSLP治疗组的生存期也显著延长。此外，纳米药物处理组小鼠的体重无显著变化，说明这种药物递送策略在提高药效的同时具有较好的安全性，这为纳米药物的进一步临床转化提供了较好的基础。

Claims (10)

1.一种细胞膜包被的前药纳米粒，其特征在于，包括：由脂质单分子层和装载于所述脂质单分子层中的SN38前药组成的SN38前药脂质纳米粒以及包裹在纳米粒外面的细胞膜；
所述的脂质单分子层由卵磷脂、胆固醇和DDAB/DOTAP作为骨架，同时以DSPE-PEG2k双亲性聚合物作为添加剂；
所述的SN38前药的结构如下：
Figure FDA0003698466210000011
2.根据权利要求1所述的细胞膜包被的前药纳米粒，其特征在于，所述细胞膜包被的前药脂质纳米粒为球形形貌，粒径为50-800nm；所述SN38前药脂质纳米粒为球形形貌，粒径为50-600nm。
3.根据权利要求1所述的细胞膜包被的前药纳米粒，其特征在于，以SN38计，载药量为2～15％。
4.根据权利要求1所述的细胞膜包被的前药纳米粒，其特征在于，卵磷脂、胆固醇、DDAB/DOTAP和DSPE-PEG2k质量比为10～20:1.5～3.5:1:3～5。
5.根据权利要求1所述的细胞膜包被的前药纳米粒，其特征在于，所述细胞膜为M1型巨噬细胞膜。
6.根据权利要求1所述的细胞膜包被的前药纳米粒，其特征在于，所述细胞膜采用LPS刺激小鼠单核/巨噬细胞系获得的细胞膜。
7.一种如权利要求1至6任一项所述的SN38前药脂质纳米粒和细胞膜包被的SN38前药纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.一种SN38前药纳米粒的制备方法，其特征在于：
将卵磷脂、胆固醇、DDAB/DOTAP和DSPE-PEG2k的脂质混合物溶于有机溶剂I中，再将溶于有机溶剂II的PCL-SN38前药与以上脂质混合物混合后，通过纳米沉淀法得到均匀分散的SN38前药脂质纳米粒。
9.根据权利要求8所述的SN38前药纳米粒的制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂I为乙醇，所述有机溶剂II为丙酮。
10.一种如权利要求1～6任一项所述的细胞膜包被的前药脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，将分离提取的细胞膜与SN38前药脂质纳米粒充分混合，将混合物用挤出器通过聚碳酸酯薄膜挤压，制备细胞膜包被的SN38前药脂质纳米粒。
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