CN110200942A - 一种包含阿帕替尼和sn38-聚乳酸偶联药物的纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种包含阿帕替尼和SN38‑聚乳酸偶联药物的纳米颗粒、制备方法及在抗肿瘤治疗中的应用。本发明利用纳米粒特有的EPR效应，该纳米粒可以实现在这两种药物的可控释放和不同时序地作用于肿瘤血管和肿瘤细胞。即在肿瘤部位先将抗血管药物阿帕替尼释放作用于肿瘤血管封闭局部血管，后将肿瘤细胞杀伤药物SN38释放出来局部高效针对性地作用于肿瘤细胞。而且本发明公开了阿帕替尼对于肝癌细胞的转移也有一定的抑制作用，在一定程度上减少了由于肿瘤对于抗血管药阿帕替尼的耐药可能性。而且纳米形式的药物提高了前体药物阿帕替尼和SN38‑聚乳酸的水溶性，可直接静脉注射。

Description

一种包含阿帕替尼和SN38-聚乳酸偶联药物的纳米颗粒及其 制备方法和应用
技术领域
本发明属于抗肿瘤药物设计技术领域，具体是涉及一种两亲性聚合物包裹的阿帕替尼和SN38-聚乳酸偶联药物(SN38-PLA)纳米颗粒、制备方法及应用。
背景技术
抑制肿瘤血管生长在抗肿瘤治疗中起到关键的作用，但是目前的研究结果显示单独的抗肿瘤药物如抗VEGFR2小分子药物或抗体都不能起到十分满意的抗肿瘤效果，而且有些报道还提示使用了抗血管药物后起到反作用，加速了肿瘤的进展和转移，其中一个主要的原因可能是在抗血管药物关闭了肿瘤血管之后会导致肿瘤局部低氧相关因子的高表达，进一步赋予了肿瘤细胞转移和侵袭的能力。因此目前常将抗血管药物和化疗药物结合使用。
阿帕替尼，又称为艾坦，是全球第一个在晚期胃癌被证实安全有效的小分子抗血管生成靶向药物，也是晚期胃癌标准化疗失败后，明显延长生存期的单药。同时，该药是胃癌靶向药物中唯一一个口服制剂，该药在人体生物利用度高，安全性及耐受性良好，可有效提高患者治疗的依从性。该药作用机制为高度选择性竞争细胞内VEGFR-2的ATP结合位点，阻断下游信号转导，抑制肿瘤组织新血管生成，发挥抗肿瘤作用。7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)是DNA拓扑酶I的抑制剂，具有很好的化疗效果。SN38的水溶性很差，临床上利用水溶性前体药物伊立替康(CPT-11)代替，但是CPT-11的疗效远远差于SN38。
多聚纳米粒介导的药物递送技术现在正处于广泛研究中，纳米药物递送系统利用实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR效应)增加药物的靶向性，而且还能通过包裹材料和基团修饰改变该药物的溶解性从而改变给药方式。聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)是常用的包裹材料，在体内容易降解，具有高度的生物兼容性。使用PEG-PLA包裹连接了聚乳酸链的SN38能实现SN38在肿瘤部位缓释的效果，延长了药物在体内的循环周期，极大地降低了SN38的毒性，提高了MTD。同时，使用纳米系统可以共载两种或多种不同功能的药物，可以控制实现多种药物的协同效应。
发明内容
本发明提供了一种包含阿帕替尼和SN38-聚乳酸偶联药物(以下简称SN38-PLA)的纳米颗粒。
本发明提供了一种两亲性聚合物包裹的阿帕替尼和SN38-PLA纳米颗粒的制备方法，该方法步骤简单。
本发明提供了一种包含所述的两亲性聚合物包裹的阿帕替尼和SN38-PLA纳米颗粒的药物制剂以及应用。
本发明将临床上广泛用于肿瘤抗血管靶向治疗小分子药物阿帕替尼和化疗药物伊立替康活性产物SN38的聚乳酸偶联物(其中，SN38的聚乳酸偶联物可以采用现有方法制备，例如CN 106620714 A)联合使用，共载纳米经被动靶向到达肿瘤部位后可以实现抗血管药物阿帕替尼先释放封闭肿瘤局部血管，SN38后从肿瘤部位释放出来杀死局部肿瘤细胞的作用。同时使用将这两种药物与两亲性聚合物PEG-PLA共溶形成纳米粒，明显提高了这两种药物的水溶性，实现了两种药物的静脉给药，减少了药物的大量口服给药导致的肝肾毒性。本研究还观察到阿帕替尼不仅仅具有抗肿瘤血管的作用，还具有抗肿瘤细胞转移的功能。
一种两亲性聚合物包裹的阿帕替尼和SN38-PLA纳米颗粒，所述两亲性聚合物为聚乙二醇-聚乳酸PEG-PLA。
阿帕替尼结构式为：
SN38-PLA结构式为：
n为17-71.
PEG-PLA的结构式为：
m为45-227，n为28-222。
作为优选，所述聚乙二醇-聚乳酸为PEG5k-PLA8k，其中，5K和8K表示分子量。即m＝113,n＝111。
作为优选，所述纳米颗粒中，阿帕替尼和SN38-PLA中含有的净SN38摩尔比为10:1～1:20。进一步优选为5:1。
作为优选，所述纳米颗粒中，阿帕替尼或SN38与聚乙二醇-聚乳酸的质量比为1:(5～50)；进一步优选为阿帕替尼：PEG5k-PLA8k质量比为1:20，净SN38：PEG5k-PLA8k质量比为1:20。
作为优选，所述纳米颗粒中，SN38-PLA中含有的PLA分子量为3600。
一种两亲性聚合物包裹的阿帕替尼和SN38-PLA纳米颗粒的制备方法，包括：将阿帕替尼和SN38-PLA和两亲性聚合物溶于有机溶剂并混合均匀，匀速滴入水相后水浴锅中蒸发除去有机溶剂，得到均匀分散的纳米粒。包裹阿帕替尼或SN38-PLA的纳米粒也可以采用同样的方法制备。
本发明提供了使用沉淀法制备纳米粒方法，该方法简单，即前药与PEG5k-PLA8k溶于有机溶剂并混合均匀，匀速滴入水相后水浴锅中蒸发除去有机溶剂，得到均匀分散的纳米粒。
作为优选，所述有机溶剂选自丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇等中的一种或多种。
本发明还提供了一种包含上述任一技术方案所述的两亲性聚合物包裹的阿帕替尼或SN38-PLA纳米颗粒的药物制剂。
作为优选，所述药物制剂为片剂、颗粒剂、胶囊剂、乳剂、混悬剂。
一种上述任一技术方案所述的两亲性聚合物包裹的阿帕替尼或SN38-PLA纳米颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明使用PEG5k-PLA8k将阿帕替尼和SN38-PLA非共价包裹成纳米颗粒进行体内递送。纳米颗粒通过EPR效应而在肿瘤中聚集，从而实现肿瘤的高靶向性治疗。通过EPR效应进入肿瘤部位的纳米颗粒先释放出阿帕替尼抑制肿瘤新生血管生成，使已形成的血管萎缩，在局部形成缺血灶，抑制肿瘤细胞的营养来源，由于SN38连上了聚乳酸链，可以缓慢从纳米粒中释放出来，从而在局部的缺血灶更好地发挥杀肿瘤作用，抑制肿瘤细胞的耐药。将阿帕替尼或SN38-PLA包裹成纳米形式不但可以提高两者的水溶性，实现静脉注射，避免药物的大剂量口服带来的毒性，提高了药物的利用率。
本发明提供了单独包裹阿帕替尼，单独包裹SN38-PLA和两者一起包裹的纳米粒的粒径分布图以及扫描电镜图，其平均粒径均在100nm以下。纳米粒粒径较小，易通过肿瘤部位的EPR效应，在肿瘤部位积聚，降低对正常组织的损害，更好地发挥抗肿瘤效果。
本发明提供了阿帕替尼纳米粒(Apa-NPs)，单独包裹SN38-PLA的纳米粒(SN38-PLA-NPs)和两者共载纳米粒(SN38-PLA/Apa-NPs)的体外释放图，体外释放实验验证了SN38-PLA的释放明显缓于阿帕替尼。这个结果可以支持这种共载纳米粒先后可控性地在体内释放抗肿瘤药物的猜想。
本发明通过体外细胞划痕实验和微管形成试验验证了同浓度时阿帕替尼纳米粒，共载的纳米粒和单独的阿帕替尼一样具有明显的抑制血管内皮细胞迁移和形成小管的能力。SN38-PLA的纳米粒也具有一定的抗血管迁移和抑制小管形成的能力，但是主要原因是SN38对内皮细胞的毒性太强，对内皮细胞主要起到的是杀伤作用，对内皮细胞起到杀伤毒性的同时影响内皮细胞的迁移和形成小管的能力。
本发明还证明了浓度为16μM的单独阿帕替尼，阿帕替尼纳米粒，共载的纳米粒在给药24h后就具有明显地抑制肝癌细胞Huh-7转移的能力，而3.2μM的SN38-PLA纳米粒对Huh-7细胞的迁移几乎没有影响。说明了阿帕替尼在体内给药时不仅仅可以抑制血管生长，还能抑制肿瘤细胞的转移和侵袭，这在一定程度能减少由于抗肿瘤血管治疗后引起的肿瘤转移恶化的可能性。
本发明更进一步提供了体内评价共载纳米粒的疗效。结果表明：
与生理盐水对照组相比，单独的阿帕替尼纳米粒对肿瘤的抑制效果不明显，阿帕替尼纳米粒给药组和生理盐水给药组在开始给药后8天就超过了2000mm3。而在第8天，使用SN38-PLA纳米粒，单独包裹的两种纳米粒相加和共载的两种纳米粒组的肿瘤都没有超过500mm3,但是共载的两种纳米粒组的肿瘤已经比前两组的肿瘤体积小，在21天时，两药联用共载的纳米粒静脉给药组肿瘤对比于单独的SN38-PLA纳米粒给药组缩小了2.6倍；相比于单独包裹联合使用的给药组，肿瘤缩小了1.52倍。说明了无论是单独包裹联合使用的两药联用还是共载纳米粒的两药联用，效果都优于单药，而且共载的纳米粒比单独包裹的两药联用效果更好。生存率结果显示共载纳米粒组的小鼠生存时间至少比单纯的SN38-PLA纳米粒组的小鼠延长6天(18％)。CD31血管染色结果也显示共载纳米粒组的肿瘤组织明显血管匮乏。体内试验的这些结果为这种药物的优越性提供了强有力的证据，开拓了广阔的应用前景。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
(1)本发明中所使用的聚乙二醇-聚乳酸均为无毒且具有生物相容性和生物可降解性的高分子材料。并且，上述高分子材料均已被美国FDA批准上市使用，具有很好的临床转化作用。
(2)本发明中使用了包裹材料聚乙二醇-聚乳酸，提高了阿帕替尼和SN38-PLA的溶解性，为小剂量静脉给药也能发挥有效抑制肿瘤的作用提供可能。
(3)本发明中的纳米粒粒径均在100nm范围内，粒径较小，易通过肿瘤部位的EPR效应，在肿瘤部位滞留发挥药效。
(4)本发明中使用的SN38-聚乳酸前药具有较强的疏水性，位于纳米颗粒的疏水核心。前药纳米粒需经两步才能释放出SN38分子，故其释放速率缓慢。
(5)本发明使用的共载纳米粒能实现两种药物的可控性先后释放，使不同功能的药物在相应的时空起作用。这种药物的递送方法对于现在的抗肿瘤药物给药系统研究有很大的意义。
(6)本发明证明了阿帕替尼不仅仅具有抗血管的作用，还具有抑制肝癌肿瘤细胞转移的作用，这对于阿帕替尼的临床应用和功能探索有一定的启示。
(7)体内实验结果显示，两种药物的联合使用对体重影响不大，说明毒性反应小，副作用小，更容易通过临床试验，获得批准上市。
附图说明
图1为阿帕替尼、SN38-聚乳酸和聚乙二醇-聚乳酸的化学结构和共载纳米粒形成的示意图。
图2为使用PEG-PLA将阿帕替尼和SN38-PLA包裹形成的纳米粒的表征。a,b,c分别为Apa-NPs,SN38-PLA-NPs和SN38-PLA/Apa-NPs纳米粒的电镜图谱和粒径分布。d为三种纳米粒的释放示意图。
图3为纳米药中的阿帕替尼的抗血管作用。图a为不同给药组对内皮细胞迁移能力影响的研究。图b为不同给药组对内皮细胞成管能力的研究。图c为图a的定量结果，图d,e为图b的定量结果。
图4为纳米药中的阿帕替尼对肝癌细胞的抗迁移作用。
图5为共载纳米体系抑制了肝癌细胞Huh-7皮下移植瘤的增长。
图中Apa-NPs表示单纯包裹了阿帕替尼的纳米粒；SN38-PLA-NPs表示单纯包裹了SN38-聚乳酸；SN38-PLA/Apa-NPs表示共同包裹了阿帕替尼和SN38-聚乳酸的纳米粒；*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明并不受其限制。
实施例1使用聚乙二醇-聚乳酸将阿帕替尼和SN38-PLA包裹形成纳米粒
本发明中的前药纳米粒采用纳米沉淀法制得(图1)。阿帕替尼和SN38-PLA的共载纳米粒的制备具体操作步骤如下：事先通过紫外分光光度计法和碱水解法测定合成的SN38-PLA(PLA分子量为3600)中SN38的净含量，然后用电子天平称量1mg阿帕替尼和含有0.25mg SN38的SN38-PLA分别溶解于500μL丙酮中，再称25mg溶解于1ml的丙酮中，再将以上三种溶解混合，再用微量注射泵将溶液恒速缓慢(30mL/h)地注入到装有高速搅拌的10ml二次纯水的烧杯中，注射完毕后再用500μL丙酮润洗注射器及针头，将润洗液再次注入到水溶液中，继续搅拌10min后将烧杯转移到温度设置为50℃水浴磁力搅拌锅中搅拌约40min。当溶液中不再有丙酮的刺激性气味时再次定量终体积是否为10ml，如果少于10ml，则加入重蒸水，使总体积为10ml，即获得了阿帕替尼浓度为0.1mg/mL，SN38浓度为0.025mg/mL的共载纳米粒水溶液。制备单独包裹的阿帕替尼和SN38-PLA纳米粒也使用同样的丙酮法。
实施例2纳米粒的表征。
通过透射电子显微镜(TEM)观察粒子的形貌。制样：取上述阿帕替尼浓度为0.1mg/ml的共载纳米粒1ml到浓缩管中2500rpm转速下离心5-10分钟，待浓缩至400μL左右时，即可得到浓度约为0.25mg/ml的纳米粒。取一滴0.5mg/mL的纳米粒溶液点样于铜网上，用2％醋酸铀负染，在空气中干燥后在透射电子显微镜下进行观察。纳米粒的粒径分布和Zeta电位测试由动态光散射仪测得纳米粒的粒径及其分布(PDI)和Zeta电位。测试温度为25℃，平衡时间为2min，每个样品平行测试3次。所得粒径和电位均为样品的平均值。Apa-NPs,SN38-PLA-NPs和SN38-PLA/Apa-NPs的粒径检测结果和透射电子显微镜观察的结果如图2a、b、c所示。由图2可知，本发明的阿帕替尼和SN38共载纳米粒粒径均在100nm范围内，粒径较小，易通过肿瘤部位的EPR效应，在肿瘤部位滞留发挥药效。
纳米药物的体外释放情况观察。将制备好的三种纳米药物3mL分别置于分子量为7000kDa的透析袋中，透析袋置于50mL离心管中。透析袋外界为20mL pH为7.4的磷酸缓冲液，离心管置于温度为37℃，转速为150r/min的环境中，分别在2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h和96h取出外界磷酸缓冲液，用高效液相测得SN38含量和阿帕替尼，从而得到3个纳米药物的相应的体外释放情况，结果如图2d所示。
实施例3纳米药中的阿帕替尼的抗血管作用。
考察实施例1纳米粒中的阿帕替尼中对内皮细胞迁移和成管能力的抑制作用，采用的方法为划痕实验和微管形成实验，具体方法如下：
划痕实验：将贴壁的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)用胰酶消化下来后，用DMEM培养基将细胞吹打均匀，计数。将HUVEC接种于6孔板中，每孔2×105个，2mL，培养24h。显微镜下观察到细胞贴壁后，用200μL枪头小心在细胞生长的中央区域画两条竖线后弃掉原有的培养基，再用磷酸盐缓冲液PBS洗两遍去掉划落的细胞，然后加入预先配置好的单独的阿帕替尼，Apa-NPs,SN38-PLA-NPs和SN38-PLA/Apa-NPs，阿帕替尼的浓度为2μM，含有SN38的给药组SN38的浓度为0.4uM。空白组的培养基不加任何药物,为对照组。加入药物后在显微镜下拍照，保存图片。继续培养24h后再次拍照观察划痕处细胞的迁移情况。放大倍数为40×。实验重复三遍以上。结果统计使用Photoshop CC软件计算0h和24h时处的划痕大小，推算各组细胞的迁移率。细胞的相对迁移率计算为迁移率＝(0h划痕宽度-24h划痕宽度)/(0h划痕宽度)×100％。如图3a和c所示，可以观察到含有阿帕替尼的单独给药或纳米给药都能明显抑制内皮细胞的迁移。
微管形成实验：在96孔板内铺上30μL的基质胶后置于37℃1h后在基质胶上加混有同以上划痕实验相同浓度的同种药物的培养基DMEM100μL。培养基中含有浓度为2×105/ml的HUVEC。培养6h后在显微镜下观察拍照，放大倍数为100×。每组实验重复三遍。在Image J软件中计算分支和小管长度。如图3b,d,e所示含有阿帕替尼的单独给药或纳米给药都能明显抑制内皮细胞的小管形成能力。
实施例4为纳米药中的阿帕替尼对肝癌细胞的抗迁移作用。
考察实施例1纳米粒中的阿帕替尼中对肝癌肿瘤细胞迁移能力的抑制作用，采用的方法为划痕实验。
具体操作步骤同上述划痕实验，将Huh-7用胰酶消化下来后，用DMEM培养基将细胞吹打均匀，计数。将Huh-7接种于6孔板中，每孔2.5×105个，2mL，培养24小时。细胞贴壁后划痕再用PBS洗，然后加入预先配置好的单独的阿帕替尼，Apa-NPs,SN38-PLA-NPs和SN38-PLA/Apa-NPs，阿帕替尼的浓度为16μM，含有SN38的给药组SN38的浓度为3.2uM。拍照后继续培养24小时后再次拍照统计结果。如图4所示，可以观察到含有阿帕替尼的单独给药或纳米给药都能明显抑制肿瘤细胞的迁移，说明阿帕替尼具有一定的抗肿瘤转移和侵袭能力。
实施例5为共载纳米体系抑制了肝癌细胞Huh-7皮下移植瘤的增长。
本发明采用人肝癌细胞Huh-7异种移植裸鼠皮下瘤模型对实施例1前药纳米粒进行抑瘤效果评价。当裸鼠皮下肿瘤体积达到280mm3时，开始分组共5组，每组7只裸鼠。分组后开始给药，给药分组为，生理盐水组，单独包裹阿帕替尼纳米粒组，单独包裹SN38-PLA组，单独包裹的阿帕替尼或SN38-PLA纳米粒联用组，共载包裹阿帕替尼和SN38-PLA纳米粒组。给药剂量为含有阿帕替尼的药物组阿帕替尼的浓度为40mg/kg,含有SN38-PLA的给药组，净SN38的含量为10mg/kg。对照组为生理盐水。各组给药方式均为尾静脉给药，给药体积为200μL。单剂量给药。给药结束后，每隔两天测量一次肿瘤体积和小鼠体重的同时观察小鼠生存率。16天后改为每6天观察一次。各种药物的抑瘤效果图如图5所示。由图可知，含有SN38-PLA的纳米粒抑瘤效果明显，单独的阿帕替尼纳米粒的抑瘤效果不明显。在治疗的后期，共载纳米粒的抑瘤效果明显比单纯SN38-PLA的纳米粒效果好。而且也明显延长了生存率。免疫组化结果显示共载纳米粒组的肿瘤血管确实明显比对照组减少很多。且两种药物的联合使用对体重影响不大，说明毒性反应小，副作用小，再次验证了本发明的优越性。

Claims (8)

1.一种包含阿帕替尼和SN38-聚乳酸偶联药物的纳米颗粒，其特征在于，所述的阿帕替尼和SN38-聚乳酸偶联药物由两亲性聚合物进行包裹；
所述的两亲性聚合物为聚乙二醇-聚乳酸。
2.根据权利要求1所述的包含阿帕替尼和SN38-聚乳酸偶联药物的纳米颗粒，其特征在于，所述的聚乙二醇-聚乳酸为PEG5k-PLA8k。
3.根据权利要求1所述的包含阿帕替尼和SN38-聚乳酸偶联药物的纳米颗粒，其特征在于，所述的阿帕替尼与SN38-聚乳酸偶联药物中含有的净SN38摩尔比为10:1～1:20。
4.根据权利要求1所述的包含阿帕替尼和SN38-聚乳酸偶联药物的纳米颗粒，其特征在于，所述的阿帕替尼与聚乙二醇-聚乳酸的质量比为1:(5～50)。
5.一种如权利要求1～4任一项所述的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括：
将阿帕替尼、SN38-聚乳酸偶联药物和两亲性聚合物溶于有机溶剂并混合均匀，匀速滴入水相后，再蒸发除去有机溶剂，得到所述的纳米颗粒。
6.根据权利要求5所述的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂选自丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇中的一种或多种。
7.一种如权利要求1～4任一项所述的纳米颗粒的在制备抗癌药物中的应用，其特征在于，所述的抗癌药物包括所述的纳米颗粒和药用辅料。
8.根据权利要求1所述的纳米颗粒的在制备抗癌药物中的应用，其特征在于，所述的抗癌药物的剂型为片剂、颗粒剂、胶囊剂、乳剂或混悬剂。
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